Способ диагностики неспецифического иммунопатологического состояния новорожденного организма Российский патент 2023 года по МПК A01K67/02 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к ветеринарной неонатологии, которое может быть использовано в клинической практике для раннего и своевременного выявления осложненного течения неонатального периода, в частности к способу диагностики неспецифического иммунопатологического состояния новорожденного организма на крупных и мелких животноводческих фермах.

Уровень техники

При изучении патентной и научно-технической информации выявлено несколько способов диагностики неспецифического иммунопатологического состояния новорожденного организма.

Известен способ диагностики неспецифического иммунопатологического состояния организма путем забора крови, приготовления из нее мазков, их фиксации и окраски с последующим подсчетом клеток белой крови. Однако известным способом невозможно определить латентные формы моноцитоза и эозинофилии у доноров или больных со скрытыми формами некоторых заболеваний - пневмонией с астматоидными проявлениями, сывороточной болезнью и другими, что снижает диагностическую достоверность (см. Руководство по клиническим лабораторным исследованиям основанное В.Е. Предтеченским [Текст] / Под ред. Л. Г. Смирновй и Е.А. Кост. - 5-е изд., перераб. и доп. - Москва : Медгиз, 1960. - 963 с.).

Известен способ диагностики нарушения состояния новорожденного во время родов, заключающийся в том, что у роженицы при раскрытии на 13 см шейки матки и повторно при раскрытии на 6-10 см определяют в эритроцитах крови активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы / Г-6-ФД / и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы / 6-ФГД /, а в сыворотке крови активность изоцитратдегидрогеназы / ИЦД / и лактатдегидрогеназы / ЛДГ /, и по изменению отношений ИЦД / ЛДГ и Г-6-ФД / 6-ФГД диагностируют нарушение состояния новорожденного в перинатальном периоде (см. А. с. СССР №670300, М.Кл.² A61B 10/00, G01N 33/16).

Этот способ имеет ряд недостатков: технически сложен, требует двухкратное определение двух ферментов сыворотки крови и двух в эритроцитах после их выделения, сложных математических расчетов; инвазивен, производится внутривенный забор крови у роженицы; необходимо динамическое /2-х кратное/ наблюдение; требуется проведение неоднократного влагалищного исследования у роженицы, что сопряжено с риском развития послеродовых инфекционных осложнений.

Известен способ определения тяжести асфиксии новорожденного, характеризующийся тем, что в 1-ые сутки жизни из пробы крови готовится суспензия эритроцитов с измерением гематокрита с последующим определением способности к деформации эритроцитов и по величине этого показателя делают вывод о степени тяжести (см. А.с. СССР №1448278, М.Кл. G01N 33/48).

Приведенный метод имеет ряд недостатков: он не направлен на прогнозирование осложнений в перинатальном периоде, а свидетельствует только о тяжести асфиксии; необходим забор крови новорожденного в 1-ые сутки жизни; для приготовления суспензии отмытых эритроцитов необходимо достаточно большое количество крови и временные затраты.

Известен способ прогнозирования состояния здоровья новорожденных телят, заключающийся в том, что в крови сухостойных коров определяют содержание метгемоглобина и при его уровне более 12,5% констатируют неблагоприятный прогноз в отношении заболеваемости желудочно-кишечными болезнями (см. патент Р.Ф. №2057485, МПК C1 A61B 10/00, A01K 67/02, опубл. 10.04.1996).

Недостатком данного способа является то, что увеличение содержания метгемоглобина в крови указывает на наличие отравления животных определенной группой токсинов, последствием которого является гипоксия плода с соответствующими изменениями клинико-функционального статуса новорожденных. Практическую значимость данный способ имеет только в случаях отравления беременных коров, что на практике встречается сравнительно редко.

Предложена дифференциальная таблица, в которой на основании параметров массы тела, высоты в холке, охвата за лопатками и др. промеров оценивают степень зрелости новорожденного (Методические рекомендации по диагностике, профилактике и лечению омфалита у новорожденных телят/ Золотарев А.И., Тумилович Г.А. и др.. / Сб. науч. тр. Гродн. гос. аграр. Ун-т. 2008).

Данный способ имеет ряд недостатков, снижающих его информативность. Так, определяемый показатель массы тела претерпевает существенные изменения в течение первых часов жизни, обусловленные не только физиологическими процессами (испарение влаги с поверхности кожи, отхождением мекония, вентиляция легких и т.д.), но и неконтролируемыми технологическими параметрами (температура и влажность внешнего воздуха, теплопроводность поверхностей, время облизывания теленка, количество выпаиваемого молозива и т.п.). Масса тела приплода также зависит от породы. Однако в условиях сравнительно широкого спектра вариантов скрещивания, используемых в хозяйствах, породные особенности массы тела менее выражены, что может дать ошибочную информацию о степени развития новорожденного. Высокая вариабельность разводимого скота также снижает информативность таких параметров как высота в холке, охват за лопатками, длина хвоста, длина последнего ребра и других промеров и зависит от породных особенностей матери. Последние определяются породой или вариантами скрещивания.

Известен способ оценки уровня естественной резистентности организма животных в ранний постнатальный период, заключающийся в том, что в сыворотке крови определяют общий белок и, при содержании его менее 50 г/л, констатируют низкий уровень резистентности организма (см. патент Р.Ф. №2260185, МПК C1, G01N 33/48, опубл. 10.09.2005)

Однако данный способ имеет сравнительно низкую информативность в отношении уровня антенатального развития, так как содержание белка в крови новорожденных в основном определяется качеством и временем выпаивания молозива.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному результату, принятый авторами за прототип, является способ диагностики неспецифического иммунопатологического состояния организма, заключающийся в том, что для диагностики неспецифического иммунопатологического состояния организма проводят забор крови и приготовления из нее мазков, их фиксация и окраска с последующим подсчетом клеток белой крови, с целью повышения диагностической достоверности, кровь предварительно смешивают с раствором цитрата натрия, культивируют на питательном агаре, готовят мазки - отпечатки через 3-5 мин, 50-60 мин от начала культивирования и по изменению физиолого-морфологического состояния клеток в мазках в процессе и по окончании культивирования диагностируют иммунопатологическое состояние организма (см. А.с. №625695 (11), М. Кл.² А61В 10/00, опубл. 30.09.1978).

Однако недостатком данного способа является отсутствие информации, акцентированной на антенатальное развитие организма. Так, причиной данного явления может быть нарушение плацентарного барьера, что не является основанием для констатации нарушения развития плода. Помимо этого, у здоровых новорожденных может содержаться в крови большое количество различных форм клеток белой крови, что является следствием особенности развития их иммунокомпетентных органов. При этом нарушения в период фетального развития являются не менее актуальными в формировании морфофункционального статуса организма.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является диагностика неспецифического иммунопатологического состояния новорожденного организма, направленного на более релевантную оценку здоровья новорожденных животных, путем проведения ферментного теста по активности карбоксипептидазы в плаценте. Данный фермент, являясь компонентом калликреин-кининовой системы (ККС), главным образом вовлечен в физиологический контроль за фетоплацентарной гомеостатичностью.

При легких формах поздних гестозов отмечена незначительная активация карбоксипептидазы, однако, при прогрессировании данной патологии наступает истощение регулирующих систем и значительное повышение его активности. Таким образом, при гестационных осложнениях отмечаются изменения в функционировании ферментных систем плаценты, в том числе тех, которые участвуют в образовании и инактивации регуляторных пептидов. Последние, в свою очередь, могут быть вовлечены в нарушение многочисленных адаптационных реакций.

Техническим результатом изобретения является повышение, достоверности лабораторного исследования (неинвазивного пренатального скрининга новорожденных животных) за счет выявления состояния повышенной ферментативной активности плацентарной ткани. Предлагаемый способ позволяет сформировать группу животных с высоким риском развития неспецифического иммунопатологического состояния.

Технический результат достигается при помощи способа диагностики неспецифического иммунопатологического состояния новорожденного организма, включающий исследование ферментативной активности ткани, причем дополнительно проводят путем проведения ферментного теста по активности карбоксипептидазы в плаценте и при активности фермента ниже 4,0 единицы животных относят к группе особей с высоким адаптивным потенциалом, а при активности фермента более 4,0 - к животным с признаками неспецифического иммунопатологического состояния.

В настоящее время все большее внимание уделяют разработке биохимических способов диагностики, основанных на многозвеньевых межсистемных процессах, отражающих патогенетические, компенсаторные, адаптивные сдвиги, сопутствующие осложненному его течению. Но, несмотря на разнообразие методов, их не всегда можно использовать в диагностическом процессе из-за сложности, а иногда из-за низкой информативности; кроме того, многие из них не обладают необходимой специфичностью.

Краткое описание чертежей и иных материалов

На фиг 1, приведены показатели активности фермента карбоксипептидазы в плацентарной ткани.

На фиг 2, приведены показатели естественной резистентности опытной группы и контрольных групп поросят.

Осуществление изобретения

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Проводят отбор материала поверхности плаценты в области дихотомического разделения пуповины размером 1,5*1,5 см. Иссекают ножницами на более мелкие кусочки и промывают холодным физиологическим раствором для удаления крови. Избыток физиологического раствора удаляют фильтровальной бумагой.

Промытую ткань плаценты освобождают от соединительной ткани, оболочек и подвергают измельчению ножницами до гомогенной массы. Затем берут навеску массой 5 граммов для приготовления 10% гомогената на 0,1 Н фосфатном буфере, pH 7,4. Навеску в одном экземпляре ткани помещают в фарфоровые чашки, и сразу замораживают в холодильнике при температуре -25 С° в течении 40 минут. При этом достигается хорошее сохранение активности фермента и облегчается процесс растирания замороженной ткани для приготовления гомогената.

В приготовленном гомогенате плаценты определяют активность плацентарного фермента. В качестве кофермента используют НАДФ (никотинамид-адении-динуклеотид-фосфат), субстратом служит лимонно-кислый натрий. Активность выражают в условных единицах (количество микрограммов восстановленного неотетраэолия иа 1 мг сухой ткани плаценты за 30 мин). Если активность карбоксипептидазы плаценты выше 4,0 единиц, то это - указывает на перинатальный риск новорожденного животного и позволяет проводить диагностику неспецифического иммунопатологического состояния. Технический результат осуществляется за счет выявления активации протеолитического фермента.

Примеры конкретного выполнения способа диагностики неспецифического иммунопатологического состояния новорожденного организма.

Пример 1.

Для апробации предлагаемого способа были сформированы контрастные группы животных. В опытную группу (10 животных) были включены свиноматки с признаками гестоза во вторую половину беременности. Контрольная группа (10 животных) свиноматок не имела изменений в физиологическом течении беременности.

Отбор материала для исследований проводили путем извлечения ножницами кусочка поверхности плаценты в области дихотомического разделения пуповины размером 1,5*1,5 см. Затем иссекают на более мелкие кусочки и промывают холодным физиологическим раствором для удаления крови. Избыток физиологического раствора удаляют фильтровальной бумагой.

Промытую ткань плаценты отделяют от соединительной ткани, оболочек и подвергают измельчению ножницами до гомогенной массы. Затем берут навеску для приготовления 10% гомогената на 0,1 Н фосфатном буфере, pH 7,4. Навеску ткани помещают в фарфоровые чашки, и сразу замораживают в холодильнике при температуре -25 С° в течении 40 минут. При этом достигается хорошее сохранение активности фермента и облегчается процесс растирания эаморожеиной ткани для приготовления гомогената.

В приготовленном гомогенате плаценты определяют активность плацентарного фермента. В качестве кофермента используют НАДФ (никотинамид-адении-динуклеотид-фосфат), субстратом служит лимонно-кислый натрий. Активность выражают в условных единицах (количество микрограммов восстановленного неотетраэолия иа 1 мг сухой ткани плаценты за 30 мин) см. фиг 1.

Пример 2.

Предлагаемый способ изучался на двух группах новорожденных поросят. В опытную группу вошли поросята, в плаценте у свиноматок которых наблюдалась повышенная активность фермента. Контрольная группа представлена поросятами от свиноматок с нормативными показателями. Различия между свиноматками по показателям протеолитической ферментативной активности были статистически достоверными. Этот показатель в опытной группе свиноматок составил 8,48±0,11 ед., а в контрольной группе - 2,70±0,25 ед.

У поросят обеих групп в суточном возрасте исследовали кровь по показателям естественной резистентности. В течении 7 месяцев учитывалась заболеваемость и летальность животных. Результаты исследований приведены в фиг. 2.

Как видно из фиг. 2, опытная и контрольная группы поросят существенно отличались друг от друга по показателям, характеризующим состояние естественной резистентности. При анализе гематологических показателей установлено, что поросята, родившиеся от свиноматок опытной группы, имеют меньшее количество эритроцитов в 1 мм³ крови (6.41±0,12) по сравнению с поросятами контрольной группы (7,63±0,08). Идентичные различия наблюдаются между группами животных по содержанию гемоглобина, скорости оседания эритроцитов (СОЭ). По содержанию лейкоцитов в 1 мм³ крови существенных различий между группами животных не установлено. Однако функциональная активность лейкоцитов у животных опытной группы было значительно ниже, чем у контрольной.

Фагоцитарная активность нейтрофилов у поросят контрольной группы составила в суточном возрасте 65,76±0,23 %, а у поросят опытной группы она была соответственно 46,84±0,41%. Имели место различия и по другим показателям лейкоцитарного фагоцитоза (ФИ, ФЧ).

Лизоцимная активность сыворотки крови также имелись достоверные различия, причем эти показатели у контрольной группы значительно превосходили опытную.

Потомство (поросята) опытной и контрольной групп отличались между собой по живой массе. Так масса тела у животных опытной группы составила 1,096±0,034 кг, а у животных контрольной - 1,596±0,019 со статистически достоверным различием соответственно.

Таким образом, по показателям естественной резистентности в суточном возрасте поросята, рожденные от свиноматок с повышенной плацентарной ферментативностью, существенно отличались от своих сверстников. Слабое проявление естественной резистентности и более низкая масса поросят у опытной группы связана с нарушением планцентарного барьера и неблагоприятным влиянием иммунологических факторов материнского организма на процессы роста и развития плода.

Важным критерием жизнеспособности новорожденных животных является заболеваемость и летальность в процессе онтогенеза. В результате проведенных испытаний было установлено, что в месячном возрасте заболеваемость в опытной группе составила 18,0%, а в контрольной 7,0%. Летальность в опытной группе составила 14,0%. В контрольной группе случаев падежа не регистрировалось. Дальнейшие наблюдения за поросятами до 7 месячного возраста показали, что процент заболеваемости и летальности в опытной группе значительно выше, чем в контрольной. Всего пало в опытной группе 29,3%, а в контрольной 7,0%.

Плод практически во всех случаях беременности в антигенном отношении является чужеродным для материнского организма, так как часть генетического материала он получает от отцовского организма.

Взаимозащита матери и плода от воздействия иммунологических факторов связана с наличием биологических барьеров - плаценты, плодных оболочек и околоплодной жидкости. Наличие плацентарного барьера исключает возможность иммунизации (изоиммунизации) организма матери антигенами плода и наоборот, попадание иммунологических факторов материнского организма в организм плода.

Учитывая высокую интенсивность процессов роста и развития, а также тот факт, что питание плода осуществляется через плаценту, важное значение имеет внутриутробное развитие и полноценность плацентарного барьера.

Из проведенного исследования можно сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение обладает в отношении известных разработок следующими преимуществами:

1. Предлагаемый способ предназначен для диагностики неспецифического иммунопатологического состояния новорожденного животного.

2. Обладает меньшей трудоемкостью в применении, делая его простым и доступным по техническому выполнению на любом сельскохозяйственном предприятии.

3. Исключается необходимость инвазивных и стрессовых манипуляций у новорожденных животных в ранних периодах постнатального развития, которыми повышается их чувствительность, с возможными осложнениями.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ диагностики риска развития неспецифического иммунопатологического состояния у новорожденных поросят, включающий выявление ферментативной активности в плацентарной ткани, отличающийся тем, что дополнительно определяют компонент калликреин-кининовой системы (ККС) – карбоксипептидазу и при показателе протеолитической ферментативной активности больше 4 ед. относят новорожденных поросят к группе риска развития неспецифического иммунопатологического состояния. Техническим результатом изобретения является повышение достоверности лабораторного исследования - неинвазивного пренатального скрининга новорожденных животных. 2 ил., 2 пр.

Способ диагностики риска развития неспецифического иммунопатологического состояния у новорожденных поросят, включающий выявление ферментативной активности в плацентарной ткани, отличающийся тем, что дополнительно определяют компонент калликреин-кининовой системы (ККС) – карбоксипептидазу и при показателе протеолитической ферментативной активности больше 4 ед. относят новорожденных поросят к группе риска развития неспецифического иммунопатологического состояния.