ДИМЕРНАЯ ОККЛЮДАНТНАЯ НАНОСТРУКТУРА, МЕЧЕННАЯ МОЛЕКУЛОЙ, АКТИВНОЙ В ОТНОШЕНИИ РАМАНОВСКОГО РАССЕЯНИЯ, ЛОКАЛИЗОВАННОЙ В МЕЖЧАСТИЧНОМ СОЕДИНЕНИИ, ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2015 года по МПК C12N15/11 B82B1/00 B82B3/00 C12Q1/68 

Область техники

Настоящее изобретение относится к окклюдантной димерной наночастице, меченной молекулой, активной в отношении рамановского рассеяния, в межчастичном соединении. Более конкретно, настоящее изобретение относится к димерной наноструктуре, содержащей две наночастицы с молекулой, активной в отношении рамановского рассеяния, локализованной в соединении между ними, в котором каждая наночастица состоит из золотого или серебряного ядра с олигонуклеотидами, прикрепленными к его поверхности, и золотой или серебряной оболочки, покрывающей ядро. Также настоящее изобретение относится к применению димерной наноструктуры и способу получения димерной наноструктуры.

Предшествующий уровень техники

Крайне чувствительное, точное детектирование единичных молекул из биологических и других образцов экстенсивно широко применяется во многих областях, включая медицинскую диагностику, патологию, токсикологию, взятие проб из окружающей среды, химический анализ и т.д.

Не так давно, в связи с этой целью, при исследовании метаболизма, распределения и связывания малых синтетических материалов и биомолекул в биолого-химической области широко применяли специфически меченые наночастицы или химические материалы. Как правило, применяли радиоактивные изотопы, органические флуоресцентные красители и квантовые точки.

Показательные примеры радиоактивных изотопов, обычно применяемых в исследовании, включают ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S и ¹²⁵I, которые соответственно применяют при замене ¹Н, ¹²C, ³¹P, ³²S и ¹²⁷I, которые широко распространены в организме. Радиоактивные изотопы долгое время применяли вследствие того, что радиоактивные и нерадиоактивные изотопы имеют почти одинаковые химические свойства и могут быть применены взаимозаменяемо, и вследствие того, что даже небольшое количество радиоактивных изотопов можно детектировать благодаря их относительно высокой энергии эмиссии. Однако с радиоактивными изотопами труднее работать вследствие того, что радиация, которую они излучают, приносит вред организму. Кроме того, хотя их энергия эмиссии высока, некоторые радиоактивные изотопы имеют короткий период полураспада, и их нельзя хранить в течение длительного периода времени, или они не пригодны для использования в длительных экспериментах.

В качестве альтернативы радиоактивным изотопам применяли органическое флуоресцентное вещество. Органическое флуоресцентное вещество поглощает энергию определенной длины волны и излучает свет при другой характерной длине волны. В частности, поскольку способы детектирования все больше упрощаются, радиоактивные вещества сталкиваются с пределами детектирования и, таким образом, требуют длительных периодов времени для детектирования. В противоположность этому органическая флуоресценция теоретически делает возможным детектирование даже единственной молекулы ввиду того, что она может излучать тысячи фотонов на молекулу при надлежащих условиях. Однако в отличие от радиоактивных изотопов, флуорофоры не могут заменять элементы активных лигандов напрямую. Вместо этого они узко предназначены быть связанными с составными группами, которые не оказывают эффекта на их активность, в свете взаимосвязи структуры и активности. Кроме того, флуоресцентные метки претерпевают со временем фотообесцвечивание. Другой проблемой, связанной с флуорофорами, является интерференция между различными флуорофорами вследствие того, что они повторно излучают широкий спектр длин световых волн, тогда как они возбуждаются крайне узким спектром длин волн. Более того, лишь небольшое число флуорофоров является доступным.

Квантовая точка является полупроводниковым наноматериалом, который составлен, как правило, из CdSe или CdS в качестве ядра и ZnS или ZnSe в качестве оболочки, и может излучать свет различных цветов в зависимости от размера частиц и вида материалов ядра. В сравнении с органическими флуоресцентными красителями квантовые точки могут возбуждаться более широким спектром длины волны возбуждения, излучать свет в более широком спектре длин волн и, таким образом, демонстрируют большее число различных цветов. Таким образом, квантовые точки привлекли большое внимание благодаря их преимуществу над органическими флуоресцентными красителями. Однако недостатком квантовых точек является высокая токсичность и трудности крупномасштабного производства. Кроме того, число доступных квантовых точек, несмотря на теоретическую вариабельность, на практике крайне ограничено.

Для преодоления этих проблем для мечения в последнее время применяли рамановскую спектрометрию и/или поверхностный плазмонный резонанс.

Поверхностно усиленное рамановское рассеяние (SERS) является спектроскопическим способом, который использует явление, в результате которого, когда молекулы абсорбируются на шероховатой поверхности металлической наноструктуры, такой как золотые или серебряные наночастицы, интенсивность рамановского рассеяния резко увеличивается до уровня 10⁶-10⁸ раз по сравнению с нормальными рамановскими сигналами. Когда свет проходит через прозрачную среду, молекулы или атомы среды рассеивают свет. В этом случае небольшая часть фотонов проходит неупругое рассеяние, известное как рамановское рассеяние. Например, часть падающих фотонов взаимодействует с молекулами таким образом, что высвобождается энергия, или электроны возбуждаются до более высоких энергетических уровней, так что рассеянные фотоны обладают частотой, отличной от той, что бывает у падающих фотонов. Вследствие того, что частоты спектра рамановского рассеяния обуславливают химические составы и структурные свойства абсорбирующих свет молекул в образце, рамановскую спектроскопию совместно с нанотехнологией, которая непрерывно развивается в настоящее время, можно дополнительно развивать в направлении высокочувствительного детектирования единичной молекулы. Кроме того, существует серьезное ожидание, что сенсор SERS можно использовать в значительной мере в качестве медицинского датчика. Эффект SERS взаимосвязан с плазмонным резонансом. В этом контексте металлические наночастицы демонстрируют очевидный оптический резонанс в ответ на падающее электромагнитное излучение вследствие коллективного связывания электронов проводимости в металле. Таким образом, наночастицы золота, серебра, меди и других конкретных металлов могут быть основой наноразмерной антенны для расширения локализации электромагнитных лучей. Молекулы, локализованные вблизи этих частиц, обнаруживают гораздо большую чувствительность к рамановской спектроскопии.

Таким образом, в дополнение к крайне чувствительному анализу ДНК, проводится много исследований, связанных с применением сенсоров SERS для детектирования биомаркеров, включающих гены и белки, в целях ранней диагностики различных заболеваний. Рамановская спектроскопия обладает различными преимуществами перед другими способами (инфракрасная спектроскопия). Тогда как инфракрасная спектроскопия может детектировать сильные сигналы от молекул, которые имеют дипольный момент, рамановская спектроскопия позволяет детектировать сигналы даже от неполярных молекул, в которых индуцированная поляризуемость снижена. Таким образом, почти все органические молекулы имеют свои собственные смещения частоты при рамановском рассеянии (см^-1). Кроме того, будучи свободной от интерференции молекул воды, рамановская спектроскопия пригодна для использования в детектировании биомолекул, включая белки, гены и т.д. Однако вследствие низкой интенсивности сигнала развитие рамановской спектроскопии еще не достигло уровня, при котором его можно было бы практически применять, несмотря на то, что исследования охватывают значительный период времени. После своего открытия поверхностно-усиленное рамановское рассеяние (SERS) постоянно развивалось до такого уровня, который позволяет детектировать сигналы на молекулярном уровне от рандомизированных скоплений наночастиц, абсорбировавших флуоресцентные красители (Science 1997, 275(5303), 1102; Phys rev lett 1997, 78(9), 1667). После этого сообщалось о многих исследованиях оптимизации SERS различными наноструктурами (наночастицы, нанооблочки, нанопровода). Для того чтобы применять SERS в качестве высокочувствительного способа детектирования для биодатчика, Mirkin et al. сообщали о высокочувствительном ДНК анализе с использованием ДНК-модифицированных золотых наночастиц, с пределом детектирования 20 fM (2002, science, 297, 1536). Однако не было почти никаких успехов в приготовлении SERS-активных субстратов из единичных молекул на основе индуцированной солью агрегации серебряных (Ag) наночастиц, несущих молекулы, активные в отношении рамановского рассеяния (например, Родамин 6G) после первого исследования. В одном отчете сообщали, что только одна часть (менее чем 1%) гетерогенно агрегированных коллоидов имеет SERS-активность единичной молекулы (J Phys Chem B 2002, 106(2), 311). Подобно этому, произвольно шероховатые поверхности обеспечивают множество интересных существенных данных, связанных с SERS, но эту стратегию принципиально невозможно воспроизвести, так как даже малое изменение морфологии поверхности ведет к значительному изменению усиления. Недавно Fang et al. сообщили о количественном измерении распределения центров усиления при SERS. Самые горячие SERS-активные центры (EF>10⁹) насчитывали только 63 центра из общего количества 1000000 центров, но составили 24% от общей интенсивности SERS (Science, 2008, 321, 388). В связи с этим объединение SERS-активных наночастиц в хорошо определенные и воспроизводимые горячие SERS наночастицы привело бы к высоконадежному, чувствительному анализу биомолекул и было бы очень полезным для применения в ксенодиагностике и методах визуализации in vivo.

Однако общепринятые способы детектирования для различных аналитов, как правило, используют коллоидные частицы металлов на субстратах и/или подложках, например, агрегированные наночастицы Ag. Это устройство часто способствует SERS-детектированию с чувствительностью, повышенной до порядка 10⁶-10⁸, но не может быть применено для детектирования единичных молекул малых аналитов, таких как нуклеотиды. Несмотря на достоинства SERS механизмы, стоящие за SERS, еще недостаточно поняты. Дополнительно, детектирование единичных молекул, основанное на SERS, обычно сталкивается со многими проблемами структурной воспроизводимости и надежности вследствие не только трудности в синтезе и контроле хорошо определенных наноструктур, но также и изменений увеличения выхода при длине волны и направлении поляризации излучения возбуждения, применяемого для измерения спектра. Такие проблемы остаются громадной помехой в применении SERS в попытке достичь развития и коммерциализации нанобиосенсоров. Чтобы решить вышеизложенные проблемы, сейчас, более чем когда-либо ранее, необходимы исследования оптических свойств и точные измерения SERS-усиления хорошо определенных наноструктур.

Исследования SERS-усиления, сообщенные Jeong, Proke, Schneider, и Lee, et. al., и с димером металлических частиц, поддерживают теоретические SERS-исследования по SERS-усилению, где SERS является результатом очень сильного электрического поля (т.е. горячая точка или интерстициальное поле), которое образуется, по меньшей мере, между двумя наночастицами. В соответствии с теоретическими вычислениями, основанными на электромагнитном принципе, в «горячей точке» ожидается усиление SERS в примерно 10¹² раз. В силу этого увеличенная чувствительность детектирования рамановского рассеяния, хотя, по-видимому, не являющаяся гомогенной внутри агрегатов коллоидных частиц, варьирует в зависимости от наличия «горячих точек». Однако информация о физической структуре «горячих точек», диапазоне расстояний от наночастиц, где достигается повышенная чувствительность, и увеличивающей чувствительность пространственной взаимосвязи между аналитами и агрегированными наночастицами еще нигде ранее не сообщалась. Кроме того, агрегированные наночастицы являются нестабильными в растворах, таким образом, оказывая противоположный эффект на воспроизводимость детектирования аналитов из единичных частиц.

Кроме того, хотя создавались теоретические имитационные модели и проводили экспериментальную проверку концепции димерных структур золота и серебра, о получении единичной молекулы, локализованной в соединении между наночастицами, еще не сообщалось. Синтез прочных SERS-активных наноструктур золота или серебра до сих пор остается нерешенной проблемой.

Ведущие к настоящему изобретению интенсивные и полные исследования развития наноструктур, способных к детектированию единичной ДНК с высокой чувствительностью и воспроизводимостью, проведенные авторами настоящего изобретения, имели результатом открытие того, что димерная окклюдантная наночастица, меченная молекулой, активной в отношении рамановского рассеяния, локализованной в межчастичном соединении, в котором расстояние между димерными наночастицами подогнано под желаемый диапазон посредством контроля толщины оболочки, показывает очень сильные сигналы поверхностно-усиленного рамановского рассеяния (SERS) с фактором усиления SERS (EF) до ~2,7×10¹², и, как доказано, является высоковоспроизводимой частицей - «горячей точкой».

Раскрытие сущности изобретения

Техническая проблема

Таким образом, предмет настоящего изобретения относится к димерной окклюдантной наноструктуре, в которой молекула, активная в отношении рамановского рассеяния, локализована в межчастичном соединении.

Другой предмет настоящего изобретения относится к способу конструирования димерной наноструктуры.

Дополнительно, предмет настоящего изобретения относится к способу детектирования аналита с применением димерной наноструктуры.

Еще один дополнительный предмет настоящего изобретения относится к набору для детектирования аналита, содержащему димерную наноструктуру.

Техническое решение

В соответствии с вышеизложенным аспектом, настоящее изобретение относится к димерной окклюдантной наноструктуре, меченной молекулой, активной в отношении рамановского рассеяния, локализованной в межчастичном соединении.

Более подробно, димерная окклюдантная наноструктура по настоящему изобретению содержит две наночастицы, каждая из которых состоит из ядра (золотого или серебряного) и оболочки (золотой или серебряной), покрывающей ядро, где олигонуклеотиды прикреплены к поверхности каждой наночастицы, и части олигонуклеотидов выходят на внешнюю сторону оболочки, при этом частицы соединены друг с другом посредством прямой или непрямой гибридизации между двумя олигонуклеотидами. В каждой наночастице олигонуклеотид прикреплен одним концом к поверхности ядра, и в то же время частично выходит на наружную сторону оболочки. Экспонированные олигонуклеотидные последовательности двух наночастиц могут быть гибридизированы непосредственно одна с другой, когда они комплементарны одна с другой, или косвенно через олигонуклеотидную последовательность, комплементарную обеим экспонированным олигонуклеотидным последовательностям.

Как его применяют в настоящем документе, термин "ядро" относится к металлической частице, к поверхности которой непосредственно прикреплен олигонуклеотид. Предпочтительно, применяют золотую или серебряную частицу. Термин "оболочка" относится к металлическому, покрывающему ядро слою. Часть олигонуклеотида, прикрепленного к ядру, находится внутри оболочки. Предпочтительно, оболочка изготовлена из золота или серебра.

Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения димерная окклюдантная наноструктура выбрана из группы, состоящей из i) димерной наноструктуры, состоящей из двух наночастиц, каждая из которых состоит из золотого ядра и серебряной оболочки, ii) димерной наноструктуры, состоящей из двух наночастиц, каждая из которых состоит из серебряного ядра и золотой оболочки, iii) димерной наноструктуры, состоящей из двух наночастиц, каждая из которых состоит из золотого ядра и золотой оболочки, и iv) димерной наноструктуры, состоящей из двух наночастиц, каждая из которых состоит из серебряного ядра и серебряной оболочки, и v) димерной наноструктуры, состоящей из двух наночастиц, одна из которых состоит из золотого ядра и серебряной оболочки, и другая частица состоит из серебряного ядра и золотой оболочки. Наиболее предпочтительно, димерная окклюдантная наноструктура по настоящему изобретению состоит из двух наночастиц, каждая из которых состоит из золотого ядра и серебряной оболочки.

Окклюдантная наноструктура по настоящему изобретению может быть в форме гомодимера или гетеродимера. Как он применяется в настоящем документе, термин "гомодимер" относится к димерной сруктуре, содержащей две наночастицы, идентичные по размеру и структуре друг другу, а термин "гетеродимер" относится к димерной структуре, содержащей две наночастицы, отличающиеся по размеру и структуре друг от друга.

Диаметр частицы ядра димерной окклюдантной наноструктуры для наномечения посредством поверхностно-усиленного рамановского рассеяния в соответствии с настоящим изобретением составляет предпочтительно порядка от 5 нм до 300 нм. Когда диаметр ядра менее чем 5 нм, получается эффект пониженного SERS-усиления. С другой стороны, диаметр ядра, превышающий 300 нм, накладывал бы много ограничений на биологическое применение наноструктуры. Более предпочтительно, размер диаметра ядра находится в диапазоне от 10 нм до 40 нм. Наночастицы могут быть приблизительно сферическими, но также могут иметь неправильную форму или какой-либо другой вид формы.

Нанооболочка наносится на поверхность частицы ядра. Будучи адаптированной к тому, чтобы обеспечивать поверхность частицы ядра эффектом усиленного рамановского рассеяния, нанооболочка облегчает спектроскопический анализ рамановского рассеяния. То есть частица ядра, покрытая нанооболочкой, увеличивает поверхность усиленного рамановского рассеяния, таким образом, гарантируя уравнивание сигналов от каких-либо химических веществ. Предпочтительно, оболочка имеет толщину от 1 нм до 300 нм и более предпочтительно от 1 нм до 20 нм. Кроме того, толщина оболочки может увеличиваться пропорционально диаметру ядра и длине используемой ДНК.

Ядро характеризуется присутствием там, по меньшей мере, одного функционального олигонуклеотида, прикрепленного к его поверхности. Например, ядро A может быть функционализировано защитной олигонуклеотидной последовательностью, модифицированной тиольной группой на 3'-конце и захватывающей мишень олигонуклеотидной последовательностью, модифицированной тиольной группой на 3'-конце. С другой стороны, ядро B может быть функционализировано двумя различными видами олигонуклеотидных последовательностей (защитная последовательность и захватывающая мишень последовательность - обе модифицированные тиольной группой на соответствующих 5'-концах). Кроме того, захватывающие мишень олигонуклеотиды, прикрепленные к ядру A или к ядру B, модифицированы молекулой, активной в отношении рамановского рассеяния. Альтернативно, олигонуклеотиды могут быть прикреплены к 5'-модифицированному концу ядра A в то время как ядро B функционализировано 3'-модифицированными олигонуклеотидами в соответствии с настоящим изобретением.

Как он применяется в настоящем документе, термин "защищитный олигонуклеотид" относится к олигонуклеотиду, который прикреплен к поверхности частицы ядра, стабилизируя частицу ядра с целью способствовать захватывающему мишень олигонуклеотиду прикрепляться должным образом к поверхности ядра и защищать его.

Как он применяется в настоящем документе, термин "захватывающий мишень олигонуклеотид" относится к олигонуклеотиду, имеющему последовательность, комплементарную последовательности таргетного олигонуклеотида. Оба соответствующих захватывающих мишень олигонуклеотида для ядра A и ядра B гибридизуются с общим таргетным олигонуклеотидом для образования димерной наноструктуры.

Как он применяется в настоящем документе, термин "таргетный олигонуклеотид" относится к олигонуклеотиду, который содержит последовательность, комплементарную обоим захватывающим мишень олигонуклеотидам для ядер A и B, и, таким образом, пригодную в качестве линкера, с которым эти два захватывающих мишень олигонуклеотида гибридизуются для образования димерной наноструктуры. Следует понимать, что "таргетный олигонуклеотид" не означает конечного таргетного аналита для анализа с использованием димерной наноструктуры.

Как защитный олигонуклеотид, так и захватывающий мишень олигонуклеотид можно модифицировать на их 3'- или 5'-концах поверхностно-связанной функциональной группой, которой они прикреплены к поверхности частицы ядра.

Как он применяется в настоящем документе, термин "поверхностно связанная функциональная группа" относится к соединению, которое связано с 3'- или 5'-концами каждого олигонуклеотида, и которая служит для прикрепления олигонуклеотида к частице ядра. Можно использовать без ограничений любую поверхностно-связанную функциональную группу при условии, что она способствует образованию такого малого агрегата наноструктур, что агрегат не осаждается. Поверхностно-связанную функциональную группу можно использовать для сшивания наноструктур, как описано ранее в данной области (Feldheim, The Electrochemical Society Interface, Fall, 2001, pp. 22-25). Соединение, имеющее поверхностно-связанную функциональную группу, пригодную в настоящем изобретении, содержит на его одном конце поверхностно-связанную функциональную группу, которая связана с поверхностью частицы ядра. Предпочтительно, поверхностно-связанная функциональная группа является серосодержащей группой, такой как тиольная или сульфгидрильная (HS). Таким образом, функциональная группа может быть соединением, представленным RSH, и являющимся производным спирта или фенола, в котором атом серы присутствует вместо атома кислорода. Альтернативно функциональная группа может быть группой тиолового сложного эфира или дитиолового сложного эфира, соответственно представленной как RSSR' и RSR', или аминогруппой (-NH2). Кроме того, соединение, имеющее поверхностно-связанную функциональную группу, можно связать с рядом реакционноспособных групп, например -NH₂,-COOH, -CHO, -NCO, и эпоксидной группой, которая может реагировать с биомолекулами, такими как ДНК-зонды, антитела, олигонуклеозиды и аминокислоты. Эти реакционноспособные группы хорошо известны в данной области, и их можно применять к способу и аппаратуре по настоящему изобретению.

С другой стороны, олигонуклеотид может содержать спейсерную область на конце, противоположном линкерному соединению. Спейсерная область не только предохраняет оболочку, покрывающую ядро, от перекрывания таргетной распознающей последовательности захватывающего мишень олигонуклеотида, но также обеспечивает пространство для подходящей толщины оболочки. Примером спейсерной области является A10-PEG.

Как он применяется в настоящем документе, термин "молекула, активная в отношении рамановского рассеяния", относится к молекуле, которая облегчает детектирование и измерение аналита посредством рамановского детектора, когда димерная наноструктура по настоящему изобретению применяется к одному или нескольким аналитам. Захватывающий мишень олигонуклеотид либо на ядре A, либо на ядре B модифицирован молекулой, активной в отношении рамановского рассеяния. Молекула, активная в отношении рамановского рассеяния, создает специфический рамановский спектр и обладает преимуществом способствовать эффективному анализу последующих биомолекул.

В качестве молекул, активных в отношении рамановского рассеяния, пригодных в рамановской спектроскопии, можно применять органические или неорганические молекулы, атомы, комплексы или синтетические молекулы, красители, натуральные красители (фикоэритрин и т.д.), органические наноструктуры, такие как С₆₀, бакиболы, углеродные нанотрубки, квантовые точки и органические флуоресцентные молекулы. Конкретные примеры молекул, активных в отношении рамановского рассеяния, включают FAM, Dabcyl, TRITC (тетраметил родамин-5-изотиоцианат), MGITC (малахитовый зеленый изотиоцианат), XRITC (X-родамин-5-изотиоцианат), DTDC (3,3-диэтилтиадикарбоцианин иодид), TRIT (тетраметил родамин изотиол), NBD (7-нитробенз-2-1,3-диазол), фталевую кислоту, терефталевую кислоту, изофталевую кислоту, пара-аминобензойную кислоту, эритрозин, биотин, дигоксигенин, 5-карбокси-4',5'-дихлор-2',7'-диметокси, флуоресцеин, 5-карбокси-2',4',5',7'-тетрахлорфлуоресцеин, 5-карбоксифлуоресцеин, 5-карбоксиродамин, 6-карбоксиродамин, 6-карбокситетраметил аминофталоцианин, азометин, цианин (Cy3, Cy3,5, Cy5), ксантин, сукцинилфлуоресцеин, аминоакридин, квантовые точки, аллотропы углерода, цианиды, тиол, хлор, бром, метил, фосфор и серу, но не ограниченные этим. Для применения в димерной наноструктуре по настоящему изобретению от молекулы, активной в отношении рамановского рассеяния, требуется продемонстрировать отчетливый спектр рамановского рассеяния, и она должна быть связана различными видами аналитов или иметь сродство с ним. Предпочтительными являются флуоресцентные красители цианинового типа, такие как Cy3, Cy3,5 и Cy5, или органические флуоресцентные молекулы, такие как FAM, Dabcyl, молекулы родамина и т.д. Эти органические флуоресцентные молекулы обладают преимуществом детектирования более высоких рамановских сигналов, резонируя под действием возбуждения лазерных длин волн, пригодных для рамановского анализа. Молекулы, активные в отношении рамановского рассеяния, могут быть прикреплены к аналитам прямо или через линкерное соединение.

В соответствии с аспектом настоящего изобретения, выявлено, что наноструктура может детектировать SERS сигналы, только когда молекула, активная в отношении рамановского рассеяния, локализована на междучастичном стыке. Например, никакие SERS сигналы не могли быть детектированы для окклюдантных мономеров вследствие того, что они не обладали горячими точками, и присутствовала только одна молекула, активная в отношении рамановского рассеяния (фиг.3A-1, 2).

По другому аспекту, настоящее изобретение относится к способу конструирования димерной окклюдантной наноструктуры, меченной молекулой, активной в отношении рамановского рассеяния.

Более подробно, способ конструирования димерной окклюдантной наноструктуры, меченной молекулой, активной в отношении рамановского рассеяния, включает: 1) синтезирование ядра A и ядра B, соответственно, причем ядро A имеет защитный олигонуклеотид и захватывающий мишень олигонуклеотид, которые связаны с его поверхностью, а ядро B имеет защитный олигонуклеотид и захватывающий мишень олигонуклеотид, модифицированные на одном конце молекулой, активной в отношении рамановского рассеяния, которая связана с его поверхностью, 2) гибридизование ядра A и ядра B с таргетным олигонуклеотидом для образования димерной структуры, и 3) нанесение оболочки на ядро A и ядро B.

На первом этапе синтезируют ядро A и ядро B, каждое из которых обладает защитным олигонуклеотидом и захватывающим мишень олигонуклеотидом, связанными с их поверхностью. При синтезе частиц ядра по варианту осуществления настоящего изобретения золотое ядро A функционализировано двумя типами последовательностей ДНК, модифицированных тиольной группой на 3'-концах (защитная олигонуклеотидная последовательность и захватывающая мишень олигонуклеотидная последовательность). Аналогично, золотое ядро B функционализировано двумя типами ДНК-последовательностей, модифицированных тиольной группой на 5'-концах. Молярные отношения этих двух типов последовательностей (защитная последовательность/захватывающая мишень последовательность) составляют 99:1 для ядра A и 199:1 для ядра B. Эти соотношения были приняты такими, чтобы модифицировать один захватывающий мишень олигонуклеотид на зонд с учетом емкости загрузки по ДНК, зависящей от размера наночастиц (фиг.1A). Важно отметить, что Cy3, FAM или краситель Dabcyl, активные в отношении рамановского рассеяния, предварительно конъюгируют с захватывающим мишень олигонуклеотидом, связанным с ядром B.

Чтобы удалить мономер наночастицы, с которым не связаны захватывающие мишень последовательности, ядра, модифицированные олигонуклеотидами, можно очищать посредством процесса магнитного разделения. Тозил-модифицированные магнитные частицы (диаметр 1 мкм, Invitrogen) можно функционализировать аминомодифицированными таргетными олигонуклеотидными последовательностями, комплементарными к захватывающим мишень последовательностям для ядер A и B, соответственно. Только частицы ядра, имеющие захватывающие мишень последовательности, связанные с ними, образуют комплексы с магнитными частицами посредством гибридизации. После реакции гибридизации к реакционному раствору применяется наружное магнитное поле для разделения комплексов ядер и магнитных частиц. Ядра освобождаются от магнитных частиц посредством нагревания комплексов до температуры выше температуры плавления (Tm) гибридизированных двухцепочечных ДНК последовательностей.

На втором этапе ядрам A и B дают возможность образовывать димер посредством гибридизации с таргетной олигонуклеотидной последовательностью. На первом этапе частицы ядра A и B, разделенные и изолированные от магнитных частиц в буфере, например, 0,3M PBS, гибридизуются с достаточным количеством таргетной олигонуклеотидной последовательности для образования желаемой димерной наноструктуры. Таким образом, способ по настоящему изобретению дает возможность производить димер с высоким выходом продукта (70-80%).

На третьем этапе нанесение нанооболочки на частицы ядра можно предпочтительно проводить посредством реакции предшественника золотой частицы ядра с предшественником серебряной наночастицы при 10-100°C в растворителе. Предпочтительно, предшественник серебряной наночастицы выбран из AgNO₃ и AgClO₄. Любое соединение можно использовать в качестве предшественника золотых частиц ядра при условии, что оно содержит ионы Au. Предпочтительным является HAuCl₄. Серебряные ионы или золотые ионы можно превратить в золотые или серебряные наночастицы посредством восстановителя. Примеры восстановителя, пригодного в настоящем изобретении, включают гидрохинон, борогидрид натрия (NaBH₄) и аскорбат натрия, но не ограничены ими. Растворитель, пригодный для использования в образовании нанооболочки, является предпочтительно водным раствором (чистая вода или фосфатный буфер). Дополнительно, можно использовать стабилизатор для точного контроля толщины нанооболочки. Реакция при температуре менее чем 10°C занимает слишком много времени на образование серебряных наночастиц. С другой стороны, когда температура реакции превышает 100°C, образуются искривленные серебряные наночастицы. Таким образом, предшественники предпочтительно реагируют в пределах данного диапазона температур. Реакцию можно проводить в течение от 10 до 24 часов в зависимости от температуры реакции.

Димерная окклюдантная наноструктура, меченная молекулой, активной в отношении рамановского рассеяния, в межчастичном соединении, в соответствии с настоящим изобретением является функционализированной на ее поверхности или поверхности ядра молекулой зонда, способного распознавать аналит, так что она может быть применена для детектирования различных биомолекул.

Примерами аналитов являются аминокислоты, пептиды, полипептиды, белки, гликопротеины, липопротеины, нуклеозиды, нуклеотиды, олигонуклеотиды, нуклеиновые кислоты, сахариды, углеводы, олигосахариды, полисахариды, жирные кислоты, липиды, гормоны, метаболиты, цитокины, хемокины, рецепторы, нейромедиаторы, антигены, аллергены, антитела, субстраты, кофакторы, ингибиторы, лекарственные средства, фармацевтические вещества, нутриенты, прионы, токсины, токсические вещества, взрывчатые вещества, пестициды, вещества для химического оружия, биологические вредновоздействующие вещества, радиоактивные изотопы, витамины, гетероциклические ароматические соединения, онкогенные средства, мутагенные факторы, анестетики, амфетамин, барбитурат, галлюциногены, отходы и примеси. Когда аналитами являются нуклеиновые кислоты, они включают гены, вирусную РНК и ДНК, бактериальную ДНК, грибную ДНК, ДНК млекопитающих, кДНК, мРНК, РНК и фрагменты ДНК, олигонуклеотиды, синтетические олигонуклеотиды, модифицированные олигонуклеотиды, одно- и двухцепочечные нуклеиновые кислоты и природные или синтетические нуклеиновые кислоты.

Неограничивающие примеры распознающих аналиты молекул-зондов, связанных с поверхностью димерной наноструктуры, включают антитела, фрагменты антител, антитела, созданные методами генной инженерии, одноцепочечные антитела, белки рецепторов, белки лигандов, ферменты, ингибиторные белки, лектины, белки клеточной адгезии, олигонуклеотиды, полинуклеотиды, нуклеиновые кислоты и аптамеры.

Полную димерную наноструктуру по настоящему изобретению можно покрывать неорганическим веществом. После полного покрытия неорганическим веществом димерная наноструктура по настоящему изобретению может выдерживать более значительные воздействия структурной деформации. Таким образом, полное неорганическое покрытие стабилизирует димерную наноструктуру и является преимущественным для хранения и применения димерной наноструктуры. Можно использовать любое неорганическое вещество при условии, что оно не оказывает влияния на сигналы рамановского рассеяния. Предпочтительным неорганическим веществом является диоксид кремния.

По дополнительному аспекту, настоящее изобретение относится к способу детектирования аналита с применением димерной наноструктуры по настоящему изобретению.

Более подробно, способ включает 1) синтезирование димерной наноструктуры по настоящему изобретению; 2) функционализирование поверхности димерной наноструктуры или ядра молекулой-зондом, способной детектировать аналит; 3) воздействие на димерную наноструктуру образца, содержащего, по меньшей мере, один аналит; и 4) детектирование и идентификацию аналита посредством лазерного возбуждения и рамановской спектроскопии.

Предпочтительно, аналиты детектируются и идентифицируются с применением любой хорошо известной рамановской спектроскопии. Примеры рамановской спектроскопии, пригодной в настоящем изобретении, включают SERS (поверхностно-усиленная рамановская спектроскопия), SERRS (резонансная поверхностно-усиленная рамановская спектроскопия), гиперрамановская и/или CARS (когерентная антистоксовая рамановская спектроскопия).

Термин "поверхностно-усиленная рамановская спектроскопия" (SERS) относится к спектроскопическому способу, который использует явление, при котором, когда молекулы адсорбированы на шероховатой поверхности металлической наноструктуры, такой как золотые или серебряные наночастицы, или присутствуют в пределах расстояния в сотни нанометров от поверхности, интенсивность рамановского рассеяния существенно увеличивается до уровня 10⁶-10⁸ раз по сравнению с нормальными сигналами рамановского рассеяния. Термин "резонансная поверхностно-усиленная рамановская спектроскопия" (SERRS) относится к комбинации SERS и резонансной рамановской спектроскопии, которая использует пространственную близость к поверхности для усиления рамановской интенсивности, и длины волны возбуждения, подходящей для максимальной поглощающей способности анализируемой молекулы. Термин "когерентная антистоксовая рамановская спекроскопия" (CARS) относится к спектроскопическому способу, в котором два лазерных луча - переменный и фиксированный, падают на рамановскую активную среду, генерируя когерентный антистоксовый частотный луч.

В варианте осуществления способ детектирования аналитов в соответствии с настоящим изобретением включает 1) синтезирование димерной наноструктуры по настоящему изобретению; 2) функционализирование поверхности димерной наноструктуры или ядра молекулой зонда, комплементарного детектируемому аналиту нуклеиновой кислоты; 3) изолирование, очистка и амплифицирование аналита нуклеиновой кислоты из образца; 4) гибридизацию димерной окклюдантной наноструктуры со специфической последовательностью амплифицированных нуклеиновых кислот; и 5) детектирование и идентификацию аналита нуклеиновой кислоты, комбинированной с димерной наноструктурой, с применением рамановской спектроскопии. Если он модифицирован подходящим образом для условий аналита, этот способ можно применять при детектировании, по меньшей мере, одного однонуклеотидного полиморфизма (SNP) или других генетических мутаций в образце и дополнительно применять при секвенировании ДНК.

В варианте осуществления, применяемом на практике, субстрат, активный в отношении рамановского рассеяния, можно функционально связать с, по меньшей мере, одним устройством детекции рамановского рассеяния. Способы, основанные на рамановской спектроскопии, детектирующие аналиты, хорошо известны в данной области (например, патенты США № 6002471, 6040191, 6149868, 6174677 и 6313914). При SERS и SERRS интенсивность рамановского рассеяния от молекул, адсорбированных на шероховатой металлической поверхности, такой как серебро, золото, платина, медь или алюминий, усиливается в 10⁶ раз или выше по сравнению с нормальными сигналами рамановского рассеяния.

Неограничивающие примеры устройств детектирования рамановского рассеяния описаны в патенте США № 6002471. Возбуждающее излучение получают или посредством Nd:YAG лазера при длине волны 532 нм или Ti:сапфирового лазера при длине волны 365 нм. Можно применять как импульсные лазерные лучи, так и непрерывные лучи. Сигнал светового возбуждения проходит через конфокальную оптическую систему 6 и объектив микроскопа и фокусируется на субстрате, активном в отношении рамановского рассеяния, содержащем, по меньшей мере, один аналит. Рамановское излучение, испускаемое аналитом, собирается посредством объектива микроскопа и конфокальной оптической системы, и соединяется с монохроматором для спектрального расщепления. Конфокальное оптическое устройство включает комбинацию дихроичных фильтров, барьерных фильтров, конфокальных точечных отверстий, линз объектива и зеркал и служит для уменьшения фонового сигнала. Можно использовать стандартную оптику полного поля, а также конфокальную оптику. Сигналы рамановского излучения детектируются посредством детекторной системы, которая включает лавинный фотодиод, связанный с компьютером для расчета цифрового кодирования сигналов.

Другой пример устройства детекции можно найти в патенте США № 5306403, в котором SERS-измерения можно проводить посредством спектрометра Spex Model 1403 с двумя дифракционными решетками, оснащенного фотоэлектронным умножителем на арсениде галлия (RCA, Model C31034 или Burle Industries Model C3103402), который эксплуатируют в однофотонном режиме работы с расчетом выключки строк. Лазерный генератор является 514,5 нм линейным аргон-ионным лазером (SpectraPhysics, Model 166) и 647,1 нм линейным криптон-ионным лазером (Innova 70, Coherent).

Другие лазеры, доступные для возбуждения, включают азотный лазер (Laser Science Inc.) при 337 нм и гелиево-кадмиевый лазер (Liconox) при 325 нм (патент США № 6174677), фотодиоды, Nd:YLF лазер и/или различные ионные лазеры и/или лазеры на красителе. Лучи спектрально очищают полосно-пропускающим фильтром (Corion) и коллимируют перед фокусированием на субстрат, активный в отношении рамановского рассеяния, с помощью 6X линзы объектива (Newport, Model L6X). Кроме того, линзу объектива применяют как для возбуждения аналита, так и для собирания сигналов рамановского рассеяния. Эта геометрия возбуждения/собирания с торцевым входом стала возможной благодаря использованию голографической светоделительной призмы (Kaiser Optical Systems, Inc., Model HB 647-26N18). Голографический узкополосный режекторный фильтр (Kaiser Optical Systems, Inc., HNPF-647-1,0) можно поместить в луч SERS-сигнала для дальнейшего отклонения рэлеевского рассеянного излучения. Другим детектором рамановского излучения является спектрограф (ISA, ЧАС-320), оснащенный системой детекции на основе усиленного по красному спектру интенсифицированного прибора с зарядовой связью (RE-ICCD) (Princeton Instruments). Можно использовать другие детекторы, такие как Фурье-спектрометр (основанный на интерферометре Майкельсона), прибор с инжекцией заряда (CID), фотодиодные матрицы, InCaAs детекторы, электронно-множительный CCD, высокочувствительный CCD и/или фототранзисторные установки.

Для детектирования аналитов можно использовать любую хорошо известную подходящую форму или модификацию рамановской спектроскопии или связанной с ней спектрометрии. В качестве неограничивающих примеров рамановская спектроскопия включает нормальное рамановское рассеяние, резонансное рамановское рассеяние, поверхностно-усиленное рамановское рассеяние, поверхностно-усиленное резонансное рамановское рассеяние, когерентную антистоксовую рамановскую спектроскопию, стимулированную рамановскую спектроскопию, инверсную рамановскую спектроскопию, спектроскопию комбинационного усиления, гиперкомбинационное рассеяние, молекулярно-оптический лазерный щуп (MOLE), рамановское микрозондирование, рамановскую микроскопию, конфокальный рамановский микроспектрометр, 3-D или сканирующую рамановскую спектроскопию, рамановскую спектроскопию насыщения, резонансное рамановское рассеяние с временной разрешающей способностью, рамановскую диссоциационную спектроскопию и рамановскую спектроскопию с УФ-возбуждением.

По варианту осуществления настоящего изобретения прибор для детектирования рамановского рассеяния может содержать компьютер. На компьютер, используемый в настоящем изобретении, не накладывается никаких ограничений. Показательный компьютер может содержать канал для обмена информацией и процессор для обработки информации. Компьютер может дополнительно содержать RAM или другое динамическое запоминающее устройство, ROM или другое статическое запоминающее устройство и устройство для хранения данных, такое как магнитный диск или оптический диск, вместе с соответствующим драйвером. Также компьютер может содержать периферические устройства, такие как дисплей (например, электронно-лучевая трубка или жидко-кристаллический дисплей), алфавитное устройство ввода данных (например, клавиатура), координатно-указательное устройство (например, мышь, трекбол, или клавиша управления курсором) и устройство связи (например, модем, сетевая интерфейсная карта или локальная компьютерная сеть Ethernet, кольцевая сеть с маркерным доступом или другие устройства, взаимодействующие с сетью).

В варианте осуществления настоящего изобретения прибор для детекции рамановского рассеяния можно оперативно связать с компьютером. Данные от детектирующего прибора можно обрабатывать процессором и хранить в главном устройстве памяти. Данные по профилям эмиссии для стандартных аналитов могут быть сохранены в главном устройстве памяти или ROM. Процессор может идентифицировать аналит в образце посредством сравнения спектров испускания аналита в рамановском активном субстрате. Процессор может анализировать данные от детектирующего прибора для идентификации и количественного определения различных аналитов. Компьютеры, настроенные различным образом, можно использовать для различных целей. Таким образом, структура системы рамановской спектроскопии может различаться от одного варианта осуществления к другому. После сбора данные, как правило, переводят в устройство, где данные анализируют. Для анализа данных, данные от детектора обрабатываются цифровым компьютером, как описано выше. Как правило, компьютер запрограммирован, чтобы получать и хранить данные от детектора, а также анализировать и обрабатывать данные.

В соответствии с еще одним дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к набору для детектирования аналита, содержащего димерную наноструктуру по настоящему изобретению.

Например, когда детектируемым аналитом является нуклеиновая кислота, набор может содержать ингредиенты, необходимые для ПЦР-РВ для амплификации нуклеиновой кислоты, содержащейся в образце. Набор для ПЦР-РВ может дополнительно содержать пару праймеров, специфичных для аналита нуклеиновой кислоты, тестовую пробирку или другой подходящий контейнер, рабочий буферный раствор (различные значения pH и концентрации Mg), дезоксинуклеотиды (dNTPs), ферменты, такие как Taq-полимераза и обратная транскриптаза, ингибиторы ДНКазы и РНКазы, DEPC-воду и стерилизованную воду. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения набор для детектирования может быть предназначен для осуществления функции ДНК-чипа. Набор ДНК-чипа может содержать субстрат, на котором располагаются гены или кДНК, соответствующие фрагментам генов, и реагенты, составы и ферменты для конструирования флуоресцентных зондов. Также субстрат может дополнительно содержать контрольный ген или кДНК, соответствующие фрагменту гена.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения, когда детектируемый аналит является белком, набор может предназначаться для иммунологического детектирования антитела и может содержать субстрат, соответствующий буферный раствор, вторичное антитело, конъюгированное с димерной наноструктурой по настоящему изобретению, и краситель. Субстрат можно подвергать обработке на нитроцеллюлозной мембране, 96-луночном планшете, изготовленном из поливинилового полимера, 96-луночном планшете, изготовленном из полистиролового полимера или предметном стекле.

В действительности, набор для детектирования содержит распространенные инструменты и средства, хорошо известные в данной области. В качестве неограничивающих примеров инструменты/средства включают носитель, вещество для мечения, способное производить детектируемый сигнал, растворяющее средство, моющее средство, буферный раствор и стабилизатор. В случае когда вещество для мечения является ферментом, набор может содержать субстрат для измерения активности ферментов и ограничитель реакции. В качестве неограничивающих примеров носители включают растворимые носители, например хорошо известные физиологически приемлемый буфер, например PBS, нерастворимые носители, например полистирол, полиэтилен, полипропилен, сложный полиэфир, полиакрилонитрил, фторсодержащий полимер, поперечно-сшитый декстран, полисахариды, полимеры, такие как магнитные бусины, в которых латекс покрывают металлом, бумагу, стекло, агарозу или их сочетания.

Для образования комплексов антиген-антитело могут быть применены хорошо известные способы. В качестве неограничивающих примеров способы включают гистохимическое окрашивание, RIA, ELISA, Вестерн-блоттинг, иммунопреципитационный анализ, иммунодиффузионный анализ, анализ связывания комплемента, FACS и белковый чип.

Полезные эффекты

Так как молекула, активная в отношении рамановского рассеяния, локализована в межчастичном соединении, и расстояние между молекулой, активной в отношении рамановского рассеяния, и частицей наноядра точно определяется толщиной серебряной или золотой оболочки, димерная окклюдантная наноструктура по настоящему изобретению способствует получению сильных сигналов поверхносто-усиленного рамановского рассеяния (SERS). Кроме того, несмотря на локализацию только одной молекулы, активной в отношении рамановского рассеяния, сильные рамановские сигналы можно детектировать с использованием димерной окклюдантной наноструктуры. Кроме того, способ конструирования димерной окклюдантной наноструктуры гарантирует производство димера высокой чистоты. В частности, наноструктуру можно сконструировать с высокой степенью чистоты посредством стехиометрического контроля олигонуклеотидов для ядер А и В и посредством использования магнитных частиц при очистке ядер А и В. Кроме того, зазор между двумя наночастицами можно регулировать на наноуровне. Будучи спроектированной для амплификации рамановских сигналов в большой степени, окклюдантная наноструктура по настоящему изобретению находит применение в различных областях, включая детектирование аналитов, таких как ДНК и белки (биомаркеры), связанные с возникновением и прогрессированием специфических заболеваний, анализом крупномасштабных геномных последовательностей, детектированием однонуклеотидного полиморфизма (SNP), секвенированием оснований, генным фингерпринтингом, взаимосвязью между заболеваниями и разработкой лекарственных средств.

Описание рисунков

Фиг.1A и 1B являются схематическими диаграммами, представляющими синтез димеров Au-наночастицы, проходящих через магнитную очистку, ДНК гибридизацию и образование Ag-оболочки. Защитной последовательностью для зонда A является 3'-HS-(CH₂)₃-A ₁₀ -PEG ₁₈-AAACTCTTTGCGCAC-5', захватывающей мишень последовательностью для зонда A является 3'-HS-(CH₂)₃-A ₁₀ -PEG ₁₈-CTCCCTAATAACAAT-5', и модифицированной последовательностью для MMP-A является 3'-NH₂-(CH₂)₃-A ₁₀ -PEG ₁₈-ATTGTTATTAGGGAG-5' (Tm=38°С). Защитной последовательностью для зонда B является 5'-HS-(CH₂)6-A₁₀-PEG₁₈-AAACTCTTTGCGCAC-3', захватывающая мишень последовательность для зонда B представлена формулой 5'-HS-(CH₂)₃-A ₁₀ -PEG ₁₈- ATCCTTATCAATATTAAA-Cy3-3' и модифицированная последовательность для MMP-B представлена формулой 5'-NH₂-(CH₂)₃-A ₁₀ -PEG ₁₈-TTTAATATTGATAAGGAT-3' (Tm=40°C). Подчеркнутые части представляют спейсерные области, сконструированные так, чтобы облегчить образование Ag-оболочки. Последовательность таргетной ДНК представлена 5'-GAGGGATTATTGTTAAATATTGATAAGGAT-3' (олигонуклеотид сибирской язвы).

На фиг.1C представлена коррелированная с AFM наладка рамановской спектроскопии (лазерный фокальный диаметр 250 нм) для идентификации горячей точки SERS из единичной димерной наноструктуры.

На фиг.2A представлен спектр излучения в УФ- и видимой области до и после образования димера Au-наночастицы и соответствующие TEM и HR-TEM изображения. На фиг.2B представлен спектр излучения в видимой и УФ-области до и после нанесения Ag-оболочки на димер Au-наночастицы и соответствующие TEM и HR-TEM изображения. На фиг.2C представлен плазмонный резонанс (пик при ~400 нм) наноструктуры, которая варьирует в зависимости от толщины серебряной оболочки. Они соответствуют HR-TEM изображениям Au-Ag окклюдантного димера. HR-TEM изображения C.1a и C.1b окклюдантной наноструктуры представляют Au-Ag окклюдантные мономеры с толщиной оболочки 5 нм и 10 нм соответственно. C.2, C.3 и C.4 являются соответственно Au-Ag окклюдантными гетеродимерами с толщиной оболочки ~3 нм, ~5 нм и ~10 нм.

На фиг.3A представлен AFM (атомный силовой микрограф, 1×1 мкм) Au-Ag окклюдантного мономера и гетеродимера. На фиг.3B представлены коррелированные SERS-спектры, взятые от мономерных или димерных Au-Ag окклюдантных наноструктур. На фиг.3C представлены все спектры, полученные 514,5 нм возбуждающим лазером, накопление 1 сек, образец 100 мкВт и фокальный диаметр лазера 250. Спектры рамановского рассеяния получены от Cy3-модифицированных олигонуклеотидов (красная линия) и Cy3-свободных олигонуклеотидов (черная линия) в NaCl-агрегированных серебряных коллоидах.

На фиг.4 представлены SERS сигналы от индивидуальных проанализированных Au-Ag окклюдантных димеров, которые соответствуют единичной молекуле активного Cy3.

На фиг.4A представлены AFM изображения в полуконтактном режиме (5×5 мкм) Au-Ag окклюдантного димера (соответствующего наноструктуре с толщиной Ag-оболочки ~5 нм и пропуску ~1 нм на фиг.2B-2). На фиг.4B представлены SERS-спектры Cy3 от индивидуальной димерной наноструктуры с длиной волны лазера 514,5 нм, мощностью лазера ~80 мкВт, лазерным фокальным диаметром ~250 нм и продолжительностью интегрирования 1 сек.

На фиг.5A и 5B представлены мерцающие SERS-спектры, полученные от наноструктуры с временем аккумуляции 1 сек. На фиг.5C представлен SERS-спектр, полученный от Au-Ag окклюдантных гетеродимеров с различной поляризацией падающего лазерного луча. На фиг.5D представлены полярные диаграммы интегрированных SERS-интенсивностей рамановских полос 1470 и 1580 см^-1 в зависимости от ?. Их измеряли лазером с длиной волны 514,5 нм, мощностью лазера ~40 мкВт, фокальным диаметром лазера ~250 нм и временем интеграции 20 сек.

На фиг.6 представлены SERS-спектры от димерных наноструктур, модифицированных олигонуклеотидами, меченными FAM и Dabcyl. На фиг.6A представлены спектры рамановского рассеяния от FAM-меченых олигонуклеотидов (1 нМ) и Dabcyl-меченых олигонуклеотидов (1 нМ) в растворах. На фиг.6B представлены спектры рамановского рассеяния от димерных Au-Ag окклюдантных наноструктур, меченных FAM (Ag-оболочка 5 нм) и Dabcyl (Ag оболочка, 5 нм).

Лучшее понимание настоящего изобретения можно получить с помощью следующих примеров, которые описаны для иллюстрации, но не в качестве ограничивающих примеров настоящего изобретения.

Варианты реализации изобретения

Вышеизложенные и другие объекты, свойства и другие преимущества настоящего изобретения будут более понятны из следующих примеров, но следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено следующими примерами ни в коей мере.

ПРИМЕР 1: Получение димерной Au-Ag окклюдантной наноструктуры, меченной молекулой, активной в отношении рамановского рассеяния (Cy3), локализованной в межчастичном соединении

Основанный на ДНК-направленном мостиковом способе синтез рамановского Au-Ag окклюдантного димера проводили с использованием таргетных Au-наночастиц, связанных с олигонуклеотидами с Ag оболочкой, образованной из контролируемого количества Ag предшественника (фиг.1).

Во-первых, высокоочищенные гетеродимеры Au-наночастиц получены путем точного контроля молярного отношения между защищающим олигонуклеотидом и захватывающим мишень олигонуклеотидом с последующей эффективной очисткой. Вследствие того, что максимальное расстояние (расстояние зазора) между поверхностью Au-наночастицы (AuNP) и Cy3 молекулы еще оставалось равным 7,5 нм, его необходимо было уменьшить, чтобы обеспечить увеличенное электромагнитное усиление. Серебряную нанооболочку наносили, потому что серебро усиливает SERS сигналы в несколько раз больше, чем золото.

Подробно, ДНК, связанную с димерами наночастиц, покрывали серебром посредством хорошо известного процесса осаждения серебряной оболочки в наномасштабе (Chem. Comm. 2008, J. Phys. Chem. B 2004, 108, 5882-5888) на поверхности Au-наночастицы, чтобы сократить расстояние между наночастицами, что ведет к усилению SERS-сигналов. В отношении этого 250 мкм раствор димера Au-наночастиц реагировал с различными количествами раствора AgNO₃ [10^-3M] при комнатной температуре в течение 3 часов в присутствии 100 мкл поливинилпирролидона в качестве стабилизатора и 50 мкл L-аскорбата натрия [10^-1M] в качестве восстановителя в 0,3 M растворе PBS. Толщина Ag оболочки Au-Ag окклюдантных наночастиц составляла ~3 нм, ~5 нм и ~10 нм при использовании 30 мкл, 40 мкл, и 70 мкл раствора AgNO₃ [10^-3M], соответственно. Таким образом, синтезировали таргетные, связанные с олигонуклеотидом Au-Ag окклюдантные гетеродимерные наноструктуры с толщиной оболочки ~3 нм, ~5 нм и ~10 нм.

Золотую наночастицу (15 нм) для зонда A функционализировали двумя видами 3'-тиол-модифицированных олигонуклеотидов таким образом, что одну захватывающую мишень последовательность прикрепляли к поверхности золотой наночастицы. Кроме того, золотую наночастицу (30 нм) для зонда B функционализировали двумя видами 5'-тиол-модифицированных олигонуклеотидов. Молярные отношения этих двух видов последовательностей (защитная последовательность/захватывающая мишень последовательность) были 99:1 для ядра A и 199:1 для ядра B. Эти отношения были приняты для модификации одного захватывающего мишень олигонуклеотида на зонд на основе емкости ДНК, зависящей от размера наночастиц (фиг.1). Важно отметить, что захватывающую мишень последовательность для зонда B помечали на конце посредством Cy3, который служил рамановской меткой. Чтобы устранить мономер наночастицы, к которому не прикреплены никакие захватывающие мишень последовательности, олигонуклеотид-модифицированные зонды A и B очищали посредством процесса магнитного разделения. Тозил-модифицированные магнитные частицы (диаметр 1 мкм, Invitrogen) функционализировали посредством амин-модифицированных таргетных олигонуклеотидных последовательностей, комплементарных к захватывающим мишень последовательностям для ядер A и B соответственно. Только частицы ядер, имеющие захватывающие мишень последовательности, связанные с ними, могли бы быть разделены магнитными частицами. Кроме того, очищенные растворы зондов A и B гибридизовали достаточным количеством таргетной последовательности в 0,3 M PBS.

Кроме того, получали олигонуклеотид-модифицированные димеры Au-Ag окклюдантных наночастиц, меченные молекулой, активной в отношении рамановского рассеяния, FAM или Dabcyl.

ПРИМЕР 2: Спектроскопия в УФ- и видимой области и HR-TEM анализ изображений

Образование димеров Au-наночастиц (в качестве молекулы, активной в отношении рамановского рассеяния, использовали Cy3) верифицировали посредством спектроскопии в УФ- и видимой области и изображений трансмиссионного электронного микроскопа высокого разрешения (HRTEM) (фиг.2). УФ- и видимый спектры демонстрируют очень малое красное смещение после образования димера, что согласуется с ранее сообщенными результатами Oaul Alivisatos, et al. (Angew chem. 1999,38(12), 1808). Фиг.2A представляет стандартные HR-TEM изображения димеров Au-наночастиц. Посредством статистического анализа, по меньшей мере, 200 частиц выявлено, что 25% частиц существовали в качестве мономера и 65% частиц существовали в качестве димера, и менее чем 10% существовали в качестве мультимера (тримера, тетрамера и т.д.). Межчастичное расстояние между золотыми частицами было равно около 2-3 нм по измерению HR-TEM. В растворе (0,3M PBS) межчастичное расстояние было ~15 нм, что, как ожидалось, должно было быть намного длиннее, чем в обезвоженных условиях. Кроме того, серебряные наночастицы вводили в наномасштабе на поверхность димера Au-наночастицы посредством хорошо известного способа (Chem. Comm. 2008, J. Phys. Chem. B 2004, 108, 5882-5888) на поверхности Au-наночастицы, чтобы уменьшить расстояние между наночастицами, что ведет к усилению SERS-сигналов (см. пример 1). Au-Ag окклюдантные мономеры с толщиной Ag-оболочки ~3 нм и ~10 нм (1a и 1b на фиг.2C) также синтезировали из очищенного раствора зонда B (30 нм AuNP) при сходных условиях. Спектры УФ- и видимой области из индивидуальных растворов разделяли на пике плазмонного резонанса -400 нм соответственно толщине оболочки. Фиг.2C представляет HR-TEM изображения, полученные от индивидуальных Au-Ag окклюдантных гетеродимеров с диаметром 26-36 нм (фиг.2C-2), 30-40 нм (фиг.2C-3) и 40-50 нм (фиг.2C-3) для набора двух сфер окклюдантных наночастиц. Фиг.2C-1a и 1b представляют HR-TEM изображения, полученные от индивидуальных Au-Ag окклюдантных мономеров с диаметром 40 нм (толщина оболочки = 5 нм, 2C-1a) и 50 нм (толщина оболочки = 10 нм, 2C-1b).

Кроме того, мономерные и димерные окклюдантные наноструктуры (с использованием Cy3 в качестве молекулы, активной в отношении рамановского рассеяния) измеряли посредством SERS/AFM. В стандартном эксперименте аликвоты (20 мкл) растворов Au-Ag окклюдантного гетеродимера промывали посредством повторного центрифугирования (8,000 об/мин, 20 мин, три раза), наносили посредством центрифугирования на стеклянные подложки, покрытые поли-L-лизином, промывали много раз водой Nanopure и просушивали на воздухе. Сразу же после получения образцы измеряли посредством AFM и SERS. SERS-спектры записывали с использованием AFM-связанного нанорамановского микроскопа, оборудованного инвертированным оптическим микроскопом (Axovert 200, Zeiss), и пьезоэлектрический двухкоординатный сканер (Physik Instrument) применяли с использованием независимого самодельного сканирующего контроллера. Применяли 514,5 нм линейный аргоново-ионный лазер (Melles Griot) в качестве источника возбуждения, объединенного с одномодальным оптическим волокном. Установили дихроичное зеркало (520DCLP, Chroma Technology Corp.), чтобы направить возбуждающий лазерный луч от 50 нВт до 1 мВт в масляную иммерсию объектива микроскопа (x100, 1,6 NA, Zeiss), который фокусировал луч на дифракционно-ограниченную точку (250 нм) на верхней поверхности покровного стекла. AFM (Bioscope, Digital Instruments, Veeco Metrology Group) с контроллером Nanoscope IV установили на микромеханическом столе. Полуконтактный режим модуля AFM на столе оптического микроскопа применяли для корреляции сигнала рамановского рассеяния с топографическим изображением AFM с точностью перекрытия менее 100 нм. Фокальная точка лазера в точности совпадала с центром верхушки для симметричного рассеяния на конце верхушки AFM. Фоновые сигналы рамановского рассеяния собирали на охлажденном жидким азотом (-125°C) CCD (прибор с зарядовой связью). Спектры рассеяния образца были записаны в диапазоне 500-2,000 см^-1, при одном захвате, накопление 1 сек и 400 мкВт. Все данные откорректированы посредством вычитания фоновых сигналов из Si.

ПРИМЕР 3: AFM (Атомная силовая микрография) анализ Au-Ag окклюдантных наночастиц

На фиг.3A представлены изображения AFM (1×1 мкм) окклюдантных мономерных и гетеродимерных наноструктур (с использованием Cy3 в качестве молекулы, активной в отношении рамановского рассеяния), которые совпадают по форме и диаметру с изображениями HR-TEM. На фиг.3B представлены коррелированные SERS-спектры от соответствующих единичных частиц, изображенных посредством AFM на фиг.3A. Не было детектировано никаких сигналов рамановского рассеяния для мономерных Au-Ag окклюдантных наночастиц с 5 нм (фиг.3A-1) и 10 нм (фиг.3A-2) серебряными оболочками соответственно, потому что у них нет горячих точек и есть только одна Cy3 молекула на частицу. Гетеродимеры Au-наночастиц без Ag оболочек или с расстоянием зазора менее 1 нм между ними не демонстрирует также никакого SERS-сигнала. Это происходит из-за недостаточного электромагнитного усиления в условиях возбуждения лазером 514,5 нм. При толщине Ag оболочки менее 3 нм (фиг.3A-4) не детектировали никакие сигналы рамановского рассеяния даже после использования повышенной мощности падающего лазерного луча 200 мкВт). Эти результаты указывают на то, что тонкая серебряная оболочка (<3 нм) не могла бы вызвать достаточного электромагнитного возбуждения при SERS.

В противоположность этому, когда толщина Ag оболочки была ~5 нм (фиг.3A-5), наблюдали сильный сигнал SERS от Cy3 метки, расположенной в соединении двух окклюдантных частиц. Характерные пики рамановского рассеяния для красителя Cy3, хотя низкие по интенсивности, наблюдали при 1,470 и 1,580 см^-1, характерные для фингерпринт спектров, от 514,5 нм лазерного возбуждения. Низкая интенсивность этих пиков возможно обусловлена присутствием только одной молекулы в пределах области горячего соединения и относительно низкой лазерной мощности (100 мкВт) по сравнению с интенсивностью мощности, применяемой в других SERS-исследованиях единичных молекул (Science 1997. 275(5203), 1102, Phys rev lett 1997, 78(9), 1667, Nano lett 2006, 6(1) 2173, Nano lett DOI: 10,1021/ni803621x). Сигналы получали от различных видов так же, как от олигонуклеотид-модифицированных Au-наночастиц. На фиг.3C представлено сравнение SERS-спектров Cy3-модифицированных олигонуклеотидов (5-HS-(CH₂)₆-A10-PEG18-ATCCTTATCAATATTAAA-Cy3-3', 1 нМ, красная линия) с теми олигонуклеотидами, свободными от Cy3 (5-HS-(CH₂₎6-A10-PEG18-ATCCTTATCAATATTAAA-3', 1 нМ, черная линия), в агрегированных Ag коллоидах. SERS-спектры на фиг.3C (черная линия) представляют преимущественные адениновые пики (734 см^-1, 1320 см^-1) над другими базовыми основаниями из-за обогащения адениновым основанием (в качестве спейсерной последовательности применяли А10) (JACS 2008, 130(16), 5523). Важно отметить, что самый низкий предел детектирования для неадениновых ДНК оснований, сообщаемый до сих пор, находится в субмикромолярном диапазоне (JACS, 2006, 128, 15580). Однако относительно сильные сигналы получали при 1,470 см^-1 и 1,580 см^-1, характерных для молекулы Cy3, как показано на SERS-спектрах на фиг.3С (красная линия) (Anal chem. 2004, 76, 412-417). Известно, что рамановская интенсивность и спектральные позиции молекулы Су3 колеблются со временем, и рамановские спектры отличаются для каждой наблюдаемой наноструктуры (J. Phys. Chem. B 2002, 106, 8096). Таким образом, спектральные паттерны являются сравнимыми, но не полностью сходными с сообщенными ранее. Независимо от толщины оболочки никакие наблюдения от детектируемых SERS сигналов от Au-Ag окклюдантных мономеров в экспериментальных условиях не указывали на то, что только Cy-молекулы, локализованные в межчастичном соединении, могли вызывать SERS-пики при 1,470 и 1,580 см^-1. Как показано в рамановских спектрах, полученных от окклюдантных димеров с толщиной оболочки ~10 нм (фиг.3A-6), преимущественные адениновые пики наблюдали при 734 см^-1 и 1320 см^-1 наряду с Cy3 пиком при 1,480 см^-1. Интенсивность рамановского рассеяния от других наночастиц не наблюдали в специфической форме. Толстая Ag оболочка могла компенсировать молекулы Cy3, которые вызывали несоответствующее электромагнитное усиление.

ПРИМЕР 4: Анализ SERS-спектров от димеров Au-Ag окклюдантных наночастиц в соответствии с поляризацией падающего лазерного луча

Большинство димеров окклюдантных наночастиц с толщиной оболочки ~5 нм (с использованием Cy3 в качестве рамановской активной молекулы) продемонстрировало детектируемые SERS-сигналы от единичных молекул, как показано на фиг.4A и 4B. Принимая во внимание, что падающий лазерный луч неточно поляризовался на межчастичных осях димера (панели 1-5 на фиг.4A), детектируемые SERS-сигналы от каждого из перпендикулярно поляризуемых димеров наночастиц наблюдали на той же поверхности. Однако на фиг.5C представлены только малые пики при 1,470 см^-1, потому что ориентация димера приблизительно перпендикулярна падающему лучу. В настоящем документе выявлено, что димеры окклюдантных наночастиц с оптимизированной толщиной оболочки могли бы быть структурами горячих точек, весьма подходящих для детектирования единичной молекулы ДНК.

В результате экспериментов известно, что двухпозиционное мерцающее поведение включено-выключено наблюдают при детектировании единичной молекулы (фиг.5A) (J. Phys. Chem. B2002, 106, 8096). Отсутствие рамановской интенсивности продолжается в течение 10 сек, после чего рамановская интенсивность находится в положении ВКЛЮЧЕНО. Это циклическое явление включено-выключено может повторяться несколько минут, в течение которых сигналы окончательно исчезают из интенсивного поля. Флуктуацию SERS-интенсивности наблюдали на второй временной шкале вследствие броуновского движения вокруг горячей точки. Эти явления мерцания и флуктуации соответствовали предыдущим сообщениям.

На фиг.5C и 5D представлена зависимость поляризации падающего лазерного луча от рамановских сигналов для Au-Ag окклюдантного димера. Все спектры получены посредством 514,5 нм возбуждения лазера, накопления 20 сек и мощности лазера 40 мкВт. Максимальные пики Cy3 наблюдали, когда падающий лазерный луч был поляризован параллельно продольной оси гетеродимера. Когда лазерный луч вращали на 20-90° от продольной оси Cy3, сигнал постепенно ослаблялся. Пики рамановского рассеяния исчезали, когда лазерный луч поляризовали перпендикулярно продольной оси (т.е. 90° и 270°). Фактор усиления (EF) при 1,580 см^-1 горячей точки в димерной наноструктуре рассчитывали в соответствии со следующим уравнением.

EF= (I _sers×N _bul k)/(I _bulk×N _molecule ),

где I_sers и I_bulk представляют одну и ту же интенсивность полос для SERS и bulk спектров соответственно, N_bulk является числом плотности массы молекул в массе образца, N_molecule является числом плотности Cy3 в SERS-спектрах (N_molecule=1). Наиболее сильную полосу спектра прочитывали при областях 1,580 см^-1, так что ее применяли при интенсивности для I_sers и I_bulk. Таким образом, EF горячей точки по расчетам была 2,7×10¹².

С другой стороны, высокочувствительные SERS-спектры были детектированы от димеров наночастиц, модифицированных олигонуклеотидами, меченными FAM и Dabcyl, как описано для Cy3. Таким образом, димерные наноструктуры и способ получения в соответствии с настоящим изобретением применимы к обычным рамановским активным молекулам.

Хотя предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения были описаны для показательных целей, специалисты в данной области оценят, что различные модификации, дополнения и замены возможны без отклонения от объема и сущности изобретения, как описано в прилагаемой формуле изобретения.

Изобретение относится к области молекулярной биологии и биохимии. Предложена димерная наноструктура, способ её конструирования, способ детектирования аналита и набор для детектирования аналита. Изобретение позволяет повысить чувствительность и точность детектирования единичных молекул. 4 н. и 19 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 пр.

1. Димерная наноструктура, пригодная в качестве метки в методе поверхностно-усиленного рамановского рассеяния (SERS-метки), содержащая наночастицу A и наночастицу B, а также молекулу, активную в отношении рамановского рассеяния, локализованную в месте соединения между указанными наночастицами;
причем наночастица A содержит золотое или серебряное ядро A, олигонуклеотид, прикрепленный к поверхности ядра A, и золотую или серебряную оболочку, покрывающие ядро A, таким образом, что конец олигонуклеотида прикреплен к поверхности ядра A посредством связанной с поверхностью функциональной группы или соединения, имеющего связанную с поверхностью функциональную группу, и в то же время олигонуклеотид частично экспонирован с наружной стороны оболочки (т.е. выходит наружу за пределы оболочки), и
наночастица В содержит золотое или серебряное ядро B, олигонуклеотид, прикрепленный к поверхности ядра B, и золотую или серебряную оболочку, покрывающие ядро B, таким образом, что конец олигонуклеотида прикреплен к поверхности ядра B посредством связанной с поверхностью функциональной группы или соединения, имеющего связанную с поверхностью функциональную группу, и в то же время олигонуклеотид частично экспонирован с наружной стороны оболочки (т.е. выходит наружу за пределы оболочки),
при этом наночастица A и наночастица B связаны друг с другом указанными олигонуклеотидами и, таким образом, что указанные олигонуклеотиды гибридизованы непосредственно друг с другом в том случае, когда они являются комплементарными друг к другу, или гибридизованы с помощью олигонуклеотидной последовательности, комплементарной к обоим указанным олигонуклеотидам в их частях, выходящих наружу;
и где при этом:
молекула, активная в отношении рамановского рассеяния, представляет собой молекулу, которая имеет рамановский сдвиг в рамановской спектроскопии, и данная молекула, активная в отношении рамановского рассеяния, связана с выступающим наружу указанным олигонуклеотидом, что тем самым обеспечивает ее локализацию в месте соединения между наночастицей A и наночастицей B;
диаметр ядра A и ядра B варьирует в диапазоне от 5 до 300 нм; и
толщина оболочек на ядре A и на ядре B варьирует в диапазоне от 1 до 300 нм.

2. Димерная наноструктура по п.1, где наночастицы A и B дополнительно содержат олигонуклеотиды, прикрепленные к поверхности ядра A и ядра B, соответственно, и при этом частично экспонирован с наружной стороны оболочки; и
в дальнейшем указанные олигонуклеотиды стабилизируют, соответственно, ядро A и ядро B каждой наночастицы за счет того, что они дают возможность указанным олигонуклеотидам надлежащим образом прикрепиться к поверхности ядер и защищают поверхность ядер.

3. Димерная наноструктура, пригодная в качестве SERS-метки, по п.1, где связанная с поверхностью функциональная группа выбрана из группы, состоящей из тиольной группы, аминной группы и спиртовой группы.

4. Димерная наноструктура, пригодная в качестве SERS-метки, по п.1, выбранная из группы, состоящей из:
i) димерной наноструктуры, содержащей две наночастицы, каждая из которых состоит из золотого ядра и серебряной оболочки,
ii) димерной наноструктуры, содержащей две наночастицы, каждая из которых состоит из серебряного ядра и золотой оболочки,
iii) димерной наноструктуры, содержащей две наночастицы, каждая из которых состоит из золотого ядра и золотой оболочки,
iv) димерной наноструктуры, содержащей две наночастицы, каждая из которых состоит из серебряного ядра и серебряной оболочки, и
v) димерной наноструктуры, содержащей две наночастицы, одна из которых состоит из золотого ядра и серебряной оболочки, а другая состоит из серебряного ядра и золотой оболочки.

5. Димерная наноструктура, пригодная в качестве SERS-метки, по п.1, где диаметр каждого из ядра A и ядра B независимо варьируют в диапазоне от 10 до 40 нм.

6. Димерная наноструктура, пригодная в качестве SERS-метки, по п.1, где толщина каждой из оболочек ядра A и ядра B независимо варьирует в диапазоне от 1 до 20 нм.

7. Димерная наноструктура, пригодная в качестве SERS-метки, по п.1, где молекула, активная в отношении рамановского рассеяния, выбрана из группы, состоящей из FAM, Dabcyl, TRIT (тетраметил родамин изотиол), NBD (7-нитробенз-2-1,3-диазол), красителя Texas Red, фталевой кислоты, терефталевой кислоты, изофталевой кислоты, крезилового фиолетового прочного, крезилового синего, бриллианткрезил блау, пара-аминобензойной кислоты, эритрозина, биотина, дигоксигенина, 5-карбокси-4′,5′-дихлор-2′,7′-диметоксифлуоресцеина, 5-карбокси-2′,4′,5′,7′-тетрахлорфлуоресцеина, 5-карбоксифлуоресцеина, 5-карбоксиродамина,6-карбоксиродамина, 6-карбокситетраметил аминофталоцианина, азометина, цианина, ксантина, сукцинилфлуоресцеина, аминоакридина, квантовых точек, углеродных нанотрубок, углеродных аллотропов, цианида, тиола, хлора, брома, метила, фосфора, серы, цианиновых красителей (Су3, Су3,5, Су5) и родамина.

8. Димерная наноструктура, пригодная в качестве SERS-метки, по п.1, где молекула, активная в отношении рамановского рассеяния, является органической флуоресцентной молекулой.

9. Димерная наноструктура, пригодная в качестве SERS-метки, по п.1, связанная на ее поверхности или на поверхности ядра с молекулой зонда, способной распознавать анализируемый аналит.

10. Димерная наноструктура, пригодная в качестве SERS-метки, по п.9, где анализируемый аналит выбран из аминокислот, пептидов, полипептидов, белков, гликопротеинов, липопротеинов, нуклеозидов, нуклеотидов, олигонуклеотидов, нуклеиновых кислот, сахаридов, углеводов, олигосахаридов, полисахаридов, жирных кислот, липидов, гормонов, метаболитов, цитокинов, хемокинов, рецепторов, нейромедиаторов, антигенов, аллергенов, антител, субстратов, кофакторов, ингибиторов, лекарственных средств, фармацевтических субстанций, нутриентов, прионов, токсинов, токсических веществ, взрывчатых веществ, пестицидов, средств химического оружия, биологически вредных веществ, радиоактивных изотопов, витаминов, гетероциклических ароматических соединений, онкогенных веществ, мутагенных факторов, анестезирующих средств, амфетамина, барбитурата, галлюциногенов, шлаков и загрязняющих веществ.

11. Димерная наноструктура, пригодная в качестве SERS-метки, по п.9, где молекула зонда выбрана из антител, фрагментов антител, растворимых белков, лигандных белков, ферментов, ингибирующих белков, белков клеточной адгезии, олигонуклеотидов, полинуклеотидов, нуклеиновых кислот и аптамеров.

12. Димерная наноструктура, пригодная в качестве SERS-метки, по п.1, полностью покрытая неорганическим веществом.

13. Димерная наноструктура, пригодная в качестве SERS-метки, по п.12, где неорганическое вещество является диоксидом кремния.

14. Способ конструирования димерной наноструктуры, пригодной в качестве метки в методе поверхностно-усиленного рамановского рассеяния (SERS-метки), по п.1, включающий:
1) синтезирование ядра A и ядра B, соответственно, причем ядро A имеет олигонуклеотид, прикрепленный одним концом к поверхности ядра A; ядро B имеет защитный олигонуклеотид, прикрепленный одним концом к поверхности ядра B; и с экспонированной наружу частью указанного олигонуклеотида связана молекула, активная в отношении рамановского рассеяния;
2) связывание ядра A и ядра B с помощью указанных олигонуклеотидов посредством гибридизации указанных олигонуклеотидов непосредственно друг с другом в том случае, когда они являются комплементарными друг к другу, или гибридизованы с помощью олигонуклеотидной последовательности, комплементарной к обоим указанным олигонуклеотидам в их частях, выходящих наружу, с образованием тем самым димерной структуры, в которой молекула, активная в отношении рамановского рассеяния, локализована между ядром A и ядром B; и
3) нанесение оболочки на каждое из ядра A и ядра B, с образованием тем самым наночастицы A и наночастицы B, связанных друг с другом, причем молекула, активная в отношении рамановского рассеяния, локализована в месте соединения между наночастицей A и наночастицей B.

15. Способ по п.14, дополнительно включающий следующую стадию, осуществляемую между стадиями 1) и 2):
отделение только ядер A и B, которые связаны с указанными олигонуклеотидами, соответственно, посредством гибридизации с магнитными микрочастицами, имеющими комплементарную последовательность по отношению к указанным олигонуклеотидам.

16. Способ по п.14, где нанесение оболочки достигается посредством реакции ядра с предшественником оболочки в присутствии восстановителя и стабилизатора.

17. Способ детектирования аналита, включающий:
1) получение димерной наноструктуры, пригодной в качестве метки в методе поверхностно-усиленного рамановского рассеяния (SERS-метки), по любому из пп.1-13;
2) связывание молекулы зонда, способной детектировать аналит, с поверхностью димерной наноструктуры или ядра SERS-метки;
3) воздействие на помеченную SERS-меткой молекулу зонда образцом, содержащим, по меньшей мере, один аналит; и
4) детектирование и идентификацию аналита посредством лазерного возбуждения и рамановской спектроскопии.

18. Способ детектирования нуклеиновой кислоты, включающий:
1) получение димерной наноструктуры, пригодной в качестве метки в методе поверхностно-усиленного рамановского рассеяния (SERS-метки), по любому из пп.1-13;
2) функционализирование поверхности димерной окклюдантной наноструктуры или ядра с молекулой зонда, комплементарной к детектируемому аналиту нуклеиновой кислоты;
2) связывание молекулы зонда, комплементарной к детектируемому аналиту нуклеиновой кислоты, с поверхностью димерной наноструктуры или ядра SERS-метки;
3) амплификацию аналита нуклеиновой кислоты из образца;
4) гибридизацию помеченной SERS-меткой молекулы зонда с амплифицированными нуклеиновыми кислотами; и
5) детектирование и идентификацию аналита нуклеиновой кислоты, комбинированного с помеченной SERS-меткой молекулой зонда, с использованием рамановской спектроскопии.

19. Способ по п.18, применяемый для диагностики заболевания.

20. Способ по п.18, применяемый для детектирования однонуклеотидного полиморфизма (SNP).

21. Способ по п.17, где рамановская спектроскопия выбрана из поверхностно-усиленной рамановской спектроскопии (SERS), поверхностно-усиленной резонансной рамановской спектроскопии (SERRS), гиперрамановской, когерентной антистоксовой рамановской спектроскопии и их сочетания.

22. Способ по п.18, где нуклеиновая кислота выбрана из генов, вирусных РНК и ДНК, бактериальных ДНК, ДНК грибов, ДНК млекопитающих, кДНК, мРНК, РНК и фрагментов ДНК, олигонуклеотидов, синтетических олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, одно- и двухцепочечных нуклеиновых кислот и природных или синтетических нуклеиновых кислот.

23. Набор для детектирования аналита, содержащий димерную наноструктуру, пригодную в качестве метки в методе поверхностно-усиленного рамановского рассеяния (SERS-метки), по любому из пп.1-13.