Способ определения изоантигенной нагрузки в функциональной системе "мать-плод-новорожденный" Российский патент 2021 года по МПК G01N33/53 A01K67/02 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, которое может быть использовано в клинической практике для диагностики изоантигенной нагрузки у животных, в частности к способу определения изоантигенной нагрузки в функциональной системе «мать-плод-новорожденный» и использовать иммунологические методы диагностики для выявления различных заболеваний и предрасположенности к иммунологической толерантности животного организма на крупных и мелких животноводческих фермах.

Уровень техники

При изучении патентной и научно-технической информации выявлено несколько способов определения изоантигенной нагрузки в функциональной системе «мать-плод-новорожденный» путем оценки иммунологической реактивности организма.

Известен способ определения иммунологической реактивности организма путем воздействия на организм лекарственным веществом (вводят пирогенал в дозе 0,15-0,18 мкг на 1 кг веса) и при повышении температуры до 37,0-37,5°C определяют иммунологическую реактивность в пределах нормы, при 36,6-36,9°C - определяют недостаточность иммунологической реактивности (См. Авт. св. СССР №1689857, М.Кл.² G01N 33/53, 1989 г.). Данный способ имеет ряд недостатков, снижающих его информативность. Так, определяемый показатель температуры тела претерпевает существенные изменения, обусловленные не только физиологическими процессами (испарение влаги с поверхности кожи, вентиляция легких и т.д.), но и неконтролируемыми технологическими параметрами (температура и влажность внешнего воздуха, теплопроводность поверхностей). Высокая вариабельность полученных результатов, также снижает информативность таких параметров для суждения о недостаточности иммунологической реактивности.

Известен способ оценки иммунологической реактивности организма, включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы (См. Авт. св. СССР №1686364, М.Кл.² G01N 33/53, 1991 г.). Однако для реализации способа требуется дорогостоящее оборудование и биопрепараты. Кроме того, способ недостаточно информативен, а также сложен.

Известен способ оценки иммунологической реактивности организма включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы и определение концентрации иммуноглобулинов и специфических антител в плазме, отличающийся тем, что, дополнительно определяют концентрацию иммуноглобулинов A, G, М и специфических сывороточных антител, сорбированных на форменных элементах крови и по соотношению концентраций иммуноглобулинов и специфических сывороточных антител в плазме и сорбированных на форменных элементах крови судят об иммунологической реактивности организма (См. Патент РФ №2126154, М.Кл.² G01N 33/53, 1999 г.).

Недостаток данного способа в том, что он применим только в специальных лабораторных условиях с применением методов иммунохимии, что сужает диапазон его полезного использования в полевых условиях. Кроме того, определение концентраций иммуноглобулинов и специфических сывороточных антител в плазме и сорбированных на форменных элементах крови достаточно сложно технически и требует значительных временных затрат, специального оборудования и реактивов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному результату, принятый авторами за прототип является способ оценки иммунологической реактивности организма, включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы и определение иммунологических показателей клеток крови, по которым судят о состоянии организма (См. Патент СССР №1813213, M.Кл.² G01N 33/53, 1993 г.).

Однако недостатком данного способа является повышенная травматичность, т.к. отбор крови производится из локтевой вены, что особенно сложно для тяжелобольных и в педиатрической практике. Из-за невозможности проведения анализа после длительного хранения проб исключается проведение скрининговых исследований. Способ недостаточно информативен, т.к. позволяет определить предрасположенность к небольшому количеству заболеваний, характеризуется низкой пропускной способностью из-за длительности процесса.

В известных способах определения изоантигенной нагрузки в функциональной системе «мать-плод-новорожденный» проводится без выявления и определения значений титра антител и не позволяет достоверно установить наличие и степень тяжести изоиммунного эффекта в функциональной системе «мать-плод-новорожденный». Эффективных методов диагностики изоантигенной нагрузки в функциональной системе «мать-плод-новорожденный» в настоящее время не существует. Наш способ будет выявлять уже доступные изменения с первых часов жизни у полученного потомства и материнского организма.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа определения изоантигенной нагрузки в функциональной системе «мать-плод-новорожденный», направленного на более релевантное определение иммуногенности антигенов материнского организма в отношении аллоиммунизированых факторов у потомства, позволяющего в относительно короткие сроки определить уровень развития иммунологической толерантности.

Техническим результатом изобретения является повышение, достоверности лабораторного исследования (неинвазивного пренатального скрининга изоиммунизационных эффектов у плода по крови беременной) за счет выявления состояния повышенной чувствительности материнского организма к антигенам плода реакцией скорости оседания эритроцитов в присутствии специфических белков новорожденного организма. Предлагаемый способ позволяет сформировать группу животных с высоким риском развития иммунологической толерантности.

Цель изобретения - повышение точности и упрощения процедуры определения нарушения плацентарных условий путем оценки антигенного постоянства материнского организма и организма потомства.

Технический результат достигается при помощи способа определения изоантигенной нагрузки в функциональной системе «мать-плод-новорожденный» по биологическому тесту при чем, с целью повышения точности и упрощения способа, в качестве биологического теста используют скорость оседания эритроцитов в реакции с пробами крови материнского организма во взаимодействии с сывороткой крови потомства и крови новорожденного животного в присутствии сыворотки крови матери, а также о контрольных пробах крови матери и новорожденного животного с физиологическим раствором, после чего вычисляют коэффициент прогноза по формуле:

где К - критерий изоантигенной нагрузки;

СОЭо1, СОЭо2 - скорость оседания эритроцитов материнской крови в присутствии сыворотки крови новорожденного и скорость оседания эритроцитов крови новорожденного в присутствии сыворотки крови матери. СОЭк1, СОЭк2 - скорость оседания эритроцитов материнской крови в присутствии изотонического раствора хлористого натрия и скорость оседания эритроцитов крови новорожденного о присутствии изотонического раствора хлористого натрия и при значении коэффициента не более 29 считают поросят без антигенной изоиммунизации, а при повышении коэффициента выше 43 с нарушением фетоплацентарного комплекса.

Краткое описание чертежей и иных материалов

В таблице 1 приведена скорость оседания эритроцитов крови системы «мать-плод-новорожденный» и степень антигенной нагрузки у новорожденных животных.

Осуществление изобретения

В период беременности со стороны материнского организма и со стороны плода устанавливается иммунобиологический контроль за антигенным постоянством в функциональной системе «мать-плод». При возникающих нарушениях функционального состояния данной системы происходит нарушение иммунологического равновесия, что влечет за собой структурные нарушения иммунной системы матери и плода. Исходя из этого, для полноценного воспроизводства сельскохозяйственных животных необходимо разработать способы оценки антигенного постоянства материнского организма и организма потомства.

Примеры конкретного выполнения способа определения изоантигенной нагрузки в функциональной системе «мать-плод-новорожденный».

Пример 1

У 20 свиноматок после родов и от них полученных 180 поросят для оценки антигенного влияния на иммунную систему новорожденного животного в период внутриутробного развития у материнского организма сразу после родов из яремной вены и у полученного потомства из пуповинной крови до приема молозива отбирают кровь. Часть крови 1/3 используют для получения сыворотки крови материнского организма и новорожденного животного. В пипетку Панченкова отбирают сыворотку крови новорожденного до метки Р и переносят на часовое стекло. Затем после ополаскивания пипетки в растворе гепарина аналогичным способом до метки К отбирают кровь материнского организма и вносят в лунку часового стекла. После в течение 1 минуты перемешивают концом пипетки и набирают пипетку (сыворотка крови новорожденного + кровь материнского организма) до метки К, устанавливая в штатив по 450. В качестве контроля используют постановку реакции, в которой вместо крови материнского организма используют изотонический физиологический раствор NaCl 0,9%.

Для оценки антигенного влияния на иммунную систему материнского организма в период беременности у материнского организма сразу после родов из яремной вены и у полученного потомства из пуповинной крови до приема молозива отбирают кровь. Часть крови 1/3 используют для получения сыворотки крови материнского организма и новорожденного животного. В пипетку Панченкова отбирают сыворотку крови материнского организма до метки Р и переносят на часовое стекло. Затем после ополаскивания пипетки в растворе гепарина аналогичным способом до метки К отбирают кровь новорожденного организма и вносят в лунку часового стекла. После в течение 1 минуты перемешивают концом пипетки и набирают пипетку (сыворотка крови материнского организма + кровь новорожденного организма) до метки К, устанавливая в штатив по 450. В качестве контроля используют постановку реакции, в которой вместо крови новорожденного используют изотонический физиологический раствор NaCl 0,9%.

Учет реакции проводят через 1 час, анализируя качественные изменения в пробирке Панченкова с наклоном на 45° в опытном и контрольном образце. Животных относят в группу с нарушением антигенного равновесия в фетоплацентарном комплексе с разницей СОЭ в опытной и контрольной пробах в пределах 3,9-8,9 мм за 1 час.

Для определения изоантигенной нагрузки в функциональной системе «мать-плод-новорожденный» вычисляют коэффициент изоантигенной нагрузки по формуле

где К1 и К2 - коэффициенты изоантигенной нагрузки в цункциональной системе «мать-плод-новорожденный»; СОЭо1, СОЭо2 - скорость оседания эритроцитов материнской крови в присутствии сыворотки крови новорожденного и скорость оседания эритроцитов крови новорожденного в присутствии сыворотки крови матери. СОЭк1, СОЭк2 - скорость оседания эритроцитов материнской крови в присутствии изотонического раствора хлористого натрия и скорость оседания эритроцитов крови новорожденного о присутствии изотонического раствора хлористого натрия.

Степень изоантигенной нагрузки определяли по результатам исследования скорости оседания эритроцитов в опыте и контроле через 1 ч. СОЭ жизнеспособных новорожденных животных составляла в среднем в опыте 3.1 и 2.4, в контроле, соответственно, 2.3 и 1,7 мм в 1 ч. Коэффициент изоантигенной нагрузки у жизнеспособных новорожденных составил о пределах 26-29 и приведен в таблице 1.

Пример 2

У 10 свиноматок после родов и полученных от них 96 новорожденных поросят отбирали кровь. Взятие крови и проведение исследования проводят в соответствии с примером 1. Изоантигенную нагрузку новорожденных животных определяли по результатам СОЭ в опытной и контрольной пробах через 1 ч. Скорость оседания эритроцитов (средние значения) поросят составила в опытной реакции 8,2 и 9,3, а в контрольном опыте 4,2-5,7 мм в 1 час, см. таблицу 1.

Пример 3

У 11 свиноматок после родов и 121 поросенка при рождении брали кровь для определения степени изоантигенной нагрузки новорожденных животных. Взятие крови и проведение исследования проводят в соответствии с примером 1. Для осуществления способа изоантигенной нагрузки новорожденных поросят определяли скорость оседания эритроцитов материнской крови в присутствии сыворотки новорожденного и СОЭ крови новорожденного о присутствии сыворотки крови матери. По результатам исследования скорости оседания эритроцитов через 1 ч в опыте и контроле определяли степень жизнеспособности поросят при рождении. СОЭ у нежизнеспособных животных составила в среднем опыте 15.3 и 13,9 мм в 1 ч, а в контроле соответственно 6.4 и 5.2 мм в 1 ч. Коэффициент изоантигенной нагрузки в функциональной системе «мать-плод-новорожденный» у нежизнеспособных поросят был высоким и составил в пределах 57-69. Все новорожденные животные были подвержены к различным заболеваниям, которые приводили к отходу. Причиной падежа поросят были заболевания системы органов дыхания и пищеварения. Использование способа обеспечивает повышение точности и снижение трудоемкости определения изоантигенной нагрузки животного организма при различных функциональных состояниях.

Из проведенного исследования можно сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение обладает в отношении известных разработок следующими преимуществами:

1. Предлагаемый способ предназначен для определения изоантигенной нагрузки в функциональной системе «мать-плод-новорожденный».

2. Обладает меньшей трудоемкостью в применении, делая его простым и доступным по техническому выполнению на любом сельскохозяйственном предприятии.

Изобретение относится к области к ветеринарной иммунологии. Предложен способ определения изоантигенной нагрузки в функциональной системе «мать-плод-новорожденный». Способ включает забор крови из яремной вены после родов свиноматки и из пуповинной крови от новорожденного поросенка, получение первого опытного образца (сыворотка крови поросенка + кровь свиноматки) и второго опытного образца (сыворотка крови свиноматки + кровь поросенка), а также контрольные образцы. После опытные и контрольные образцы размещают на штативе и анализируют качественные изменения. Для определения изоантигенной нагрузки в функциональной системе «мать-плод-новорожденный» вычисляют коэффициент изоантигенной нагрузки в функциональной системе «мать-плод-новорожденный». При значении коэффициента не более 29 новорожденного животного считают без антигенной изоиммунизации, а при повышении 43 - с нарушением фетоплацентарного комплекса. Изобретение обеспечивает повышение достоверности лабораторного исследования и формирование группы животных с высоким риском развития иммунологической толерантности. 1 табл., 3 пр.

Способ определения изоантигенной нагрузки в функциональной системе «мать-плод-новорожденный», отличающийся тем, что осуществляют забор крови у материнского организма, представляющего собой свиноматку, из яремной вены после родов и от нее полученного новорожденного животного, представляющего собой поросенка, из пуповинной крови до приема молозива, где часть указанной крови используют для получения сыворотки крови материнского организма и новорожденного животного, далее получают первый опытный образец - сыворотка крови новорожденного животного + кровь материнского организма и второй опытный образец - сыворотка крови материнского организма + кровь новорожденного организма, а также контрольные образцы, где для первого опытного образца используют первый контроль - сыворотка крови материнского организма + изотонический физиологический раствор NaCl 0,9% и для второго опытного образца используют второй контроль - сыворотка крови новорожденного животного + изотонический физиологический раствор NaCl 0,9%, после чего указанные опытные и контрольные образцы размещают на штативе с наклоном 45° и через 1 час осуществляют учет реакции, анализируя качественные изменения, для определения изоантигенной нагрузки в функциональной системе «мать-плод-новорожденный», вычисляя коэффициент (K1, К2) изоантигенной нагрузки в функциональной системе «мать-плод-новорожденный» по формуле:

где:

СОЭ o1 - скорость оседания эритроцитов крови материнского организма в присутствии сыворотки крови новорожденного животного;

СОЭ о2 - скорость оседания эритроцитов крови новорожденного животного в присутствии сыворотки крови материнского организма;

СОЭ к1 - скорость оседания эритроцитов крови материнского организма в присутствии изотонического раствора хлористого натрия;

СОЭ к2 - скорость оседания эритроцитов крови новорожденного животного в присутствии изотонического раствора хлористого натрия;

и при значении коэффициента не более 29 новорожденного животного считают без антигенной изоиммунизации, а при повышении 43 - с нарушением фетоплацентарного комплекса.