СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АНТИГЕНА MBP_RBD_6His ВИРУСА SARS-CoV-2 с C-КОНЦЕВОЙ АФФИННОЙ МЕТКОЙ 6xHIS-tag, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯЧ В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ COVID-19 Российский патент 2024 года по МПК C12N15/00 C12N15/11 C12N15/63 C12N15/70 

Изобретение относится к области вирусологии, молекулярной биологии и биотехнологии, а именно - к разработке диагностических наборов реагентов для серодиагностики вирусных инфекционных заболеваний и может быть использовано при создании набора реагентов для выявления антител к вирусу SARS-CoV-2.

В настоящее время широкое применение при создании диагностикумов для серодиагностики вирусных инфекционных заболеваний получили рекомбинантные вирусные антигены (РВА). Использование РВА является универсальным приемом при разработке медицинских средств защиты в отношении эмерджентных вирусных инфекций.

Пандемия COVID-19 продемонстрировала роль и место рекомбинантных вирусных белков, продуцируемых искусственно созданными генно-инженерными конструкциями (ГИК), для создания средств диагностики, профилактики и лечения заболевания.

При диагностике COVID-19 в настоящее время ведущее место занимает обнаружение РНК вируса SARS-CoV-2. Данный тест предназначен для диагностики активной инфекции и проводится тем, у кого есть симптомы респираторного заболевания или тем, кто имел контакты с возможным источником инфекции [U.S. Food & Drug Administration. In Vitro Diagnostics EUAs 2020.].

Для проведения диагностики берут мазок из носа и ротоглотки и методом ОТ-ПЦР в биологическом материале выявляют наличие или отсутствие генетического материала вируса (РНК вируса SARS-CoV-2). Отрицательный результат определения генетического материала возбудителя означает, что на момент взятия анализа человек не инфицирован. Для подтверждения или исключения наличия инфекции тест выполняется повторно через 10 дней после первичного взятия мазка.

Применяемые сегодня тест-системы отличаются высокой чувствительностью. Разработанный в ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР-РВ позволяет выявить РНК в пробе при ее концентрации не менее 1,0 10³ ГЭ.мл^-1 [Набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, возбудителя нового коронавирусного заболевания COVID-2019, методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени. Патент RU 2732608 C1 от 09.04.2020 г. Алексеев Я.И., Борисевич С.В. Варламов Д.А. [и др.].] точностью. Однако даже использование столь чувствительного набора не исключает получение ложноотрицательных результатов, возможными причинами которых могут быть малое количество вируса в исследуемом биоматериале (ниже пороговой чувствительности метода, стадия заболевания, при которой вирус уже отсутствует в верхних дыхательных путях), человеческий фактор (нарушения при заборе биологического материала).

Другим прямым методом является выявление вирусного антигена (белка, входящего в состав вируса, который распознается иммунной системой). Для проведения анализа используют ИФА или иммунохемилюминесцентный анализ (ИХЛА) [Möckel, М. SARS-CoV-2 antigen rapid immunoassay for diagnosis of COVID-19 in the emergency department [Text] /. M. Möckel, V.M. Corman, M.S. Stegemann [et al.] // Biomarkers. 2021 Vol. 26, N 3. - 213-220.

Согласно рекомендациям ВОЗ и управлению по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration), США, количественное определение антигена белка нуклеокапсида (N) вируса SARS-CoV-2 методом ИХЛА является высокоэффективным тестом для диагностики коронавирусной инфекции. Однако показатели диагностической чувствительности и специфичности данного метода уступают таковым при проведении ПЦР-анализа на РНК вируса SARS-CoV-2. Тест на антиген может определить наличие вируса SARS-CoV-2, при высокой концентрации вируса в исследуемой пробе, которая чаще бывает в самом начале заболевания или в период пика инфекции. При низкой концентрации вируса результат теста может быть ложноотрицательным.

Невысокая аналитическая чувствительность иммунохимических методов анализа является ограничивающим фактором методик, в которых проводится выявление вирусных антигенов.

Таким образом, успешное применение прямых методов возможно лишь при выполнении двух основных условий:

- концентрация возбудителя в пробе, превышающее значение аналитической чувствительности используемого метода при применении конкретного набора реагентов;

- своевременное взятие пробы.

По этой причине при проведении диагностики COVID-19 важное место занимают непрямые методы, направленные на выявление специфических антител (IgM и IgG), которые вырабатываются в организме человека в результате его контакта с вирусом. Для этого исследования используют капиллярная или венозная кровь.

IgM вырабатываются в самом начале заболевания, обычно они появляются на 3-5 день после появления первых симптомов и свидетельствуют о продолжающемся остром заболевании - текущей инфекции.

IgG обычно появляются на 10-14 день от начала заболевания и сохраняются в крови в течение я достаточно продолжительного времени после перенесенного заболевания. Их наличие говорит о перенесенном заболевании и о формирующемся иммунитете.

Выявление антител класса IgG имеют особо важное значение, так как позволяет оценить коллективный иммунитет против COVID-19. Полученные результаты могут служить не только для определения иммунного ответа у конкретного человека, но и для оценки количества переболевших в разных группах населения.

Вирусные антигены являются важнейшим компонентом наборов реагентов для выявления специфических антител. Относительно низкий уровень накопления вируса SARS-CoV-2 и масштаб пандемии COVID-19 (свыше 600 млн лабораторно подтвержденных случаев заболевания к началу осени 2022 г. ) не позволяют ограничиться использованием в качестве диагностикума антигенов нативного возбудителя. Вышеизложенное определяет роль РВА при проведении диагностики COVID-19.

Важным структурным элементом при создании РВА является выбор дизайна ГИК для их продукции. Этот выбор может иметь широкий диапазон различных решений. Безусловно, клетки эукариот, и, особенно, клетки млекопитающих, имеют несомненные преимущества перед прокариотами, особенно в том случае, когда целевой РВА представляет собой полноразмерный гликопротеин оболочки вируса. Так, белок S вируса SARS-CoV-2 имеет 22 сайта гликозилирования [Бруякин С.Д., Макаревич С.А. Структурные белки коронавируса SARS-COV-2: роль, иммуногенность, суперантигенные свойства и возможности использования для терапевтических целей // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета 2021. - Вып. 2.(78). С 18-27]. Воспроизведение вторичной структуры белка S в РВА, полученном при культивировании ГИК в клетках прокариот представляет очень сложную задачу.

В то же время, системы культивирования в клетках прокариот обладают определенными преимуществами, среди которых основным является высокая скорость размножения бактерии (и, следовательно, потенциально высокий выход РВА). Поэтому, если РВА представляет собой фрагмент гликопротеина без сайта гликозилирования, культивирование в клетках прокариот вполне может быть использовано для получения РВА ВЭВИ.

Целью настоящего изобретения является разработка способа получения рекомбинантного антигена MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, предназначенного для использования в качестве компонента набора реагентов для серодиагностики COVID-19.

Для достижения поставленной цели были проведены следующие исследования:

- путем клонирования гена, кодирующего РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 и вставки кДНК фрагмента гена белка S в плазмидный вектор рЕТ создана ГИК рЕТ MBP_RBD_6His.

- проведена трансформация плазмидной ДНК рЕТ MBP_RBD_6His клеток штамма JM109 Escherichia coli с последующим получением штамма-продуцента РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag. - Е. coli JM109/рЕТ MBP_RBD_6His

- проведено культивирование штамма-продуцента, наработана клеточная биомасса, путем ее разрушения в буферном растворе при рН 8.0±0.5 в присутствии ингибитора протеаз и неионного детергента, центрифугирования с последующим удалением клеточного дебриса, получали осветленный клеточный супернатант, который наносили на колонну с металл-хелатным аффинным сорбентом при рН 8.0±0.5.

- в ходе элюции в градиенте от 0 до 500 мМ имидазола в присутствии ингибитора протеаз и неионного детергента собирали фракции, содержащие РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2.

- для получения целевого продукта проведена очистка с помощью гель-фильтрационной хроматографии, раствор очищенного белка стерильно фильтровали и лиофильно высушивали.

Сущность изобретения

Сущность изобретения заключается в разработке способа получения РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 c С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, включающего конструирование рекомбинантной плазмиды ДНК рЕТ MBP RBD 6His, получение штамма-продуцента Е. coli JM109 MBP_RBD_6His путем трансформации клеток штамма Е. coli JM109 рекомбинантной плазмидной ДНК MBP_RBD_6His. культивирование штамма-продуцента, разрушение клеточной биомассы, отделение клеточного супернатанта, выделение целевого белка, его хроматографическую очистку, стерильную фильтрацию и лиофильное высушивание.

Рекомбинантный антиген MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 получали следующим образом. Сначала конструировали плазмидный вектор рЕТ MBP_RBD_6His, для чего из биологического материала выделяли РНК вируса SARS-CoV-2, штамм У-2. Амплифицировали фрагмент ген, кодирующий антиген MBP_RBD_6His с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, на полученной ДНК-матрице с использованием специфических праймеров, содержащих сайты узнавания рестриктаз NcoI и XhoI. Полученный ДНК-фрагмент клонировали в плазмидный вектор рЕТ по этим сайтам. Полученную в результате экспрессионную плазмидную ДНК рЕТ MBP_RBD_6His. Путем трансформации компетентных клеток E.coli JM109 с рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ MBP_RBD_6His получали штамм E.coli JM109 MBP_RBD_6His, являющийся продуцентом РВА MBP_RBD_6His с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.

Культивирование штамма-продуцента проводили в культуральной среде Лурье-Бертрана при 37 С. Индукцию белкового биосинтеза вызывали путем добавления в культуральную среду индуктора изопропилтио-β-D-галактозида (ИПТГ). Культивирование проводили в течение 3 ч при 37°С после внесения ИПТГ. При культивировании штамма-продуцента достигается высокий уровень экспрессии гена, кодирующего РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.

Выделение РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag включало стадии разрушения клеточной биомассы с помощью ультразвукового дезинтегратора в присутствии ингибитора протеаз и неионного детергента, отделения клеточного супернатанта, содержащего целевой белок, с помощью центрифугирования, выделения целевого белка из клеточного супернатанта, его очистку с помощью металл-хелатной аффинной и гель-фильтрационной хроматографии, стерильную фильтрацию и лиофильное высушивание.

Клеточную биомассу разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора в Трис-буферном растворе при рН 8,0±0,5 в присутствии ингибитора протеаз и неионного детергента. Осветленный клеточный супернатант наносили на колонну с металл-хелатным аффинным сорбентом при рН 8,0±0,5. В ходе элюции в ступенчатом градиенте от 0 до 500 мМ имидазола в присутствии ингибитора протеаз и неионного детергента собирали фракции, содержащие РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 c С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag. Дальнейшую очистку проводили с помощью гель-фильтрационной хроматографии. Раствор очищенного белка стерильно фильтровали и лиофильно высушивали.

Созданный штамм Е.coli JM109 MBP_RBD_6His является продуцентом РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag. Аминокислотная последовательность данного РВА представлена на последовательности SEQ ID NO 3.

Представленное изобретение решает задачу получения высокоочищенного рекомбинантного антигена MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag с иммунохимическими свойствами, позволяющими использовать его при иммуноферментном определении специфических антител к вирусу SARS-CoV-2.

Для выбора прототипа настоящего изобретения рассмотрены описанные в литературе способы получения рекомбинантного антигена патогенных для человека коронавирусов с использованием прокариотической системы экспрессии. Наиболее близкий к заявленному для патентования способу получения описан в патенте RU 2253870 С1 [Рекомбинантные белки, содержащие диагностически значимые антигенные эпитопы белков коронавируса (SARS-CoV), связанного с тяжелым острым респираторным синдромом, и последовательности синтетических генов, кодирующих диагностически значимые антигенные детерминанты белков коронавируса (SARS-CoV), связанного с тяжелым острым респираторным синдромом, авторы: Бурков А.Н., Уланова Т.И., Обрядина А.П., Пузырев В.Ф.] в котором для синтеза рекомбинантных белков вируса SARS-CoV были предсказаны и выбраны последовательности, содержащие потенциальные эпитопы структурных белков S, М, Е и N. В предложенном авторами способе Фрагменты рекомбинантных белков, кодируемые ДНК-последовательностями, были синтезированы в виде слитых белков (фьюжн-белков) с Glutathione-S-transferase, что позволяло проводить их очистку методом аффинной хроматографии, при этом эффективность выделения РВА уступает методу, предполагающему проведение металл-хелатной хроматографии на Ni-хелатирующем сорбенте. По мнению авторов, «изобретение может найти широкое применение в области диагностики и медицины», однако конкретные результаты применения полученных РВА в работе не приведены.

Заявляемый способ отличается от прототипа структурой рекомбинантных вставок в геном, молекулярной массой, молекулярно-биологическими и иммунохимическими характеристиками целевого продукта и использованием для его получения металл-хелатной хроматографии на Ni-хелатирующем сорбенте.

Технический результат

Техническим результатом изобретения является получение высокоочищенного РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.

Технический результат изобретения достигается путем:

- выделения из биологического материала РНК вируса SARS-CoV-2, штамм У-2

- амплификации гена, кодирующего антиген MBP_RBD_6His, на полученной ДНК-матрице с использованием специфических праймеров, содержащих сайты узнавания рестриктаз NcoI и XhoI. Олигонуклеотидные последовательности, представляющие первичную структуру олигонуклеотидных праймеров, использованных при амплификации гена, кодирующего антиген MBP_RBD_6His, представлены на последовательностях SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2;

- клонирования полученного ДНК-фрагмента в плазмидный вектор рЕТ по указанным сайтам;

- трансформации компетентных клеток E.coli JM109 созданной экспрессионной плазмидной ДНК рЕТ MBP_RBD_6His, физическая карта которой представлена на фиг. 1.

Предлагаемое техническое решение является новым, поскольку из общедоступных сведений в Российской Федерации неизвестен способ получения рекомбинантного антигена MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag с иммунохимическими свойствами, позволяющими использовать его при иммуноферментном определении специфических антител к вирусу SARS-CoV-2.

Предлагаемое техническое решение имеет изобретательский уровень, поскольку предлагаемый способ получения рекомбинантного антигена MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, включающий конструирование экспрессионной плазмидной ДНК рЕТ MBP_RBD_6His путем клонирования гена, кодирующего антиген MBP_RBD_вируса SARS-CoV-2 в плазмидный вектор, трансформацию плазмидной ДНК рЕТ MBP_RBD_6His L клеток штамма Е. coli JM109 с последующим получением штамма-продуцента растворимой формы рекомбинантного антигена MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, разрушение клеточной биомассы, содержащей целевой белок, его выделение, хроматографическую очистку, стерильную фильтрацию и лиофильное высушивание обеспечивает получение целевого продукта, который может быть использовано в качестве специфического компонента набора реагентов для выявления антител к вирусу SARS-CoV-2.

Предлагаемое техническое решение промышленно применимо, поскольку для его реализации может быть использовано типовое оборудование, а также широко распространенные в вирусологических и молекулярно-генетических исследованиях реактивы и материалы.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры, в которых представлена как процедура наработки биомассы рекомбинантного антигена, так и его практического применения

1 Получение ГИК рЕТ MBP_RBD_6His

Плазмидный вектор рЕТ MBP_RBD_6His.получали по следующей методике. Проводили наработку биомассы вируса SARS-CoV-2. В работе был использован штамм У-2 (Инв. №в коллекции ФГБУ «48 ЦНИИ» - 1226)

Для проведения культивирования использовали следующую методику. Ддвухсуточную монослойную культуру клеток Vero С 1008 в пластиковых матрасах фирмы Cell Star (США) с площадью рабочей поверхности 25 см (посевная концентрация 2,0. 10⁵ кл.мл^-1) инфицировали вирусом SARS-CoV-2 из расчета множественности заражения 0,01 БОЕ.кл^-1. Затем матрасы укладывали горизонтально, при этом поверхность с клеточным монослоем должна находиться внизу, и оставляли при температуре (37,5±0,5)°С. Через 60 минут инокулят из флаконов удаляли пипеткой и в каждый флакон вносили 7,5 мл поддерживающей среды Эрла с 2% фетальной телячьей сыворотки (ФТС). Культивирование проводили в течение 3-х суток. После окончания культивирования вируссодержащую среду сливали и определяли биологическую активность полученной рабочей культуры по методу негативных колоний. Для контроля процесса репродукции возбудителя часть матрасов сразу после проведения адсорбции инфицирующей дозы возбудителя в течение 1 ч при комнатной температуре и внесения поддерживающей среды Эрла с 2% ФТС помещали в холодильник с температурой от 2 до 6°С. После окончания культивирования определяли концентрацию биологически активного вируса в исследуемых препаратах.

Подлинность полученных препаратов вируса SARS-CoV-2 проверяли с помощью ОТ-ПЦР-РВ, которую проводили по разработанной ранее методике [Набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, возбудителя нового коронавирусного заболевания COVID-2019, методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени. Патент RU 2732608 C1 от 09.04.2020 г. Алексеев Я.И., Борисевич С.В. Варламов Д.А. [и др.].].

Данные оценки подлинности дали положительный результат, что позволило использовать полученный вируссодержащий препарат для выделения РНК вируса SARS-CoV-2 для использования в экспериментах по созданию ГИК, продуцирующих РВА вируса SARS-CoV-2.

Выделение РНК вируса SARS-CoV-2 проводили в условиях 2-й санитарной зоны согласно разработанной инструкции, основанной на использовании метода сорбции НК на развитой поверхности оксида кремния в присутствии высокой концентрации раствора гуанидина изотиоцината с применением на стадиях отмывки осадка НК от солевого раствора 70% этанолом и ацетоном. После отмывки и для ускорения дегидратации осадка ацетоном, РНК в нативном виде элюировали при нагревании в растворе с низкой ионной силой (в дистиллированной воде). В результате на заключительной стадии выделения был получен водный раствор геномной РНК анализируемого возбудителя, не содержащий биологически активный вирус.

В дальнейшем для оценки биологической безопасности и полноты инактивации исходного препарата были проведены три последовательных пассажа через монослойную культуру клеток Vero С1008. Оценку биологической активности полученной пробы определяли по образованию негативных колоний на монослое культуры клеток Vero С1008 под агаровым покрытием.

Формирования негативных колоний на монослое культуры клеток Vero С1008, под агаровым покрытием при титровании материалов, полученных в каждом их трех последовательных пассажей, не наблюдали.

На основании проведенных исследований был сделан вывод о том, что полученный из вируссодержащего препарата вируса SARS-CoV-2 с исходной

биологической активностью 2,0⋅10⁷ БОЕ⋅мл^-1 материал после проведенной пробоподготовки не содержит биологически активный вирус и опасности не представляет и может быть передан в чистую зону для проведения молекулярно-биологических исследований.

При проведении реакции обратной транскрипции (ОТ) в качестве универсального неспецифического компонента использовали ОТ-смесь, содержащую 1 мкМ Трис-HCl, 0,05% Тритона Х-100, 0,1 мкМ магния хлорида, 0,4 мкМ аммония сульфата, смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов, по 0,02 мкМ каждого, 100 ед. M-MLV обратной транскриптазы, 20 ед. ингибитора РНКаз, случайные гексануклеотидные праймеры и краситель крезоловый красный и ОТ-растворитель, содержащий 10 мкМ Трис-HCl, 0,5 М Na₂ ЭДТА, 10% глицерина.

Использование данных универсальных неспецифических компонентов позволяет получить препарат кДНК анализируемой пробы, предназначенный для направленной амплификации РНК вируса SARS-CoV-2.

Для постановки ОТ использовали 10 мкл раствора РНК, выделенной в ходе вышеизложенных исследований. Реакцию проводили с использованием комплекта реагентов для получения кДНК на матрице РНК «Реверта L» производства ФГУНЦНИИИЭ, Россия. В реакционную смесь вносили фермент M-MLV-ревертазу (200 ЕД в 2 мкл) и при 37°С в течение 1 ч проводили ОТ-реакцию.

Необходимо отметить, что для очистки получаемых с помощью ГИК РВА целесообразно вставка в состав последних N-концевого 6His-участка который может быть использован для аффинной очистки генетически модифицированных белков. Поэтому на 5^/-конце всех используемых нами для конструирования ГИК обратных праймеров содержится последовательность gtggtgatggtgatggtg.

Амплификацию проводили согласно следующему температурно-временному режиму 95°С - 60 с- 1 цикл; 95°С - 10 с, 50°С - 10 с, 60°С - 90 с - 30 циклов.

После завершения амплификации проводили очистку полученного продукта с помощью переосаждения этиловым спиртом.

В реакционную смесь добавляли 2 мкл 1,5 М ацетата натрия и 2,5 объема 96% спирта, перемешивали на вортексе.

Проводили центрифугирование (центрифуга Эппендорф, Германия 3200 об⋅мин^-1 30 мин при 4°С).

Отбирали супернатант и добавляли 100 мкл 70% этилового спирта, перемешивали на вортексе.

Проводили центрифугирование (центрифуга Эппендорф, Германия 3200 об⋅мин^-1 5 мин при 4°С).

Супернатант высушивали в вакуумном концентраторе 5 минут при 60°С и добавляли 10 мкл деионизованного формамида, перемешивали на вортексе, центрифугировали (центрифуга Эппендорф, Германия 3200 об⋅мин^-1 5 мин при 4°С). (центрифуга Эппендорф, Германия 3200 об⋅мин^-1 5 мин при 4°С).

ДНК денатурировали в амплификаторе в течение 5 минут при темрературе 95°С.

Амплификат для клонирования в выбранном плазмидном векторе получали с кДНК вируса SARS-CoV-2.

Встраивание полученных очищенных фрагментов кДНК гена белка S в плазмиду рЕТ проводили по следующей методике.

Лигирование очищенного фрагмента кДНК гена белка S вируса SARS-CoV-2- с вектором проводили с использованием Т4 ДНК-лигазы (Promega, США). Лигазную смесь составляли по схеме, предложенной фирмой-производителем Т4 ДНК-лигазы (Promega, США). Реакцию лигирования проводили при температуре 15±2°С в течение 18 ч.

Трансформацию клеток Е. coli, штамм JM109, лигазной смесью, содержащей рекомбинантные плазмиды, проводили по стандартной методике с использованием хлористого кальция [Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование [Текст]: / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук Пер. с англ. / - М., 1984.]. Тепловой шок проводили при 42°С в течение 90 с. Для трансформации использовали только высокоэффективные компетентные клетки с концентрацией выше 1.10⁸ cfu.мг^-1 ДНК.

Скрининг клонов, содержащих рекомбинантную ДНК, проводили на селективной среде, содержащей 1,5% агар (фирма Difco, США) в присутствие ампициллина (50 мг.мл^-1), изопропил β-D-1-тиогалактопиранозида (0,05 мг.мл^-1), 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактозид (80 мг.мл^-1) при температуре 37±2 °С. Колонии, окрашенные в белый цвет, считали депонентами клонированной последовательности и отбирали для выделения ДНК и последующего изучения в ПЦР.

Для выделения рекомбинантной ДНК и проверка полученной ДНК на наличие вставки чужеродного гена в ПЦР со специфическими праймерами.

Отобранные полоски переносили в среду LB с добавлением ампициллина (50 мг.мл^-1) и культивировали при температуре 37±2°С в течение суток. Бактериальные клетки осаждали центрифугированием и выделяли рекомбинантную ДНК клонов с использованием наборов DNA Purification System (Promega, США) по рекомендации фирмы производителя [Инструкция к набору для выделения плазмидной ДНК Wizard^R Plus minipreps/Promega.-2003.-Кат №1330.] Количественные характеристики полученной ДНК оценивали электрофоретически в 1% геле агарозы.

Для получения клонов, способных к экспрессии рекомбинантного белка RBD проводили ко-трансформацию плазмид компетентных клеток E.coli (штамм BL21(DE3) методом теплового шока в соотношении 1:1:1, наносили на твердый селективный агар, содержащий ампициллин/карбециллин (100 мкг/мл), канамицин (25 мкг/мл) и инкубировалив течение 12 час.при температуре 37°С при 170 об/мин. Отбирали выросшие клоны и проводили ПЦР-скрининг на содержание всех трех конструкций в отобранных клонах. Полученные клоны использованы для хранения и получения рекомбинантного белка.

Схема полученной рекомбинантной плазмиды рЕТ MBP_RBD_6His / SARS-CoV-2 приведена на фиг 1.

Характеристики полученной ГИК:

- размер 5430 пар нуклеотидных остатков п. н.о.;

- вставка кДНК вируса SARS-CoV-2, имеющая первичную структуру 5^/ - cggcccc aaggtttacc caataatact gcgtcttggt tcaccgctct cactcaacat ggcaaggaag accttaaatt ccctcgagga caaggcgttc caattaacac caatagcagt ccagatgacc aaattggcta ctaccgaaga gctaccagac gaattcgtgg tggtg - 3^/ кодирующая антиген MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag;

- NcoI/XhoI-фрагмент ДНК плазмиды рЕТ размером 3587 п.н.о., содержащийо участки инициации репликации плазмидного вектора (ori) и фага fl (florigin), промотор и терминатор транскрипции РНК-полимеразы бактериофага Т7, ген РНК-организующего белка (Rop), ген β-лактамазы (AmpR), детерминирующий устойчивость трансформированных рекомбинантной плазмидой рЕТклеток Е. Coli к пенициллиновым антибиотикам, и NcoI/XhoI-фрагмента ДНК длиной 172 п.о., кодирующего РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2;

- уникальные сайты узнавания рестрикционных эндонуклеаз, расположенные на следующем расстоянии от сайта NcoI: EcoRV- 280 п. о., XhoI - 332 п. о., ScaI - 1397 п. о., PvuI - 1508 п. о., BglI - 1756 п. о, BglII - 3822 п. о., XbaI - 3880 п. о..

С помощью сконструированной ГИК при культивировании штамма-продуцента достигается высокий уровень экспрессии фрагмента гена белка S, кодирующего РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.

Хранение рекомбинантных плазмид осуществляли в культуре клеток Е. Coli, штамм JM109, с добавлением 50% глицерина при температуре от минус 18 до минус 22°С.

Свойства ГИК рЕТ_MBP_RBD_6His были стабильны в течение 12 месяцев хранения (срок наблюдения)

Пример 2. Получение штамма-продуцента Escherichia coli JM109 /рЕТ MBP_RBD_6His и определение его продуктивности

Штамм, являющийся продуцентом РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, получают путем трансформации клеток штамма Е. coli JM109 рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ MBP_RBD_6His создание которой описано в примере 1..

Клетки штамма Е. coli JM109/рЕТ MBP_RBD_6His являются продуцентом РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.

Трансформированные клетки высевают на агаризованную среду LB, содержащую ампициллин (100 мкг/мл), и выращивают в течении 14 ч при 37°С для получения отдельных колоний. После чего несколько колоний переносят в 50 мл среды LB, содержащей 2% глюкозу и ампициллин (100 мкг/мл), и выращивают 8-10 ч при 37°С на шейкере при перемешивании со скоростью 180 об/мин для получения маточной культуры. Полученной культурой (процент засева составляет 2.5%) засевают требуемый объем среды LB, содержащей0.2% глюкозу и ампициллин (100 мкг/мл), и выращивают при 37°С при перемешивании со скоростью 180 об/мин. При плотности клеточной культуры ОД₆₀₀=0.8-0.9 о.е. вносят ИПТГ до концентрации 0.4 мМ и выращивают при 37°С в течение 3 ч. Каждый час после добавления ИПТГ отбирают аликвоты для последующего электрофоретического анализа. По окончании выращивания клеточную культуру центрифугируют в течение 30 мин при 4000 об/мин и охлаждении 10°С.

Штамм-продуцент Е. coli JM109/рЕТ MBP_RBD_6His характеризуется следующими показателями:

Морфологические признаки.

Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" - колонии круглые, гладкие, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или среде Лурье-Бертрана) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки.

Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам.

Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 100 мкг/мл).

Генетические особенности штамма.

Генотип штамма - canr::CBD fhuA2 [lon] ompT gal (λ DE3) [dcm] arnA::CBD slyD::CBD glmS6Ala ΔhsdS λ DE3=λ sBamHIo ΔEcoRI-B int::(lacI::PlacUV5::T7 genel) i21 Δnin5 pET MBP_RBD_6His.

Для экспрессии белка брали культуру в объеме 10 мкл и На фиг. 2 представлен результат электрофоретического анализа накопления РВА MBP_RBD_6His в ходе выращивания клеточной культуры штамма-продуцента Е. coli/pET MBP_RBD_6His 1 - стандарт молекулярных масс; 2 - лизат клеточной культуры до внесения ИПТГ; 3 - тотальный клеточный лизат после 1 ч выращивания после внесения ИПТГ; 4 - тотальный клеточный лизат после 2 ч выращивания после внесения ИПТГ; 5 - тотальный клеточный лизат после 3 ч выращивания после внесения ИПТГ; А - антиген MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2/

Пример 3 Получение РВА MBP _RBD_6His вируса SARS-CoV-2

Проводили культивирование в среде LB при температуре 30°С пре перемешивании со скоростью 275 об/мин до достижения плотности культуры ОД₆₀₀ 0,3…0,4. Затем вводили изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 0,5 мМ. Это соединение используется в качестве аналога аллолактозы, метаболита лактозы, который запускает транскрипцию lac оперона.

Клетки охлаждали до 18°С при 150 об.мин^-1 в течение 16 час. Осажденные клетки хранили при минус 20°С.

Для выделения РВА из осажденных клеток использовали следующую методику. Клетки размораживали и ресуспендировали в буфере, содержащем 20 мм Трис-HCl рН 7,4, 0,2 М NaCl и 50 мкл смеси ингибиторов протеаз (Sigma, Cat.# Р8849) на грамм клеточной биомассы. Затем ресуспендированные клетки лизировали с помощью эмульгирования. Полученный лизат осветляли центрифугированием при 40000 g в течение 30 минут при 4°С. Затем осветленный лизат фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм (Миллипор) и пропускали через колонку MBPTrap объемом 5 мл (GE) с использованием AKTA FPLC (Amersham Biosciences). Неспецифически связанные белки вымывали из колонки 10 мл буфера для ресуспензирования, и РВА RBD-MBP элюировали в течение 10 мл градиентным методом, используя буфер, содержащий 20 мм Трис-HCl, рН 7,4, 0,2 М NaCl и 10 мм мальтозы. Содержащие белок фракции определяли по показателю ОД₂₈₀, и проверяли с помощью электрофореза с использованием 10%-ного геля SDS-PAGE (Genscript). Окрашивания геля проводили Coomassie Brilliant Blue G-250. Затем фракцию загружали на колонку NiAff объемом 1 мл (GE) с рабочим буфером, содержащим 2 PBS с 20 мм имидазолом, рН 8, и буфером для элюирования, содержащим 2 PBS с 1 М имидазолом, рН 8. Полученные пики были снова проверены с помощью электрофореза в геле. Полосы с ММ, соответствующей 74 кДа (ожидаемый размер белка слияния RBD-MBP), концентрировали и загружали в эксклюзионную колонку HiLoad 16/60 Superdex75 (GE).

Фракции, соответствующие белку слияния, объединяли и концентрировали (с использованием концентраторов регенерированной целлюлозы Amicon (Cat # UFC803096). Идентичность RBD-MBP после каждой колонки была подтверждена в Вестерн-блот Peggy Sue (Protein Simple) с использованием антитела против S- белка коронавируса (Cat # 40591-Т62). Концентрацию рекомбинантного белка определяли с помощью НаноДроп1000 Фишера, используя ММ 74 кДа для белка слияния, и проводили расчет по формуле 1:

Е₂₈₀=101,19 М^{-1 см-1}

Для практического использования РВА необходимо было отработать метод получения очищенного препарата.

Наиболее распространенными методами очистки рекомбинантных белков в биотехнологии являются хроматографические методы и, в частности, металлохелатная аффинная хроматография. Один из приемов металлоафинной хроматографии основан на том, что некоторые аминокислоты, в частности гистидин, способны формировать комплексы с ионами металлов. После иммобилизации на хроматографической фазе хелатирующих групп целевой рекомбинантный белок, содержащий блок из нескольких остатков гистидина, связывается с хроматографической фазой, после чего отделяются сопутствующие белки и проводится элюция целевого белка.

Кроме блока из остатков гистидина, целевой рекомбинантный белок может содержать последовательности глутатион-S-трансферазы (GST), хитина, S-белка и другие, при этом принципы хроматографического выделения целевого рекомбинантного белка остаются теми же.

Для проведения очистки РВА MBP_RBD_6His использовали следующую методику. Клетки E.coli, содержащие РВА, осаждали центрифугированием (6000 g, 4°С, 20 мин), промывали буфером (10 мМ трис-HCl, рН 7,4, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (20 мМ натрий-фосфатный буфер, 0,5 М Nad), содержащем 10 мМ имидазол, 20% глицерин и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (буфер для выделения). Клетки подвергали двукратному замораживанию-оттаиванию. После этого клетки подвергали ультразвуковой дезинтеграции (22 кГц, 3×10 с), добавляли рибонуклеазу до концентрации 2 ед./мл и дезоксирибонуклеазу до концентрации 300000 ед./мл и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. Фрагменты разрушенных клеток осаждали центрифугированием (100000 g, 4°С, 1 ч). Осадок ресуспендировали в буфере для выделения, содержащем 1% Emulgen-913, инкубировали в течение 2 часов при температуре 4°С и медленном покачивании, после чего повторно центрифугировали при указанных выше условиях. Полученный в обоих случаях супернатант пропускали через фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.

К лизату клеток E.coli добавляли порошок никеля с диаметром частиц 50 нм в соотношении 5 мг частиц никеля на 1 мг суммарного белка грубого лизата, инкубировали при интенсивном встряхивании в течение 15 мин при комнатной температуре. Магнитную сепарацию частиц никеля проводили с использованием Magnetic Separation Unit (Promega, США). Несвязавшиеся белки удаляли, частицы никеля промывали путем добавления фосфатно-солевого буфера при интенсивном встряхивании 15 мин при комнатной температуре. Далее, частицы также были сепарированы, элюцию белка проводили с использованием фосфатно-солевого буфера с добавлением 250 мМ имидазола. Наличие очищенного белка в полученном препарата проверяли с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (10%). РВА MBP_RBD_6His, очищенный с помощью данной процедуры использовали при проведении дальнейших экспериментов.

Выход из 1 литра культуры составлял приблизительно 2,5 мг очищенного РВА MBP_RBD_6His. Очищенный РВА MBP RBD_6His хранили при -20°С в 2Х PBS с добавлением конечной концентрации 30% глицерина

Пример 4 Оценка определение соответствия РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 антигену возбудителя COVID-19

В качестве критерия соответствия полученного РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 антигену нативного возбудителя COVID-19 использовали следующие показатели:

- полученный РВА вируса SARS-CoV-2 должен реагировать с сыворотками конвалесцентов COVID-19;

- антитела к РВА вируса SARS-CoV-2 должны реагировать с антигеном вируса SARS-CoV-2.

При проведении экспериментов использовали следующую методику Была проведена внутрибрюшинная иммунизация беспородных белых мышей РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2. В качестве варианта сравнения использовали инактивированный вирус SARS-CoV-2. Использовали одну и ту же схему иммунизации в опыте и контроле (трехкратное введение без ПАФ с интервалом 7 суток, взятие крови через 3-е суток после заключительной иммунизации). При исследовании полученных сывороток в ИФА в качестве антигена использовали либо инактивированный вирус SARS-CoV-2, либо РВА MBP_RBD_6His. Полученные данные представлены в таблице 33.

Титр специфических антител определяли по следующей методике:

- лунки 96-луночных планшетов сенсибилизировали либо инактивированным вирусом SARS-CoV-2, либо РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2. Адсорбцию проводили в течение суток при температуре 4°С;

- лунки промывали раствором ФСБ-Т и вносили в них по 0,2 см³ блокирующего буфера (ФСБ-Т-БСА) и помещали на 1 час в термостат при температуре 37°С;

- лунки промывали раствором ФСБ-Т и вносили в них по 100 мкл соответствующего разведения исследуемой иммунной сыворотки. Инкубировали 1 час при 37°С

- содержимое сунок удаляли, лунки промывали раствором ФСБ-Т и в дунки вносили 100 мкл рабочего разведения антимышиных антител, конъюгмрованных с пероксидазой хрена (из коммерческого наборо. Инкубацию проодили в течение 60 мин при 37°С.

- после 5-кратной промывки в лунки добавляли 50 мкл субстрат-индикаторного раствора (ТМБ+цитратно-ацетатный буфер+H₂O₂). Инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего в лунки добавляли 50 мкл стоп-реагента (2 н H₂SO₄)

Определяли оптическую плотность раствора при длине волны 450 нм.

За титр иммунной сыворотки (в соответствующем варианте опыта принимали ее высшее разведение, в котором еще была зарегистрирована положительная реакция в ИФА. Результаты представлены в таблице.

Как следует из полученных данных, результаты, полученные в ходе ИФА, свидетельствуют о достаточно эффективной экспрессии специфических антител. С учетом ошибки метода анализа (при используемом двукратном шаге разведения -×/:2 различия между определяемыми показателями недостоверны

При анализе исследуемых сывороток в ИФА с использованием различных антигенов не выявлено никаких различий при смене антигена, используемого для проведения анализа.

Таким образом, проведенное иммунохимическими методами сравнение полученных РВА вируса SARS-CoV-2 антигенам нативного возбудителя COVID-19 показало высокий уровень соответствия. РВА, продуцируемые разработанными ГИК, могут быть использованы для создания наборов реагентов для выявления антител к вирусу SARS-CoV-2.

Пример 5 Использование РВА вируса SARS-CoV-2 в качестве компонента набора реагентов

В экспериментах использовали сыворотки конвалесцентов COVID-19, сыворотки от иммунизированных вакциной против COVID-19, взятые спустя 21-28 суток после заключительной иммунизации. При проведении исследований был в качестве варианта сравнения использовали коммерческий набор для определения антител к возбудителю COVID-19 методом ИФА. В качестве «захватывающих антигенов использованы антиген, входящий в состав коммерческого набора, инактивированный вирус SARS-CoV-2 и

При проведении экспериментов использовали следующую методику:

- лунки 96-луночных планшетов сенсибилизировали либо антигеном, входящим в состав набора, либо инактивированным вирусом SARS-CoV-2, либо РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2. Адсорбцию проводили в течение суток при температуре 4°С;

- лунки промывали раствором ФСБ-Т и вносили в них по 0,2 см блокирующего буфера (ФСБ-Т-БСА) и помещали на 1 час в термостат при температуре 37°С;

- лунки промывали раствором ФСБ-Т и вносили в них по 100 мкл соответствующего разведения исследуемой иммунной сыворотки. Инкубировали 1 час при 37°С

- содержимое сунок удаляли, лунки промывали раствором ФСБ-Т и в дунки вносили 100 мкл рабочего разведения античеловеческих антител, конъюгмрованных с пероксидазой хрена (из коммерческого наборо. Инкубацию проодили в течение 60 мин при 37°С.

- после 5-кратной промывки в лунки добавляли 50 мкл субстрат-индикаторного раствора (ТМБ+цитратно-ацетатный буфер+Н₂О₂). Инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего в лунки добавляли 50 мкл стоп-реагента (2 н H₂SO₄)

Определяли оптическую плотность раствора при длине волны 450 нм.

За титр иммунной сыворотки (в соответствующем варианте опыта принимали ее высшее разведение, в котором еще была зарегистрирована положительная реакция в ИФА. Результаты представлены в таблице.

Как следует из представленных данных, с учетом ошибки метода анализа (при используемом двукратном шаге разведения -×/:2 различия между определяемыми показателями недостоверны.

Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:

На фиг. 1 показана физическая карта рекомбинантной плазмиды рЕТ MBP_RBD_6His Указаны уникальные сайты эндокуклеаз рестрикции. Ori - участок инициации репликации плазмидного вектора, М13 ori - участок инициации репликации фага М13, AmpR - ген устойчивости к ампициллину, lacI - ген репрессора лактозного оперона, Rop - ген РНК-организующего белка, MBP_RBD - ген, кодирующий РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.

На фиг. 2 представлена электрофореграмма анализа накопления РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag в ходе выращивания клеточной культуры штамма-продуцента Е. coli JM109/рЕТ MBP_RBD_6His

1 - стандарт молекулярных масс; 2 - лизат клеточной культуры до внесения ИПТГ; 3 - тотальный клеточный лизат после 1 ч выращивания после внесения ИПТГ; 4 - тотальный клеточный лизат после 2 ч выращивания после внесения ИПТГ; 5 - тотальный клеточный лизат после 3 ч выращивания после внесения ИПТГ; А - РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.

На фиг. 3 представлена электрофореграмма анализа постадийного выделения РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.

1 - стандарт молекулярных масс; 2 - Клеточный лизат; 3 - Клеточный супернатант; 4 - Объединенный элюат после металл-хелатной аффинной хроматографии; 5 - Объединенный элюат после гель-фильтрационной хроматографии; 6 - очищенный белок MBP_RBD_6His после лиофилизации; А - РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.

На фиг. 4 представлена электрофореграмма анализа очищенного РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag. 1 - восстанавливающие условия; 2 - стандарт молекулярных масс; 3 - невосстанавливающие условия; А - РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag.

На фиг. 5 представлен результат анализа очищенного РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag методом иммуноблотинга с использованием человеческих IgG к вирусу SARS-CoV-2 (восстанавливающие условия). 1 - стандарт молекулярных масс; 2 - РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, нагрузка 0.5 мкг; 3 - антиген MBP_RBD_6His, нагрузка 1 мкг; 4 - РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, нагрузка 2 мкг.

В таблице 1 представлены результаты иммуноферментного определения титра специфических антител в сыворотках после иммунизации белых мышей РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2.

В таблице 2 представлены результаты иммуноферментного определения титра вирусспецифических антител в сыворотках крови реконвалесцентов м иммунизированных против COVID-19 при использовании РВА MBP _RBD_6HisBHpyca SARS-CoV-2 в качестве захватывающего антигена.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3"

fileName="Sequence list.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.3.0" productionDate="2023-10-24">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2023117738</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-07-03</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное учреждение «48 Центральный научно-исследовательский

институт» Министерства обороны Российской Федерации (ФГБУ «48 «ЦНИИ»

Минобороны России)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal State Budgetary Inctitution 48 Central

Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian

Federation</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО

АНТИГЕНА MBP_RBD_6His ВИРУСА SARS-CoV-2 с С-КОНЦЕВОЙ АФФИННОЙ МЕТКОЙ

6xHIS-tag, ПРЕДНАЗНАЧЕННОГО ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТА

НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ COVID-19</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q7">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Direct primer used to amplife the gene

encoding MBP_RBD_6His virus SARS-CoV-2</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>taagagtcattttgctattggcc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>41</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..41</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q9">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Reverse primer used to amplify the gene

encoding MBP_RBD_6His virus SARS-CoV-2</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggtggtgatggtgatggtgtgtaaagttgccacattcctac</INSDSe

q_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>34</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..34</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Amino acid sequence MBP_RBD_6His of the

virus SARS-CoV-2 with C-terminal 6xHis-tag</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>SSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGA</INSDSeq_seque

nce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>68</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>RNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..68</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic RNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q5">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>The nucleotide sequence MBP_RBD_6His of

the virus SARS-CoV-2 with C-terminal 6xHis-tag

</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acgtccctcgtcggagctctcaggtgggttgtcttagataacctctgag

ctcccatggagtaataatt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан способ получения рекомбинантного антигена MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, предусматривающий трансформацию штамма Escherichia coli JM109 плазмидной ДНК рЕТ MBP_RBD_6His, содержащей ген, кодирующий антиген MBP_RBD_6His вируса вакцины с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag. Техническим результатом изобретения является получение высокоочищенного РВА MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag. 5 ил., 2 табл., 5 пр.

Способ получения рекомбинантного антигена MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, предусматривающий трансформацию штамма Escherichia coli JM109 плазмидной ДНК рЕТ MBP_RBD_6His, содержащей ген, кодирующий антиген MBP_RBD_6His вируса вакцины с С-концевой аффинной меткой 6xHis-tag, создание штамма-продуцента рекомбинантного антигена MBP RBD_6His Escherichia coli рЕТ MBP_RBD_6His, культивирование штамма-продуцента для накопления целевого продукта, разрушение клеточной биомассы с помощью ультразвукового дезинтегратора в буферном растворе с рН 8,0±0,5 в присутствии ингибитора протеаз и неионного детергента, отделение клеточного супернатанта, содержащего целевой белок, с помощью центрифугирования, выделение и очистку антигена MBP_RBD_6His вируса SARS-CoV-2 с помощью металл-хелатной аффинной и гель-фильтрационной хроматографии, его стерильную фильтрацию и лиофильное высушивание, отличающийся аминокислотной структурой рекомбинантного антигена, представленной в SEQ ID NO 3.