Способ одновременного определения генотипа человека по полиморфизмам в трех генах, участвующих в регуляции поведения Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/6806 

Изобретение относится к области молекулярной генетики и может быть использовано для определения генотипа человека.

Область, к которой относится изобретение.

В исследованиях генетических факторов, ассоциированных с психоэмоциональными особенностями человека, выявлены полиморфизмы различных типов. Секвенирование образцов ДНК методами NGS позволяет установить генотип образца по SNP-маркерам, тогда как определение генотипа по маркерам, содержащим повторяющиеся последовательности, такие как VNTR-маркеры, затрудненно. Так как показано, что VNTR-маркеры ряда генов (MAOA-uVNTR, HTTLPR, AVPR-S1 и AVPR-S3) играют важную роль в детерминации психоэмоциональных особенностей и поведения, их генотипирование необходимо при исследовании генетической детерминации психологических особенностей, нарушений поведения, в спортивной генетике и при ряде соматических заболеваний. Наиболее эффективным методом генотипирования в данном случае является мультиплексный фрагментный анализ с флуоресцентно меченными праймерами, позволяющий одновременно установить генотипы по нескольким генам и провести детекцию результатов в автоматизированном режиме.

Краткое описание сущности изобретения Одновременное определение генотипа человека по полиморфизмам в трех генах, участвующих в регуляции поведения, проводят путем мультиплексной ПЦР-амплификации с специально подобранными флуоресцентно меченными праймерами, фланкирующими содержащие варьирующее число тандемных повторов участки генов AVPR1a*RS1 и AVPR1a*RS3, SLC6A4* 5-HTTLPR, MAOA*uVNTR, с последующим разделением полученных в результате ПЦР-амплификации фрагментов ДНК и установлением их размеров с помощью фрамгентного анализа на капиллярном секвенаторе.

Подробное описание изобретения Изобретение относится к способу одновременного определения генотипа человека по полиморфизмам в трех генах, участвующих в регуляции поведения, основан на проведении ПЦР-амплификации с меченными праймерами, фланкирующими содержащие варьирующее число тандемных повторов участки генов AVPR1a*RS1 и AVPR1a*RS3, SLC6A4* 5-HTTLPR, MAOA*uVNTR, с регистрацией результатов ПЦР с помощью процедуры фрагментного анализа на приборах для капиллярного электрофореза, отличающегося тем, что реакционная смесь содержит праймеры, состав которых подобран таким образом, чтобы условия их амплификации позволяли проводить ПЦР одновременно для всех четырех пар праймеров, а размер образующихся фрагментов, устанавливаемый по соотношению со стандартом длины для определения размера фрагментов, позволял определять количество повторов в анализируемых полиморфных локусах меченных флуоресцентными красителями прямых и обратных праймеров следующего состава:

Прямой праймер для AVPR1a-RS1-F: 5'-FAM-ACCTCTCAAGTTATGTTGGTGG3'

Обратный праймер для AVPR1a-RS1-R: 5'-ATAGGGACTGGTTCTACAATCTGC3'

Прямой праймер для AVPR1a-RS3-F: 5'-R6G-CAGTATCCCCCTGAGAAAAGG3'

Обратный праймер для AVPR1a-RS3-R: 5'- ATACAAAGGCACACTGTTCTCACTTT3'

Прямой праймер для SLC6A4-F: 5'- Tamra-ATAGGGACTGAGCTGGACAACC3'

Обратный праймер для SLC6A4-R: 5'-CCTAGGATCGCTCCTGCATC3',

Прямой праймер для MAOA-F: 5'-ROX-ACAGCCTGACCGTGGAGAAG- 3'

Обратный праймер для MAOA-R: 5'ATACGGACGCTCCATTCGG3'

BDP630: Стандарт длины для определения размера фрагментов,

где F обозначает прямой праймер, R обратный праймер, FAM,, R6G, Tamra, ROX, BDP630 обозначают флуоресцентные красители, при этом определение присутствующих в образец аллелей с варьирующим числом тандемных повторов проводится по определению размера фрагментов, установленных при сопоставлении со стандартом размера фрагментов, меченных флуоресцентным красителем, при этом линейки размеров амплифицированных фрагментов, соответствующие аллелям каждого гена, перекрываются, но могут быть различены за счет использования различных флуоресцентных красителей, причем размеры фрагментов, соответствующие аллелям, составляют:

FAM (Синий): AVPR1a-RS1 207 п. н. -237 п. н. - 9 аллелей с шагом 4 п. н.

R6G (Зеленый): AVPR1a-RS3 352-382 п. н. - 16 аллелей с шагом 2.п.н.

Tamra (Желтый): SLC6A4(HTTLPR) 412 п. н. и 456 п. н. - аллели с 14 и с 16 44-нуклеотидными повторами

ROX (Красный): МАОА 242 пар нуклеотидов (п.н.) для аллеля 2R, 272 п. н. для аллеля для аллеля 3R, 287 п. н. для аллеля 3.5R, 302 а.н. для аллеля 4R,

Хроматограммы с аллельной линейкой фрагментов для полиморфизмов AVPR1a*RS1 и AVPR1a*RS3, SLC6A4* 5-HTTLPR, MAOA*uVNTR показаны на фигуре 1.

Результаты фрагментного анализа образцов с определением генотипа по сочетанию установленных размеров фрагментов в отдельном образце для полиморфизмов AVPR1a*RS1 и AVPR1a*RS3, SLC6A4* 5-HTTLPR, MAOA*uVNTR показаны на фигуре 2.

После проведения мультиплексной ПЦР-амплификации с разработанными праймерами в подобранных условиях затем определяют размер фрагментов с помощью фрагментного анализа на капиллярном секвенаторе, при наличии фрагментов разного размера образец следует интерпретировать как гетерозиготный по исследуемому полиморфизму, а если для исследуемого полиморфзима выявлен фрагмент только одного размера, то такой образец следует интерпретировать, как гомозиготный, за исключением полиморфизма MAOA*uVNTR у мужчин, который следует интерпретировать как гемизиготный.

Заявленный способ дополнительно характеризуется тем, что в реакционную смесь вносят следующую смесь праймеров:

AVPR1-RS1-F

AVPR1a-RS1-R

AVPR1a-RS3-F

AVPR1a-RS3-R

SLC6A4-F

SLC6A4-R

MAOA-F

MAOA-R

в количестве, обеспечивающем конечную концентрацию X для прямых праймеров и XX для обратных.

Кроме того, заявленный способ дополнительно характеризуется тем, что в реакционную смесь включают следующие стандартные компоненты:

смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов;

реакционный буфер (состав реакционного буфера: 100 мМ Tris-HCl (рН 8,8 при 25°С), 500 мМ KCl, 0,8% Р40, 20 мМ MgCl2);

бидистиллированая вода;

Taq-полимераза;

минеральное масло;

парафин.

1. Реакционная смесь 5 мкл

2. Активатор 5 мкл

3. Праймерная смесь 1 мкл

4. ДНК+H2O 14 мкл

V реакции 25 мкл

Дополнительно заявленный способ характеризуется тем, что ПЦР-амплификацию проводят в следующих условиях:

94°С 3 мин

98°С 30 сек

60°С 2 мин 4 цикла

72°С 1 мин 30 сек

94°С 10 сек

60°С 30 сек 27 циклов

72°С 1 мин

90°С 30 сек

56°С 2 мин 4 цикла

72°С 1 мин 15 сек

68°С 10 мин

15°С ∝

Набор праймеров и программа амплификации валидированы для проведения ПЦР-амплификации в амплификаторах: GeneAmp® 9700, GeneAmp® 2720, Veriti™ 96-Well Thermal Cycler. Анализ ПЦР-продуктов может проводиться с использованием генетических анализаторов ABI PRISM® 3130/3130XL/3500/3500XL (Applied Biosystems).

Исследуемые гены кодируют

моноаминоксидазу А, МАОА, VNTR-полиморфизм в регуляторном участке (название полиморфизма МАОА uVNTR)

Транспортер серотонина SLC6A4, VNTR-полиморфизм в регуляторном участке (название полиморфизма 5-HTTLPR или просто HTTLPR)

Рецептор вазопрессина 1А (он же аргинин-вазопрессиновый рецептор AVPR1a), полиморфизмы RS1 и RS3, микросателлитные маркеры.

Разработан способ одновременного определения генотипа в участках с варьирующим числом тандемных повторов (полиморфизм VNTR-типа, Variable Number Tandem Repeats) трех генов. Для этого разработаны праймеры для проведения одновременной ПЦР-амплификации четырех целевых участков (мультиплексная ПЦР multiplex PCR) в трех генах (в гене AVPR1A генотипируется два участка).

Ранее генотипирование этих генов проводилось преимущественно по отдельности. Разработка мультиплексной системы генотипирования позволяет получить результат в одной ПЦР-реакции вместо четырех, что ускоряет анализ и делает его более дешевым.

Для анализа VNTR маркеров на данном этапе разработан способ анализа с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с последующей детекцией размера фрагментов методом капиллярного электрофореза для 4 полиформных маркеров 3 генов. Фрагментный анализ проводят на капиллярном генетическом анализаторе ABI3500.

Для проведения одновременного генотипирования микросателлитных генетических маркеров и маркеров VNTR-типа разработан набор праймеров для мультиплексного фрагментного анализа на генетических анализаторах типа ABI 3500 и ABI 3130. Для этого разработаны праймеры, позволяющие одновременно амплифицировать все анализируемые локусы. Для разработанных праймеров подобраны условия для эффективной одновременной амплификации всех маркеров в одной реакции с целью достижения максимальной чувствительности и устойчивости анализа. Этот этап включает работу по оптимизации состава реакционного буфера и нуклеотидных последовательностей праймеров. Затем разработанная система была апробрована на образцах с известным генотипом, установленным иными методами.

Разработка мультиплекса включает следующие этапы:

1. Дизайн мультиплексной системы

2. Подбор высокоспецифичных праймеров

3. Оптимизация условий амплификации

4. Проверка системы на образцах с известным генотипом

5. Создание протокола по применению разработанной мультиплексной системы

Поскольку VNTR маркеры характеризуются большой длиной единицы повтора для большинства маркеров диапазон аллелей очень широк. Чтобы избежать перекрывания диапазонов аллелей, необходимо использование всех 6 каналов детекции капиллярного генетического анализатора ABI3500. Это определило выбор флуоресцентных красителей для мечения праймеров. На схеме указано распределение маркеров по каналам детекции с ожидаемым диапазоном аллелей. R6G:

AVPR1a-RS3 (160-204 п. н.)

Tamra: SLC6A4(HTTLPR) (350-394 п.н.)

ROX: AVPR1a-RS1 (120-320 п.н.)

BDP630: МАОА (200-350 н.п.)

FAM: Стандарт длины для определения размера фрагментов

На основе предварительного дизайна системы для каждого маркера были подобраны 5 пар праймеров, чтобы в дальнейшем выбрать наиболее эффективную. Подобранные праймеры проверялись на уникальность последовательности в геноме человека с помощью сервиса BLAST. В таблице перечислены наиболее эффективные из подобранных с указанием использованной флуоресцентной метки.

AVPR1a-RS1-F ROX-ACCTCTCAAGTTATGTTGGTGG AVPR1a-RS1-R ATAGGGACTGGTTCTACAATCTGC AVPR1a-RS3-F R6G-CAGTATCCCCCTGAGAAAAGG AVPR1a-RS3-R ATACAAAGGCACACTGTTCTCACTTT SLC6A4-F Tamra-ATAGGGACTGAGCTGGACAACC SLC6A4-R CCTAGGATCGCTCCTGCATC MAOA-F BDP630-ACAGCCTGACCGTGGAGAAG MAOA-R ATACGGACGCTCCATTCGG

Мультиплексная ПЦР

Характеристика генов и полиморфизма, числа аллелей

Изобретение относится к области молекулярной генетики. Сущность способа заключается в проведении анализа с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции с последующей детекцией размера фрагментов методом капиллярного электрофореза для 4 полиморфных маркеров 3 генов. Изобретение позволяет одновременно установить генотипы по нескольким генам и провести детекцию результатов в автоматизированном режиме. 2 ил.

Способ одновременного определения генотипа человека по полиморфизмам в трех генах, участвующих в регуляции поведения, основанный на проведении ПЦР-амплификации с меченными праймерами, фланкирующими содержащие варьирующее число тандемных повторов участки генов: ген AVPR1a повтор RS1 и ген AVPR1a повтор RS3, ген SLC6A4 повтор 5-HTTLPR, ген MAOA повтор uVNTR, с регистрацией результатов ПЦР с помощью процедуры фрагментного анализа на приборах для капиллярного электрофореза, характеризующийся тем, что реакционная смесь содержит праймеры, состав которых подобран таким образом, чтобы условия их амплификации позволяли проводить ПЦР одновременно для всех четырех пар праймеров, а размер образующихся фрагментов, устанавливаемый по соотношению со стандартом длины для определения размера фрагментов, позволял определять количество повторов в анализируемых полиморфных локусах с меченных флуоресцентными красителями прямых и обратных праймеров следующего состава:

прямой праймер для AVPR1a-RS1-F: 5'-FAM-ACCTCTCAAGTTATGTTGGTGG3',

обратный праймер для AVPR1a-RS1-R: 5'-ATAGGGACTGGTTCTACAATCTGC3',

прямой праймер для AVPR1a-RS3-F: 5'-R6G-CAGTATCCCCCTGAGAAAAGG3',

обратный праймер для AVPR1a-RS3-R: 5'-ATACAAAGGCACACTGTTCTCACTTT3',

прямой праймер для SLC6A4-F: 5'-Tamra-ATAGGGACTGAGCTGGACAACC3',

обратный праймер для SLC6A4-R: 5'-CCTAGGATCGCTCCTGCATC3',

прямой праймер для MAOA-F: 5'-ROX-ACAGCCTGACCGTGGAGAAG-3',

обратный праймер для MAOA-R: 5'ATACGGACGCTCCATTCGG3',

BDP630: стандарт длины для определения размера фрагментов,

где F обозначает прямой праймер, R – обратный праймер, FAM, R6G, Tamra, ROX, BDP630 обозначают флуоресцентные красители, при этом определение присутствующих в образце аллелей с варьирующим числом тандемных повторов проводят по определению размера фрагментов, установленных при сопоставлении со стандартом размера фрагментов, меченных флуоресцентным красителем, при этом линейки размеров амплифицированных фрагментов, соответствующие аллелям каждого гена, перекрываются, но могут быть различены за счет использования различных флуоресцентных красителей, причем размеры фрагментов, соответствующие аллелям, составляют:

синий краситель FAM: AVPR1a-RS1 207 п.н. – 237 п.н. – 9 аллелей с шагом 4 п.н.,

зеленый краситель R6G: AVPR1a-RS3 352-382 п.н. – 16 аллелей с шагом 2 п.н.,

желтый краситель Tamra: SLC6A4(HTTLPR) 412 п.н. и 456 п.н. – аллели с 14 и с 16 44-нуклеотидными повторами,

красный краситель ROX: MAOA 242 пар нуклеотидов (п.н.) для аллеля 2R, 272 п.н. для аллеля 3R, 287 п.н. для аллеля 3.5R, 302 п.н. для аллеля 4R,

затем определяют размер фрагментов, и при наличии фрагментов разного размера образец интерпретируют как гетерозиготный по исследуемому полиморфизму, а при выявлении для исследуемого полиморфизма фрагмента только одного размера образец интерпретируют как гомозиготный, за исключением полиморфизма MAOA повтор uVNTR у мужчин, который интерпретируют как гемизиготный.