СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ФЕТОПЛАЦЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ У ЖИВОТНЫХ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/53 A61B5/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к ветеринарной неонатологии и ветеринарному акушерству, которое может быть использовано в клинической практике для раннего и своевременного выявления осложненного течения неонатального периода, в частности к способу диагностики фетоплацентарной недостаточности у животных на крупных и мелких животноводческих фермах.

Уровень техники

При изучении патентной и научно-технической информации выявлено несколько способов диагностики фетоплацентарной недостаточности.

Известен способ диагностики плацентарной недостаточности по (см. А. с. СССР № 1232220, М.Кл.² G01N 33/50, Бюл. №19 от 23.05.1986 года) согласно которому в плацентарной ткани проводят определение суммарного содержания свободных и мембрано-связанных рибосом и при величине этого значения менее 1,01±0,05 мг/г диагностируют плацентарную недостаточность. Основной недостаток данного способа заключается в том, что эта диагностика осуществляется уже после окончания беременности, что резко ограничивает возможность его применения.

Известен способ диагностики плацентарной недостаточности, основанный на методах ультразвукового исследования плаценты - оценке ее толщины и структуры [Демидов В.Н. Ультразвуковая плацентография. // Акушерство и гинекология. 1988. №12. С.13-18]. Для реализации способа ультразвукового исследования плаценты получают ее «эхографическую картину». Эхографическая картина плаценты формируется в результате использования в аппарате УЗИ физических особенностей прохождения и отражения ультразвуковых волн высокой частоты (3,5-5 МГц) от тканей плаценты. Морфологическое строение плаценты изменяется в зависимости от срока беременности, соответственно изменяется и эхографическая картина плаценты. Полученное изображение сопоставляют с нормальной эхографической картиной плаценты по ряду признаков: толщина, однородность строения, контуры материнской части плаценты и плодовой поверхности, появление нетипичных структур в плаценте - инфарктов, включений, кровоизлияний. Изменения эхографической картины плаценты является отражением происходящих патологических процессов в плаценте, проводящих к изменению морфологической структуры плаценты. Патологические изменения морфологии плаценты приводят к плацентарной недостаточности и нарушениям нормального развития плода. Недостатком ультразвукового исследования плаценты является наличие многообразных эхографических «картин» плаценты, которые не укладываются в традиционно применяемую классификацию стадий структуризации плаценты [Милованов А.П., Чехонацкая М.Л. Гистологическая идентификация ультразвуковых объектов плаценты // Ультразвуковая диагностика 1998. №1. С.79-82].

Известен способ диагностики плацентарной недостаточности (см. А. с. СССР № 1627987, М.Кл.² G 01N 33/48, Бюл. №5 от 15.02.1991 года) по определению в сыворотке крови активности глутаматдегидрогеназы в конце первого триместра беременности. Следует отметить, что метод характеризуется простотой исполнения, но может применяться только с 11 недель беременности, ограничивая область проявления дальнейшей патологии.

Известен способ прогнозирования фетоплацентарной недостаточности (Патент РФ № 223567, МПК G01N 33/68, опубл. 20.10.2004) Сущность способа: в сыворотке крови беременной в ранние сроки, с 5 недель гестации, определяют содержание трансформирующего фактора роста (ТФР) и эпидермального фактора роста (ЭФР) и при величине ТФР, равного 270,0 пкг/мл и выше и ЭФР 560 пкг/мл и выше, прогнозируют развитие фетоплацентарной недостаточности. Способ обеспечивает высокую точность прогноза, позволяет выявить патологию в ранние сроки беременности, что дает возможность своевременно осуществлять адекватную акушерскую тактику. Недостатками известного способа является то, что по результатам лабораторных методов исследования можно выявить лишь наличие или отсутствие плацентарной недостаточности. Однако форму плацентарной недостаточности определить невозможно, так как концентрация определяемых веществ не зависит от формы и степени выраженности плацентарной недостаточности.

Наиболее близким по технической сущности и принятый авторами за прототип является способ определения формы плацентарной недостаточности, основанный на гистологическом исследовании плаценты после родов, который позволяет определять изменения морфологического строения плаценты, выяснять по морфологическому строению плаценты вероятные причины поражения плаценты и форму плацентарной недостаточности с высокой точностью благодаря возможности получения любых образцов плаценты после родов для проведения указанных исследований [Милованов А.П. Патология системы мать - плацента - плод. (Руководство для врачей) М., Медицина. 1999. - 448 с.]. Способ реализуется в несколько этапов [Микроскопическая техника (Руководство для врачей и лаборантов, под редакцией Д.С. Саркисова и Ю.Л. Перова. М., «Медицина», 1996. - 544 с.].

Существенными недостатками прототипа является, то, что морфологические исследования плаценты после родов осуществляют в условиях специальных морфологических лабораторий, и этот процесс занимает значительное время. Затраты времени связаны с длительностью технологических операций по приготовлению образцов плаценты для микроскопического исследования: окрашивание, приготовление срезов. Этот недостаток точных, гистологических методов отмечается ведущими специалистами [Милованов А.П. Патология системы мать - плацента - плод. (Руководство для врачей) М., Медицина. 1999. - 448 с.]. «С.388. Гистологические заключения по последам поступают в родильные дома на 5-8 сутки, что делает их практически бесполезными для педиаторов и акушеров».

Также весомым недостатком имеющегося прототипа является отсутствие информации, акцентированной на антенатальное развитие новорожденного организма. Так, как причиной фетоплацентарной недостаточности может быть нарушение плацентарного барьера, что является патогномотическим основанием для констатации данного патологического явления.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является выявления риска развития фетоплацентарной недостаточности у животных, направленного на более релевантную оценку репродуктивной функции у животных, с целью полноценности следующих состояний беременности и здоровья новорожденных животных, путем проведения экспрессии CD34 иммунопозитивных клеток в эндотелиальном сосудистом слое хориона путем иммуногистохимического исследования.

При различных формах поздних гестозов отмечена незначительная активация иммунопозитивных клеток CD-34 в эндотелии плацентарной ткани, однако, при прогрессировании данной патологии наступает истощение регулирующих систем и значительное повышение его активности. Таким образом, при гестационных осложнениях отмечаются изменения в функционировании ферментных систем плаценты, в том числе тех, которые участвуют в образовании и инактивации регуляторных пептидов. Последние, в свою очередь, могут быть вовлечены в нарушение многочисленных адаптационных реакций.

Техническим результатом изобретения является повышение, достоверности лабораторного исследования (неинвазивного пренатального скрининга новорожденных животных) за счет выявления экспрессионной активности иммунопозитивных клеток в сосудистом слое хориона плаценты и при значении экспрессионной активности иммунопозитивных клеток не более 1,76±0,09 % животных относят к группе особей с высоким риском развития фетоплацентарной недостаточности. Предлагаемый способ позволяет сформировать группу животных с высоким риском развития фетоплацентарной недостаточности.

Технический результат достигается при помощи способа выявления риска развития фетоплацентарной недостаточности у животных, включающего исследование использование подходов по CD-типированию фетоплацентарного комплекса в зависимости от ферментативной активности плаценты в виде окрашенных ядер в коричневый цвет хориальной оболочки, что позволяет устанавливать нарушения и патологические состояния с целью предотвращения ранних репродуктивных потерь у сельскохозяйственных животных. При этом выявление характерных условий плацентации с именным рецептивным профилем дают возможность объективно оценить иммуногенные и реактивные возможности новорожденного организма, а также конкретизировать тактику последующих беременностей у продуктивных животных.

В настоящее время все большее внимание уделяют разработке биохимических способов диагностики, основанных на многозвеньевых межсистемных процессах, отражающих патогенетические, компенсаторные, адаптивные сдвиги, сопутствующие осложненному его течению. Но, несмотря на разнообразие методов, их не всегда можно использовать в диагностическом процессе из-за сложности, а иногда из-за низкой информативности; кроме того, многие из них не обладают необходимой специфичностью.

Краткое описание чертежей и иных материалов

На фиг. 1, приведены показатели экспрессии CD34 в ворсинах хориона свиноматок группы с активностью плацентарной карбоксипептидазы (ср. значение 8,48±0,11 ед.).

На фиг. 2, приведены показатели экспрессии CD34 в ворсинах хориона свиноматок группы с активностью плацентарной карбоксипептидазы (ср. значение 2,70±0,25 ед.).

На фиг. 3, отображены данные площади экспрессия эндотелиального маркера CD34 в ворсинах хориона свиноматок групп сравнения.

Осуществление изобретения

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом проводили исследование рецептивного профиля плацентарной ткани у свиноматок. Группы сравнения являются свиноматки с различной ферментативной активностью плацентарной ткани: первая группа с высокой активностью плацентарной карбоксипептидазы (среднее значение 8,48±0,11 ед.) и вторая группа с низкой активностью плацентарной карбоксипептидазы (среднее значение 2,70±0,25 ед.). Материал отобранный из плацентарной ткани фиксировали в 10%-м буферном растворе формалина. Проводили гистологические проводки в спиртах возрастающей концентрации и формировали парафиновые блоки. После готовили срезы диаметром 3-4 мкм и окрашивали (гематоксилином и эозином).

Следующим этапом является осуществление экспрессии CD34 иммунопозитивных клеток в эндотелиальном сосудистом слое хориона путем иммуногистохимического исследования в системе проводки и инкубации с антителами по протоколу от производителя (Dako - USA) с мышиные моноклональные антитела к CD34 - CD34 Mouse Monoclonal Antibody - фл., конц. 0,5 (мл). С применением промывного буфера ТРИС 20Х кратный для ИГХ + ТВИН20 - 20Х TBS IHC Wash Buffer + Tween 20 - фл. конц. 1000,0 мл.

В приготовленном материале плацентарной ткани определяют активность CD-34 маркера в иммунопозитивных клетках.

Примеры конкретного выполнения способа диагностики неспецифического иммунопатологического состояния новорожденного организма.

Пример 1.

Для апробации предлагаемого способа были сформированы контрастные группы животных. В опытную группу (10 животных) были включены свиноматки с признаками гестоза во вторую половину беременности. Контрольная группа (10 животных) свиноматок не имела изменений в физиологическом течении беременности.

При проведении иммуногистохимического исследования плацент свиноматок выявлены различия в экспрессивной активности маркера CD34 в ворсинах хориона групп сравнения. Так высокая оптическая плотность свидетельствует о патологии эндотелия см. фиг. 1, 2.

Экспрессия иммунопозитивных структур маркера CD34 определялась в виде окрашенных ядер в коричневый цвет хориальной оболочки. Цитоплазматическая мембрана сосудистого эндотелия представлена в микроскопической картине.

Пример 2.

Различный уровень ферментативной активности плацентарной ткани проявился в изменении уровня экспрессии CD34 отраженном на фиг. 3.

В группе животных с высокой ферментативной активностью плацентарной ткани выявлены CD34 - иммунопозитивные структуры в парацентральных зонах ворсин хориона у 87% особей. Уровень экспрессионной активности иммунопозитивных клеток составил не более 1,76±0,09 % за весь период исследования. Этот факт обуславливает дистрофические процессы в стенках сосудов плаценты и указывает на патоморфологические изменения плацентарного барьера.

Учитывая высокую интенсивность процессов роста и развития, а также тот факт, что питание плода осуществляется через плаценту, важное значение имеет внутриутробное развитие и полноценность плацентарного барьера.

Из проведенного исследования можно сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение обладает в отношении известных разработок следующими преимуществами:

1. Предлагаемый способ предназначен для диагностики фетоплацентарной недостаточности у животных.

2. Обладает меньшей трудоемкостью в применении, делая его простым и доступным по техническому выполнению на любом сельскохозяйственном предприятии.

3. Исключается необходимость инвазивных и стрессовых манипуляций у новорожденных животных в ранних периодах постнатального развития, которыми повышается их чувствительность, с возможными осложнениями.

Изобретение относится к ветеринарной неонатологии и ветеринарному акушерству, которое может быть использовано в клинической практике для выявления риска развития фетоплацентарной недостаточности у животных. Исследуют рецептивный профиль плаценты, проводят определение экспрессии эндотелиального маркера CD34 в сосудистом слое хориона плаценты. При значении экспрессионной активности иммунопозитивных клеток не более 1,76% животных относят к группе с риском развития фетоплацентарной недостаточности. Изобретение обеспечивает ускорение, упрощение и повышение точности прогнозирования патологии фетоплацентарного комплекса, способ позволяет сформировать группу животных с высоким риском развития фетоплацентарной недостаточности. 3 ил., 2 пр.

Способ выявления риска развития фетоплацентарной недостаточности у животных, включающий исследование рецептивного профиля плаценты, отличающийся тем, что проводят определение экспрессии эндотелиального маркера CD34 в сосудистом слое хориона плаценты и при значении экспрессионной активности иммунопозитивных клеток не более 1,76% животных относят к группе с риском развития фетоплацентарной недостаточности.