Способ определения иммунологической реактивности организма животных Российский патент 2020 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к ветеринарной иммунологии, которое может быть использовано в клинической практике для оценки иммунологической реактивности организма животного, в частности к способу оценки иммуносупрессивных эффектов в биологической системе «мать-плод-новорожденный» и использовать иммунологические методы диагностики для выявления различных заболеваний животного организма на крупных и мелких животноводческих фермах.

Уровень техники

При изучении патентной и научно-технической информации выявлено несколько способов определения иммунологической реактивности.

Известен способ определения иммунологической реактивности организма путем воздействия на организм лекарственным веществом (вводят пирогенал в дозе 0,15-0,18 мкг на 1 кг веса) и при повышении температуры до 37,0-37,5°С определяют иммунологическую реактивность в пределах нормы, при 36,6-36,9°С определяют недостаточность иммунологической реактивности (См. Авт. св. СССР №1689857, М. Кл.² G01N 33/53, 1989 г.). Данный способ имеет ряд недостатков, снижающих его информативность. Так, определяемый показатель температуры тела претерпевает существенные изменения, обусловленные не только физиологическими процессами (испарение влаги с поверхности кожи, вентиляция легких и т.д.), но и неконтролируемыми технологическими параметрами (температура и влажность внешнего воздуха, теплопроводность поверхностей). Высокая вариабельность полученных результатов, также снижает информативность таких параметров для суждения о недостаточности иммунологической реактивности.

Известен способ оценки иммунологической реактивности организма, включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы (См. Авт. св. СССР №1686364, М. Кл.² G01N 33/53, 1991 г.). Однако для реализации способа требуется дорогостоящее оборудование и биопрепараты. Кроме того, способ недостаточно информативен, а также сложен.

Известен способ оценки иммунологической реактивности организма включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы и определение концентрации иммуноглобулинов и специфических антител в плазме, отличающийся тем, что, дополнительно определяют концентрацию иммуноглобулинов A, G, М и специфических сывороточных антител, сорбированных на форменных элементах крови и по соотношению концентраций иммуноглобулинов и специфических сывороточных антител в плазме и сорбированных на форменных элементах крови судят об иммунологической реактивности организма (См. Патент РФ №2126154, М. Кл.² G01N 33/53, 1999 г.).

Недостаток данного способа в том, что он применим только в специальных лабораторных условиях с применением методов иммунохимии, что сужает диапазон его полезного использования в полевых условиях. Кроме того, определение концентраций иммуноглобулинов и специфических сывороточных антител в плазме и сорбированных на форменных элементах крови достаточно сложно технически и требует значительных временных затрат, специального оборудования и реактивов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному результату, принятый авторами за прототип является способ оценки иммунологической реактивности организма, включающий взятие крови, разделение ее на плазму и форменные элементы и определение иммунологических показателей клеток крови, по которым судят о состоянии организма (См. Патент РФ №1813213, M. Кл.² G01N 33/53, 1993 г.).

Однако недостатком данного способа является повышенная травматичность, т.к. отбор крови производится из локтевой вены, что особенно сложно для тяжелобольных и в педиатрической практике. Из-за невозможности проведения анализа после длительного хранения проб исключается проведение скрининговых исследований. Способ недостаточно информативен, т.к. позволяет определить предрасположенность к небольшому количеству заболеваний, характеризуется низкой пропускной способностью из-за длительности процесса.

Недостатком большинства способов оценки иммунологической реактивности организма является их акцентирование на возможности оценить клеточно-опосредованный иммунный ответ, который у живого организма особенно важно при иммунодефиците и иммуносупрессии. Иммунодефицит характеризуется снижением способности вызывать эффективный иммунный ответ. Такой неполный иммунный ответ или его отсутствие могут возникнуть в результате первичного или приобретенного (вторичного) иммунодефицита.

В настоящее время основной проблемой, связанной со многими маркерами, используемыми для мониторинга и определения связанных с иммунодефицитом заболеваний, является отсутствие клеточного иммунитета.

Существует необходимость в разработке способа определения иммунологической реактивности организма животных, который позволял бы оценить комбинированное функциональное состояние клеточно-опосредованной иммунологической реактивности врожденного и приобретенного иммунитета в функциональной системе «мать-плод-новорожденный» и определить факторы, вызывающие иммуносупрессию.

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа определения иммунологической реактивности организма животных, направленного на более релевантную оценку клеточно-опосредованной иммунологической реактивности по реакции НСТ-теста крови материнского организма в присутствии сыворотки крови новорожденного животного, обладающего ускорением, упрощением и повышением точности прогнозирования развития новорожденного организма.

Технический результат достигается путем оценки адсорбирующей способности эритроцитов при инкубации в растворе Хэнкса. (80% раствор смеси). Инкубацию проводят с интервалом времени от 30 минут до 3 часов. Показатели адсорбционной способности устанавливали по степени угнетения НСТ-теста компетентными клетками (нейтрофилами). Наиболее активное подавление иммуносупрессорных свойств установлено при падении биологической активности в НСТ-тесте до 40%, что связано с пределом рецепторной емкости данных клеток.

Технический результат достигается при помощи способа определения иммунологической реактивности организма животных, включающего исследование крови путем проведения биологического теста, в качестве которого используют биологическую активность эритроцитов в НСТ-тесте и по показателям их сорбционной активности - более 40%, животных относят к особям со сниженной иммунологической реактивностью среди однородной выборки.

Краткое описание чертежей и иных материалов

В таблице 1 приведены показатели сорбционной активности эритроцитов беременных свиноматок в НСТ-тесте %.

Осуществление изобретения

Примеры конкретного выполнения способа определения иммунологической реактивности организма животных.

Пример 1.

В качестве объекта исследования использовали эритроцитарные клетки 42 супоросных свиноматок (вторая половина беременности) 3-х групп, 4 группа служила контролем.

У животных отбирали 500 мкл капиллярной крови в пробирку, содержащую 45 мкл консерванта ЭДТ. После центрифугирования и удаления супернатанта к 200 мкл эритроцитарной массы добавляли 1,4 мл 100 мкМ раствора нильского голубого. Пробу центрифугируют при 3 тыс.об/мин 10 мин и супернатант удаляли. К 200 мкл эритроцитарной массы добавляли 1,4 мл 100 мкМ нильского голубого, приготовленного на физиологическом растворе с рН 7,4. Смесь перемешивали инкубировали при комнатной температуре 20 мин, затем центрифугировали 5-10 мин при 3 тыс об/мин и измеряли оптическую плотность в супернатанте при 630 нм. Чтобы исключить концентрационное снижение оптической плотности красителя, отобранную пробу супернатанта разводили в 2 раза дистиллированной водой и измеряли поглощение в кювете толщиной 0,5 см

Опытные группы подвергались гипериммунизации (использовали ассоциированные вакцины) во время беременности, а контрольная группа особей оставалась на тривиальной (принятой в хозяйстве) антигенной нагрузке. Адсорбирующую способность проводили при инкубации отмытых эритроцитов (три раза) в растворе Хэнкса. (80% раствор смеси). Инкубацию проводили с интервалом времени от 30 минут до 3 часов. Показатели адсорбционной способности устанавливали по степени угнетения НСТ-теста компетентными клетками (нейтрофилами).

Полученные результаты свидетельствуют о значительной вариабельности в зависимости от групп животных, использованных при исследовании (см. таблица 1). Сорбционная активность эритроцитов у контрольной группы особей характеризуется незначительным падением биологической активности в НСТ-тесте до 40%. Более выраженное падение сорбционной активности установлено в опытных группах из-за изменения содержания белков, повышения эластичности, снижения прочности и иммунологической активности.

Таким образом наиболее активное подавление иммуносупрессорных свойств крови установлено при биологической активности в НСТ-тесте до 40%, а повышение связано с пределом рецепторной емкости данных клеток.

Поэтому целесообразно использовать автологическую сорбционную активность эритроцитов в качестве иммунологических диагностических тестов для оценки иммунологической реактивности особей.

Пример 2.

Доказательством того, что у свиноматок опытных групп в период беременности имело место быть снижение иммуносупресорных свойств, может служить увеличение скорости оседания эритроцитов и снижения их количества у поросят опытных групп по отношению к контрольной. Известно, что изоиммунные антитела, а такие сенсибилизированные лейкоциты, попадая в организм плода через плаценту или с молозивом, вступают в иммунологическую реакцию с эритроцитами новорожденного, которые содержат антитела. Это приводит к изменению коллоидных свойств оболочек эритроцитов, в результате чего они легко агглютинируют и подвергаются разрушению.

Важным критерием жизнеспособности новорожденных животных является заболеваемость и летальность в процессе онтогенеза. В результате проведенных испытаний было установлено, что возрасте 30 дней заболеваемость в опытных группах составила 16,0, 12,0, 9,0%, а в контрольной 7,0%. Летальность в опытных группах составила 14,0%. В контрольной группе случаев падежа не регистрировалось. Дальнейшие наблюдения до 7 месячного возраста показали, что процент заболеваемости и летальности в опытных группах значительно выше, чем в контрольной. Всего пало в опытной группе 22,0%, а в контрольной 7,0%.

Сегодня достоверно известно, что эритроциты вовлекаются в патологический процесс не только при гематологических заболеваниях, но и претерпевают серьезные изменения структуры и функции при болезнях разного генеза. Доказано, что выявленные закономерности нарушений структуры и функции мембраны эритроцитов с определенной долей коррекции, обусловленной, прежде всего, видовой специфичностью клеток, могут быть экстраполированы на иные мембранные системы. Повышенный интерес исследователей к эритроциту при болезнях разного генеза обусловлен его участием в процессах, связанных с поддержанием гомеостаза, в том числе иммунных. Существующие данные не оставляют сомнений в том, что эритроциты являются важным звеном механизма иммунорегуляции при патологических состояниях и в условиях стресса.

Из проведенного исследования можно сделать вывод о том, что предлагаемое изобретение обладает в отношении известных разработок следующими преимуществами:

1. Предлагаемый способ предназначен для определения иммунологической реактивности организма животных.

2. Обладает меньшей трудоемкостью в применении, делая его простым и доступным по техническому выполнению на любом сельскохозяйственном предприятии.

3. НСТ тест практически не требует затрат: для исследования необходимо небольшое количество крови. Кроме того, для проведения анализа не используется специальное оборудование.

Изобретение относится к ветеринарии и касается способа определения иммунологической реактивности организма животных, включающего исследование крови, где дополнительно проводят биологический тест, в качестве которого используют биологическую активность эритроцитов в НСТ-тесте, где инкубацию эритроцитов осуществляют в 80% растворе Хэнкса с интервалом времени от 30 минут до 3 часов; показатели сорбционной способности эритроцитов устанавливают по степени угнетения НСТ-теста нейтрофилами, и по показателям их сорбционной способности - более 40%, животных относят к особям со сниженной иммунологической реактивностью. Изобретение обеспечивает ускорение, упрощение и повышение точности определения иммунологической реактивности особей. 2 пр., 1 табл.

Способ определения иммунологической реактивности организма животных, включающий исследование крови, отличающийся тем, что дополнительно проводят биологический тест, в качестве которого используют биологическую активность эритроцитов в НСТ-тесте, где инкубацию эритроцитов осуществляют в 80% растворе Хэнкса с интервалом времени от 30 минут до 3 часов; показатели сорбционной способности эритроцитов устанавливают по степени угнетения НСТ-теста нейтрофилами, и по показателям их сорбционной способности - более 40%, животных относят к особям со сниженной иммунологической реактивностью.