ОЛИГОГЛИКОЛЬ-КАРБОНАТНЫЕ ПРОЛЕКАРСТВА НА ОСНОВЕ 5-МОДИФИЦИРОВАННЫХ 2'-ДЕЗОКСИУРИДИНОВ, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ Российский патент 2023 года по МПК C07H19/06 A61K31/706 A61P31/04 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области органической химии, молекулярной биологии и микробиологии и предназначено для синтеза новых соединений, подавляющих рост ряда грамположительных бактерий, включая резистентные штаммы Staphylococcus aureus и Mycobacterium smegmatis. Более конкретно, изобретение относится к области биологически активных соединений и касается разработки новых пролекарственных форм 5-алкилоксиметил-2'-дезоксиуридинов - эффективных ингибиторов роста грамположительных бактерий, и обладающих низкой цитотоксичностью. Предложены новые C-5-производные 2'-дезоксиуридина, которые способны подавлять рост грамположительных бактерий.

Уровень техники

Аналоги нуклеозидов являются перспективными соединениями для разработки противомикробных средств. Среди модифицированных нуклеозидов значительной противотуберкулезной активностью обладают С-5-модифицированные производные 2'-дезоксиуридина, содержащие различные протяженные заместители [М. Johar, Т. Manning, D.Y. Kunimoto and R. Kumar, Bioorg. Med. Chem., 2005, 13, 6663; D. Rai, M. Johar, T. Manning, B. Agrawal, D.Y. Kunimoto and R. Kumar, J. Med. Chem., 2005, 48, 7012; E.R. Shmalenyuk, S.N. Kochetkov and L.A. Alexandrova, Russ. Chem. Rev., 2013, 82, 896 (Uspekhi Khimii), 2013, 82, 896; E.R. Shmalenyuk, L.N. Chernousova, I.L. Karpenko, S.N. Kochetkov, T.G. Smirnova, S.N. Andreevskaya, O.V. Efremenkova and L.A. Alexandrova, Bioorg. Med. Chem., 2013, 21, 4874; E.R. Shmalenyuk, I.L. Karpenko, L.N. Chernousova, A.O. Chizhov, T.G. Smirnova, S.N. Andreevskaya and L.A. Alexandrova, Russ. Chem. Bull. Int. Ed., 2014, 63, 119; E. Matyugina, A. Khandazhinskaya, L. Chernousova, S. Andreevskaya, T. Smirnova, A. Chizhov, I. Karpenko, S. Kochetkov, L. Alexandrova, Bioorg. Med. Chem. 2012, 20, 6680; A.L. Khandazhinskaya, L.A. Alexandrova, E.S. Matyugina, P.N. Solyev, O.V. Efremenkova, K.W. Buckheit, M. Wilkinson, R.W. Buckheit, L.N. Chernousova, T.G. Smirnova et al. Molecules 2018, 23, 3069; Y.B. Platonova, A.N. Volov, L.G. Tomilova, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2020, 30, 127351; A.N. Volov, N.A. Volov, Y.B. Platonova, Bioorg. Med. Chem. Lett. 2021, 48, 12826]. Однако их крайне низкая водорастворимость представляет собой серьезную проблему, которая препятствует исследованию их активности против бактериальных штаммов.

Наиболее распространенным методом изменения необходимых фармакологических параметров биологически активных соединений является подход с созданием пролекарств, который предполагает синтез содержащего исходное лекарство модифицированного соединения, которое затем претерпевает биотрансформацию in vivo с высвобождением активного компонента [В.М.А. Sanches and E.I. Ferreira, Int. J. Pharm., 2019, 568, 118498; D.H. Jornada, G.F. Dos Santos Fernandes, D.E. Chiba, T.R.F. De Melo, J.L. Dos Santos and M.C. Chung, Molecules, 2016, 21, 42; K. Huttunen, H. Raunio and J. Rautio, Pharmacol. Rev., 2011, 63, 750; J. Rautio, H. Kumpulainen, T. Heimbach, R. Oliyai, D. Oh, T. Järvinen and J. Savolainen, J. Nat. Rev. Drug Discov., 2008, 7, 255; A. Khandazhinskaya, M. Yasko and E. Shirokova, 2006 Current Med. Chem. 2006, 13, 2953; V.J. Stella and K.W. Nti-Addae, Adv. Drug Deliv. Rev., 2007, 59, 677; G. Mori, L.R. Chiarelli, G. Riccardi and M.R. Pasca, Drug Discov. Today, 2017, 22,519].

Наиболее близкими к заявляемому, являются работы, в которых представлен синтез и изучены антибактериальные свойства набора гликольсодержащих пролекарственных форм 5-алкилтриазолилметил-2'-дезоксиуридинов [S.D. Negrya, M.V. Jasko, P.N. Solyev, I.L. Karpenko, O.V. Efremenkova, B.F. Vasilyeva, I.G. Sumarukova, S.N. Kochetkov, L.A. Alexandrova, J. Antibiot. 2020, 73,236-24, S.D. Negrya, M.V. Jasko, D.A. Makarov, P.N. Solyev, I.L. Karpenko, O.V. Shevchenko, O.V. Chekhov, A.A. Glukhova, B.F. Vasilyeva, T.A. Efimenko et al. Mol. Biol. 2021, 55, 143-153, S.D. Negrya, M.V. Jasko, D.A. Makarov, I.L. Karpenko, P.N. Solyev, V.O. Chekhov, O.V. Efremenkova, B.F. Vasilieva, T.A. Efimenko, S.N. Kochetkov, L.A. Alexandrova. Oligoglycol carbonate prodrugs of 5-modified 2'-deoxyuridines: synthesis and antibacterial activity. Mendeleev Commun., 2022, 32, 433-435], которые оказались как минимум на два порядка более растворимы в воде, чем исходные нуклеозиды и обладали значительной ингибирующей активностью в отношении грамположительных бактерий, рост которых не подавлялся исходными соединениями. Основными недостатками методов, представленных в литературе являются недостаточно оптимизированные способы получения соединений, использование трудноудаляемых из реакционной среды фторида тетрабутиламмония и высококипящего диметилформамида.

Таким образом, разработка метода синтеза гликоль-содержащих пролекарственных форм 5-алкилоксиметил-2'-дезоксиуридинов остается актуальной задачей для повышения биодоступности соединений.

Раскрытие сущности изобретения

Нуклеозиды с протяженными алкильными заместителями крайне низко растворимы в воде. Введение в 3'- или 5'-положение углеводного фрагмента 5-алкилоксиметил-2'-дезоксиуридинов три- или тетраэтиленгликолевых групп значительно увеличивает водорастворимость соединений и, таким образом, их биодоступность [S.D. Negrya, M.V. Jasko, D.A. Makarov, I.L. Karpenko, P.N. Solyev, V.O. Chekhov, O.V. Efremenkova, B.F. Vasilieva, T.A. Efimenko, S.N. Kochetkov, L.A. Alexandrova. Oligoglycol carbonate prodrugs of 5-modified 2'-deoxyuridines: synthesis and antibacterial activity. Mendeleev Commun., 2022,32, 433-435].

Целью данного изобретения является получение новых гликольсодержащих пролекарственных форм 5-модифицированных 2'-дезоксиуридинов, содержащих в своем составе протяженный (с длиной углеродной цепи C₁₀-C₁₆) алкильный заместитель, подавляющих рост грамположительных бактерий, включая их лекарственно-устойчивые штаммы, а именно: Staphylococcus aureus MRSA, Mycobacterium smegmatis, Bacillus subtilis, Leuconostoc mesenteroides, Micrococcus luteus.

Для осуществления поставленной цели используют такие методы, как:

- введение защитных групп (блокирование гидроксильных групп нуклеозида проводят с целью предотвращения нежелательных реакций в ходе синтеза, а также с целью улучшения подвижности промежуточных соединений при хроматографическом разделении, что облегчает их очистку);

- конденсацию 3'- или 5'-гидроксильной группы с N, N'-карбонилдиимидазолом (CDI) с последующей реакцией с три- или тетраэтиленгликолем для введения три- или тетраэтиленгликолевого фрагмента в молекулу нуклеозида;

- деблокирование защитных групп.

Следующим пунктом осуществления изобретения являлась проверка антибактериальной активности полученных соединений в отношении ряда тест-штаммов грамположительных бактерий по методу двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде, для этого тест-штаммы микроорганизмов инкубировали в модифицированной питательной среде №2 Гаузе в присутствии тестируемых производных.

Далее изобретение будет раскрыто подробнее со ссылками на фигуры и примеры, которые приводятся исключительно с целью иллюстрации и пояснения сущности заявленного изобретения, но которые не предназначены для ограничения объема притязаний.

Краткое описание фигур и таблиц

Фигура 1. Синтез 3'-О-карбонилтри- и тетраэтиленгликоль-5-алкилоксиметил-2'-дезоксиуридинов (1-1 - 1-7). Условия проведения реакций: i, TBSCl, пиридин, 25°С, 16 ч; ii, 1) CDI, диоксан, 37°С, 24 ч, 2) триэтиленгликоль (для 1-1 - 1-3, 1-5, 1-6) или тетраэтиленгликоль (для 1-4, 1-7), диоксан, 37°С, 24 ч; iii, 80% уксусная кислота, 37°С, 18 ч.

Фигура 2. Синтез 5'-О-карбонилтриэтиленгликоль-5-алкилоксиметил-2'-дезоксиуридинов (1-8 - 1-9). Условия проведения реакций: i, DMTrCl, пиридин, 37°С, 4 ч; ii, TBSCl, имидазол, ДМФА, 25°С, 8 ч; iii, АсОН, H₂O, 37°С, 25 мин, iv, 1) CDI, ДМФА, 37°С, 24 ч, 2) триэтиленгликоль, диоксан, 37°С, 24 ч; v, 80% уксусная кислота, 37°С, 18 ч.

Таблица 1. Олигогликоль-карбонатные про лекарственные формы на основе 5-алкилоксиметил-2'-дезоксиуридинов.

Таблица 2. Значения растворимости в воде 5-алкилоксиметил-2'-дезоксиуридинов.

Таблица 3. Минимальные ингибирующие концентрации (мкМ) соединений. Ингибирующая активность аналогов 2'-дезоксиуридина зависит от заместителя в С-5 положении азотистого основания и изменяется соответственно: С₁₀Н₂₁, С₁₆Н₃₃ (неактивны) << С₁₁Н₂₃ < С₁₄Н₂₉ < С₁₂Н₂₅.

Осуществление изобретения

Исходные 5-модифицированные 2'-дезоксиуридины 2-1 - 2-5 (Фигура 1) были получены по описанному ранее методу [Е.R. Shmalenyuk, L.N. Chernousova, I.L. Karpenko, S.N. Kochetkov, T.G. Smirnova, S.N. Andreevskaya, О.V. Efremenkova and L.A. Alexandrova, Bioorg. Med. Chem., 2013, 21, 4874]. Синтез 3'-О-карбонилтри- и тетраэтиленгликоль-5-алкилоксиметил-2'-дезоксиуридинов (1-1 - 1-7) представлен на Фигуре 1. На первой стадии селективно защищали 5'-гидроксильную группу трет-бутилдиметилсилильной группой (TBS) действием трет-бутилдиметилсилилхлорида в пиридине; затем проводили конденсацию 3'-гидроксильной группы с N, N'-карбонилдиимидазолом (CDI) с последующей реакцией с три- или тетраэтиленгликолем. Деблокирование TBS-защиты действием 80% уксусной кислоты и последующее выделение колоночной хроматографией на силикагеле с элюцией хлороформом или этилацетатом с увеличивающейся концентрацией этанола приводили к продуктам 1-1 - 1-7 (Таблица 1) с общим выходом 34-49%.

Синтез 5'-О-карбонилтриэтиленгликоль-5-алкилоксиметил-2'-дезоксиуридинов (1-8 - 1-9) представлен на Фигуре 2. На первой стадии в 5'-положение исходных 5-модифицированных 2'-дезоксиуридинов 2-2 - 2-3 нуклеозида вводили диметокситритильную группу действием диметокситритилхлорида в пиридине. Затем по 3'-гидроксильному положению вводили защитную TBS-группу (обработкой соединения, полученного на первой стадии, трет-бутилдиметилсилилхлоридом в пиридине). Дважды защищенные нуклеозиды обрабатывали 80% уксусной кислотой - деблокирование защитной группы по 5'-положению, полученные таким образом производные со свободной 5'-гидроксильной группой были использованы для получения 5'-триэтиленгликолевых производных 1-8 - 1-9 (Таблица 1) с общими выходами 40-43%.

Таким образом предложенные в настоящей заявке изменения в методиках синтеза, позволяют существенно удешевить и упростить получение заявляемых соединений, а именно: (1) N,N'-карбонилдитриазол заменен на менее дорогой конденсирующий агент N,N'-карбонилдиимидазол, (2) конденсацию 3'- или 5'-гидроксильной группы с N,N'-карбонилдиимидазолом (CDI) предлагается проводить в диоксане, а не в высококипящем диметилформамиде, что значительно упрощает выделение заявляемых соединений, (3) удаление TBS-группы предложено проводить нагреванием в 80% уксусной кислоте, что значительно упрощает выделение заявляемых соединений.

Для синтезированных соединений была изучена их растворимость в воде (Таблица 2). Присутствие три- или тетраэтиленгликолевой группы приводило к увеличению растворимости более чем на два порядка по сравнению с исходными соединениями.

Для целевых соединений 1-1 - 1-9 определяли цитотоксическое действие in vitro в культурах клеток Vero Е6 и А549 по МТТ-тесту, для этого клетки рассаживали в 96-луночный планшет и инкубировали с изучаемыми соединениями, после чего проводили окрашивание раствором МТТ. Показания оптической плотности (OD) считывали на планшетном ридере Chameleon при длине волны 544 нм. Для полученных гликолевых производных значение CD₅₀ было равно или больше 100 мкг/мл (128-174 мкМ).

Для заявленных соединений были изучены антибактериальные свойства. Как видно из Таблицы 3, тестируемые соединения показали заметную активность в отношении двух штаммов М. smegmatis и S. aureus, включая лекарственно устойчивые штаммы. Также можно заметить, что ингибирующая активность аналогов 2'-дезоксиуридина зависит от заместителя в С-5 положении азотистого основания и изменяется соответственно: С₁₀Н₂₁, С₁₆Н₃₃ (неактивны) << С₁₁Н₂₃ < С₁₄Н₂₉ < С₁₂Н₂₅.

Спектры ЯМР (δ, м.д., КССВ, Гц) регистрировали в DMSO-d₆ на спектрометре Avance III (Braker, США) с рабочей частотой 300 МГц для ¹H-ЯМР (внутренний стандарт - Me₄Si), 75 МГц для ¹³С-ЯМР (внутренний стандарт - Me₄Si).

УФ-спектры регистрировали на спектрофотометре Perkin Elmer lambda 25 (Perkin Elmer, США) в метаноле. КД-спектры регистрировали на спектрополяриметре Jasco j715 в диапазоне от 200 до 350 нм со скоростью сканирования 100 нм/мин.

Масс-спектры высокого разрешения регистрировали на приборе Bruker Daltonics micrOTOF-Q II методом электрораспылительной ионизации (ESI). Измерения выполнены на положительных ионах. Напряжение на капилляре: 4500В; диапазон сканирования масс: m/z 100-3000 Да; калибровка: внешняя (Electrospray Calibrant Solution, Fluka); давление на распылителе: 0.8 бар; скорость потока: 3 мкл/мин; газ-распылитель: азот (4 л/мин); температура интерфейса: 190°С. Образцы подавались в распылительную камеру масс-спектрометра после жидкостного хроматографа Agilent 1260, оснащенного колонкой Agilent Poroshell 120 ЕС-С18 (3.0×50 мм; 2.7 мкм); скорость потока 0.2 мл/мин; образцы веществ подавались в ВЭЖХ-хроматограф из раствора ацетонитрил-вода 1:1 (5 мкл).

Далее приведены примеры, иллюстрирующие данное изобретение. Варианты и модификации осуществления изобретения, которые могут быть воспроизведены, не отходя от общей концепции настоящего изобретения и без привлечения собственной изобретательской деятельности, также будут входить в объем притязаний настоящего изобретения.

Пример 1. Общий метод синтеза 3'-О-карбонилтри- и тетраэтиленгликоль-5-алкилоксиметил-2'-дезоксиуридинов (1-1 - 1-7).

К раствору 0.7 ммоль нуклеозида (2-1 - 2-5) в 5 мл сухого пиридина добавляют 129 мг (0,85 ммоль) трет-бутилдиметилсилилхлорида и выдерживают смесь при 4°С 16 часов, затем упаривают. TBS-защищенные нуклеозиды (3-1 - 3-5) выделяют хроматографией на колонке с силикагелем, используя систему хлороформ-этанол (50:1 v/v) для элюции. Далее к раствору (0,28 ммоль) нуклеозида (3-1 - 3-5) в 1 мл сухого ДМФА добавляют 137 мг, 0.84 ммоль N,N'-карбонилдиимидазола. Смесь нагревают при 37°С 24 часов затем добавляют 1.65 г (11 ммоль) сухого триэтиленгликоля (для соединений 1-1 - 1-3, 1-5, 1-6) или 2,1 г (11 ммоль) сухого тетраэтиленгликоля (для 1-4, 1-7), 1 мл диоксана, и выдерживают при 37°С 24 ч, затем упаривают до постоянного объема. Продукты распределяют между хлороформом и водой, органический слой промывают водой, высушивают над Na₂SO₄, упаривают и выделяют на колонке с силикагелем, используя систему хлороформ-этилацетат-этанол (5:5:0,1 v/v) для элюции. Целевые фракции упаривают, растворяют в 80% уксусной кислоте (5 мл) и выдерживают 18 ч при 37°С, затем упаривают. Продукты выделяют на колонке с силикагелем, используя систему хлороформ-этанол (9:1 v/v) для элюции. Целевые фракции упаривают.

3'-О-Карбонилтриэтиленгликоль-5-децилоксиметил-2'-дезоксиуридин (1-1)

Выход 34 мг. ¹Н NMR (DMSO-d6) δ 0.84-0.88 (м, 3Н, -С₉Н₁₈СН₃), 1.24-1.30 (м, 14Н, -С₂Н₄С₇Н₁₄СН₃), 1.44-1.51 (м, 2Н, -СН₂СН₂С₈Н₁₇), 2.26-2.42 (м, 2Н, СН₂-2'), 3.36-3.66 (м, 14Н, -СН₂С₉Н₁₉ + -СН₂(ОС₂Н₄)₂ОН + СН₂-5'), 4.07-4.10 (м, 3Н, СН₂-5 + Н-4'), 4.22-4.25 (м, 2Н, -СН₂СН₂(ОС₂Н₄)₂ОН), 4.56 (т, 1Н, J=5.4 Hz, -(ОС₂Н₄)₃ОН), 5.16-5.22 (м, 2Н, Н-3' + ОН-5'), 6.18 (дд, 1H, J=6.0, 8.4 Hz, Н-1'), 7.91 (с, 1Н, Н-6), 11.40 (с, 1Н, NH). ¹³С NMR (DMSO-d6) δ 14.38 (-ОС₉Н₁₈СН₃), 22.35-31.76 (-ОСН₂С₈Н₁₆СН₃), 37.23 (С-2'), 60.69 (СН₂-5'), 61.79 (СН₂-5), 64.93-72.84 (-(ОС₂Н₄)₃ОН + -ОСН₂С₉Н₁₉), 79.01 (С-3'), 84.55 (С-4'), 84.98 (С-1'), 111.58 (С-5), 138.88 (С-6), 150.75 (С-2), 154.31 (-ОС(О)О-), 163.05 (С-4). UV (метанол): λmax 263.3 нм (ε 9780). MS (ESI) рассчитано для C₂₇H₄₆N₂O₁₁ 575.3174 [М+Н]+, найдено 575.3172.

3'-О-Карбонилтриэтиленгликоль-5-ундецилоксиметил-2'-дезоксиуридин (1-2)

Выход 34 мг (49%). ¹H NMR (DMSO-d6) δ 0.83-0.88 (м, 3Н, -С₁₀Н₂₀СН₃), 1.24-1.30 (м, 16Н, -С₂Н₄С₈Н₁₆СН₃), 1.44-1.53 (м, 2Н, -СН₂СН₂С₉Н₁₉), 2.25-2.42 (м, 2Н, СН₂-2'), 3.36-3.66 (м, 14Н, -СН₂С₁₀Н₂₁ + -СН₂(ОС₂Н₄)₂ОН + СН₂-5'), 4.06-4.10 (м, 3Н, СН₂-5 + Н-4'), 4.21-4.24 (м, 2Н, -СН₂СН₂(ОС₂Н₄)₂ОН), 4.54 (т, 1Н, J=5.4 Hz, -(OC₂H₄)₃OH), 5.16-5.19 (м, 2Н, Н-3' + ОН-5'), 6.17 (дд, 1Н, J=5.8, 8.2 Hz, H-1'), 7.90 (с, 1H, Н-6), 11.40 (с, 1H, NH). ¹³C NMR (DMSO-d6) δ 14.38 (-ОС₁₀Н₂₀СН₃), 22.55-31.77 (-ОСН₂С₉Н₁₈СН₃), 37.23 (С-2'), 60.70 (СН₂-5'), 61.80 (СН₂-5), 64.93-72.84 (-(ОС₂Н₄)₃ОН + -OCH₂C₁₀H₂₁), 78.99 (С-3'), 84.55 (С-4'), 84.97 (С-1'), 111.59 (С-5), 138.87 (С-6), 150.75 (С-2), 154.32 (-ОС(О)О-), 163.05 (С-4). UV (метанол): λmax 263.3 нм (ε 9780). MS (ESI) рассчитано для C₂₈H₄₈N₂O₁₁ 589.3331 [М+Н]+найдено 589.3328.

3'-О-Карбонилтриэтиленгликоль-5-додецилоксиметил-2'-дезоксиуридин (1-3)

Выход 35 мг. ¹H NMR (DMSO-d6) δ 0.84-0.88 (м, 3Н, -С₁₁Н₂₂СН₃), 1.25-1.33 (м, 18Н, -С₂Н₄С₉Н₁₈СН₃), 1.43-1.52 (тт, 2Н, J=13.3, 7.0 Hz, -СН₂СН₂С₁₀Н₂₁), 2.26-2.41 (м, 2Н, СН₂-2'), 3.36-3.66 (м, 14Н, -СН₂С₁₁Н₂₃ + -CH₂(OC₂H₄)₂OH + СН₂-5'), 4.07-4.09 (м, 3Н, СН₂-5 + Н-4'), 4.21-4.24 (м, 2Н, -СН₂СН₂(ОС₂Н₄)₂ОН), 4.55 (т, 1Н, J=5.4 Hz, -(ОС₂Н₄)₃ОН), 5.16-5.19 (м, 2H, Н-3' + ОН-5'), 6.17 (дц, 1Н, J=6.1, 8.3 Hz, H-1'), 7.90 (с, 1Н, Н-6), 11.41 (с, 1Н, NH). ¹³С NMR (DMSO-d6) δ 14.39 (-ОС₁₁Н₂₂СН₃), 22.55-31.76 (-ОСН₂С₁₀Н₂₀СН₃), 37.22 (С-2'), 60.70 (СН₂-5'), 61.80 (СН₂-5), 64.93-72.82 (-(ОС₂Н₄)₃ОН + -ОСН₂С₁₁Н₂₃), 78.98 (С-3'), 84.54 (С-4'), 84.95 (С-1'), 111.58 (С-5), 138.88 (С-6), 150.75 (С-2), 154.31 (-ОС(О)О-), 163.05 (С-4). UV (метанол): λmax 262.9 нм (ε 9780). MS (ESI) Рассчитано C₂₉H₅₀N₂O₁₁ 603.3487 [М+Н]+ найдено 603.3488.

3'-О-Карбонилтетраэтиленгликоль-5-додецилоксиметил-2'-дезоксиуридин (1-4)

Выход 35 мг. ¹H NMR (DMSO-d6) δ 0.83-0.88 (м, 3Н, -С₁₁Н₂₂СН₃), 1.24-1.30 (м, 18Н, -С₂Н₄С₉Н₁₈СН₃), 1.44-1.53 (м, 2Н, -СН₂СН₂С₁₀Н₂₁), 2.25-2.41 (м, 2Н, СН₂-2'), 3.32-3.65 (м, 18Н, -СН₂С₁₁Н₂₃ + -СН₂(ОС₂Н₄)₃ОН + СН₂-5'), 4.05-4.12 (м, 3Н, СН₂-5 + Н-4'), 4.21-4.24 (м, 2Н, -СН₂СН₂(ОС₂Н₄)₃ОН), 4.55 (т, 1Н, J=5.4 Hz, -(ОС₂Н₄)₄ОН), 5.16-5.20 (м, 2Н, Н-3' + ОН-5'), 6.17 (дд, 1H, J=6.0, 8.4 Hz, H-1'), 7.90 (с, 1H, Н-6), 11.35 (с, 1H, NH). ¹³С NMR δ 14.39 (-ОС₁₁Н₂₂СН₃), 22.55-31.76 (-ОСН₂С₁₀Н₂₁СН₃), 37.22 (С-2'), 60.70 (СН₂-5'), 61.80 (СН₂-5), 64.93-72.82 (-(ОС₂Н₄)₄ОН + -ОСН₂С₁₁Н₂₃), 78.98 (С-3'), 84.54 (С-4'), 84.95 (С-1'), 111.58 (С-5), 138.88 (С-6), 150.75 (С-2), 154.31 (-ОС(О)О-), 163.05 (С-4). UV (метанол): λmax 263.4 нм (ε 9780). MS (ESI) рассчитано для C₂₉H₅₀N₂O₁₁ 603.3487 [М+Н]+ найдено 603.3487.

3'-О-Карбонилтриэтиленгликоль-5-тетрадецилоксиметил-2'-дезоксиуридин (1-5)

Выход 36 мг. ¹H NMR (DMSO-d6) δ 0.84-0.88 (м, 3Н, -С₁₃Н₂₆СН₃), 1.24-1.31 (м, 22Н, -С₂Н₄С₁₁Н₂₂СН₃), 1.45-1.53 (м, 2Н, -СН₂СН₂С₁₂Н₂₅), 2.26-2.42 (м, 2Н, СН₂-2'), 3.36-3.66 (м, 14Н, -СН₂С₁₃Н₂₇ + -СН₂(ОС₂Н₄)₂ОН + СН₂-5'), 4.06-4.11 (м, 3Н, СН₂-5 + Н-4'), 4.22-4.25 (м, 2Н, -СН₂СН₂(ОС₂Н₄)₂ОН), 4.56 (т, 1H, J=5.4 Hz, -(OC₂H₄)₂OH), 5.17-5.22 (м, 2Н, Н-3' + ОН-5'), 6.18 (дд, 1Н, J=6.1, 8.4 Hz, Н-1'), 7.91 (с, 1Н, Н-6), 11.40 (с, 1H, NH). ¹³С NMR (DMSO-d6) δ 14.38 (-ОС₁₃Н₂₆СН₃), 22.55-31.76 (-ОСН₂С₁₂Н₂₄СН₃), 37.23 (С-2'), 60.69 (СН₂-5'), 61.79 (СН₂-5), 64.93-72.84 (-(ОС₂Н₄)₃ОН + -ОСН₂С₁₃Н₂₇), 79.01 (С-3'), 84.55 (С-4'), 84.98 (С-1'), 111.58 (С-5), 138.88 (С-6), 150.75 (С-2), 154.31 (-ОС(О)О-), 163.05 (C-4). UV (метанол): λmax 263.1 нм (ε 9780). MS (ESI) рассчитано для C₃₁H₅₄N₂O₁₁ 631.3800 [М+Н]+ найдено 631.3798.

3'-О-Карбонилтриэтиленгликоль-5-гексадецилоксиметил-2'-дезоксиуридин (1-6)

Выход 38 мг. ¹Н NMR (DMSO-d6) δ 0.83-0.88 (м, 3Н, -С₁₅Н₃₀СН₃), 1.24-1.30 (м, 26Н, -С₂Н₄С₁₃Н₂₆СН₃), 1.44-1.53 (м, 2Н, -СН₂СН₂С₁₄Н₂₉), 2.25-2.41 (м, 2Н, СН₂-2'), 3.35-3.66 (м, 14Н, -СН₂С₁₅Н₃₁ + -СН₂(ОС₂Н₄)₂ОН + СН₂-5'), 4.06-4.09 (м, 3Н, СН₂-5 + Н-4'), 4.21-4.24 (м, 2Н, -СН₂СН₂(ОС₂Н₄)₂ОН), 4.56 (т, 1Н, J=5.4 Hz, -(OC₂H₄)₂OH), 5.16-5.20 (м, 2Н, Н-3' + ОН-5'),6.17 (дд, 1H, J=6.0, 8.4 Hz, Н-1'), 7.90 (с, 1H, Н-6), 11.41 (с, 1Н, NH). ¹³С NMR (DMSO-d6) δ 14.39 (-ОС₁₅Н₃₀СН₃), 22.55-31.76 (-ОСН₂С₁₄Н₂₈СН₃), 37.21 (С-2'), 60.68 (СН₂-5'), 61.79 (СН₂-5), 64.92-72.83 (-(ОС₂Н₄)₃ОН + -ОСН₂С₁₅Н₃₁), 78.99 (С-3'), 84.53 (С-4'), 84.95 (С-1'), 111.58 (С-5), 138.88 (С-6), 150.75 (С-2), 154.31 (-ОС(О)О-), 163.06 (С-4). UV (метанол): λmax 263.1 нм (ε 9780). MS (ESI) рассчитано для C₃₃H₅₉N₂O₁₁ 659.4113 [М+Н]+ найдено 659.4112.

3'-О-Карбонилтетраэтиленгликоль-5-гексадецилоксиметил-2'-дезоксиуридин (1-7)

Выход 35 мг. ¹H NMR (DMSO-d6) δ 0.84-0.88 (м, 3Н, -С₁₅Н₃₀СН₃), 1.24-1.30 (м, 26Н, -С₂Н₄С₁₃Н₂₆СН₃), 1.44-1.53 (м, 2Н, -СН₂СН₂С₁₄Н₂₉), 2.26-2.42 (м, 2Н, СН₂-2'), 3.35-3.66 (м, 18Н, -СН₂С₁₅Н₂₃ + -СН₂(ОС₂Н₄)₃ОН + СН₂-5'), 4.07-4.10 (м, 3Н, СН₂-5 + Н-4'), 4.21-4.24 (м, 2Н, -СН₂СН₂(ОС₂Н₄)₃ОН), 4.53 (т, 1Н, J=5.4 Hz, -(ОС₂Н₄)₄ОН), 5.15-5.19 (м, 2Н, Н-3' + ОН-5'), 6.17 (дд, 1H, J=6.0, 8.4 Hz, Н-1'), 7.90 (с, 1H, Н-6), 11.40 (с, 1H, NH). ¹³С NMR (DMSO-d6) δ 14.38 (-ОС₁₅Н₃₀СН₃), 22.55-31.76 (-ОСН₂С₁₄Н₂₈СН₃), 37.22 (С-2'), 60.70 (СН₂-5'), 61.80 (СН₂-5), 64.93-72.82 (-(ОС₂Н₄)₄ОН + -ОСН₂С₁₅Н₃₁), 78.98 (С-3'), 84.55 (С-4'), 84.95 (С-1'), 111.58 (С-5), 138.87 (С-6), 150.75 (С-2), 154.32 (-ОС(О)О-), 163.05 (С-4). UV (метанол): λmax 263.3 нм (ε 9780). MS (ESI) рассчитано для C₃₅H₆₂N₂O₁₂ 703.4376 [М+Н]+ найдено 703.4376.

Пример 2. Общий метод синтеза 5'-О-карбонилтриэтиленгликоль-5-алкилоксиметил-2'-дезоксиуридинов (1-8 - 1-9)

К раствору 0.53 ммоль нуклеозида (2-2, 2-3) в 7 мл сухого пиридина добавляют 280 мг (0,83 ммоль) 4,4'-диметокситритилхлорида и выдерживают смесь при 37°С 4 часа, затем упаривают, растворяют в хлороформе и промывают водным 0,5 M раствором NaHCO₃, сушат над Na₂SO₄ и упаривают. Остаток растворяют в 5 мл ДМФА, добавляют 145 мг (2,1 ммоль) имидазола и 161 мг (1 ммоль) трет-бутилдиметилсилилхлорида и выдерживают смесь при 37°С 16 часов, затем упаривают. Остаток распределяют между хлороформом и водой, органический слой высушивают над Na₂SO₄ и упаривают. Остаток растворяют в смеси 8 мл уксусной кислоты и 2 мл воды. Смесь нагревают при 37°С 25 мин и упаривают. Продукты выделяют на колонке с силикагелем в системе хлороформ: этанол (50:1 v/v).

Дальнейшее введение карбонилтриэтиленгликолевого фрагмента в 5'-положение нуклеозидов 5-1 и 5-2, удаление трет-бутилдиметилсилильной группы и хроматографическое выделение соединений 1-8 и 1-9 проводят как описано в Примере 1.

5'-О-Карбонилтриэтиленгликоль-5-децилоксиметил-2'-дезоксиуридин (1-8)

Выход 35 мг. ¹H NMR (DMSO-d6) δ 0.84-0.88 (м, 3Н, -С₁₀Н₂₀СН₃), 1.24-1.28 (м, 16Н, -С₂Н₄С₈Н₁₆СН₃), 1.44-1.53 (м, 2Н, -СН₂СН₂С₉Н₁₉), 2.17 (ддд, 2Н, J=6.8, 5.1, 2.0 Hz, СН₂-2'), 3.35-3.65 (м, 12Н, -СН₂С₁₀Н₂₁ + -СН₂(ОС₂Н₄)₂ОН), 3.96 (дт, 1Н, J=5.8, 3.9 Hz, H-4'), 4.09 (с, 2Н, СН₂-5), 4.20-4.33 (м, 5Н, -СН₂СН₂(ОС₂Н₄)₂ОН + Н-3' + СН₂-5'), 4.53 (т, 1H, J=5.4 Hz, -(ОС₂Н₄)₃ОН), 5.44 (д, 1Н, J=4.4 Hz, ОН-3'), 6.18 (т, 1H, J=6.8, Hz, Н-1'), 7.59 (с, 1H, Н-6), 11.37 (с, 1Н, NH). ¹³C NMR (DMSO-d6) δ 14.37 (-ОС₁₀Н₂₀СН₃), 22.56-31.77 (-OCH₂C₉H₁₈CH₃), 39.24 (C-2'), 60.69 (СН₂-5), 64.83-70.67 (-(С₂Н₄О)₃ОН + С-3' + -ОСН₂С₁₀Н₂₁), 72.85 (СН₂-5'), 84.08 (С-4'), 84.93 (С-1'), 111.56 (С-5), 139.98 (С-6), 150.69 (С-2), 154.87 (-ОС(О)О-), 163.05 (С-4). UV (метанол): λmax 263.5 нм (ε 9780). MS (ESI) Рассчитано для C₂₈H₄₈N₂O₁₁ 583.3331 [М+Н]+. Найдено 583.3331.

5'-О-Карбонилтриэтиленгликоль-5-додецилоксиметил-2'-дезоксиуридин (1-9)

Выход 36 мг (56% для двух стадий). ¹H NMR (DMSO-d6) δ 0.85 (дд, 3Н, J=6.7, 7.0 Hz, -C₁₁H₂₂CH₃), 1.20-1.28 (м, 18H, -С₂Н₄С₉Н₁₈СН₃), 1.44-1.50 (м, 2Н, -СН₂СН₂С₉Н₁₉), 2.16 (м, 2Н, СН₂-2'), 3.35-3.63 (м, 12Н, -СН₂С₁₁Н₂₃ + -СН₂(ОС₂Н₄)₂ОН), 3.95 (дт, 1H, J=5.9, 3.8 Hz, H-4'), 4.08 (с, 2Н, СН₂-5), 4.19-4.31 (м, 5Н, -СН₂СН₂(ОС₂Н₄)₂ОН + Н-3' + СН₂-5'), 4.53 (т, 1Н, J=5.5 Hz, -(ОС₂Н₄)₃ОН), 5.44 (д, 1H, J=4.5 Hz, ОН-3'), 6.17 (дд, 1H, J=6.7, 7.0 Hz, Н-1'), 7.58 (с, 1H, Н-6), 11.37 (с, 1H, NH). ¹³С NMR (DMSO-d6) δ 13.86 (-ОС₁₁Н₂₂СН₃), 22.03-31.24 (-ОСН₂С₁₀Н₂₀СН₃), 38.70 (С-2'), 60.16 (СН₂-5), 64.30-70.14 (-(С₂Н₄О)₃ОН + С-3' + -ОСН₂С₁₁Н₂₃), 72.32 (СН₂-5'), 83.55 (С-4'), 84.40 (С-1'), 111.03 (С-5), 138.47 (С-6), 150.00316 (С-2), 154.34 (-ОС(О)О-), 162.52 (С-4). UV (метанол): λmax 263.8 нм (ε 9780). MS (ESI) рассчитано для C₂₉H₅₀N₂O₁₁ 603.3487 [М+Н]+ найдено 603.3485.

Пример 3. Растворимость заявляемых соединений в воде.

Растворимость соединений в воде (Таблица 2) определяют путем перемешивания на магнитной мешалке 20 мг соединения в 3 мл воды в течение 24 ч. Осадок отделяют центрифугированием (10 мин, 14000 об/мин). Концентрацию вещества определяют, измеряя УФ-поглощение полученного раствора. Присутствие три- или тетраэтиленгликолевой группы приводило к увеличению растворимости более чем на два порядка по сравнению с исходными соединениями (Таблица 2).

Пример 4. Цитотоксическое действие заявляемых соединений в культурах клеток.

Токсичность соединений оценивают по МТТ-тесту [Niks M, Otto M. Towards an optimized MTT assay. J Immunol Methods. 1990 12;130(1):149-51]. Наращенную культуру прикрепленных клеток рассеивают на 96-ти луночный планшет в объеме 100 мкл в количестве 2*10Е5 клеток/мл. Через 24 часа к клеткам вносят тестируемые соединения в интервале концентраций 1,5-100 мкМ с шагом 1/2, инкубируют в условиях 5% СО₂, 90% влажности и при 37°С в течение 72 часов. Затем вносят по 10 мкл раствора МТТ (конечная концентрация МТТ - 0,5 мг/мл) в культуральной среде, инкубируют 4 часа в тех же условиях. По окончании инкубации среду удаляют, к окрашенным клеткам добавляют 100 мкл смеси iPrOH/0,04М HCl. Планшет выдерживают в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. Показания оптической плотности (OD) считывают на планшетном ридере Chameleon при 544 нм.

Перевиваемую прикрепленную культуру клеток VeroE6 пассируют в среде DMEM, содержащей 10% бычьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ глютамина, при 37°С, 5% СО₂ и 90% влажности.

Перевиваемую прикрепленную культуру клеток А549 растят в среде DMEM/F12, содержащей 10% бычьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ глютамина, при 37°С, 5% СО₂ и 90% влажности.

Значение CD₅₀ (концентрации соединения, вызывающей гибель 50% неинфицированных клеток) для соединений (1-1 - 1-9) было равно или превышало 100 мкМ, что близко к величинам CD₅₀ описанных в литературе соединений, проявляющих противобактериальную активность.

Пример 5. Изучение in vitro антибактериального действия полученных соединений на грамположительных и грамотрицательных бактериях.

Антибактериальное действие полученных соединений изучают по их способности ингибировать in vitro рост ряда микроорганизмов по методу двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде [S.D. Negrya, О.Е. Efremenkova, V.O. Chekhov, M.A. Ivanov., P.N. Solyev, I.G. Sumarukova, I.L. Karpenko, S.N. Kochetkov, L.A. Alexandrova, J. Antibiot. (Tokyo). 73. (2020) 236-246; Л.А. Александрова, O.B. Ефременкова, B.Л. Андронова, Г.А. Галегов, П.Н. Сольев, И.Л. Карпенко, С.Н. Кочетков. 5-[4-Алкил-(1,2,3-триазол-1-ил)-метильные] производные 2'-дезоксиуридина - ингибиторы роста бактерий и вирусов. Биоорган. химия 2016, 42, №6, 746-754].

Для изучения антибактериального действия соединений используют следующие грамположительные бактерии из коллекции Научно-исследовательского института по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе: Staphylococcus aureus ИНА 00761 (MRSA) (MRSA - метициллин-резистентные штаммы широко распространены и вызывают внутрибольничные инфекции, трудно поддающиеся современной антибиотикотерапии), Staphylococcus aureus FDA 209Р (MSSA - метициллин-чувствительный штамм); штамм Leuconostoc mesenteroides ВКПМ В-4177, отличающийся высоким уровнем природной устойчивости к гликопептидным антибиотикам группы ванкомицина, которые часто оказываются эффективными в отношении патогенных бактерий с множественной лекарственной устойчивостью, Micrococcus luteus штамм NCTC 8340; штаммы микобактерии Mycobacterium smegmatis ВКПМ Ac 1339 и mc2 155, используемые для предварительной оценки возможной активности против штаммов возбудителя туберкулеза Mycobacterium tuberculosis.

Тест-штаммы инкубируют в водной модифицированной питательной среде №2 Гаузе следующего состава (в процентах): глюкоза - 1, пептон - 0.5, триптон - 0.3, NaCl - 0.5; рН среды 7.2-7.4. Применяемый в экспериментах уровень заражения тест-культурами составлял 10⁶ клеток/мл. Изучаемые соединения растворяют в смеси вода-метанол 1:1 v/v.

Минимальные ингибирующие концентрации (мкМ) соединений представлены в Таблице 3. Гликольсодержащие нуклеозиды эффективно подавляли рост грамположительных бактерий. Наиболее активными соединениями оказались нуклеозиды с додецильным фрагментом при остатке урацила 1-3, 1-4 и 1-9.

Изобретение относится к новым олигогликоль-карбонатным пролекарствам на основе 5-модифицированных 2'-дезоксиуридинов, представленным общей формулой:

,

где R₁, R₂ и R₃ независимо друг от друга означают:

R₁=-C_mH_2m+1, (m=10, 11, 12, 14, 16);

R₂=-С(O)(ОС₂Н₄)₃ОН, -C(O)(OC₂H₄)₄OH, -Н;

R₃=-С(O)(ОС₂Н₄)₃ОН, -Н.

Технический результат: получены новые олигогликоль-карбонатные пролекарства на основе 5-модифицированных 2'-дезоксиуридинов, обладающие антибактериальной активностью в отношении ряда грамположительных бактерий, включая резистентные штаммы Staphylococcus aureus и Mycobacterium smegmatis. Предложены новые С-5-производные 2'-дезоксиуридина, которые способны подавлять рост грамположительных бактерий, включая резистентные штаммы Staphylococcus aureus и Mycobacterium smegmatis. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 5 пр.

1. Новые олигогликоль-карбонатные пролекарства на основе 5-модифицированных 2'-дезоксиуридинов, проявляющие антибактериальную активность, представленные общей формулой:

где R₁, R₂ и R₃ независимо друг от друга означают:

R₁=-C_mH_2m+1, (m=10, 11, 12, 14, 16);

R₂=-С(O)(ОС₂Н₄)₃ОН, -C(O)(OC₂H₄)₄OH, -Н;

R₃=-С(O)(ОС₂Н₄)₃ОН, -Н.

2. Соединения по п. 1, представляющие собой:

3'-О-карбонилтриэтиленгликоль-5-децилоксиметил-2'-дезоксиуридин;

3'-О-карбонилтриэтиленгликоль-5-ундецилоксиметил-2'-дезоксиуридин;

3'-О-карбонилтриэтиленгликоль-5-додецилоксиметил-2'-дезоксиуридин;

3'-О-карбонилтетраэтиленгликоль-5-додецилоксиметил-2'-дезоксиуридин;

3'-О-карбонилтриэтиленгликоль-5-тетрадецилоксиметил-2'-дезоксиуридин;

3'-О-карбонилтриэтиленгликоль-5-гексадецилоксиметил-2'-дезоксиуридин;

3'-О-карбонилтетраэтиленгликоль-5-гексадецилоксиметил-2'-дезоксиуридин;

5'-О-карбонилтриэтиленгликоль-5-ундецилоксиметил-2'-дезоксиуридин;

5'-О-карбонилтриэтиленгликоль-5-додецилоксиметил-2'-дезоксиуридин.