Способ диагностики изоиммунизации животных Российский патент 2021 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, которое может быть использовано в клинической практике для диагностики изоиммунизации у животных, в частности к способу оценки изоиммунизации эффектов в биологической системе «мать-плод-новорожденный» и использовать иммунологические методы диагностики для выявления различных заболеваний и иммунологической толерантности животного организма на крупных и мелких животноводческих фермах.

Уровень техники

При изучении патентной и научно-технической информации выявлено несколько способов диагностики изоиммунизации животных путем оценки иммунологической реактивности организма.

Известен способ определения иммунологической реактивности организма путем воздействия на организм лекарственным веществом (вводят пирогенал в дозе 0,15-0,18 мкг на 1 кг веса) и при повышении температуры до 37,0-37,5°С определяют иммунологическую реактивность в пределах нормы, при 36,6-36,9°С определяют недостаточность иммунологической реактивности (См. Авт. св. СССР №1689857, М.Кл.² G01N 33/53, 1989 г.). Данный способ имеет ряд недостатков, снижающих его информативность. Так, определяемый показатель температуры тела претерпевает существенные изменения, обусловленные не только физиологическими процессами (испарение влаги с поверхности кожи, вентиляция легких и т.д.), но и неконтролируемыми технологическими параметрами (температура и влажность внешнего воздуха, теплопроводность поверхностей). Высокая вариабельность полученных результатов, также снижает информативность таких параметров для суждения о недостаточности иммунологической реактивности.

Известен способ оценки иммунологической реактивности организма, включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы (См. Авт. св. СССР №1686364, М.Кл.² G01N 33/53, 1991 г.). Однако для реализации способа требуется дорогостоящее оборудование и биопрепараты. Кроме того, способ недостаточно информативен, а также сложен.

Известен способ оценки иммунологической реактивности организма включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы и определение концентрации иммуноглобулинов и специфических антител в плазме, отличающийся тем, что, дополнительно определяют концентрацию иммуноглобулинов A, G, М и специфических сывороточных антител, сорбированных на форменных элементах крови и по соотношению концентраций иммуноглобулинов и специфических сывороточных антител в плазме и сорбированных на форменных элементах крови судят о иммунологической реактивности организма (См. Патент РФ №2126154, M.Кл.² G01N 33/53, 1999 г.).

Недостаток данного способа в том, что он применим только в специальных лабораторных условиях с применением методов иммунохимии, что сужает диапазон его полезного использования в полевых условиях. Кроме того, определение концентраций иммуноглобулинов и специфических сывороточных антител в плазме и сорбированных на форменных элементах крови достаточно сложно технически и требует значительных временных затрат, специального оборудования и реактивов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному результату, принятый авторами за прототип является способ оценки иммунологической реактивности организма, включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы и определение иммунологических показателей клеток крови, по которым судят о состоянии организма (См. Патент РФ №1813213, M.Кл.² G01N 33/53, 1993 г.).

Однако недостатком данного способа является повышенная травматичность, т.к. отбор крови производится из локтевой вены, что особенно сложно для тяжелобольных и в педиатрической практике. Из-за невозможности проведения анализа после длительного хранения проб исключается проведение скрининговых исследований. Способ недостаточно информативен, т.к. позволяет определить предрасположенность к небольшому количеству заболеваний, характеризуется низкой пропускной способностью из-за длительности процесса.

В известных способах диагностика изоиммунизационного состояния проводится без выявления и определения значений титра антител и не позволяет достоверно установить наличие и степень тяжести изоиммунного эффекта в функциональной системе «мать-плод-новорожденный». Эффективных методов диагностики изоиммунизации материнского организма и новорожденного потомства в настоящее время не существует.Наш способ будет выявлять уже доступные изменения с первых часов жизни у полученного потомства и материнского организма.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа диагностики изоиммунизации у животных, направленного на более релевантное определение иммуногенности антигенов материнского организма в отношении аллоиммунизированых факторов у потомства, позволяющего в относительно короткие сроки определить уровень развития иммунологической толерантности.

Техническим результатом изобретения является повышение, достоверности лабораторного исследования (неинвазивного пренатального скрининга изоиммунизационных эффектов у плода по крови беременной) за счет выявления состояния повышенной чувствительности материнского организма к антигенам плода реакцией эритрогемолиза в присутствии специфических белков новорожденного организма. Предлагаемый способ позволяет сформировать группу животных с высоким риском развития иммунологической толерантности.

Технический результат достигается при помощи способа диагностики изоиммунизации у животных включающий исследование крови с дополнительным проведением биологического теста, в качестве которого используют реакцию эритрогемолизаа, а по показателям СОЭ и гемолиза -более 20%, исследуемых животных относят к особям с повышенной иммунологической толерантностью среди однородной выборки.

Предлагаемый способ включает в себя схему, базирующуюся на принципах:

1. Введения различным группам беременных животных доз антигена через определенные интервалы, отличающихся числом инъекций антигена и соответственно суммарной нагрузкой антигена на одно животное.

2. Последующего одномоментного тестирования индивидуальных образцов сывороток, определения уровня изоиммунизации у материнского организма и новорожденного животного путем оценки параметров эритрогемолиза и скорости оседания эритроцитов.

3. Определение предельно допустимой антигенной нагрузки на животного для предотвращения изоиммунизации и степень иммунологической толерантности.

Краткое описание чертежей и иных материалов

В таблице 1, приведена схема иммунизации антигеном свиноматок опытной и контрольной групп.

В таблице 2, приведены показатели аллергической альтерации эритроцитов свиноматок опытных и контрольной групп.

В таблице 3, приведены показатели естественной резистентности опытной группы и контрольных групп поросят.

Осуществление изобретения

Примеры конкретного выполнения способа диагностики изоиммунизации животных.

Пример 1.

Опыт осуществляется путем формирования шести групп животных по 7 особей в каждой группе и отличия между каждой последующей группой животных от предыдущей заключаются в количестве осуществляемых инъекций исследуемого антигена, а контрольной является седьмая группа интактных особей этой же популяции, не получавших антиген (см. таблица 1).

В качестве объекта исследования использовали 49 супоросных свиноматок крупной белой породы (вторая половина беременности за 30 суток до предполагаемого опроса), с кратностью опросов более 2-х. Антигеном служила живая вакцина против рожи свиней из штамма ВР-2 живая сухая «Рувак»

Инъекцию производят всем опытным группам свиноматок смесью равных объемов, по 1,0 см³, 25 мкг антигена в физиологическом растворе внутримышечно за ухом. Через 7 дней у животных первой группы проводят забор крови, отделяют сыворотку, а для оценки динамики накопления гуморальных антител используют твердофазный иммуноферментный метод, индивидуальные пробы сывороток исследуют в разведениях с двукратным шагом, начиная с разведения 1:100, после завершения реакции и аппаратного учета результатов реакции производят статистическую обработку данных для каждой группы животных, определяют достоверность отличий показателей между группами, группа животных с наивысшими показателями титров антител к антигену является той группой, которая получила оптимальную дозу, эффективно стимулирующую выработку гуморальных антител.

Оценка изоиммунного эффекта в биологической системе «мать-плод-новорожденный» осуществляется за счет выявления состояния повышенной чувствительности материнского организма к антигенам плода реакцией эритрогемолиза клеток в присутствии специфических белков новорожденного организма. Белки сыворотки крови изоиммунизированных новорожденных, вызывают специфические повреждения сенсибилизированных эритроцитов крови материнского организма и не действуют на эритроциты, которые по отношению к ним не проявляют повышенной чувствительности. Благодаря этому представляется возможным по установленной формуле вычислить процент лизированных эритроцитов материнского животного под воздействием сыворотки крови новорожденного животного. После чего провести оценку выполненной реакции и установить прогноз иммунологической толерантности у потомства.

Все образцы сывороток тестируют одномоментно с соблюдением одинаковых условий постановки опыта, что позволяет объективно определить динамику накопления гуморальных антител в крови животных, получивших различные суммарные дозы антигена, а также предельно допустимую антигенную нагрузку на одно животное, превышение которой может привести к толерантности.

Пример 2.

В две пробирки вносят по 0,5 мл слабо подкрашенного метиленовой синькой раствора ацидин-пепсина в концентрации 30 мг/мл. В первую (опытную) добавляют 0,2 мл сыворотки крови новорожденного, а во вторую (контрольную) - 0,2 мл стерильного физиологического раствора. Затем в каждую пробирку добавляют по 0,04 мл крови материнского животного организма. Пробы тщательно перемешивают и помещают в термостат на 2 часа при температуре 37,5°С.

Кислая среда раствора ацидин-пепсина создает условия для осмотического разрушения эритроцитов исследуемой крови.

Белки сыворотки крови новорожденных, содержащиеся в опытной пробе, вызывают специфические повреждения сенсибилизированных эритроцитов крови материнского организма и не действуют на эритроциты, которые по отношению к ним не проявляют повышенной чувствительности. Выявить повреждения эритроцитов путем подсчета возможно лишь в том случае, если они будут полностью разрушены. Разрушение поврежденных эритроцитов осуществляется ферментом пепсином, который в кислой среде действует только на поврежденные клетки и не действует на неповрежденные. Такое избирательное действие пепсина на поврежденные эритроциты обеспечивает разницу при их подсчете.

После инкубирования содержимым обеих пробирок поочередно заполняют камеру Горяева и посчитать эритроциты в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых (т.е. в 80 малых квадратах) по общепринятой тривиальной методике, принятой для подсчета эритроцитов.

Для вычисления процента лизированных эритроцитов материнского животного под воздействием сыворотки крови новорожденного животного используют формулу:

где, ПАЭ - показатель аллергической альтерации эритроцитов;

Э - количество эритроцитов.

Пример 3.

По примеру 1. в первые дни после опороса у свиноматок и соответственно у их поросят были взяты пробы крови и определены показатели аллергической альтерации эритроцитов (см. таблицу 2).

Итак, всего было исследовано 49 свиноматок и у 18 из них установлена повышенная чувствительность к белкам сыворотки новорожденных, т.е. показатель аллергической альтерации эритроцитов составил 20% и выше.

Поросята, рожденные от свиноматок с повышенной чувствительностью к фетальным антигенам (показатель аллергической альтерации эритроцитов 20% и более) были менее жизнеспособными, что подтверждает пример 3.

Пример 4.

Предлагаемый способ изучался на 7 группах новорожденных поросят по 5 голов каждой. В опытную группу вошли поросята, у маток которых наблюдалась повышенная чувствительность к антигенам новорожденных (см. пример 2). Контрольная группа представлена поросятами от несенсибилизированных свиноматок. Различия между свиноматками по показателям аллергической альтерации эритроцитов были статистически достоверными. Этот показатель со средним значением в группе свиноматок с повышенной чувствительностью составил 22.20±0,12%, а в контрольной группе - 7,38±0,09%.

У поросят контрольных и опытных групп в суточном возрасте исследовали кровь по показателям естественной резистентности. В течении 7 месяцев учитывалась заболеваемость и летальность животных. Результаты исследований приведены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, опытная и контрольная группы поросят существенно отличались друг от друга по показателям, характеризующим состояние естественной резистентности. При анализе гематологических показателей установлено, что поросята, родившиеся от сенсибилизированных свиноматок, имеют меньшее количество эритроцитов в 1 мм³ крови (5.15±0,12) по сравнению с поросятами контрольной группы (10,41±0,08). Идентичные различия наблюдаются между группами животных по содержанию гемоглобина, скорости оседания эритроцитов (СОЭ). По содержанию лейкоцитов в 1 мм³ крови существенных различий между группами животных не установлено. Однако функциональная активность лейкоцитов у животных опытной группы было значительно ниже, чем у контрольной.

Фагоцитарная активность нейтрофилов у поросят контрольной группы составила в суточном возрасте 45,76±0,11%, а у поросят опытных групп она была в среднем соответственно 58,72±0,02%. Имели место различия и по другим показателям лейкоцитарного фагоцитоза (ФИ, ФЧ).

Лизоцимная активность сыворотки крови также имелись достоверные различия, причем эти показатели у контрольной группы значительно превосходили опытную.

Установлено, что за названный период наблюдения поросята от свиноматок опытных групп по абсолютному приросту, среднесуточному привесу достоверно превосходят на 52.4% и 75,6%, контрольную группу. Причем сохранность в контрольной группе составила 100%, заболеваемость - 19,7%. В то время как у особей из опытных групп сохранность была 70,2%, заболеваемость - 44,8%, а смертность - 29,8% (см. таблицу 3).

Таким образом, по показателям естественной резистентности в суточном возрасте поросята, рожденные от свиноматок с повышенной чувствительностью к белкам сыворотки крови, существенно отличались от своих сверстников. Слабое проявление естественной резистентности связана с нарушением плацентарного барьера, явлениями изоиммунизации материнского организма антигенами плода и неблагоприятным влиянием иммунологических факторов материнского организма на процессы роста и развития плода.

Доказательством того, что изоиммунизация в период беременности имела место, может служить увеличение скорости оседания эритроцитов и снижения их количества у поросят опытной группы по отношению к контрольной. Известно, что изоиммунные антитела, попадая в организм плода через плаценту или с молозивом, вступают в иммунологическую реакцию с эритроцитами новорожденного, которые содержат антитела. Это приводит к изменению коллоидных свойств оболочек эритроцитов, в результате чего они легко агглютинируют и подвергаются разрушению.

При нарушении плацентации (плацентарного барьера) возникает состояние иммунного конфликта, характеризующегося реакцией антиген-антитело и осуществляющегося через плаценту (по отношению к плоду), либо через молозиво после рождения (по отношению к новорожденному организму).

Из проведенного исследования можно сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение обладает в отношении известных разработок следующими преимуществами:

1. Предлагаемый способ предназначен для диагностики изоиммунного состояния животного и установления факта иммунологической толерантности.

2. Обладает меньшей трудоемкостью в применении, делая его простым и доступным по техническому выполнению на любом сельскохозяйственном предприятии.

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, которое может быть использовано в клинической практике для диагностики изоиммунизации у животных, в частности к способу оценки изоиммунизационных эффектов в биологической системе «мать-плод-новорожденный». Предлагаемое изобретение касается способа определения степени иммунологической толерантности у животных и включает: исследование крови, где проводят биологический тест, в качестве которого используют реакцию эритрогемолиза для определения процента лизированных эритроцитов материнского животного под воздействием сыворотки крови новорожденного животного. Далее вычисляют процент лизированных эритроцитов по формуле с определением показателя аллергической альтерации эритроцитов (ПАЭ). При увеличении скорости оседания эритроцитов (СОЭ) по отношению к СОЭ в контрольной группе и гемолиза более 20% исследуемых новорожденных животных относят к группе с повышенной иммунологической толерантностью среди однородной выборки. Изобретение обеспечивает повышение достоверности лабораторного исследования (неинвазивного пренатального скрининга) и позволяет сформировать группу животных с высоким риском развития иммунологической толерантности. 4 пр., 3 табл.

Способ определения степени иммунологической толерантности у животных, включающий исследование крови, отличающийся тем, что проводят биологический тест, в качестве которого используют реакцию эритрогемолиза для определения процента лизированных эритроцитов материнского животного под воздействием сыворотки крови новорожденного животного, где вычисляют процент лизированных эритроцитов по формуле

,

где ПАЭ - показатель аллергической альтерации эритроцитов;

Э - количество эритроцитов, и при увеличении скорости оседания эритроцитов (СОЭ) по отношению к СОЭ в контрольной группе и гемолиза более 20%, исследуемых новорожденных животных относят к группе с повышенной иммунологической толерантностью среди однородной выборки.