Бесконтактный способ измерения температуры с помощью флуоресцентных зондов Российский патент 2023 года по МПК G01N21/64 

Бесконтактный способ измерения температуры в жидких средах, включая биологические.

Температура является фундаментальным параметром, который влияет на поведение физических, химических и биологических систем.

К бесконтактным методам измерения, как известно, относятся методы измерения, при которых измерительное средство не имеет механического контакта с поверхностью измеряемого объекта. В качестве бесконтактных способов измерения температуры в жидкостях известно очень ограниченное количество, в то время как контактных способов известно довольно много. К ним в частности относятся методы с использованием термопар, термометров сопротивления, ртутных термометров и т.п.Все эти методы имеют свои преимущества и недостатки, однако общим из них является то, что любое внедрение инородного тела в измеряемую среду приводит к возникновению неконтролируемых ошибок, в связи с чем, разработка и внедрение бесконтактных способов является всегда актуальной задачей.

Одним из известных бесконтактных методов определения температуры является способ определения локальной температуры по тепловому излучению объекта в широком диапазоне длин волн с помощью радиационного пирометра [Д.Я.Свет. Оптические методы измерения истинных температур, М., Наука, 1982 г., 295 с.]. Данный метод широко применяется при измерении температур от 500°С и выше. При понижении температур до 10-70°С интенсивность теплового излучения значительно снижается, а максимум теплового излучения находится на длине волны от 10 до 8 мкм. В результате при измерениях в диапазоне 10-70°С требуется длительное время накопления сигнала и ухудшается точность измерений. Пространственное разрешение данного метода ограничено дифракционным пределом для оптического излучения. При микроскопических измерениях с использованием иммерсионного объектива пространственное разрешение составляет ~3 мкм (для температур 10-70°С). Следует отметить, что этот метод используется в основном для измерения температуры поверхностей.

Бесконтактный метод измерения температуры в растворе описан в патенте (JP2001124768A, B62D 05/4, B62D 6/00, B62D 101/00, B62D 119/00, дата опубликования16.03.1993), «Fluorescent bead for obtaining cell temperature and its use method» (Флуоресцентная капсула для получения температуры клетки и метод ее использования). В качестве датчика температуры служит флуоресцентная гранула из полипиридина с металлом или его производным размером 80-90 нм, со встроенными в нее чувствительным и нечувствительным к температуре флуорофорами. Температуру среды вычисляют по кривой температурной характеристики, созданной путем изучения взаимосвязи между интенсивностью флуоресценции и температурой. Одна из проблем этого метода связана с необходимостью построения точной кривой температурной характеристики флуорофоров. Кроме того, в датчике температуры, использующем чувствительный к температуре люминофор Eu(TTA)₃, необходимо часто калибровать кривую температурной характеристики, чтобы избежать ошибок, связанных с изменением со временем его свойств.

Известен бесконтактный способ определения локальной температуры по флуоресценции углеродных наночастиц [Kalytchuk, S. et al. Carbon dot nanothermometry: Intracellular photoluminescence lifetime thermal sensing. ACS Nano 11, 1432-1442 (2017) https://doi.org/10.1021/acsnano.6b06670]. Метод основан на добавлении углеродных наночастиц к образцу, оптическом возбуждении образца коротким УФ импульсом, измерении послесвечения флуоресценции и определения времени жизни флуоресценции. Температура рассчитывается по времени жизни флуоресценции. Средний размер углеродных наночастиц составляет 4-5 нм. К недостаткам данного метода следует отнести: сложность и дороговизну необходимого оборудования. В данном методе требуется импульсный лазер для возбуждения флуоресценции с длительностью импульса не более нескольких наносекунд и система регистрация излучения, работающая в режиме счета фотонов с временным разрешением не хуже 1 нс. Также следует подчеркнуть необходимость использования УФ излучения (300-370 нм) для возбуждения флуоресценции, что, например, для биологических сред не всегда приемлемо.

Известен флуоресцентный датчик, который описан в патенте (WO2010150862A1, опубл. 29.12.2010) «Fluorescent temperature probe and temperature measuring device using same». (Флуоресцентный датчик температуры и прибор для измерения температуры, использующие его), описан способ измерения температуры в жидкой среде в диапазоне 10-50°С где для этого используется белковый флуоресцентный температурный зонд который формируется путем соединения в фиксированном соотношении температурно-чувствительного флуоресцентного белка, относительная интенсивность флуоресценции которого сильно меняется в диапазоне 20-50°С, и эталонного флуоресцентного материала, относительная интенсивность флуоресценции которого изменяется незначительно. Температура объекта определяется по отношению интенсивности флуоресценции температурно-чувствительного флуоресцентного белка к интенсивности флуоресценции эталонного флуоресцентного вещества при 20°С. Так как полосы поглощения составляющих молекул зонда различны для возбуждения их флуоресценции используются различные длины волн (двухволновое возбуждение).

В патенте описаны и приведены экспериментальные данные измерения температуры для нескольких зондов представляющих собой слитые конструкции термочувствительных флуоресцентных белков (mSEGFP, mOrange, TagRFP, MCherry и другие) и эталонных флуоресцентных белков (Топаз, EYFР, Venus и др.) связанных непосредственно или с помощью линкерного пептида. Также описана возможность, без подтверждения экспериментальными данными, использования в качестве эталонного флуоресцентного материала флуоресцентных меток Cy3, Cy5, FITC, родамин, FAM и другие. При этом судя по описанию флуоресцентные метки не предполагается соединять в единый зонд с термочувствительными флуоресцентными белками.

Наиболее близкий аналог изобретения описан в работе [Youshen Wu at all, Novel Ratiometric Fluorescent Nanothermometers Based on Fluorophores-Labeled Short Single-Stranded DNA, ACS Appl. Mater. Interfaces 2017, 9, 11073-11081, DOI: 10.1021/acsami.7b01554] где для измерения температуры используется флуоресцентный температурный зонд который состоит из однонитевой ДНК (онДНК) длинной не менее 12 комплементарных оснований и флуорофоров присоединенных к концам онДНК. Флуорофоры выбираются таким образом, чтобы между ними была возможность передачи энергии за счет Форстеровского резонанса (ФРЭТ пара) и при этом интенсивность флуоресценции самих флуорофоров (квантовый выход) не зависят от температуры. Последовательность нуклеотидов в зонде, по утверждению авторов, основанных на расчетах с использованием молекулярной динамики, обеспечивает возможность изменения конформации (формы) онДНК при изменении температуры окружающей среды - с увеличением температуры расстояние между противоположными концами онДНК, на которых расположены флуорофоры - увеличивается, что ведет к уменьшению передачи возбуждения между ними и, как следствие, увеличению интенсивности излучения донора и уменьшению интенсивности акцептора. Отношение этих интенсивностей (Д/А) используется авторами для определения температуры.

Техническая проблема измерения температуры жидкости и динамики ее изменения не может быть решена без использования бесконтактных способов, так как использование контактных способов с помощью термопар, термометров сопротивления, ртутных термометров и т.п.приводит к погрешностям измерения, вызванных локальным возмущением жидкости твердотельным датчиком, время релаксации которого, приводящее к установлению термодинамического равновесия, зависит от различных физических параметров. Величина этой погрешности тем больше, чем меньше отношение объема жидкости к объему датчика и чем больше скорость изменения температуры среды.

Бесконтактные методы и средства измерений температуры не требуют вмешательства в среду измерений, не создают проблем с установкой датчиков, не требуют контакта с объектом исследования, не порождают погрешностей измерения из-за взаимодействия инструмента с объектом измерения.

Имеющиеся бесконтактные способы также не свободны от погрешностей, а некоторые из них приспособлены только для измерения температуры поверхностей. К последним относится способ определения локальной температуры по тепловому излучению объекта в широком диапазоне длин волн с помощью радиационного пирометра [1].

Использование в качестве зондов для измерения температуры жидкости, коротких олигонуклеотидов не более ~10 нм, меченых ФРЭТ парой флуорофоров, квантовый выход которых зависит от температуры, обеспечивает следующий технический результат: бесконтактное, измерение температурных полей в жидкой среде, с высоким пространственным разрешением и с использованием для возбуждения флуоресценции одной длины волны (одноволновое возбуждение) в видимом диапазоне, не вредящего биологическим объектам, без применения редкоземельных металлов.

Технический результат достигается за счет использования в качестве бесконтактного датчика температуры флуоресцентного температурного зонда, состоящего из короткого олигонуклеотида (до 8-ми пар оснований) с флуоресцентными метками на его противоположных концах. Флуоресцентная пара подбирается таким образом, чтобы между ними осуществлялась эффективная передача энергии за счет Форстеровского резонанса (ФРЭТ пара). Размеры зонда (менее 10 нм) и величина излучательного времени жизни флуоресцентных меток (1-5 нс) определяют параметры пространственно временного разрешения абсолютного значения температурных полей.

Описание фигур

Фигура 1. Эмиссионные спектры флуоресцентного зонда Cy3-TTATTATT-Су5 при различных температурах. Линия 1 - 15°С, линия 2 - 30°С, линия 3-45°С, линия 4 - 60°С.Фигура 2. Зависимость отношения интенсивностей полос Су5 и Су3 от температуры для зонда Су3-TTATTATT- Су5.

Фигура 3. Эмиссионный спектр флуоресцентного зонда AF430-TTATTATT-Су3.5 при температуре+22°С, длина волны возбуждения 450 нм.

Фигура 4. Зависимость отношения интенсивностей полос AF430 и Су3.5 от температуры.

Фигура 5. Оптическая схема измерения температурного поля с помощью цифровой камеры (фотоаппарата). 1 - образец, 2 - цифровая камера, 3 - оптический фильтр, 4 - излучение для возбуждения флуоресценции.

Флуорофоры, как правило, имеют нестабильную пространственную структуру, которая зависит от температуры окружающей среды, что влияет на температурную зависимость квантового выхода. Это обстоятельство может быть использовано для бесконтактного способа определения температуры водной среды, с растворенными в ней флуорофорами.

В силу их малых размеров они могут обеспечить высокое пространственное разрешение, если будут находиться на небольшом расстоянии друг от друга, например, связанные с помощью коротких (не более 8 пар оснований) олигонуклеотидов. Такой термозонд представляет собой молекулу, состоящую из двух хромофорных центров и соединительного мостика в виде олигонуклеотида. Схематично такую конструкцию можно представить в виде Fl₁-O-Fl₂, здесь О - олигонуклеотид, Fl₁, Fl₂ - флуорофоры. Размер такого термозонда не превышает 10 нм, чем обеспечивается высокое пространственное разрешение.

Использование олигонуклеотида для связи двух флуорофоров так же решает проблему растворимости флуорофоров в водной среде, так как сами по себе они нерастворимы.

При возбуждении двух различных флуорофоров требуется использовать источник света с двумя длинами волн, что ведет к техническим сложностям использования метода и формированию дополнительных погрешностей измерения температуры с высоким пространственным разрешением. Для решения данной проблемы в этом способе предлагается подбирать флуоресцентную пару так, чтобы между ними осуществлялась эффективная передача энергии за счет Форстеровского резонанса (ФРЭТ пара). Это позволяет возбуждать только один флуорофор (донор). Возбуждение от донора передается к другому флуорофору (акцептору). В эмиссионном спектре при этом наблюдается две полосы от донора и акцептора. Соотношение интенсивностей этих полос зависит от эффективности передачи энергии и квантовых выходов флуорофоров. Особенность конструкции зонда позволяет использовать источник возбуждения с квазимонохроматическим спектром. В качестве источника возбуждения могут быть использованы: полупроводниковые лазеры, цветные светодиоды с дополнительным оптическим фильтром и.т.д.

Процесс синтеза флуоресцентных зондов (меченных олигонуклеоитидов) поставлен на промышленную основу, фактически это представляет собой мелкосерийное производство. При заказе необходимо указать состав олигонуклотида и флуорофора, которые надо присоединить к олигонуклеотиду. Например, флуоресцентные зонды доступны для заказа у Евроген (Москва) и Люминопроб (Москва). Стоимость, таких флуоресцентных зондов сравнительно невелика.

Преимуществами такого флуоресцентного термозонда являются:

1. Значение температуры определяется путем измерения отношения интенсивностей излучения флуорофоров измеренных при этой температуре в отличие от способа измерения с использованием зондов с флуоресцентными белками, где измеряется отношение интенсивности флуоресценции температурно-чувствительного белка к интенсивности флуоресценции температурно-нечувствительного белка измеренной при 20С.

2. для возбуждения флуоресценции ФРЭТ пары достаточно одной длины волны (одноволновое возбуждение), в отличие от зондов с флуоресцентными белками где для возбуждения их флуоресценции требуются различные длины волн (двухволновое возбуждение)

3. измерение температуры с ФРЭТ зондами возможно со сверхвысоким пространственным разрешением, определяемым размером зонда (~10 нм),

4. измерение динамики изменения абсолютного значения температурных полей определяется временем жизни флуорофоров (1-5 нс).

5. высокая чувствительность способа обеспечивается большим квантовым выходом флуорофоров и хорошей растворимостью зондов с ними

6. В отличие от зондов с флуоресцентными белками зонды с флуорофорами не требуют специальных условий хранения, на рынке много коммерчески доступных таких зондов и они очень просты в обращении.

7. В отличии от флуоресцентных белков флуорофоры в заявляемых зондах достаточно устойчивы к выгоранию.

8. В отличие от флуоресцентных зондов, использующих специфические длинные олигонуклеотиды, более 12 оснований, конформация которых зависит от температуры, а интенсивность флуресценции зависит от расстояния между флуорофорами, квантовый выход которых от температуры не зависит, а использование коротких, менее 8 оснований, олигонуклеотидов с неизменной формой обеспечивает максимальную передачу возбуждения между донором и акцептором и использование флуорофоров, интенсивность флуоресценции которых, зависит от температуры обеспечивает измерение температурных полей в жидкой среде, с высоким пространственным разрешением.

Предлагаемый способ измерения температуры более надежен и универсален, так как он опирается на фундаментальные знания о свойствах флуорофоров и широкий выбор флуорофоров для предлагаемого метода, отсутствуют ограничения по подбору последовательностей коротких (до 8 оснований) олигонуклеотидов. Длинные олигонуклеотиды менее стабильны в биологических средах, что ведет к уменьшению их времени функциональной активности.

Примеры реализации измерения температуры с помощью зонда Cy3-TTATTATT-Су5.

Пример1

Измерение температуры с помощью зондов на основе ФРЭТ пары Су3 - Су5Зонд состоит из ФРЭТ пары расположенной на концах олигонуклеотида из восьми оснований: Cy3-TTATTATT-Cy5. При возбуждении Су3 происходит эффективная передача энергии на Су5 вследствие эффекта ФРЭТ. Эффективность передачи энергии определяется парой флуорофов для этого зонда она составляет 80% при комнатной температуре (+22С). На Фиг. 1 показаны спектры водного раствора зондов при возбуждении излучением с длиной волны 520 нм. В спектре имеется две эмиссионных полосы с максимумами на 566 нм (Су3) и 663 нм (Су5). При изменении температуры наблюдается изменение интенсивности флуоресценции флуорофоров Су3 и Су5. На Фиг. 2 приведено нормированное на максимальное значение отношение интенсивностей флуоресценции флуорофоров Су5 к Су3 в диапазоне температур 15-60С, записанное через 0.5С. Видно, что отношение интенсивностей является монотонно возрастающей функцией температуры, что позволяет использовать эту зависимость для определения температуры. В диапазоне 20-50С зависимость близка к линейной с наклоном k=0.024. Разрешающая способность по температуре определяется точностью измерений интенсивностей флуоресценции флуорофоров и величиной k. В приведенных данных точность определения по температуре не хуже 0.5С.При длительном накоплении сигнала точность может быть увеличина.

Пример2

Измерение температуры с помощью зондов на основе ФРЭТ пары AF430- Cy3.5.

AF430 и Cy3.5 это еще одна удобная пара для измерения температуры. AF430 это модифицированный флуорофор из класса кумаринов, Cy3.5 относится к классу карбоцианиновых красителей. Эти флуорофоры образуют эффективную ФРЭТ пару, структура зонда: Cy3-TTATTATT-Cy5. На Фиг. 3 приведен эмиссионный спектр зонда при температуре+22С, для возбуждения использовалась длина волны 450 нм. В спектре имеется две эмиссионных полосы с максимумами на 527 нм (AF430) и 606 нм (Cy3.5). При изменении температуры наблюдается изменение интенсивности флуоресценции флуорофоров AF430 и Cy3.5. На Фиг. 4 показано отношение интенсивности полос Cy3.5/Су3 в диапазоне 20-60С, записанное через 0.5С. Видно, что отношение интенсивностей флуоресценции является монотонно возрастающей функцией температуры, что позволяет использовать эту зависимость для определения температуры. Так как изменение отношения интенсивностей флуоресценции полос при изменении температуры выражено сильнее чем у зонда Cy3-TTATTATT-Cy5, то использование этой ФРЭТ пары позволяет точнее измерять температуру. Преимуществом этой пары также является то, что у нее большее спектральное различие между максимумами полос AF430 и Су3.5.

Пример3

Измерение температуры с использованием флуоресцентного микроскопа.

При использовании современного флуоресцентного микроскопа для измерения температуры среды его необходимо дооснастить оптическими фильтрами, полосы пропускания которых соответствуют спектральным диапазонам излучения флуорофоров входящих в состав зондов. Пространственное разрешение при этом определяется дифракционным пределом микроскопа (λ/(2nA) здесь λ - длина волны, n - коэффициент преломления иммерсионной жидкости, А - апертура объектива, для высококачественного объектива А близко к 1 (обычно 0.95-0.98)). Для иммерсионного объектива высокого качества и длины волны 600 нм пространственное разрешение составляет около 200 нм, что значительно больше размеров флуоресцентного зонда.

Для измерения температуры раствора используется 10 нМ концентрация Cy3-TTATTATT-Су5. При регистрации света на черно-белую камеру, необходимо сделать два снимка. Первый с флуоресцентным кубом 520/570 нм, второй с флуоресцентным кубом 520/660 нм. На первом кадре регистрируется флуоресценция от Су3, а на втором кадре флуоресценция от Су5. Затем рассчитывается отношение интенсивностей I_Cy5/I_Cy3, и для каждой точки кадра по градуировочному графику определяется температура, что позволяет снять карту температур. Временное разрешение в данном случае определяется скоростью смены флуоресцентного куба в микроскопе и временем накопления сигнала. Для современного моторизованного микроскопа время смены флуоресцентного куба не превышает 1-2 с.Время накопления сигнала зависит от интенсивности свечения флуорофоров и обычно составляет 0.001-1 с.Таким образом временное разрешение в данном случае составляет 3-4 с.

Если для регистрации света используется цветная камера, то при подходящем выборе флуорофоров температура может быть определена по одному снимку. Для выделения цвета на ПЗС матрицах используются 3 фильтра Байера: синий (максимум пропускания 450 нм), зеленый (максимум пропускания 530 нм) и красный (максимум пропускания 610 нм). Селективности данных фильтров вполне достаточно для разделения флуоресценции Су3 и Су5. Для измерений требуется флуоресцентный куб 520 нм - возбуждение флуоресценции и 540-700 нм для регистрации флуоресценции. На снимке в зеленом канале (G) записано преимущественно излучение Су3, в красном канале (R) преимущественно излучение Су5. Используя файл с цветным изображением рассчитывается отношение интенсивностей R/G. Температура определяется по градуировочному графику.

Временное разрешение в этом способе определяется временем накопления сигнала, которое зависит от интенсивности свечения флуорофоров и обычно составляет 0.001-1 с.Таким образом, в данной схеме эксперимента может быть достигнуто временное разрешение 1 мс.

Пример 4.

Измерение температуры с помощью цифровой камеры (фотоаппарата)

Температурное поле образца может быть измерено с помощью цифровой камеры. Для измерения температуры раствора используется 10 нМ концентрация Cy3-TTATTATT-Су5. Вариант оптической схемы приведен на Фиг. 5.

Освещение образца осуществляется под углом относительно оптической оси цифровой камеры, длина волны возбуждающего излучения зависит от типа применяемых зондов. Для зондов Cy3-O-Су5 используется излучение с длиной волны 500-535 нм. Регистрация света осуществляется через оптический фильтр. Имеется два способа определения температуры.

А. Производится съемка двух кадров через различные фильтры без изменения положения объекта. Первый снимок производится через фильтр 566 нм (полоса пропускания 10-20 нм), второй снимок производится через фильтр 663 нм (полоса пропускания 10-20 нм). На первом кадре регистрируется интенсивность флуоресценции Су3, а на втором кадре интенсивность флуоресценции Су5. Далее для каждой точки кадра рассчитывается отношение интенсивностей I_Cy5/I_Cy3. Температура рассчитывается по градуировочному графику. Временное разрешение в данном случае определяется временем смены фильтра и суммарной экспозицией двух кадров.

Б. С помощью цветной камеры производится съемка образца через фильтр блокирующий возбуждающее излучение и пропускающий излучение 550-700 нм. В этом случае в зеленом канале кадра регистрируется преимущественно излучение Су3, в красном канале - излучение Су5. Используя файл с цветным изображением рассчитывается отношение интенсивностей R/G для каждой точки кадра. Температура определяется по градуировочному графику. Временное разрешение определяется временем экспозиции, и составляет 0.001-1 с.В данной схеме эксперимента может быть достигнуто временное разрешение 1 мс.

Изобретение относится к области измерительной техники и касается бесконтактного способа измерения температуры. Измерение температуры осуществляют с помощью флуоресцентных зондов по измерению отношения интенсивностей свечения двух флуорофоров, входящих в состав зонда, представляющего собой два хромофорных центра, соединенных коротким олигонуклеотидным мостиком, содержащим не более восьми оснований. Для измерения температуры исследуемого объекта подбирают флуорофоры так, чтобы их интенсивность флуоресценции зависела от температуры и между ними осуществлялась эффективная передача энергии за счет Форстеровского резонанса. Флуоресцентные зонды добавляют к объекту, проводят измерения интенсивностей флуоресценции максимумов эмиссионных полос и рассчитывают их отношения. По градуировочному графику определяют температуру объекта. Для возбуждения флуоресценции используют источник возбуждения с квазимонохроматическим спектром. Технический результат заключается в обеспечении возможности измерении температурных полей в жидкой среде с высоким пространственным разрешением и с использованием для возбуждения флуоресценции одной длины волны. 5 ил.

Бесконтактный способ измерения температуры с помощью флуоресцентных зондов по измерению отношения интенсивностей свечения двух флуорофоров, входящих в состав зонда, представляющего собой два хромофорных центра, соединенных коротким олигонуклеотидным мостиком, содержащим не более восьми оснований, состоящий в том, что для измерения температуры исследуемого объекта, подбирают флуорофоры так, чтобы их интенсивность флуоресценции зависела от температуры и между ними осуществлялась эффективная передача энергии за счет Форстеровского резонанса, строят градуировочный график температур по отношению флуоресценции максимумов эмиссионных полос в исследуемой среде, используя необходимую концентрацию зондов в диапазоне 10-50°С, к объекту добавляют флуоресцентные зонды в необходимом количестве, проводят измерения интенсивностей флуоресценции максимумов эмиссионных полос и рассчитывают их отношения, при этом используют источник возбуждения с квазимонохроматическим спектром, по градуировочному графику определяют температуру объекта.