Способ получения аффинного носителя в виде суспензии частиц гидрогеля на основе модифицированного нерастворимого полисахарида для выделения специфической РНК/ДНК, необходимой для проведения ОТ-ПЦР- и/или ПЦР-диагностики Российский патент 2023 года по МПК C08B37/02 C12Q1/6806 

Изобретение относится к способу получения аффинного носителя в виде суспензии частиц гидрогеля на основе модифицированного нерастворимого полисахарида для выделения специфической РНК/ДНК, необходимой для проведения ОТ-ПЦР- и/или ПЦР-диагностики и может быть использовано в молекулярной биологии и биотехнологии для идентификации биоматериала.

Известно большое разнообразие методик для выделения РНК, предложенных в научной литературе, и до сих пор отсутствует та, которая позволила бы проводить быстрое выделение специфической РНК, необходимой для проведения диагностики конкретного заболевания (инфекционного, генетического и онкологического). В настоящее время рынок предлагает большое количество наборов для выделения РНК или ДНК, а также нуклеиновых кислот обоих видов, но операции, приведенные в инструкциях по выделению, заканчиваются тем, что исследователи в конечном счете имеют дело только с суммарным РНК- или ДНК-продуктом, или, другими словами, тотальной (общей) РНК или ДНК. Предлагаются также наборы для выделения, когда из одного образца можно выделить не только оба типа нуклеиновой кислоты, но и белки. Недостатком последних является громоздкая схема выделения. Известно обнаружение фрагментов РНК или ДНК патогенов разных заболеваний человека (или животных) при использовании ампликонов, полученных в ходе проведения соответственно ОТ-ПЦР или ПЦР с последующей гибридизацией их одноцепочечных цепей при диагностике образцов суммарной РНК или суммарной ДНК с помощью биочиповых технологий. При проведении 1-го раунда ПЦР в качестве матрицы используется суммарная ДНК (или суммарная кДНК, полученная в реакции обратной транскрипции), выделенная из диагностируемого образца (аналита), и только при проведении 2-го раунда аПЦР (асимметричной) в качестве матрицы используется полученный в 1-м раунде видоспецифичный ампликон. В амплификате - конечном продукте реакции - после 1-го раунда в виде примеси могут присутствовать и другие так называемые неспецифичные ампликоны и неспецифичные нуклеотидные последовательности, но поскольку праймеры для получения продукта 2-го раунда используются иные, отличающиеся по структуре от праймеров 1-го раунда, то в итоге при проведении гибридизации будет использован только видоспецифичный ампликон. Однако эти технологии сложны при технической реализации и длительны по времени. Развитие биочиповых технологий, безусловно, необходимо, и в будущем они будут востребованы в персонализированной медицине.

Известен способ получения диальдегиддекстрана для применения в качестве носителей и модификаторов биологически активных веществ и фармацевтических субстанций (патент ЕАПО №11718, МПК С08 В37/02, опубл. 28.04.2009). Диальдегиддекстран получают путем окисления низкомолекулярных декстранов (20-75 кДа) 5-15%-м водным или водно-солевым раствором перманганата калия в кислой среде, для создания которой используют уксусную или муравьиную кислоту в концентрации 5-35% и количестве 0,5-2,0% от исходного объема раствора декстрана. Процесс окисления проводится при нагревании (80-100°С) с выходом более 80%.

Сложные схемы для подготовки различных твердых носителей с целью присоединения к ним олигонуклеотидов для захвата последними нуклеиновых кислот из различных источников при проведении гибридизации, в частности рибонуклеиновых кислот, описанных выше, свидетельствуют о необходимости упрощения подходов уже не к выделению суммарного пула ДНК или РНК, как это делалось до сих пор, а к выделению видоспецифичных и, в первую очередь, тех патогенов, которые инфицируют человека, животных и растения.

Для решения этого вопроса мы обратили внимание на такие твердые носители, как сефадексы широко используемые в настоящее время в качестве сорбентов для эксклюзионной и ионообменной хроматографии биологических молекул (олигонуклеотидов, нуклеиновых кислот, пептидов, белков, олигосахаридов, полисахаридов и других молекул).

Сефадексы - это модифицированные сорбенты. В основе их лежит природный водорастворимый полимер, выделяемый из бактерий Leuconostoc mesenteroides, - декстран, низкомолекулярные продукты которого хорошо зарекомендовали себя в медицине, в частности в гемотрансфузии и фармацевтике для получения лекарственных средств пролонгированного действия.

Сефадексы G-типа используются в биоорганической химии в хроматографическом процессе в основном в виде частиц (гранул) малого размера в диапазоне от 40 до 120 мкм. Для этого водорастворимый декстран переводят в трехмерную структуру, создавая с помощью бифункциональных соединений сшивки между углеводными звеньями его отдельных молекул. Для получения сефадексов в промышленном масштабе в качестве сшивающего агента традиционно используется эпихлоргидрин.

Существуют и другие сефадексы, такие как SP сефадекс С-25, SP сефадекс С-50, СМ сефадекс С-25, СМ сефадекс С-50 (катиониты) и DEAE сефадекс А-25, DEAE сефадекс А-50, QAE сефадекс А-25, QAE сефадекс А-50 (аниониты) - для ионообменной хроматографии.

Нами предлагается после проведения активации этих сорбентов использовать полученные соединения, так называемые функционализированные носители, содержащие альдегидные группы, для проведения ковалентного присоединения специфичных олигонуклеотидов (одного или нескольких). Для присоединения таких олигонуклеотидов к альдегидным группам требуется, чтобы они на одном из концов (5'- или 3'-конце) содержали аминогруппу. Полученные носители после присоединения олигонуклеотидов являются аффинными носителями. Они способны взаимодействовать при определенных условиях со специфичными нуклеиновыми кислотами, которые содержат нуклеотидные последовательности, комплементарные нуклеотидной последовательности олигонуклеотида. Благодаря взаимодействию водородных связей гетероциклических оснований специфичного олигонуклеотида и специфической нуклеиновой кислоты происходит образование гибридного участка двухцепочечной спирали путем гибридизации, что в конечном счете приводит к извлечению (захвату) специфической нуклеиновой кислоты из раствора, содержащего суммарную РНК/ДНК, полученную в ходе ее выделения с помощью коммерческих наборов или любых других методик.

Для активации сефадексов в настоящей заявке на изобретение предлагается использовать метапериодат натрия, наиболее часто используемый в фармацевтике для получения физиологически активных препаратов пролонгированного действия на основе водорастворимых полисахаридов.

Особенность водорастворимого периодата в том, что реакция сефадекса с ним приводит к разрушению углеводного звена и только в том случае, если в самом углеводном звене, как известно (согласно реакции Малапрада), имеются вицинальные гидроксильные группы, т.е. гидроксильные группы при соседних атомах углерода. Если таковые отсутствуют, то углеводное звено не подвергается деструкции.

В автореферате диссертации, защищенной Круппа Инной Сергеевной в 2017 году в Москве, под названием «Полисахаридные полимеры-носители для физиологически активных нафтальдегидов» описан способ получения физиологически активных веществ (ФАВ), ковалентно присоединенных к полисахариду, активированному периодатом натрия. Полимерами в качестве носителя ФАВ были выбраны диальдегид декстрана (ДАД) и диальдегид карбоксиметилцеллюлозы (ДАКМЦ). Оба исходных полимера, декстран и карбоксиметилцеллюлоза, в воде хорошо набухают, образуя вязкие растворы. При обработке периодатом натрия или йодной кислотой в этих полимерах образуются альдегидные группы вследствие деструкции углеводного звена.

Наиболее близким аналогом (прототипом) к предлагаемому изобретению является статья_авторов Damavandi F., Wang W., Shen W.-Z., Cetinel S., Jordan Т., Jovel J., Montemagno C, Wong G.K.-S. // Enrichment of low abundance DNA/RNA by oligonucleotide-clicked iron oxide nanoparticles Scientific Reports. V 11, Article number: 13053 (2021), размещенная по адресу https://doi.org/l 0.1038/s41598-021-92376-9. В русском переводе под названием «Обогащение [образца] с низким содержанием ДНК/РНК с помощью наночастиц оксида железа, несущих олигонуклеотид». В статье приведен многостадийный способ получения суперпарамагнитных наночастиц, которые покрыты силикагелем, на поверхности которого ковалентно закреплен олигонуклеотид с образующейся в ходе его присоединения линкерной группой.

Однако указанный способ для подготовки твердых носителей с целью присоединения к ним олигонуклеотидов для захвата последними нуклеиновых кислот из различных источников является громоздким, хотя и позволяет выявлять специфичную нуклеиновую кислоту, РНК или ДНК, но для этого впоследствии требуется тепловая денатурация дуплекса, образованного захваченной нуклеиновой кислотой, РНК/ДНК, и олигонуклеотидом, для освобождения ее от магнитных частиц с последующим перенесением ее водного раствора в новую пробирку.

Техническим результатом заявляемого изобретения является упрощение способа получения аффинных носителей и обеспечение возможности выделения вирусспецифической РНК/ДНК для проведения последующей ОТ-ПЦР- и(или) ПЦР-диагностики.

В этом случае не требуется проведения тепловой денатурации, т.е. освобождения специфической нуклеиновой кислоты от аффинного носителя. Последний вместе с захваченной специфической РНК/ДНК в качестве нуклеотидной матрицы переносят в предреакционную смесь для прямого проведения ОТ-ПЦР и(или) ПЦР. Аффинный носитель с захваченной специфической РНК/ДНК не мешает проведению ни реакции обратной транскрипции, ни полимеразной цепной реакции, проводимой как в обычном формате, так и в режиме реального времени.

Указанный технический результат достигается созданием способа получения аффинного носителя в виде суспензии частиц гидрогеля на основе модифицированного нерастворимого полисахарида для выделения специфической РНК/ДНК для проведения ОТ-ПЦР- и/или ПЦР-диагностики, включающий использование в качестве исходного носителя материал, представляющий собой суспензию в виде гидрогеля набухших в воде частиц нерастворимого полисахарида, содержащего в углеводном звене вицинальные гидроксильные группы, обработкой указанного носителя в смеси с водой реагентом, способным образовывать альдегидные группы в течение времени, достаточном для проведения реакции с получением активированного носителя, а для придания активированному носителю аффинных свойств с помощью приготовления суспензии из смеси воды, активированного носителя, ДМСО или ДМФА и олигонуклеотида или с помощью приготовления суспензии из смеси воды, активированного носителя, ДМСО или ДМФА и олигонуклеотида с добавлением в полученную смесь красителя в концентрации не менее 0,001 мг/мл и выдерживания указанной смеси в течение времени, достаточном для получения ковалентной связи указанного олигонуклеотида с активированным носителем или олигонуклеотида и красителя с активированным носителем, причем, олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность, которая способна гибридизоваться со специфической комплементарной последовательностью, присутствующей в исследуемом образце выделяемой или определяемой нуклеиновой кислоты с образованием двойной спирали, а краситель обладает одновременно поглощением в видимой области спектра и флуоресценцией при облучении ультрафиолетовым светом.

В качестве носителя используют SP сефадекс С-25 или SP сефадекс С-50 с получением после обработки реагентом активированного носителя в виде полиальдегида SP сефадекса С-25 или полиальдегида SP сефадекса С-50 соответственно, а в качестве реагента используют периодат натрия или калия, или йодную кислоту, (выделены неразрывный дефис и неразрывный пробел)

Обработку носителя для его активации проводят в смеси с водой и реагентом в конечном соотношении вода: носитель: реагент 300: 10: 1.

В качестве олигонуклеотида используют олигодезоксирибонуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1: 5'-GTACTACTACTCTGTATGGTTGGTAACCААС-3', комплементарную нуклеотидной последовательности одноцепочечных нуклеиновых кислот видоспецифической геномной РНК вируса SARS-CoV-2, а в качестве красителя используют сафранин.

Для придания активированному носителю аффинных свойств, суспензию в виде смеси воды, активированного носителя, ДМСО или ДМФА, и олигонуклеотида готовят в конечном соотношении 1:2:4:1 соответственно.

Для придания активированному носителю аффинных свойств при добавлении красителя, суспензию из смеси воды, активированного носителя, ДМСО или ДМФА и олигонуклеотида готовят в конечном соотношении 2:2:5:1 соответственно.

Изобретение поясняется следующими графическими материалами. Фиг. 1. а) Расположение основных генов, кодирующих белки, вируса тяжелого острого респираторного синдрома-2 в геноме; длина референсной геномной РНК 29903 н.о. б) Гены S, Е и N размещаются в правой части геномной РНК. Между нуклеотидными последовательностями генов S и N размещаются и другие дополнительные гены, кроме гена 10. Фиг. 2. Электрофореграмма отображает картину нанесенных на гель амплификатов клинических образцов и контрольных проб, полученную после проведения электрофореза в 1,4%-м геле агарозы в присутствии бромистого этидия в 1х трис-ацетатном (ТАЕ-) буфере при 120 В в течение 33 мин (снимок сделан при облучении геля ультрафиолетовым светом). Образец РНК5411 детектирован как положительный (3-я и 6-я дорожки, считая слева направо), а образец РНК5402 - как отрицательный. Образец РНК5281 взят в качестве положительного контроля в предреакционную смесь для проведения ОТ-ПЦР из раствора суммарной РНК после ее выделения в объеме 2 мкл; в амплификате, кроме контрольного, обнаружены дополнительные ампликоны. Для контроля длины ампликонов в качестве маркера брали 3 мкл смеси ДНК-фрагментов производства Fermentas из коммерческой фасовки под #SM1103: длина фрагментов 50, 200, 400, 850 и 1500 п.н. Длина искомого ампликона 316 п.н. Фиг. 3.

Флуоресценция аффинных носителей

SP сеф. С-25 - 5'-NH₂(CH₂)₆-dN(-4)-Safr,

SP сеф. С-25 - 5'-NH₂(CH₂)₆-dN(-6)-Safr и

SРсеф. C-25-5'-NH₂(CH₂)₆-dN(-8)-Safr (на фиг. 3 см. слева направо), полученных после последовательного присоединения аминированного олигодезоксирибонуклеотида с различным разведением его в воде_ПЦР и блокирующего альдегидные группы красителя сафранина, приготовленного с использованием дистиллированной воды. Снимок сделан при облучении УФ-светом после отмывки дистиллированной водой конъюгатов от избытка красителя и центрифугирования. Окончание промывки контролируется отсутствием флуоресценции в надосадочной жидкости.

Фиг. 4. Флуоресценция аффинных носителей

SP сеф. С-50 - 5'-NH₂(CH₂)₆-dN(-8)-Safr и

SP сеф. С-50 - 5'-NH₂(CH₂)₆-dN(-6)-Safr (на фиг. 4 см. слева направо), полученных после последовательного присоединения аминированного олигодезоксирибонуклеотида с различным разведением его в воде_ПЦР и блокирующего альдегидные группы красителя сафранина, приготовленного с использованием дистиллированной воды. Снимок сделан при облучении УФ-светом после отмывки дистиллированной водой конъюгатов от избытка красителя и центрифугирования. Окончание промывки контролируется отсутствием флуоресценции в надосадочной жидкости. На фиг. 4 показано, что частицы геля вследствие высокой степени набухаемости оседают медленно при условиях центрифугирования (1000 об./мин в течение 1 мин), а значит, могут быть более пригодны для проведения гибридизации с РНК-матрицей. Кажущаяся флуоресценция надосадочной жидкости связана с тем, что набухаемость гранул исходного сефадекса выше: пробирки следует рассматривать и готовить снимки в вертикальном положении, а не в наклонном. Фиг. 5. Электрофореграмма (выявление S-гена вируса SARS-CoV-2) отображает картину нанесенных на гель амплификатов клинических образцов, отобранных в ходе манипуляций с аффинным носителем как в виде супернатантов (надосадочных жидкостей) при промывках - sn, так и в виде конечного продукта (суспензии - р) и контрольных проб, полученную после проведения электрофореза в 1,4%-м геле агарозы в присутствии бромистого этидия в 1×TAE-буфере при 120 В (снимок сделан при облучении геля ультрафиолетовым светом). Образцы РНК6329 и РНК6330 детектированы как положительные (3-я и 4-я дорожки - для супернатантов, считая слева направо, так и 6-я и 7-я - для суспензий). Образец PHK5376sn взят в качестве положительного контроля в предреакционную смесь для проведения ОТ-ПЦР из раствора РНК в объеме 5 мкл после проведения нулевой промывки и ее удаления. Для контроля длины ампликонов в качестве маркера использовали смесь ДНК-фрагментов производства «СибЭнзим» (г. Новосибирск) из коммерческой фасовки М12: длина фрагментов 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 п.н. Наличие ампликона в промывках образцов и в суспензии свидетельствует о высоком содержании РНК в суммарном препарате образцов. Длина искомого ампликона 316 п.н. Фиг. 6. Электрофореграмма (выявление N-гена вируса SARS-CoV-2) отображает картину нанесенных на гель амплификатов клинических образцов, отобранных в ходе манипуляций с аффинным носителем как в виде супернатантов (надосадочных жидкостей) при промывках - sn0, sn1, sn2, так и в виде конечного продукта (суспензии - р) и контрольных проб, полученную после проведения электрофореза в 1,4%-м геле агарозы в присутствии бромистого этидия в 1 × ТАЕ-буфере при 120 В в течение 45 мин (снимок сделан при облучении геля ультрафиолетовым светом). Образцы РНК5964р, РНК5966р и РНК5967р детектированы как положительные (6-я, 8-я и 9-я дорожки - для суспензий, считая слева направо), так и 6330sn0 (2-я - для супернатанта) и 6330sn1 и 6330sn2 как отрицательные (3-я и 4-я дорожки - для супернатантов). Образец РНК5965р взят в качестве положительного контроля в предреакционную смесь для проведения ОТ-ПЦР в виде суспензии РНК в объеме 5 мкл после проведения 3 промывок (sn0, sn1 и sn2) РНК-буфером из набора «Рибо-преп» производства ЦНИИ эпидемиологии. Для контроля длины ампликонов в качестве маркера использовали смесь ДНК-фрагментов производства из ООО «Лаб. Медиген» (г. Новосибирск) из коммерческой фасовки: длина фрагментов 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 п.н. Наличие ампликона и в промывках образцов, и в суспензии свидетельствует о высоком содержании РНК в суммарном препарате образцов. Длина искомого ампликона 157 п.н. Фиг. 7. Электрофореграмма (выявление Е-гена вируса SARS-CoV-2) отображает картину нанесенных на гель амплификатов клинических образцов РНК8149р и РНК8150р, полученных по окончании проведения ОТ-ПЦР в режиме реального времени в присутствии специфичных праймеров и флуоресцентного зонда на выявление ампликона, соответствующего гену Е. Перед внесением суспензий РНК8149р и РНК8150р в предреакционную смесь были проведены 3 промывки (sn0, sn1, sn2) РНК-буфером по 50 мкл. Супернатанты были отброшены. При выполнении ОТ-ПЦР-РВ использовали набор реагентов для одноступенчатого проведения ОТ-ПЦР - продукта БиоМастер ОТ-ПЦР - Color (2×) производства «Биолабмикс» (г. Новосибирск). В качестве положительного контроля стандартный образец РНК, периодически нарабатываемый в лаборатории, был добавлен в предреакционную смесь для проведения ОТ-ПЦР-РВ в объеме 10 мкл. Электрофорез проводили в 1,4%-м геле агарозы в присутствии бромистого этидия в 1х ТАЕ-буфере при 120 В в течение 41 мин (снимок сделан при облучении геля ультрафиолетовым светом). Образцы РНК8149р, РНК8150р детектированы как положительные (3-я и 4-я дорожки, считая слева направо). Для контроля длины ампликонов в качестве маркера использовали смесь ДНК-фрагментов производства из ООО «Лаб. Медиген» (г. Новосибирск) из коммерческой фасовки: длина фрагментов 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900,1000 п.н. Длина искомого ампликона 113 п.н.

В результате экспериментальных научных исследований авторы для получения активированных носителей предлагают использовать сефадексы и другие их производные, которые хорошо зарекомендовали себя в гель-проникающей и ионообменной хроматографии как сорбенты для очистки олигонуклеотидов, полинуклеотидов, белков, полисахаридов и других биомолекул. После проведения активации (т.е. функционализации) сефадексов с помощью периодата натрия образуются альдегидные группы. Строение продукта частичного окисления сефадекса периодатом - полиальдегидсефадекса, можно представить так, как отражено на рис. ниже:

где R - место присоединения эпихлоргидрина или другого сшивающего агента.

К альдегидным группам активированного полиальдегидсефадекса могут быть ковалентно присоединены разные по своей природе как низкомолекулярные вещества, так и высокомолекулярные, и, в частности олигонуклеотиды, имеющие единичные функциональные группы, например, аминогруппу, присоединенную предварительно к одному из его концов - 5'-или 3'-концу. Далее проводится стадия гибридизации, в ходе которой осуществляется захват специфических одноцепочечных нуклеиновых кислот из растворов, содержащих суммарную РНК и(или) ДНК при их дополнительной очистке, которая сводится только к дополнительным промывкам. За счет образования водородных связей образуется локальная двухцепочечная спираль между нуклеотидной последовательностью олигонуклеотида и комплементарной ему последовательностью, присутствующей в структуре искомой специфической нуклеиновой кислоты.

Для раскрытия изобретения ниже приводятся примеры с подробным описанием.

Пример 1. Получение активированного носителя - полиальдегида SP сефадекса С-25.

1,0 г SP сефадекса С-25 (размер частиц 40-120 мкм) вносили в сухую банку с плоским дном общим объемом 100 мл. Приливали 25 мл дистиллированной воды (DW) и давали набухнуть частицам сефадекса до образования геля. При включенной магнитной мешалке к суспензии добавляли 100,0 мг метапериодата натрия, после чего добавляли еще 5 мл DW (итого 30 мл). Вращение не должно быть интенсивным: в противном случае некоторые частицы геля окажутся выше границы раздела жидкость - воздух. Перемешивали суспензию при температуре 33,4°С + 1°С в течение 8 ч. Суспензию переносили в 2 пробирки (Axygen) на 15 мл, разделяя приблизительно поровну. Давали первый раз частицам полученного активированного геля осесть под действием силы тяжести для того, чтобы установить объем набухшего геля (в данном эксперименте гель занимал суммарный объем 8,5 мл, оседание частиц длилось в течение ночи, 16 ч). Проводили промывки 3 раза DW для удаления примесей, заполняя водой пробирки доверху. В этом эксперименте при проведении промывок давали частицам геля оседать в течение 3,5 ч. После 3-й промывки (оседание частиц оставляли в ночь) удаляли надосадочную жидкость неполностью во избежание подсыхания геля. (Низкоскоростное центрифугирование не использовали во избежание уплотнения геля). Полученный активированный носитель полиальдегид SP сефадекс С-25 в виде набухшего геля сохраняли под слоем дистиллированной воды в холодильной камере.

Пример 2. Получение аффинного носителя, несущего целевой олигодезоксирибонуклеотид для захвата вирусспецифических молекул вируса ТОРС-КоВ-2 (SARS-CoV-2).

Используемый активированный носитель, представляющий собой суспензию полиальдегида SP сефадекса С-25 для присоединения аминированного олигонуклеотида, вносили в объеме 0,2 мл, используя пипетку с наконечником, в центрифужную цилиндрическую пробирку объемом 2 мл, имеющую полусферическое дно. Используемый специфический олигонуклеотид содержит NH₂-группу на 5'-конце, нуклеотидная последовательность которого представлена следующей структурой:

5'-GTACTACTACTCTGTATGGTTGGTAACCААС-3' (SEQ ID №: 1) (НПК «Синтол», Москва, Россия).

Пример 2-1.

Получение аффинного носителя ПА SP сеф. С-25 - 5'-NH₂(CH₂)₆-dN(-6) в среде вода/ДМСО.

В пробирку объемом 2 мл вносили 100 мкл воды_ПЦР-_DEPC, затем -200 мкл осевших частиц (ОЧ) ПА SP сефадекса С-25, пипетировали, после чего добавляли 300 мкл ДМСО, повторно пипетировали. При вращении пробирки с ПА (полиальдегидом) на вортексе по каплям в течение 7-10 с вносили 200 мкл разведения - 6NH₂dN-Sp (SEQ ID №: 1) (разведение предварительно готовили, смешивая 100 мкл разведения - 6 (хранение в морозильной камере) и 100 мкл ДМСО) (в пробирке реакционный объем суспензии 800 мкл). Пробирку ставили на миксер при комнатной температуре (27,8°С) и перемешивали в течение 60 мин (частицы геля не должны оседать).

Пример 2-2.

Получение аффинного носителя ПА SP сеф. С-25 - 5'-NH₂(CH₂)₆-dN(-6) в среде вода/ДМФА.

В пробирку объемом 2 мл вносили 100 мкл воды_ПЦР-DEPC, затем -200 мкл ОЧ ПА SP-сефадекса С-25, пипетировали, после чего добавляли 300 мкл ДМФА, повторно пипетировали. При вращении пробирки с ПА (полиальдегидом) на вортексе по каплям в течение 7-10 с вносили 200 мкл разведения - 6NH₂dN-Sp (SEQ ID №: 1) (разведение предварительно готовили, смешивая 100 мкл разведения - 6 (хранение в морозильной камере) и 100 мкл ДМФА) (в пробирке реакционный объем суспензии 800 мкл). Пробирку ставили на миксер при комнатной температуре (27,8°С) перемешивали в течение 60 мин (частицы геля не должны оседать).

Пример 3. Получение аффинного носителя.

SР сеф. С-25-5'-NH₂(СН₂)₆-dN(-6)-Safr в среде вода/ДМСО (визуализация конъюгата с одновременным блокированием оставшихся альдегидных групп).

К 800 мкл аффинного носителя ПА SP сеф. С-25 - 5'-NH₂(CH₂)₆-dN(-6) (см. пример 2-1) в пробирку, смешивая на вортексе, добавляли 200 мкл водно-органического раствора сафранина (вода_ПЦР - ДМСО=1: 1) с концентрацией 0,001 мг/мл. Вращали на миксере в течение 5-10 мин). При непродолжительном оседании частицы при дневном освещении были равномерно, по всему объему, окрашены ярко цветом чайной розы и поэтому заметны невооруженным глазом. При освещении пробирки УФ-светом (пробирку для этого помещали на поверхность трансиллюминатора) содержимое пробирки флуоресцировало (фиг. 3). На хранение полученные аффинные конъюгаты ставили в холодильную камеру обычного бытового холодильника до использования.

Пример 4. Выделение тотальной РНК и видоспецифической РНК ТОРС-КоВ-2 (SARS-CoV-2).

Выделение тотальной РНК проводили, используя коммерческий набор для выделения тотальной РНК «Амплисенс» производства ЦНИИ эпидемиологии (Москва, Россия). Полученные лизаты из клинических образцов 5402 и 5411, находящиеся в пробирках типа эппендорф объемом 1,5 мл, были переданы из зонированного помещения и предположительно содержали коронавирус ТОРС-КоВ-2 в объеме 400 мкл (100 мкл образца и 300 мкл лизирующего буфера, согласно инструкции производителя).

К этим лизатам, согласно инструкции производителя, добавили по 400 мкл раствора для преципитации и аккуратно, без резких движений перемешивали во избежание разрывов в РНК, после чего переносили в морозильную камеру как минимум на 30 мин. Полученные образцы РНК-преципитатов (мелкодисперсный осадок) в виде суспензии имел объем 800 мкл. Преципитаты способны оседать не только на дно пробирки, но и ее стенки. Далее выделение суммарной РНК с помощью указанного набора из каждого образца проводили из суспензии преципитата, взятого в объеме 200 мкл. Для этого сначала преципитат извлекали из морозильной камеры, суспендировали в полном объеме жидкости, получая однородную суспензию, и затем отбирали 200 мкл, помещая в пробирку типа эппендорф объемом 1,5 мл. Оставшийся объем преципитата возвращали в морозильную камеру на хранение и использовали для повторных экспериментов, если возникала необходимость. Все остальные растворы при последующем выделении тотальной РНК использовали так же в уменьшенном объеме. Такой подход к обработке образца позволяет сэкономить реактивы при выделении как минимум в 4 раза и не запрашивать в случае неудачи для повторного проведения диагностического теста у ответственного сотрудника дополнительного приготовления лизата, которое обычно проводится в зонированном помещении при работе с особо опасными патогенами.

Кратко: отобранные преципитаты в объеме 200 мкл центрифугировали при 3000 об./мин в течение 2 мин. Удаляли супернатанты, чтобы не зацепить осадки, хорошо видимые на дне пробирки. К осадкам добавляли по 125 мкл раствора 3 для отмывки. Перемешивали (не на вортексе, чтобы не разрушить уплотнившийся осадок) и центрифугировали при тех же условиях, что описаны выше. Удаляли супернатант.

К осадкам добавляли по 50 мкл раствора 4 для отмывки, промывали осадки, слегка постукивая по пробирке. При такой щадящей операции осадки цельно отделяются ото дна пробирки и хорошо промываются. Снова центрифугировали при 3000 об./мин в течение 2 мин и удаляли супернатант. Промывку повторяли, центрифугируя при 3000 об./мин в течение 3 мин. Супернатант удаляли, наклонив пробирку книзу из горизонтального положения и забирая стекающий супернатант с помощью пипетки с наконечником. Осадки подсушивали на воздухе. К высушенному осадку добавляли 20 мкл РНК-буфера, затем 20 мкл суспензии аффинного носителя SP сефадекса С-25 - dN(-6)-Safr, осторожно встряхивали и прогревали на водяной бане при 70°С течение 5 мин, один раз дополнительно встряхивая, чтобы суспендировать осадок. Отжиг проводили на воздухе, изъяв пробирки из водяной бани.

Образцы видоспецифической РНК, полученные после гибридизации с олигонуклеотидом, ковалентно присоединенным к аффинному носителю SP сефадексу С-25 - dN(-6)-Safr впоследствии дополнительно промывали дважды по 50 мкл РНК-буфером, последовательно суспендируя и центрифугируя при 3000 об./мин в течение 2 мин. Супернатанты удаляли не в полном объеме, чтобы не зацепить осадок (визуализация окрашенного осадка проводится при видимом свете). В отдельных экспериментах супернатанты отбирали и обозначали, как sn0 (добавление РНК-буфера после гибридизации, sn1 (после 1-й промывки), sn2 (после 2-й промывки) (фиг.6). Такой подход при обращении с образцом РНК позволяет убедиться в том, что именно вирусспецифическая РНК (всРНК), находившаяся ранее в растворе суммарной РНК, была действительно захвачена аффинным носителем SP сефадексом С-25 - dN(-6)-Safr, несущим ковалентно присоединенный олигодезоксирибонуклеотид с образованием гибридного комплекса олигодезоксирибонуклеотид - вс РНК.

Пример 5. Проведение обратной транскриптазно-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).

При выполнении ОТ-ПЦР использовали набор реагентов для одноступенчатого проведения ОТ-ПЦР - продукта БиоМастер ОТ-ПЦР - Color (2х) производства «Биолабмикс» (г.Новосибирск). ОТ-ПЦР Реакцию проводили в 14 мкл в пробирках объемом 0,5 мл. Загрузки компонентов для проведения ОТ-ПЦР приведены как на одну реакцию (пробирку), так и на 6 реакций, включая контроли.

Объем воды (вода_{ПЦР-Fermentas}), вносимой в предреакционную смесь, для 6 реакций, рассчитывали, как 6 × 14=84-48=36,0-30,0 (6 × 5,0)=6,0 мкл (из расчета 5,0 мкл НМ (РНК) на пробу в виде суспензии).

В пробирку, используемую в качестве положит, контроля, k⁺, вносили 3 мкл воды_{ПЦР-Fermentas} и вне ПЦР-бокса 2 мкл РНК5281, выделенную из образца в виде суммарной РНК с помощью набора реагентов «Рибо-преп» (ЦНИИ эпидемиологии, Москва), и так же, вне ПЦР-бокса, в соответствующую пробирку по 5 мкл PHK5402(sn(1), р(3)), PHK5411(sn(2), р(4)). sn (supernatant) означает, что РНК взята из супернатанта; p(pellit) - РНК взята из осадка, связанного с аффинным носителем SP сеф. С-25 - dN(-6)-Safr (в скобках после букв sn и р - номер дорожки) (фиг. 2).

Отрицат. контроль, k^-, - 5,0 мкл воды_{ПЦР-Fermentas}. SARS_CoV-2-праймеры присутствовали во всех реакционных смесях. Пробы перемешивали пипетированием и ставили в ячейки блока-матрицы амплификатора.

ТВП (температурно-временной профиль) записан как: 4× [45°С - 7 мин 30 с], 1× [95°С - 5 мин], 35×[95°С - 15 с, 52°С - 20 с, 72°С - 30 с], 1×[72°С - 5 мин].

По окончании ОТ-ПЦР готовили амплификаты и проводили электрофорез: в каждую ячейку иммунопланшета вносили 3 мкл буфера для нанесения проб на гель и 7 мкл амплификата; расположение проб на электрофореграмме: k^- _{OT ПЦР}, 5402(sn), 5411(sn), m, 5402(р), 5411(р), 5281(k⁺), для контроля в качестве маркера длины ампликонов брали 3 мкл смеси ДНК-фрагментов из коммерческой фасовки Fast Ruler Low Range (Fermentas) под #SM1103, в которой они соответствуют длинам 50, 200, 400, 850 и 1500 п.н. ЭФ проводили в 1× ТАЕ-буфере в 1,4%-м агарозном геле. Длина наблюдаемого ампликона в агарозном геле 316 п.н. (фиг. 2).

Пример 6. Приготовление аффинных носителей

SP сефадекс С-25 - 5'-NH₂(CH₂)₆-dN(-4)-Safr,

SP сефадекс С-25 - 5'-NH₂(CH₂)6-dN(-6)-Safr и

SP сефадекс С-25 - 5'-NH₂(CH₂)₆-dN(-8)-Safr.

Они отличаются между собой разведениями олигонуклеотида, ковалентно присоединяемого при получении аффинного носителя.

В 3 пробирки объемом 2 мл, обозначенные как

0,5×10^-4 dN ПА SP сефадекс С-25 (пробирка №1),

0,5×10^-6 dN ПА SP сефадекс С-25 (пробирка №2) и

0,5×10^-8 dN ПА SP сефадекс С-25 (пробирка №3),

вносили в каждую 50 мкл воды_{ПЦР- Fermentas}.затем - по 100 мкл осевших частиц (ОЧ) ПА SP сефадекса С-25*, пипетировали (во всех 3 пробирках V по 150 мкл), после чего добавляли по 150 мкл ДМСО и снова пипетировали. При вращении на вортексе пробирки с ПА в первую вносили по каплям в течение 7-10 с 100 мкл разведения - 4NH₂dN-Sp(SEQ ID №: 1) (разведение готовили, смешивая 50 мкл разведения - 4 (доставали из морозильной камеры) и 50 мкл ДМСО), во вторую аналогично - 100 мкл разведения - 6NH₂dN-Sp (SEQ ID №: 1) (разведение готовили, смешивая 50 мкл разведения -6 (доставали из холодильной камеры) и 50 мкл ДМСО), в третью аналогично - 100 мкл разведения - 8NH₂dN-Sp(SEQ ID №: 1) (разведение готовили, смешивая 50 мкл разведения - 8 и 50 мкл ДМСО). Реакционный объем суспензии составлял 400 мкл. Пробирки ставили на миксер при комнатной температуре (30,0°С) и перемешивали в течение 30 мин (частицы геля не должны оседать). Далее к предполагаемым аффинным конъюгатам в пробирки 1, 2 и 3, смешивая на вортексе, добавляли по 400 мкл водно-органического раствора сафранина (вода_{ПЦР-«Медиген»} - ДМСО=1:1 (0,001 мг/мл), заранее приготовленного: 1350 мкл смеси воды: ДМСО=1: 1+150 мкл раствора из воды _{ПЦР-«Медиген»}: ДМСО=1:1, содержащего сафранин в концентрации 0,01 мг/мл, как в примере 2.1 и примере 3. Вращали на миксере в течение 5-10 мин). После непродолжительного оседания частицы при дневном освещении были равномерно, по всему объему, окрашены цветом чайной розы и поэтому заметны. Центрифугировали при 1000 об./мин в течение 2 мин и немедленно делали снимки. При освещении УФ-светом осадки интенсивно флуоресцировали (см. снимок, фиг. 3).

*Примечание: ОЧ геля подогревали на водяной бане до состояния меньшей вязкости (прибл. до температуры 40-45°С) так, чтобы можно было набирать суспензию в наконечник пипетки на 200 мкл (использовали желтые наконечники).

Готовые аффинные носители оставляли в холодильной камере. Перед забором аффинного носителя из полученного препарата удаляли супернатант практически полностью. К аффинному носителю добавляли 50 мкл РНК-буфера, встряхивали до образования суспензии, быстро отбирали 15 мкл и вносили в раствор 25 мкл выделенной суммарной РНК5411 или любой другой.

Пример 7. Выделение РНК из преципитата клинического образца 5411.

Преципитат РНК5411, извлеченный из морозильной камеры, отбирали в виде суспензии преципитата в объеме 200 мкл и переносили в пробирку объемом 0,5 мл (ранее выделение проводили в пробирке объемом 1,5 мл, см. ПРИМЕР 4). Преципитат центрифугировали при 3000 об./мин в течение 2 мин. Удаляли супернатант, чтобы не зацепить осадок, хорошо видимый на дне пробирки. К осадку добавляли 125 мкл раствора 3 для отмывки. Осторожно перемешивали (не на вортексе), легко встряхивая, и центрифугировали при тех же условиях, что описаны выше и снова удаляли супернатант.

К осадку добавляли 50 мкл раствора 4 для отмывки, затем наклоняли и, вращая пробирку в руках, промывали осадок. Осадок цельно отделяется ото дна пробирки и хорошо промывается. Центрифугировали при 3000 об./мин в течение 2 мин и удаляли супернатант. Промывку повторяли, центрифугируя при 3000 об./мин в течение 3 мин. Супернатант удаляли, наклонив пробирку книзу из горизонтального положения и забирая супернатант пипеткой с наконечником, имеющей впрессованный фильтр. Осадок подсушивали на воздухе. К высушенному осадку суммарной РНК5411 добавляли 100 мкл РНК-буфера, растворяли суммарную РНК на водяной бане при 70°С и затем расфасовывали по 25 мкл (по ¼V_исх) в 3 новые пробирки, в которые соответственно вносили по 15 мкл суспензии аффинного носителя SP сефадекса С-25-dN(-4)-Safr*, SP сефадекса С-25 - dN(-6)-Safr и SP сефадекса С-25 - dN(-8)-Safr и осторожно встряхивали. Все 3 пробирки прогревали на водяной бане при 70°С течение сначала 2 мин, затем легко встряхивали и продолжали инкубировать 5 мин, чтобы суспендировать осадок аффинного носителя - олигоdN-Safr. Отжиг проводили на воздухе, изъяв пробирки из бани. Далее пробирки центрифугировали при 1000 об./мин в течение 2 мин, смотрели на трансиллюминаторе, чтобы убедиться в том, что осадки флуоресцируют. Осадки полученных конъюгатов действительно были и флуоресцировали. Переносили супернатанты (15-17 мкл) в чистые пробирки (их 3) на 0,5 мл (sn0 - пробы РНК) - это пробы РНК, подготовленные для проведения ОТ-ПЦР. Оставались 3 пробирки на 0,5 мл с конъюгатами (это р-пробы РНК) - и это тоже пробы РНК, подготовленные для проведения ОТ-ПЦР. Осадки, содержащиеся в пробирках на 0,5 мл, - конъюгаты, при дневном свете были окрашены в малиновый цвет. Интенсивность флуоресценциии была практически равной.

Пример 8. Приготовление аффинных носителей

SP сефадекс С-50 - 5'-N-NH₂(CH₂)₆-dN(-8)-Safr и

SP сефадекс С-50 - 5'-NH₂(CH₂)₆-dN(-6)-Safr.

В 2 пробирки объемом 2 мл, обозначенные как

ПА SP сефадекс С-50 - 0,5×10^-8 dN (пробирка №1) и

ПА SP сефадекс С-50 - 0,5×10^-6 dN (пробирка №2) вносили в каждую 50 мкл воды_ПЦР-DEPC (ООО Лаборатория «Медиген»), затем - по 100 мкл ОЧ ПА SP сефадекса С-50*, пипетировали (в 2 пробирках V по 150 мкл), после чего добавляли по 150 мкл ДМСО и снова пипетировали. При вращении пробирки с ПА на вортексе в первую по каплям в течение 7-10 с вносили 100 мкл разведения - 8NH₂dN-Sp(SEQ ID №: 1) (разведение готовили, смешивая 50 мкл разведения - 8 (доставали из холодильной камеры) и 50 мкл ДМСО), во вторую аналогично - 100 мкл разведения - 6NH₂dN-Sp(SEQ ID №: 1) (разведение готовили, смешивая 50 мкл разведения - 6 (доставали из холодильной камеры) и 50 мкл ДМСО). Реакционный объем 400 мкл. Пробирки ставили на миксер при комнатной температуре (30,9°С) и вращали в течение 60 мин (частицы геля не должны оседать). Далее к предполагаемым аффинным носителям в 1-ю и 2-ю пробирки, смешивая на вортексе, добавляли по каплям 200 мкл водно-органического раствора сафранина (вода_ПЦР - ДМСО=1:1 (0,006 мг/мл), заранее приготовленного: 800 мкл смеси вода_ПЦР: ДМСО=1:1+1200 мкл раствора вода_ПЦР: ДМСО=1:1, содержащего сафранин в концентрации 0,01 мг/мл). Раствор сафранина с концентрацией 0,01 мг/мл был предварительно получен смешением 1 мл воды_ПЦР, 1 мл ДМСО и 2 мкл водного раствора сафранина с концентрацией 10 мг/мл. Вращали на миксере в течение 10 мин. После непродолжительного оседания частицы при дневном освещении были равномерно, по всему объему, окрашены цветом чайной розы и поэтому заметны. Центрифугировали при 1000 об./мин в течение 1 мин и немедленно делали снимки (фиг. 4). При освещении УФ-светом частицы аффинного носителя интенсивно флуоресцировали.

*Примечание. Если ОЧ геля хранились длительно в холодильной камере и уплотнились, то их сначала отбирали, используя либо наконечник на 1 мл или срезанный наконечник на 200 мкл, затем суспензию подогревали на водяной бане до состояния меньшей вязкости (приблизительно до температуры 40-45°С) так, чтобы можно было набирать в наконечник пипетки на 200 мкл (использовали желтые наконечники) или даже в наконечник пипетки на 50 мкл.

Пример 9. Выделение суммарной РНК из клинических образцов 6329(B) и 6330(B).

Лизаты образцов 6329(B) и 6330(Б) в объеме 400 мкл в лизирующем буфере (набор «Рибо-преп» от «Амплисенс», Москва) для выделения тотальной РНК были переданы из зонального помещения в чистую зону для выделения РНК. Из 2 образцов 6329(B) и 6330(B), тщательно перемешав вращением в руках, отфасовывали попарно (каждый в 2 пробирки объемом 1,5 мл) в 4 пробирки по 50 мкл лизата и выделяли согласно производителю суммарную РНК. Неиспользованные объемы лизатов (по 300 мкл) переносили в морозильную камеру. К растворам суммарной РНК добавляли в пробирки обоих образцов по 10 мкл суспензии аффинного носителя SP сефадекса С-50 - (-8)dN-Safr и по 10 мкл суспензии аффинного носителя SP сефадекса С-50 - (-6)dN-Safr. Перемешивали легким вращением в руках и устанавливали пробирки в штативе на водяную баню, нагретую до 70°С. Через 2-3 мин дополнительно перемешивали, покачивая в руках и продолжали гибридизацию еще 5 мин. Отжиг проводили на воздухе, вынув пробирки из водяной бани. Далее следует постановка ОТ-ПЦР.

Методика на выявление S-гена вируса SARS-CoV-2 (6 реакций) (выявление ампликона длиной 316 п. н. электрофорезом в геле агарозы, фиг. 5) ОТ-ПЦР реакция проводится в 13,5 мкл (расчет компонентов проводили на 12,5 мкл). Загрузки даны на 1 реакцию и в общем на 6 реакций.

Объем воды (вода_ПЦР-DEPC), вносимой в предреакционную смесь, для 6 реакций, рассчитывали, как 13,5 × 6=81-43,5=37,5 - 30,0 (6 × 5,0)=7,5 мкл (из расчета 5,0 мкл НМ (РНК) на пробу).

В пробирку, используемую в качестве положительного контроля, k⁺, вносили вне ПЦР-бокса 5 мкл раствора PHK5376sn, а также, вне ПЦР-бокса, в соответствующую пробирку 5 мкл растворов PHK6329sn и PHK6330sn и аффинных РНК-конъюгатов РНК6329р и РНК6330р. В пробирку, используемую в качестве отрицательного контроля, кг, вносили 5,0 мкл воды_ПЦР-DEPC- SARS-CoV-2-праймеры присутствовали во всех реакционных смесях на выявление нуклеотидной последовательности S-гена. ТВП ОТ-ПЦР - 4× [43°С - 7 мин 30 с], 1×[95°С - 5 мин], 45× [95°С - 15 с, 55°С - 20 с, 72°С - 15 с], 1× [72°С - 5 мин].

После окончания реакции при проведении электрофореза в качестве маркера использовали смесь ДНК-фрагментов производства «СибЭнзим» (г. Новосибирск) из коммерческой фасовки M12: 250 (20нг), 500 (30), 750 (60), 1000 (210), 1500 (50), 2000 (60), 2500 (70), 3000 (200), [4000, 5000, 6000, 8000, 10000] - 60 нг. Длина наблюдаемого ампликона в агарозном геле 316 п.н.

Пример 10. Выделение суммарной РНК и видоспецифической РНК ТОРС-КоВ-2 (SARS-CoV-2) из клинического образца 5411.

Пример. 10-1. Выделение тотальной (суммарной) РНК SARS-CoV-2.

Выделение РНК из суспензии преципитата РНК5411 с помощью набора «Рибо-преп» проводили, как в ПРИМЕРЕ 4, из объема 100 мкл (все реактивы уменьшены в объеме в 8 раз). Последнюю промывку раствором 4 проводили дважды по 25 мкл. Полученный осадок не сушили (экономия времени). К влажному осадку суммарной РНК образца 5411 добавляли 100 мкл РНК-буфера и прогревали при 70°С в течение 2-3 мин. Суммарная РНК готова.

Пример. 10-2. Выделение видоспецифической РНК SARS-CoV-2. К 100 мкл раствора суммарной РНК5411 добавляли 20 мкл суспензии аффинного носителя SP сефадекса С-25 - dN(-4)-Safr и прогревали при 70°С в течение 5 мин. Затем центрифугировали при 3000 об./мин в течение 3 мин и переносили неполностью супернатант (sn0) в пробирку объемом 0,5 мл (обозначили как PHK5411sn0). К осадку аффинного конъюгата добавляли 25 мкл РНК-буфера, затем 1 мкл (1 мкМ) обратного праймера R5-NPsars (можно любого другого, предназначенного для выявления ампликона, соответствующего N-гену). Снова прогревали при 70°С в течение 2 мин (обозначили как РНК5411p-R5-NP). Предполагается, что полученный конъюгат SP сефадекс С-25 - dN(-4)-Safr - РНК будет содержать нуклеотидную последовательность геномной видоспецифической РНК SARS-CoV-2 или ее фрагмент, с которой обратный праймер в области N-гена образует двухцепочечную спираль дополнительно, необходимую в качестве затравки для получения кДНК на стадии протекания реакции обратной транскрипции для выявления N-гена при проведении ОТ-ПЦР.

Пример 11. Выявление N-гена вируса SARS-CoV-2 (8 реакций) в ОТ-ПЦР.

Р-ция проводится в 13,5 мкл (расчет компонентов на 12,5 мкл реакционной смеси) в пробирках объемом 0,2 мл. Загрузки компонентов для проведения ОТ-ПЦР приведены ниже:

Объем воды (вода_ПЦР-DEPC), вносимой в предреакционную смесь для 8 реакций, рассчитывали, как 13,5 × 8=108-62=46-40,0 (8 × 5,0)=6,0 мкл (из расчета 5,0 мкл НМ (РНК) на пробу).

В пробирку, используемую в качестве положительного контроля, k⁺, вносили вне ПЦР-бокса 5 мкл суспензии аффинного РНК-конъюгата РНК5965р, в соответствующую пробирку - по 5 мкл суспензий аффинных РНК-конъюгатов РНК5964р, РНК5966р и РНК5967р и по 5 мкл супернатантов промывочных растворов 6330sn0 в 30 мМ AcONa, рН 5,2, 6330sn1, 6330sn2 - в 3 мМ AcONa, рН 5,2. В пробирку, используемую в качестве отрицательного контроля, k^-, - 5,0 мкл воды_ПЦР-DEPC.

SARS-CoV-2-N-праймеры на выявление нуклеотидной последовательности N-гена присутствовали во всех реакционных смесях. Пробы перемешивали пипетированием и ставили в ячейки блока-матрицы амплификатора.

ТВП ОТ-ПЦР - 4× [43°С - 7 мин 30 с], 1 × [95°С - 5 мин], 55×[95°С - 10 с, 57°С - 20 с, 72°С - 25 с], 1 × [72°С - 5 мин]. Длительность 2 ч 41-43 мин (при охлаждении проб до 10°С). Длительность реакции может быть уменьшена с уменьшением количества циклов.

Электрофорез проводили в 1 × ТАЕ-буфере в 1,4%-м геле агарозы, 120 В, 45 мин; k^- от-пцр, 6330sn0, 6330sn1, 6330sn2, m(100), 5964p, 5965p(k⁺), 5966p, 5967р. В каждую ячейку иммунопланшета вносили 5 мкл буфера для нанесения проб на гель и 5 мкл амплификата и контрольных реакционных смесей; пробирки с амплификатами, содержащими носитель, предварительно (т.е. перед приготовлением пробы для нанесения амплификата на гель) центрифугировали при 3000 об./мин в течение 3 мин, затем амплификаты смешивали с буфером и наносили на гель. Для контроля (в качестве маркера) брали 1,2 мкл ь(100) - маркера из ООО «Лаб. Медиген» + 5 мкл буфера для нанесения проб на гель + 3,8 мкл DW. Электрофореграмма с ампликоном длиной 157 п. н., что соответствовало ожидаемому результату, приведена на фиг. 6.

Пример 12. Выделение суммарной РНК из клинических образцов 8149 и 8150, предположительно содержащих нуклеотидный материал SARS-CoV-2.

Выделенную с помощью набора «Рибо-преп» суммарную РНК из клинических образцов 8149 и 8150 хранили в морозильной камере в 60 мкл РНК-буфера из набора «Рибо-преп». С помощью аффинного носителя SP сефадекса С-25 - 5'-NH₂(CH2)6-dN(-6)-Safr (пример 3) проводили доочистку РНК выше указанных образцов. Отбирали ¼^lV (15 мкл) каждого препарата суммарной РНК пипеткой на 20 мкл с наконечником, содержащим впрессованный фильтр, и вносили в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 25 мкл РНК-буфера, пипетировали 2-3 раза, затем вносили другой пипеткой на 50 мкл 25 мкл суспензии аффинного носителя SP сефадекса С-25 - 5'-NH₂(CH₂)₆-dN(-6)-Safr, встряхивали и быстро ставили в микротермостат на 70°С. Через 1-2 мин прогревания (пробирка должна нагреться) быстро извлекали пробирку из термостата, также быстро встряхивали содержимое и снова ставили в микротермостат, продолжая инкубацию еще в течение 4-5 мин. Центрифугировали 1 мин при 2000 об./мин и удаляли только 20 мкл супернатанта (это нулевой супернатант, sn0). В пробирку с осадком и небольшим объемом (20 мкл) оставшегося супернатанта вносили 50 мкл РНК-буфера для проведения 1-й промывки. Встряхивали и быстро прогревали в микротермостате в течение 2 мин. Центрифугировали 1 мин при 2000 об./мин и удаляли только 50 мкл супернатанта (это первый супернатант, sn1). В пробирку с осадком и небольшим объемом (20 мкл) оставшегося супернатанта повторно вносили 50 мкл РНК-буфера для проведения 2-й промывки. Встряхивали и быстро прогревали в микротермостате в течение 2 мин. Центрифугировали 1 мин при 2000 об./мин и удаляли только 50 мкл супернатанта (это второй супернатант, sn2). В пробирку с осадком предположительно полученного аффинного конъюгата и небольшим объемом (20 мкл) оставшегося супернатанта после 2-й промывки вносили окончательно 50 мкл РНК-буфера (в третий раз). Очищенная видоспецифическая вирусная РНК готова к проведению ОТ-ПЦР в любом формате.

Перед добавлением конъюгата видоспецифической вирусной РНК в виде суспензии в предреакционную смесь для проведения ОТ-ПЦР встряхните осевший аффинный конъюгат до образования гомогенной суспензии и быстро отберите пипеткой 10 мкл, после чего добавьте в пробирку с 15 мкл предреакц. смеси для проведения ОТ-ПЦР (полный объем реакционной смеси 25 мкл).

Реакцию ОТ-ПЦР проводили в режиме реального времени на выявление гена Е, используя соответствующие праймеры и флуоресцентный зонд, рекомендованные ВОЗ. На дне пробирок после завершения реакции находился осадок аффинного конъюгата. Проводили дополнительный тест -электрофорез в агарозном геле в присутствии EtBr, с помощью которого было показано наличие в амплификате апликона длиной 113 п.н., соответствующего гену Е (https://www.who.int/docs/default-source/coronaviruse/real-time-rt-pcr-assays-for-the-detection-of-sars-cov-2-institut-pasteur-paris.pdf).

На электрофореграмме видны полосы, соответствующие искомому гену (фиг. 7). Таким образом, было показано, что флуоресценция сафранина не мешает проведению реакции в режиме (формате) реального времени.

Выше приведенные примеры 1-12 подтверждают достижение заявляемого технического результата, а именно: упрощение способа получения носителей на основе нерастворимых полисахаридов и обеспечение возможности выделения вирусспецифической РНК/ДНК для осуществления ОТ-ПЦР- и(или) ПЦР-диагностики, проводимой как раздельно, так и совместно.

Изобретение относится к области химии и медицины, а именно к способу получения аффинного носителя в виде суспензии частиц гидрогеля на основе модифицированного нерастворимого полисахарида для выделения специфической РНК/ДНК для проведения ОТ-ПЦР- и/или ПЦР-диагностики, включающему использование в качестве исходного носителя материала, представляющего собой суспензию в виде гидрогеля набухших в воде частиц нерастворимого полисахарида, содержащего в углеводном звене вицинальные гидроксильные группы, согласно которому проводят обработку указанного носителя с образованием альдегидных групп и получением активированного носителя и готовят суспензию из смеси воды, активированного носителя, ДМСО или ДМФА и олигонуклеотида, в частности, с добавлением в полученную смесь красителя в концентрации не менее 0,001 мг/мл, и выдерживают указанную смесь в течение времени, достаточного для получения ковалентной связи. Технический результат заключается в получении аффинных носителей и обеспечении возможности выделения вирусспецифической РНК/ДНК для проведения последующей ОТ-ПЦР- и/или ПЦР-диагностики. 7 з.п. ф-лы, 7 ил., 12 пр.

1. Способ получения аффинного носителя в виде суспензии частиц гидрогеля на основе модифицированного нерастворимого полисахарида для выделения специфической РНК/ДНК для проведения ОТ-ПЦР- и/или ПЦР-диагностики, включающий использование в качестве исходного носителя материала, представляющего собой суспензию в виде гидрогеля набухших в воде частиц нерастворимого полисахарида, содержащего в углеводном звене вицинальные гидроксильные группы, согласно которому обработку указанного носителя в смеси с водой реагентом, способным образовывать альдегидные группы, проводят в течение времени, достаточного для проведения реакции с получением активированного носителя, а для придания активированному носителю аффинных свойств готовят суспензию из смеси воды, активированного носителя, ДМСО или ДМФА и олигонуклеотида или готовят суспензию из смеси воды, активированного носителя, ДМСО или ДМФА и олигонуклеотида с добавлением в полученную смесь красителя в концентрации не менее 0,001 мг/мл, и выдерживают указанную смесь в течение времени, достаточного для получения ковалентной связи указанного олигонуклеотида с активированным носителем или олигонуклеотида и красителя с активированным носителем, причем олигонуклеотид имеет нуклеотидную последовательность, которая способна гибридизоваться со специфической комплементарной последовательностью, присутствующей в исследуемом образце выделяемой или определяемой нуклеиновой кислоты с образованием двойной спирали, а краситель обладает одновременно поглощением в видимой области спектра и флуоресценцией при облучении ультрафиолетовым светом.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве носителя используют SP сефадекс С-25 или SP сефадекс С-50 с получением после обработки реагентом активированного носителя в виде полиальдегида SP сефадекса С-25 или полиальдегида SP сефадекса С-50 соответственно.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве реагента используют периодат натрия или калия или йодную кислоту.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что обработку носителя для его активации проводят в смеси с водой и реагентом в конечном соотношении вода:носитель:реагент 300:10:1.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве олигонуклеотида используют олигодезоксирибонуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ №1: 5'-gtactactactctgtatggttggtaaccaac-3', комплементарную нуклеотидной последовательности одноцепочечных нуклеиновых кислот видоспецифической геномной РНК вируса SARS-CoV-2.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве красителя используют сафранин.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для придания активированному носителю аффинных свойств суспензию в виде смеси воды, активированного носителя, ДМСО или ДМФА и олигонуклеотида готовят в конечном соотношении 1:2:4:1 соответственно.

8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для придания активированному носителю аффинных свойств при добавлении красителя суспензию из смеси воды, активированного носителя, ДМСО или ДМФА и олигонуклеотида готовят в конечном соотношении 2:2:5:1 соответственно.