СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО ПРОДУЦЕНТА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА НУКЛЕОКАПСИДА NC ВИРУСА SARS-COV-2 Российский патент 2024 года по МПК C12N15/00 C12N1/00 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и может найти применение при создании препаратов микробиологического происхождения для профилактики инфекционного заболевания, вызываемой вирусом SARS-CoV-2.

Пандемия коронавирусной инфекции (COVID-19) была вызвана вирусом SARS-CoV-2, относящимся к семейству Coronaviridae порядка Nidovirales. Геном вирусов порядка Nidovirales представляет собой несегментированную однонитевую (+)РНК размером около 30 т.п.о [https://link.springer.com/book/10.1007/978-1-4939-2438-7]. РНК вируса SARS-CoV-2 содержит пять протяженных рамок считывания, кодирующих структурные белки шипа (S) [Wrapp et al., 2020; Walls et al., 2020; Jaimes et al., 2020], оболочки (E), мембраны (M) и нуклеокапсида (N) [Kang et al., 2020], и мультиферментный комплекс репликазы. При разработке коронавирусных вакцин, как правило, в качестве доминантного антигена используют белок S [Pang et al., 2020; Chen et al., 2020]. Однако, в отличие от гена белка S, ген белка N является более консервативным [Marra et al., 2003; Drosten et al., 2003; Grifoni et al., 2020; Holmes et al., 2003; Rota et al., 2003; Zhu et al., 2005], синтезируется в большом количестве в ходе инфекции и высоко иммуногенен [Cong et al., 2020]. В сыворотках переболевших коронавирусной инфекцией людей выявляется высокий уровень антител IgG к белку N [Leung et al., 2004], а среди T-клеток присутствуют популяции как хелперных, так и цитотоксических клеток, специфичных к белку N [Gao et al., 2003; Okada et al., 2005], в составе которого выявлено 8 CTL-эпитопов [Marra et al., 2003].

В качестве разрабатываемых или уже используемых вакцин против коронавирусной инфекции, вызываемой генетическими вариантами вируса SARS-CoV-2, используется ряд платформ на основе аденовирусов [Епифанова и др., 2017, Черенова и др., 2017] и бактерий Francisella tularensis [Jia et al., 2021].

Штаммы F. tularensis 15 НИИЭГ [Olsuf'ev, 1975] и LVS, являющиеся производными штамма F. tularensis 15 [Ellis et al., 2002], используют для создания живых вакцин для профилактики туляремии у людей. Эти вакцины индуцируют длительный специфический гуморальный и клеточно-опосредованный иммунитет [Elkins et al., 2002; Eneslatt et al., 2011].

Туляремийные вакцины на основе штаммов F. tularensis 15 НИИЭГ и LVS безопасны, обладают незначительной реактогенностью и рассматриваются в качестве бактериальных векторов для представления гетерологичных протективных антигенов иммунной системе с целью формирования длительного гуморального и клеточного иммунитета против гетерологичных патогенов [Kravchenko et al., 2007; Robinson et al., 2015, Jia et al., 2018, Jia et al., 2021 ; Павлов и др., Патент RU 2745161 C1, 2021].

Технический результат изобретения заключается в получении аттенуированного штамма F. tularensis 15-NC-2, синтезирующего антиген нуклеокапсида NC вируса SARS-CoV-2, способного индуцировать специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ у экспериментальных мышей линии Balb/c.

Технический результат достигается тем, что предложен способ получения продуцента рекомбинантного белка нуклеокапсида NC вируса SARS-COV-2 на основе вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, заключающийся в конструировании плазмиды pPNC-2 на основе стабильного репликона вектора рРМС1 с рекомбинантным опероном гена nc, состоящим из промоторной области гена groE и лидерной последовательности гена fopA F. tularensis, объединенных со структурной частью рекомбинантного гена nc, кодирующего рекомбинантный белок нуклеокапсида вируса SARS-COV-2, в три этапа: сначала был создан рекомбинантный оперон, встроенный в стабильный плазмидный вектор pPMC1 с селективным маркером устойчивости к хлорамфениколу cat, после удаления из плазмиды pPCNC фрагмента ДНК с геном cat была получена плазмида pPNC-2, которая была перенесена в клетки вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ методом ко-трансформации с нестабильно наследуемой туляремийным микробом плазмидой pTV24, и после селекции был получен штамм-продуцент F. tularensis 15-NC-2 без гена cat.

Способ создания штамма F. tularensis 15 -NC-2 заключается в конструировании на основе вектора рРМС1 рекомбинантной плазмиды pPNC-2, содержащей рекомбинантный оперон, состоящий из промоторной области гена groE и фрагмента гена fopA, кодирующего лидерную последовательность FopL белка FopA F. tularensis, и структурной части рекомбинантного гена nc вируса SARS-CoV-2. В отличие от вектора рРМС1, в рекомбинантной плазмиде отсутствует ген cat. Полученную плазмиду pPNC-2 переносят в клетки реципиентного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ методом ко-трансформации с плазмидой pTV24 (Tc^R Cm^R), нестабильно наследуемой клетками туляремийного микроба. Отбор трансформантов проводили на среде FT-агар с тетрациклином. Наличие плазмиды pPNC-2 в клонах с фенотипом Tc^R выявляли методом ПЦР с праймерами, специфичными к рекомбинантному гену nc, и методом электрофореза. Селекцию клонов, несущих только одну плазмиду pPNC-2, проводили после культивирования биплазмидного штамма на среде ЖПС и высева культуры до изолированных колоний на среду FT-агар без антибиотиков. Целевые клоны отбирали по фенотипу Tc^S Cm^S, отсутствию плазмиды pTV24 и наличию ПЦР-сигнала с праймерами, специфичными к рекомбинантному гену nc. В результате был получен стабильно синтезирующий иммуногенный рекомбинантный белок NC, штамм F. tularensis 15-NC-2 с плазмидой pPNC-2 с рекомбинантным геном nc и без гена cat.

На первом этапе конструировали нуклеотидную последовательность с рекомбинантным геном nc размером 1050 п.о., фланкированную сайтами HindIII/BamHI, основываясь на нуклеотидной последовательности гена "N" из базы данных GenBank: MZ054890.1. Используя в качестве матрицы химически синтезированный рекомбинантный ген nc и праймеры FG Hind и RG Bam (таблица 1), методом ПЦР нарабатывали ампликон с рекомбинантным геном nc, который затем гидролизовали рестриктазами HindIII и BamHI и встраивали в плазмидный вектор pBlueScriptIIKS/SK(+) между сайтами HindIII и BamHI. В результате была получена плазмида pBPNC, которую вводили методом электропорации в клетки E. coli DH5α.

На втором этапе на основе вектора рРМС1 создавали плазмиду pPCNC с рекомбинантным опероном, состоящим из промоторной области гена groE и фрагмента гена fopA, кодирующего лидерную последовательность FopL белка FopA F. tularensis, и структурной части гена nc вируса SARS-CoV-2. Для этого плазмиду р17 [Kravchenko et al., 2007], содержащую, помимо репликона плазмиды рРМС1 с геном cat, промоторную область гена groE и фрагмент гена fopA, кодирующего лидерную последовательность FopL белка FopA F. tularensis, линеаризовали рестриктазой BamHI и дополнительно частично гидролизовали рестриктазой HindIII. Продукты гидролиза разделяли методом электрофореза и выделяли фрагмент HindIII-BamHI размером 4295 п.о., который затем объединяли с ампликоном с рекомбинантным геном nc, гидролизованным рестриктазами HindIII/BamHI, в кольцевую структуру. Созданную плазмиду pPCNC переносили в клетки F. tularensis 15 НИИЭГ методом электропорации. Клоны с рекомбинантной плазмидой отбирали на среде FT-агар с хлорамфениколом с последующим ПЦР-анализом с праймерами, специфичными для рекомбинантного гена nc - FG Hind/RG Bam. В результате был получен клон F. tularensis 15 (pPCNC) с плазмидой pPCNC.

На третьем этапе создавали делеционный вариант плазмиды pPCNC без гена cat. Плазмиду pPCNC гидролизовали рестриктазой XhoI и фрагменты плазмиды замыкали в кольцевые структуры лигазой фага Т4. В полученный препарат вносили плазмиду pTV24 и этой смесью трансформировали клетки F. tularensis 15 НИИЭГ методом электропорации. Селекцию трансформантов проводили на среде FT-агар с тетрациклином. Среди клонов с фенотипом Tc^R методом ПЦР с праймерами FG Hind и RG Bam и методом электрофоретического анализа выявляли клоны, которые, наряду с плазмидой pTV24 (13,4 т.п.о., Tc^R Cm^R)(Youngman et al.,1983), содержали плазмиду pPNC-2 (4,5 т.п.о.) с геном nc. Биплазмидный штамм культивировали в среде ЖПС, затем бактериальную культуру рассевали на FT-агар до изолированных колоний, далее среди клонов с фенотипом Tc^S Cm^S методом ПЦР выявляли клоны с рекомбинантным геном nc и без гена cat, и методом электрофореза выявляли клоны с плазмидой pPNC-2, утратившие плазмиду pTV24. Таким образом был получен чувствительный к хлорамфениколу моноплазмидный штамм F. tularensis 15-NC-2.

Синтез рекомбинантного белка NC клетками штамма F. tularensis 15-NC-2 подтверждали методом вестерн-блота с мышиными моноклональными антителами NCC6, специфичными к N-концевой части молекулы рекомбинантного белка NC, выделенного из штамма-продуцента E. coli. Наличие эпитопов в рекомбинантном белке NC, иммунологически идентичных эпитопам вирусного белка N, подтверждали методом вестерн-блота с использованием сывороток людей, переболевших коронавирусной инфекцией COVID-19. Уровень синтеза рекомбинантного белка NC клетками штамма F. tularensis 15-NC-2 определяли методом «сэндвич»-ИФА с парой мышиных моноклональных антител NCC6 и NCG10-биотин, специфичных к рекомбинантному белку NC.

Отличием предлагаемого способа конструирования штамма F. tularensis 15-NC-2, синтезирующего белок нуклеокапсида NC вируса SARS-CoV-2, на основе модификации вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ с помощью плазмиды, кодирующей рекомбинантный ген nc вируса SARS-CoV2, без селективного маркера антибиотикоустойчивости, от ранее разработанных способов получения аттенуированных штаммов F. tularensis, не содержащих селективных маркеров антибиотикоустойчивости и экспрессирующих гены гетерологичных антигенов в составе бактериальной хромосомы методом аллельного обмена в хромосоме F. tularensis, а также от использованных ранее маркированных генами антибиотикоустойчивости рекомбинантных плазмид, экспрессирующих гены гетерологичных антигенов [Kravchenko et al., 2007; Robinson et al., 2015; Jia et al., 2018] является использование рекомбинантной плазмиды без селективного маркера для экспрессии целевого гена в клетках вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ.

В результате разработанного способа был получен штамм F. tularensis 15-NC-2 без маркеров антибиотикоустойчивости, синтезирующий рекомбинантный белок NC вируса SARS-Co2, иммунологически близкий к нативному вирусному белку “N”.

Разработанный способ позволяет создавать модифицированные вакцинные штаммы F. tularensis, синтезирующие гетерологичные протективные антигены, без дополнительных генов антибиотикоустойчивости, что открывает широкие возможности использования данных штаммов F. tularensis для создания перспективных эффективных рекомбинантных вакцин для защиты организмов человека и животных от возбудителей вирусных и бактериальных внутриклеточных инфекций.

Основные свойства штамма F. tularensis 15-NC-2

Культурально-морфологические. Бактерии штамма F. tularensis 15-NC-2 представляют собой мелкие кокковидные и палочковидные клетки размерами 0,2-0,7 мкм, неподвижные, грамотрицательные, полиморфные, спор и капсул не образующие, аэробы, ауксотрофы, культивирующиеся при температуре от 15°C до 42°C в полноценных средах с глюкозой и повышенной концентрацией цистеина (FT- агар). Оптимальные условия выращивания: 37°C, рН 6,8-7,4.

Среды для культивирования штамма F. tularensis 15-NC-2: плотная питательная среде FT-агар (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск); жидкая питательная среда г/л: 5 г ферментативного гидролизата казеина, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого натрия, 12 г однозамещенного фосфата калия, рН 7,2, 1% глюкоза, 10 мг цистеина, 10 мг хлористого железа. На FT-агаре при температуре 37°C выпуклые, блестящие, гладкие, голубовато-белые, непрозрачные, однородные колонии появляются через 48 ч, а через 72 ч размер колоний достигает 2,0-2,5 мм.

Стабильность. При пересевах на плотных питательных средах штамм F. tularensis 15-NC-2 не диссоциирует, стабильно наследует рекомбинантную плазмиду и сохраняет способность синтезировать рекомбинантный белок NC.

Биохимические свойства. Клетки штамма F. tularensis 15-NC-2 утилизируют цистеин с образованием сероводорода, на среде Даунса ферментируют глюкозу и мальтозу, не ферментируют глицерин, сахарозу и лактозу. Устойчивы к эритромицину, полимиксину, пенициллину, ампициллину, чувствительны к стрептомицину, тетрациклину, доксициклину, гентамицину, канамицину, налидиксовой кислоте, не обладают цитруллинуреидазной и фосфатазной активностью. Штамм синтезирует рекомбинантный белок нуклеокапсида NC.

Условия хранения культуры штамма: культура штамма F. tularensis 15 NC-2 хранится при температуре +4°C на косяках среды FT-агара до 1 месяца.

Способ и условия хранения: штамм F. tularensis 15 NC-2 хранится в лиофильно высушенном состоянии в криозащитной среде при температуре (4-8)°C. Рекомендуемая перезакладка культуры - каждые 5 лет.

Технологические особенности при культивировании. Технологических особенностей при культивировании штамма F. tularensis 15-NC-2 в сравнении с вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ нет.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:

Фиг. 1 - Нуклеотидная последовательность гена “N” вируса SARS-CoV-2.

Фиг. 2 - Структурная схема плазмиды p17.

Фиг. 3 - Структурная схема плазмиды pPCNC.

Фиг. 4 - Структурная схема плазмиды pPNC-2.

Фиг. 5. - Иммуноблоттинг ультразвуковых дезинтегратов рекомбинантных клонов штамма F. tularensis (pPCNC) с мышиными моноклональными антителами NCC6 к белку NC.

Фиг. 6. - Иммуноблоттинг рекомбинантного белка NC, выделенного из E. coli, с сыворотками иммунизированных штаммом F. tularensis 15-NC-2 мышей (разведение 1:40).

Пример 1. Получение ампликона со структурной частью рекомбинантного гена nc и его клонирование в векторе pBlueScriptIIKS/SK(+) в клетках E. coli.

Для клонирования ампликона со структурной частью рекомбинантного гена nc были разработаны праймеры FG Hind, (5'- aaactgcaagcttggataatggacccc -3') и RG Bam (5'-aggggatcctcaggcctgagttgagtcag-3'), комплементарные N- и С-концевой частям гена “N”, согласно нуклеотидной последовательности (фиг.1), приведенной в базе данных GenBank: MZ054890.1.

На основе синтезированной матричной ДНК рекомбинантного гена nc и праймеров FG Hind и RG Bam был получен ампликон размером 1056 п.о., фланкированный сайтами для рестриктаз HindIII и BamHI. Гидролизованный рестриктазами HindIII и BamHI ампликон был встроен между сайтами рестрикции HindIII и BamHI вектора pBlueScriptIIKS/SK(+), полученный препарат ДНК трансформировали в клетки E. coli DH5α методом электропорации. Селекцию плазмидосодержащих клонов проводили на среде LA с Ap (100 мкг/мл) и с Х-gal (20 мкг/мл). Среди бесцветных трансформантов целевые клоны с рекомбинантной плазмидой, несущей рекомбинантный ген nc, выявляли методом ПЦР с праймерами FG Hind и RG Bam и электрофоретическим анализом. В результате был получен штамм E. coli DH5α (pBNC) с плазмидой pBNC.

Пример 2. Создание плазмиды pPCNC на основе репликона плазмиды рРМС1 и гена cat, содержащей рекомбинантный оперон, состоящий из промоторной области гена groE и фрагмента гена fopA, кодирующего лидерную последовательность FopL белка FopA F. tularensis, и структурной части рекомбинантного гена nc.

Из клеток штамма E. coli DH5α (pBNC) выделяли плазмиду pBNC, гидролизовали ее рестриктазами HindIII и BamHI и после электрофоретического разделения выделяли фрагмент размером 1050 п. о с рекомбинантным геном nc. ДНК плазмиды р17 (фиг. 2), созданной на основе плазмидного вектора рРМС1, содержащей промоторную область гена groE и фрагмент гена fopA, кодирующего лидерную последовательность FopL белка FopA F. tularensis (GenBank: AM233362.1), была линеаризована рестриктазой BamHI, частично гидролизована рестриктазой HindIII и после электрофоретического разделения был выделен фрагмент размером 4295 п.о.

В результате объединения ДНК-лигазой фага Т4 в кольцевую структуру фрагмента HindIII-BamHI размером 4295 п.о. и фрагмента HindIII-BamHI с рекомбинантным геном nc размером 1050 п.о. была получена плазмида pPCNC. Созданную плазмиду переносили в клетки F. tularensis 15 НИИЭГ методом электропорации. Селекцию трансформантов проводили на FT-агаре с Cm (3 мкг/мл). Плазмидосодержащие клоны F. tularensis15(pPCNC) с рекомбинантным геном nc выявляли методом ПЦР с праймерами FG Hind и RG Bam и после рестрикционного анализа плазмид из nc (+) клонов был отобран клон с рекомбинантной плазмидой pPCNC (фиг. 3).

Пример 3. Получение делеционного варианта плазмиды pPCNC с рекомбинантным опероном nc без гена cat.

Для удаления гена cat из плазмиды pPCNC препарат плазмидной ДНК гидролизовали рестриктазой XhoI и после электрофоретического разделения фрагментов ДНК выделяли фрагмент размером 4295 п.о., который был замкнут в кольцевую структуру с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Полученную кольцевую структуру смешивали с плазмидной ДНК pTV24 в молярном соотношении 1000:1 и ко-трансформировали в клетки F. tularensis15 НИИЭГ методом электропорации. Селекцию трансформантов проводили на среде FT-агар с Tc (10 мкг/мл). Среди тетрациклин-устойчивых клонов методом ПЦР с праймерами FG Hind и RG Bam и электрофоретическим анализом выявляли биплазмидные клоны F. tularensis, несущие рекомбинантный ген nc. Для удаления плазмиды pTV24 из биплазмидного штамма с фенотипом NC⁺ Tc^R Cm^R бактериальные клетки культивировали в ЖПС в течение 20 ч и культуру высевали на FT-агар до изолированных колоний. Среди выросших клонов отбирали клоны с фенотипом Tc^S Cm^S и методом электрофореза подтверждали отсутствие плазмиды pTV24 и наличие плазмиды pPNC-2 размером 4,5 т.п.о. (фиг. 4). Таким образом был получен штамм F. tularensis 15-NC-2, несущий плазмиду pPNC-2 с рекомбинантным опероном nc и без гена cat.

Пример 4. Синтез рекомбинантного белка NC клетками штамма F. tularensis15 (pPCNC).

Для детекции синтеза рекомбинантного белка NC бактериальными клетками штамма F. tularensis 15 (pPCNC) применяли метод иммуноблоттинга с использованием мышиных моноклональных антител NCC6, специфичных к N-концевому фрагменту рекомбинантного белка NC, выделенного из штамма-продуцента E. coli.

Для анализа использовали ночную культуру F. tularensis 15 (pPCNC), выращенную на FT-агаре. 50 мг биомассы суспендировали в 1 мл ЗФР и разрушали бактериальные клетки с помощью ультразвука на дезинтеграторе «Ultrasonic Homogenizer» (Cole Parmer, США) с микронасадкой при мощности 150 Вт в режиме обработки 30 с × 6 с интервалом 1 мин. Для разделения белков электрофорезом в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) с SDS образцы лизатов смешивали с 2-кратным буфером для нанесения в соотношении 1:1 (объем/объем), кипятили в течение 10 мин и вносили в лунки геля. Для иммуноблоттинга в качестве контрольного антигена использовали рекомбинантный белок нуклеокапсида NC с молекулярной массой ≈50 кДа, выделенный из штамма-продуцента E. coli. После разделения белки из геля переносили на мембрану Hybond P (PVDF GE Healthcare, Великобритания) полусухим методом. Мембрану блокировали 1%-ным раствором БСА в течение 30 мин при температуре 4°С и затем вносили моноклональные антитела NCC6 в рабочем разведении 1:500 и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°С. Комплекс антиген-антитело выявляли с помощью конъюгата вторичных козьих антител к IgG мыши-пероксидаза хрена («Sigma», США). Мембрану окрашивали в растворе субстрата для пероксидазы хрена 3,3'-диаминобензидин тетрагидрохлорида (ДАБ) (AppliChem, Германия).Таким образом показано, что штамм F. tularensis15(pPCNC) с рекомбинантным опероном, состоящим из промоторной области гена groE и фрагмента гена fopA, кодирующего лидерную последовательность FopL белка FopA F. tularensis, и структурной части рекомбинантного гена nc способен синтезировать рекомбинантный белок нуклеокапсида NC с молекулярной массой 50±0,7 кДа (фиг. 5).

Пример 5. Оценка уровня синтеза рекомбинантного белка нуклеокапсида NC клетками штамма F. tularensis 15-NC-2.

Уровень синтеза рекомбинантного белка нуклеокапсида NC клетками F. tularensis 15-NC-2 определяли методом ИФА в варианте «сэндвич». Для приготовления препарата антигена была использована ночная агаровая культура, ресуспендированная в буфере 50 мМ трис-HC, 0,4 М хлорида натрия, рН 7,5 до конечной концентрации сырой биомассы 100 мг/мл и дезинтегрированная ультразвуком четырежды по 15 сек с интервалом 30 с. Разрушенную биомассу центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 мин и супернатант ультразвукового дезинтеграта клеток использовали для постановки ИФА. Концентрацию общего белка в супернатанте определяли с помощью набора ВСА Protein Assay Kit (Sigma-Aldrich, США).

Моноклональные антитела NCC6 с концентрацией 5 мкг/мл в карбонатно-гидрокарбонатном буферном растворе pH 9,6 вносили по 100 мкл в лунки 96-луночного планшета для ИФА Nunc-Maxisorp (Nunc, Дания) и иммобилизировали при 4°С в течение 18 ч. Неспецифическую сорбцию блокировали 5% раствором обезжиренного молока (Oxiod, Великобритания) в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ) при 37°С в течение 30 мин. Готовили по три повтора двукратных серийных разведений исследуемых образцов супернатантов дезинтеграта культур F. tularensis и контрольного препарата белка NC в диапазоне концентраций 100-0,05 нг/мл, вносили в лунки с адсорбированными моноклональными антителами и инкубировали при 37°С в течение 2 ч . После промывки планшета добавляли раствор биотинилированных моноклональных антител NCG10 в рабочем разведении 1:2000 и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Планшет трижды промывали ФСБ с добавлением Твина-20, добавляли конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена (Thermo-Fisher, США) в рабочем разведении 1:10000 и инкубировали 30 мин при 37°С. После промывки вносили в лунки по 100 мкл раствора субстрата для пероксидазы хрена 3,3',5,5'тетраметилбензидина (ТМБ) (Thermo-Fisher, США) и через 5 мин инкубирования реакцию останавливали добавлением 50 мкл 0,1 М серной кислоты. Оптическую плотность ОП₄₅₀ измеряли с помощью микропланшетного спектрофотометра Varioscan LUX (Thermo-Fisher, США) с коррекцией фонового поглощения при OD₆₂₀. Полученные данные анализировали и строили графики с помощью компьютерной программы Sigma-Plot 12.3.

В результате было показано, что в супернатанте дезинтеграта культуры F. tularensis 15-NC-2 с концентрацией общего растворимого белка 5,65 мг/мл содержалось 2,56 мкг/мл рекомбинантного белка NC, что соответствует 0,04% от суммарной фракции растворимого белка клеток штамма F. tularensis.

Пример 6. Специфический гуморальный ответ мышей линии Balb/c, иммунизированных штаммом F. tularensis 15-NC-2, на рекомбинантный белок нуклеокапсида NC.

Для определения уровня гуморального иммунного ответа на рекомбинантный белок нуклеокапсида NC, синтезируемый клетками F. tularensis 15-NC-2, группу из 5 мышей линии Balb/c иммунизировали штаммом F. tularensis 15-NC-2 в дозе 1×10⁵ КОЕ/мышь и через 40 сут анализировали мышиные сыворотки методом иммуноблоттинга с рекомбинантным белком нуклеокапсида NC, выделенным из E. coli (фиг. 6).

Согласно полученным данным, в сыворотках крови мышей линии Balb/c, иммунизированных штаммом F. tularensis 15-NC-2 в дозе 1×10⁵ КОЕ/мышь, через 40 сут присутствовали специфические антитела к нуклеокапсиду NC.

Пример 7. Специфический клеточный иммунный ответ на рекомбинантный белок нуклеокапсида NC мышей линии Balb/c, иммунизированных штаммом F. tularensis 15-NC-2.

Специфический клеточный ответ у иммунных мышей линии Balb/c оценивали по уровню синтеза интерферона спленоцитами, активированными рекомбинантным белком нуклеокапсида NC. Группу из 5 мышей линии Balb/c иммунизировали подкожно штаммом F. tularensis 15-NC-2 в дозе 1×10⁵ КОЕ/мышь, а в качестве контрольной группы иммунизировали группу из 5 мышей линии Balb/c штаммом F. tularensis 15НИИЭГ в дозе 1×10² КОЕ/мышь. Через 40 сут после иммунизации от мышей были выделены спленоциты. В лунки 96-луночного планшета для культуры клеток вносили суспензию спленоцитов в количестве 10⁵ кл/лунку, добавляли 100 мкл рекомбинантного белка нуклеокапсида NC в концентрации 5 мкг/мл или ультразвукового дезинтеграта бактериальной суспензии в концентрации 10⁸ КОЕ/мл штамма F. tularensis 15 НИИЭГ и инкубировали в среде RPMI 1640 (GIBCO Invitrogen, Великобритания) с добавлением 10 мкг/мл гентамицина (GIBCO Invitrogen, Великобритания) в атмосфере CO₂ 5% при 37°С в течение 48 ч. В качестве положительного контроля использовали ConA (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 5 мкг/мл, в качестве отрицательного контроля использовали среду RPMI 1640.

Уровень секреции IFN-γ активированными спленоцитами оценивали с помощью набора Mouse IFN-Gamma ELISA Kit по методике фирмы-производителя (Invitrogen ThermoFisher Scientific, США). Оптическую плотность в лунках определяли на планшетном спектрофотометре MultiscanFC (ThermoFisher, США) при длине волны 450 нм.

Показано, что иммунизация мышей рекомбинантным и контрольным штаммами F. tularensis приводит к формированию выраженного клеточного иммунного ответа на суммарный антиген ультразвукового дезинтеграта бактериальной суспензии штамма F. tularensis 15 НИИЭГ (13,4 нг/мл для контрольного штамма и 20,7 нг/мл для рекомбинантного штамма). Активация препаратом ConA спленоцитов сравниваемых групп иммунных мышей находилась на сходных уровнях (5,7 нг/мл для контрольного штамма и 3,6 нг/мл для рекомбинантного штамма). Уровень секреции IFN-γ активированными спленоцитов иммунизированных рекомбинантым штаммом мышей достоверно отличался от мышей, иммунизированных контрольным штаммом (981 и 27,6 пкг/мл, соответственно)

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ получения продуцента рекомбинантного белка нуклеокапсида NC вируса SARS-CоV-2 на основе вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ заключается в конструировании стабильной рекомбинантной плазмиды pPNC-2 с рекомбинантным опероном, состоящим из промоторной области гена groE и фрагмента гена fopA, кодирующего лидерную последовательность FopL белка FopA F. tularensis, и структурной части рекомбинантного гена nc вируса SARS-CoV-2. Полученную таким способом плазмиду pPNC-2 с удаленным геном cat переносили в клетки штамма F. tularensis 15 НИИЭГ методом ко-трансформации с плазмидой pTV24 (Tc^R Cm^R) и после трехэтапной селекции и ПЦР-анализа был отобран синтезирующий иммуногенный рекомбинантный белок нуклеокапсида NC штамм F. tularensis 15-NC-2 без дополнительного маркера антибиотикоустойчивости гена cat. Предложенное изобретение позволяет получать модифицированный штамм F. tularensis, синтезирующий иммунологически активный рекомбинантный белок нуклеокапсида NC вируса SARS-CoV-2. Штамм может использоваться при создании прототипа живой комбинированной рекомбинантной вакцины для профилактики как коронавирусной инфекции, так и других инфекций, вызываемых внутриклеточными патогенами. 6 ил.

Способ получения бактериального продуцента рекомбинантного белка нуклеокапсида NC вируса SARS-CоV-2, заключающийся в конструировании плазмиды pPNC-2 на основе стабильного репликона вектора рРМС1 с рекомбинантным опероном гена nc, состоящим из промоторной области гена groE и лидерной последовательности гена fopA F. tularensis, объединенных со структурной частью рекомбинантного гена nc, кодирующего рекомбинантный белок нуклеокапсида NC вируса SARS-CоV-2, в три этапа: сначала был создан рекомбинантный оперон, который был встроен в стабильный плазмидный вектор pPMC1 с селективным маркером устойчивости к хлорамфениколу cat, после удаления из плазмиды pPCNC фрагмента ДНК с геном cat была получена плазмида pPNC-2, которая была перенесена в клетки вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ методом ко-трансформации с нестабильно наследуемой туляремийным микробом плазмидой pTV24, и после селекции был получен штамм-продуцент F. tularensis 15-NC-2 без гена cat, синтезирующий иммуногенный рекомбинантный белок нуклеокапсида NC, способный индуцировать специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ у экспериментальных мышей линии Balb/c.