Способ прогнозирования риска развития нормотензивной глаукомы с использованием данных о полиморфизме гена ADRB1 Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 A61K49/08 

Изобретение относится к области медицины, в частности офтальмологии и может быть использовано для прогнозирования риска развития нормотензивной глаукомы.

Глаукома является оптической нейропатией, характеризующейся хроническим прогрессирующим течением. Глаукома считается одной из основных причин необратимой слепоты в мире, более 60 миллионов человек страдали глаукомой в 2010 году. В настоящее время более 105 миллионов человек имеют диагноз глаукома, в России более 1 миллиона 250 тысяч человек больны этим заболеванием. Из-за быстрого роста пожилого населения, по статистическим прогнозам, число пациентов с глаукомой будет увеличиваться, причем у большинства будет диагностироваться первичная открытоугольная глаукома (ПОУГ). Глаукома нормального давления (ГНД) представляет собой клиническую разновидность ПОУГ, при которой глаукоматозное поражение зрительного нерва происходит при максимальном внутриглазном давлении ниже 21 мм рт.ст. [Волков В.В. Глаукома при псевдонормальном давлении.: Москва: «Медицина», 2001. 352 с.]. Ранние предположения о том, что глаукома при низком внутриглазном давлении является редкой патологией, не подтвердились в многочисленных эпидемиологических исследованиях. Так, в исследовании Beaver Dam [Klein B.E.K. и др. Prevalence of Glaucoma // Ophthalmology. 1992. Т. 99. №10. С. 1499-1504.] было показано, что практически у одной трети пациентов с глаукомой внутриглазное давление не было повышено. Shiose и соавторы обследовали 8126 человек старше 40 лет и выявили, что две трети японских пациентов с глаукомой имеют ГНД [Shiose Y. и др. Epidemiology of glaucoma in Japan--a nationwide glaucoma survey // Jpn. J. Ophthalmol. 1991. Т. 35. №2. С. 133-155.]. В азиатских популяциях распространенность ГНД составила от 50 до 92% от числа лиц с ПОУГ [ Cho H., Kee C. Population-based glaucoma prevalence studies in Asians // Surv. Ophthalmol. 2014. Т. 59. №4. С. 434-447.], что значительно превышает соответствующие показатели у европейцев: 30-38% [Bonomi L. и др. Prevalence of glaucoma and intraocular pressure distribution in a defined population // Ophthalmology. 1998. Т. 105. №2. С. 209-215.].

В настоящее время выделяют ряд факторов, влияющих на развитие ГНД, таких как изменения в иммунной системе, давление спинномозговой жидкости, нарушения тонуса сосудов [Petrov S. Yu. Modern view on normal-tension glaucoma // Vestn. Oftalmol. 2020. Т. 136. №6. С. 57.]. Точный механизм влияния вышеупомянутых факторов риска развития глаукомы до сих пор полностью не выяснен, эти данные свидетельствуют о том, что факторы, не связанные с внутриглазным давлением (ВГД), имеют решающее значение для развития ГНД. Известно, что глаукома и родственные эндофенотипы (внутриглазное давление, центральная толщина роговицы, параметры диска зрительного нерва в значительной степени наследуются [Asefa N.G. и др. Heritability of glaucoma and glaucoma-related endophenotypes: Systematic review and meta-analysis // Surv. Ophthalmol. 2019. Т. 64. №6. С. 835-851.]. Значительное число генетических локусов, идентифицированных в многочисленных молекулярно-генетических исследованиях глаукомы подтверждают полигенную природу заболевания [Aboobakar I.F., Wiggs J.L. The genetics of glaucoma: Disease associations, personalised risk assessment and therapeutic opportunities‐A review // Clin. Experiment. Ophthalmol. 2022. Т. 50. №2. С. 143-162; Zukerman R. и др. Molecular Genetics of Glaucoma: Subtype and Ethnicity Considerations // Genes. 2020. Т. 12. №1. С. 55.].

Ген ADRB1 кодирует бета-1-адренергический рецептор. Бета-1 адренергический рецептор - это рецептор, связанный с G-белком, который преимущественно экспрессируется в сердечной ткани и играет важную роль в регуляции сердечного ритма, сократимости миокарда и расслаблении гладкой мускулатуры сосудов. Ген ADRB1 расположен на хромосоме 10q24.3 и состоит из двух экзонов. Многочисленные исследования связали мутации в гене ADRB1 с различными клиническими исходами, включая семейную естественную короткую продолжительность сна, гипертонию, болезни сердца и метаболические нарушения, такие как диабет и ожирение.

В зарубежном исследовании [Inagaki Y. и др. Polymorphism of beta-adrenergic receptors and susceptibility to open-angle glaucoma // Mol. Vis. 2006. Т. 12. С. 673-680.] изучалась ассоциация полиморфизмов ADRB1 с открытоугольной глаукомой Исследование показало, что определенные полиморфизмы гена ADRB1 влияют на патофизиологию ПОУГ у японских пациентов. Полиморфизм Arg389Gly в гене ADRB1 показал значительно отличающиеся частоты аллелей и генотипов у пациентов с глаукомой нормального напряжения по сравнению с контрольной группой.

Поскольку начало и прогрессирование ГНД бессимптомны, очень важным моментом является диагностика заболевания на ранних этапах, до развития необратимых изменений.

Известен «Способ прогнозирования риска развития оптической нейропатии при нормотензивной глаукоме» (Патенту RU №2593891, МПК A61B 5/00 - 10.08.2016), в котором определяют толщину сетчатки в височно-наружном и нижне-наружном отделах макулы, и при значении равном или менее 210 мкм прогнозируют риск развития оптической нейропатии при нормотензивной глаукоме.

К недостаткам данного способа относится то, что он не учитывает роль локуса гена ADRB1 и требует проведения оптической когерентной томографии.

Известен «Способ прогнозирования риска нормотензивной глаукомы» (Патент RU №2573336, МПК A61B 3/00, A61B 3/18, A61B 8/10 - 20.01.2016), в котором определяют центральную толщину роговицы и тонографический показатель - коэффициент Беккера и при толщине роговицы, равной или менее 520 мкм, и коэффициенте Беккера более 110 прогнозируют риск развития нормотензивной глаукомы.

К недостаткам способа относится то, что он не учитывает роль локуса гена ADRB1 и требует наличия специального офтальмологического оборудования: пахиметра и электронного офтальмотонографа.

Задача заявляемого изобретения является разработка способа диагностики риска развития нормотензивной глаукомы с использованием генетических данных.

Техническим результатом заявленного изобретения является возможность прогнозирования риска развития нормотензивной глаукомы на основе данных о полиморфном локусе в сочетании с данными о других факторах риска, как возраст, рост, пол, вес, наличие отягощенного семейного анализа.

Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что определяются значения следующих показателей: возраст, рост, пол, наличие отягощенного семейного анамнеза, определяется генотип по локусу rs1801253 гена ADRB1 методом полимеразной цепной реакции, вычисляется вероятность развития ГНД по формуле:

р=1/(1+е^-Z),

где е - математическая константа, приблизительно равная 2,71828;

Z=(-23,7907)+2,24⋅Х1+0,1376⋅Х2+2,2736⋅Х3+(-0,0441)⋅Х4+2,4056⋅Х5+0,0859⋅Х6, где

Х1 - генетический вариант по локусу rs1801253 (GG-X1=1; GC или CC-Х1=0),

Х2 - возраст (лет),

Х3 - пол (мужчины - 0; женщины - 1),

Х4 - вес (кг),

Х5 - отягощенный семейный анамнез (нет - 0, есть - 1),

Х6 - рост (см),

при значении р равном или большем 0,26 прогнозируют высокий риск развития нормотензивной глаукомы.

Преимуществом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является возможность ранней оценке риска развития ГНД. Данный способ имеет высокую чувствительность и специфичность, отсутствие необходимости инструментального обследования.

Детали, признаки, а также преимущества настоящего изобретения следуют из нижеследующего описания реализации заявленного технического решения с использованием чертежей, на которых показано:

Фиг. 1 - Аллельная дискриминация методом детекции TaqMan зондов по данным величин ОЕФ (относительные единицы флюоресценции) в режиме реального времени полиморфизма rs1801253 на амплификаторе CFX96, - CC, - CG,- GG.

Фиг. 2 - ROC - кривая оценки модели, включающей генетические данные по локусу rs1801253 гена ADRB1.

Способ осуществляется следующим образом.

Проводится определение следующих медико-биологических показателей: возраст, рост, пол, наличие отягощенного наследственного анамнеза.

Далее, ДНК выделяется из буккального эпителия. Выделение ДНК проводится с помощью комплекта реагентов для экстракции ДНК экспресс-методом «ЭДЭМ». Для экстракции ДНК аликвота клинического образца переносится в пробирку с «ВКО-дилюентом», после чего подвергается термической обработке, в процессе которой происходит деструкция клеточных мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов и высвобождение ДНК. С помощью последующего центрифугирования нерастворимые компоненты осаждаются на дне пробирки, а супернатант, содержащий ДНК, используется для проведения ПЦР. Находящийся в реактиве «ВКО-дилюент» внутренний контрольный образец (ВКО) проходит процедуру экстракции одновременно с ДНК, содержащейся в клиническом материале, и, таким образом, является маркером качества лабораторного исследования клинического образца.

Метод ПЦР-типирования полиморфизма rs1801253 гена ADRB1 с применением олигонуклеотидных зондов предполагает наличие в смеси для амплификации зондов, строго соответствующих последовательности аллельных вариантов гена и меченных разными флуорофорами, а также зонда с гасителем флуоресценции. После амплификации целевого фрагмента гена температура реакционной смеси понижается, зонды с источником и гасителем флуоресценции гибридизуются в непосредственной близости на ДНК-матрице. Генотипирование осуществляется при температурной денатурации дуплексов зондов и фрагментов ДНК путем измерения флуоресценции в режиме «реального времени».

ПЦР в режиме реального времени проводилась на амплификаторе CFX96 (BioRad Laboratories, США), используя коммерческие реагенты (Синтол, Москва).

В ПЦР в режиме реального времени используются олигонуклеотидные пробы, меченные флуоресцентными агентами FAM и HEX. Генотипирование исследуемых образцов осуществляют с использованием программного обеспечения «CFX-Manager™» методом дискриминации аллелей по величинам относительных единиц флуоресценции (ОЕФ) (фиг. 1).

Определяют значение вероятности развития нормотензивной глаукомы по формуле:

р=1/(1+е^-Z),

где е - математическая константа, приблизительно равная 2,71828;

Z=(-23,7907)+2,24⋅Х1+0,1376⋅Х2+2,2736⋅Х3+(-0,0441)⋅Х4+2,4056⋅Х5+0,0859⋅Х6, где

Х1 - генетический вариант по локусу rs1801253 (GG-X1=1; GC или CC-Х1=0),

Х2 - возраст (лет),

Х3 - пол (мужчины - 0; женщины - 1),

Х4 - вес (кг),

Х5 - отягощенный семейный анамнез (нет - 0, есть - 1),

Х6 - рост (см),

при значении р равном или большем 0,26 прогнозируют высокий риск развития нормотензивной глаукомы.

Пример осуществления способа.

Под наблюдением находилось 137 пациентов ГАУЗ "Республиканская клиническая офтальмологическая больница МЗ РТ им. проф. Е.В. Адамюка" (37 - пациенты с ГНД, 100 - группа контроля). Группы были сформированы с учетом офтальмологического диагноза: критерием включения в группу ГНД являлся возраст старше 40 лет, наличие диагноза глаукома нормального давления при показателях тонометрического внутриглазного давления не выше 21 мм рт.ст.

Диагноз глаукома нормального давления устанавливался на основании данных оптической когерентной томографии диска зрительного нерва и компьютерной периметрии.

Выделение ДНК проводилось из буккального эпителия у всех 137 пациентов. Типирование однонуклеотидного полиморфизма rs1801253 гена ADRB1 проводили методом полимеразной цепной реакции с флюоресцентными метками и автоматической регистрацией результатов в режиме реального времени наборами компании «Синтол» (Синтол, Москва) на приборе CFX96 (BioRad Laboratories, США).

Нормальность распределения количественных признаков оценивалась с помощью теста Шапиро-Уилка. Для описания количественных переменных с нормальным распределением использовались среднее значение, стандартное отклонение. Количественные данные, распределение которых отличалось от нормального, были описаны при помощи медианы, 25 и 75 квартилей. Проверка гипотезы о равенстве генеральных дисперсий двух групп проводилось с применением критерия Бартлетта. Сравнение групп количественных показателей с нормальным распределением проводилось с помощью t-критерия Стьюдента. Статистическая значимость различий в группах показателей с распределением, отличавшимся от нормального, определялась с использованием критериев Манна-Уитни показателями. Анализ качественных данных проводился с помощью критерия хи-квадрат (χ²). Различия считали значимыми при достижении уровня значимости P<0,05. Количественные показатели, такие как возраст, вес и рост значимо различались в группах пациентов с ГНД и контрольной группе (Таблица 1).

Анализ распределения генотипа полиморфизма rs1801253 гена ADRB1 выявил повышение встречаемости генотипа GG (в сравнении с CG+CC) в группе пациентов с ГНД, отношение шансов составило 9,03 (95% ДИ 1,28 - 64,03, р=0,03).

Группы значимо различались по полу (значение хи-квадрат (χ²)=8,96; р=0,003), отягощенному семейному анамнезу (значение χ²=14,5; р<0,001).

Прогнозирование риска развития нормотензивной глаукомы проводилось с использованием многофакторной логистической регрессии и последующего ROC анализа [Grigoryev S.G., Lobzin Yu. V., Skripchenko N.V. THE ROLE AND PLACE OF LOGISTIC REGRESSION AND ROC ANALYSIS IN SOLVING MEDICAL DIAGNOSTIC TASK // J. Infectology. 2016. Т. 8. №4. С. 36-45.]. Логистическая модель вида Z=K+β₁⋅Х1+β₂⋅Х2+…+β_n⋅Xn,

где K - константа, Xi - предикторы, β_i - коэффициенты регрессии. Далее вычислялась вероятность развития нормотензивной глаукомы по формуле

р=1/(1+e^-Z),

где р - вероятность, е - математическая константа, приблизительно равная 2,71828.

Коэффициенты регрессии, уровни значимости и статистики коллинеарности VIF [Salmerón R. и др. A note about the corrected VIF // Stat. Pap. 2017. Т. 58. №3. С. 929-945.] указаны в таблице 2.

Таблица 2 Значения константы и коэффициентов регрессии для расчета вероятности развития ГНД Предиктор Вес SE p VIF Константа -237,907 89,634 0,008 ADRB1 генотип GG:1 - 0 22,004 0,9995 0,028 1,05 Возраст (лет) 0,1376 0,0431 0,001 1,18 Пол: Женщины - Мужчины 22,736 0,8496 0,007 1,45 Вес (кг) -0,0441 0,0233 0,058 1,2 Глаукома у родственников: Да - Нет 24,056 0,7275 <0,001 1,07 Рост (см) 0,0859 0,045 0,056 1,5

При проведении ROC анализа выявлена высокая специфичность и чувствительность модели, включающей вышеперечисленные показатели у пациентов с нормотензивной глаукомой по сравнению с контрольной группой (Специфичность 0,83, чувствительность 0,83, точность 0,83, AUC 0,89, при значении отсечки, установленном на 0,26) (Фиг. 2)

Это свидетельствует о значении генотипа локуса rs1801253 гена ADRB1 в сочетании с рядом других фенотипических показателей как критерия ранней диагностики нормотензивной глаукомы.

Клинические примеры.

Пример 1.

Пациент А. были определены следующие значения показателей: генетический вариант по локусу гена ADRB1 - СС (0), рост - 172 см, вес - 80 кг, возраст - 74 года, отягощенный семейный анамнез - нет (0), пол - м (0). После подстановки значений в формулу, получены следующие результаты:

Z=(-23,7907)+2,24⋅0+0,1376⋅74+2,2736⋅0+(-0,0441)⋅80+2,4056⋅0+0,0859⋅172=-2,3612.

p=1/(1+2,718282^-(-2,3612))=0,09.

Полученное значение р меньше 0,26, поэтому пациент не был отнесен в группу риска по нормотензивной глаукоме. Последующее комплексное офтальмологическое обследование не выявило наличия нормотензивной глаукомы.

Пример 2.

Пациентка Б. были определены следующие значения показателей: генетический вариант по локусу гена ADRB1 - GG (1), рост - 162 см, вес - 59 кг, возраст - 68 года, отягощенный семейный анамнез - да (1), пол - ж (1). После подстановки значений в формулу, получены следующие результаты:

Z=(-23,7907)+2,24⋅1+0,1376⋅68+2,2736⋅1+(-0,0441)⋅59+2,4056⋅1+0,0859⋅162=3,7992.

p=1/(1+2,718282^-(3,7992))=0,98.

Полученное значение р больше 0,26, поэтому пациентка была отнесена в группу риска по нормотензивной глаукоме. Диагноз нормотензивной глаукомы был подтвержден при офтальмологическом обследовании.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать группы риска по нормотензивной глаукоме для более эффективного осуществления комплекса лечебно-профилактических мероприятий.

Изобретение относится к области медицины, в частности офтальмологии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития нормотензивной глаукомы. Описан способ прогнозирования риска развития нормотензивной глаукомы (ГНД). Определяют возраст, вес, рост, пол индивида, наличие отягощенного семейного анамнеза. Осуществляют взятие буккального эпителия. Выделяют ДНК из буккального эпителия. Проводят анализ полиморфизма rs1801253 гена ADRB1. После чего определяют значение вероятности развития ГНД по формуле: р = 1/(1+е-Z), где е – математическая константа, приблизительно равная 2,71828; Z = (-23,7907) + 2,24 ⋅ Х1 + 0,1376 ⋅ Х2 + 2,2736 ⋅ Х3 + (-0,0441) ⋅ Х4 + 2,4056 ⋅ Х5 + 0,0859 ⋅ Х6, где Х1 – генетический вариант по локусу rs1801253, где GG – X1 = 1; GC или CC – Х1 = 0, Х2 – возраст в годах, Х3 – пол, где мужчины – 0; женщины – 1, Х4 – вес в кг, Х5 – отягощенный семейный анамнез, где нет – 0, есть – 1, Х6 – рост в см. При значении р, равном или большем 0,26, прогнозируют высокий риск развития нормотензивной глаукомы. Техническим результатом заявленного изобретения является возможность прогнозирования риска развития нормотензивной глаукомы на основе данных о полиморфном локусе в сочетании с данными о других факторах риска, таких как возраст, рост, пол, вес, наличие отягощенного семейного анамнеза. Преимуществом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является возможность ранней оценки риска развития ГНД. Данный способ имеет высокую чувствительность и специфичность, отсутствие необходимости инструментального обследования. 2 ил., 2 табл., 2 пр.

Способ прогнозирования риска развития нормотензивной глаукомы (ГНД), включающий определение возраста, веса, роста, пола индивида, наличия отягощенного семейного анамнеза, взятие буккального эпителия, выделение ДНК из буккального эпителия, анализ полиморфизма rs1801253 гена ADRB1, после чего определяют значение вероятности развития ГНД по формуле:

р = 1/(1+е^-Z),

где е – математическая константа, приблизительно равная 2,71828;

Z = (-23,7907) + 2,24 ⋅ Х1 + 0,1376 ⋅ Х2 + 2,2736 ⋅ Х3 + (-0,0441) ⋅ Х4 + 2,4056 ⋅ Х5 + 0,0859 ⋅ Х6,

где Х1 – генетический вариант по локусу rs1801253, где GG – X1 = 1; GC или CC – Х1 = 0,

Х2 – возраст в годах,

Х3 – пол, где мужчины – 0; женщины – 1,

Х4 – вес в кг,

Х5 – отягощенный семейный анамнез, где нет – 0, есть – 1,

Х6 – рост в см,

при значении р, равном или большем 0,26, прогнозируют высокий риск развития нормотензивной глаукомы.