Способ идентификации меда на основе изотопной масс-спектрометрии Российский патент 2023 года по МПК A01K59/00 

Изобретение относится к пищевой промышленности, продукции пчеловодства, а именно к способам установления происхождения меда для подтверждения его натуральности.

Известен способ установления происхождения меда через определение изотопных характеристик углерода δ¹³С в меде, а также в его белковой фракции [AOAC official methods of analysis (1999). 16^th Ed., 5^th Rev. Method 998.12: C-4 plant sugars in honey, internal standard stable carbon isotope ratio method, AOAC Int. Gaithersburg MD, Method 998.12, 44.4.18A.]. Авторы установили, что в натуральном меде белковая и углеводная составляющие образуются одновременно и из одного источника. Поэтому изотопное распределение углерода в них должно быть одинаковым. Отличие изотопного состава химических элементов компонентов меда брутто и белковой фракции более чем на 1‰ свидетельствует о фальсификации меда сахарами, получаемыми из С4 типа растений. Существенное усовершенствование этого метода было достигнуто за счет использования дополнительной фильтрации субстрата белковой фракции в процессе пробоподготовки, что повысило чувствительность и точность измерения [Rogers K.M., Cook J.M., Krueger D., Beckmann K. (2013). Modification of AOAC Official MethodSM 998.12 to Add Filtration and/or Centrifugation: Interlaboratory Comparison Exercis. Journal ofaoac International, 96(3), 607-614.]. Эта новая процедура позволила определить до 7 % добавок в меде сахаров из С4 типа растений, а также была утверждена для всемирного применения и до сих пор считается аналитическим эталонным методом для определения примеси в меде сахаров из С4 типа растений

Недостатками данного метода являются высокая неопределенность измерения для меда с низким содержанием белка, таких как, мед акации или лавандовый, а также риск изменения значений показателя δ¹³C белка для меда, содержащего большое количество дрожжей или остатков добавок для кормления пчел. Кроме того, остается открытым вопрос в случае добавления сахаров из С3 типа растений.

Другой метод основан на принципе жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией отношения стабильных изотопов углерода ¹³C/¹²C в меде (LC-IRMS) [Hiroto Kawashima, MomokaSuto, NanaSuto. Stable carbon isotope ratios for organic acids in commercial honey samples. Food Chemistry. Volume 289, 15 August 2019, Pages 49-55. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.03.053]. LC-IRMS позволяет за один этап выделять отдельные сахарные компоненты меда и определять их значения δ¹³C в режиме онлайн, избегая недостатков автономных методов, а также создавая реальную альтернативу сложным методикам, таким как газовая хроматография-сжигание-масс-спектрометрия изотопного соотношения (IRMS), который не получили распространения в качестве общепринятого высокопроизводительного метода для анализа фальсификаций меда [Aiman Abrahim, Andrew Cannavan, Simon D. Kelly. Stable isotope analysis of non-exchangeable hydrogen in carbohydrates derivatised with N-methyl-bis-trifluoroacetamide by gas chromatography - Chromium silver reduction/High temperature Conversion-isotope ratio mass-spectrometry (GC-CrAg/HTC-IRMS)].

Благодаря применению LC-IRMS для определения значений показателя δ¹³C фруктозы, глюкозы и сахарозы в меде и расчету разницы (Δδ¹³C) между этими значениями было показано, что фальсификации, как сахарами С4, так и сахарами С3, можно определить с чувствительностью от 1 до 10 % в зависимости от типа сахарного сиропа [ANA I. CABAN÷ERO, JOSE L. RECIO, AND MERCEDES RUPEÄ REZ. Liquid Chromatography Coupled to Isotope Ratio Mass Spectrometry: A New Perspective on Honey Adulteration Detection. J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 9719-9727. DOI: 10.1021/jf062067x].

Недостатком данного метода является то, что анализ с использованием LC-IRMS крайне затратный как с технической точки зрения, так и с финансовой. Также согласно ряду современных научных работ [JinZhong Xu, Xiuhong Liu, Bin Wu, YanZhong Cao. A comprehensive analysis of 13 C isotope ratios data of authentic honey types produced in China using the EA-IRMS and LC-IRMS. J Food Sci Technol. 2020 Apr;57(4):1216-1232. doi: 10.1007/s13197-019-04153-2. Epub 2019 Nov 29.] данный метод не столь надежный и может давать ошибочные результаты, в том числе, в аутентичных (натуральных) образцах. Более того в контексте импортозамещения и разработки собственных отечественных наработок, необходим менее затратный и простой способ без использования столь сложной опции как LC-IRMS

Известен метод по выявления добавки инвертных сиропов из С3 типа растений с помощью изотопных измерений с использованием ядерного магнитного резонанса SNIF-NMR [J F Cotte, H Casabianca, J Lhéritier, C Perrucchietti, C Sanglar, H Waton, M F Grenier-Loustalot. Study and validity of 13C stable carbon isotopic ratio analysis by mass spectrometry and 2H site-specific natural isotopic fractionation by nuclear magnetic resonance isotopic measurements to characterize and control the authenticity of honey. Anal Chim Acta. 2007 Jan 16;582(1):125-36. doi: 10.1016/j.aca.2006.08.039. Epub 2006 Aug 26].

Недостатком данного метода, как утверждают авторы работы, является то, что использование SNIF-ЯМР ограничено обнаружением добавленных сахаросодержащих веществ, начиная с 20%, что не удовлетворительно. Также стоит отметить дороговизну аналитического оборудования и техническую сложность проведения пробоподготовки при выполнение данного типа анализа.

Сербскими учеными предложен метод по идентификации меда [Smajlovic, I., et. al. (2020). “Honey and diverse sugar syrups differentiation by EIM-IRMS Method”). Isotoptech. Honey adulteration analysis.]. Исследователи утверждают, что разработанный метод (EIM-IRMS®) позволяет обнаружить добавление в мед сахарных сиропов, полученных из различных видов сырья, таких как сахарная свекла, кукуруза, пшеница, картофель, рис и др. Детектирование производится для известных и неизвестных образцов меда путем измерения относительного соотношения необменных изотопов водорода (D/H)n (δDn) в этаноле, предварительно количественно извлеченном из ферментированных образцов меда. Согласно информации авторов данный метод - это единственный метод, способный обнаружить добавление сахаров, полученных из С3- и из С4-растений.

Недостатком данного метода является то, что метод не учитывает показатель соотношения изотопов δ¹⁸О в этаноле ферментированных образцов меда, что в случае, например, со свекловичным сахаром имеет критическое значение.

Предлагаемый нами метод имеет преимущество за счет получения ранее неизвестных характеристик этанола в ферментированных образцах меда, основанных на определении изотопных отношений легких элементов (¹³С/¹²С, ¹⁸О/¹⁶О, D/H) и получении различия их соотношений в этаноле в зависимости от его происхождения. За основу был взят метод из патента RU2661606C1, «Способ определения происхождения этанола в алкогольной продукции». Предлагаемый способ позволяет повысить точность и достоверность анализа на 90%.

Это достигается тем, что способ определения происхождения этанола в ферментированных образцах меда характеризуется тем, что пробу продукта подвергают дистилляции при температуре 78,0-78,2°С, собирают отогнанный дистиллят при этой температуре, отогнанный дистиллят разделяют на три аликвоты, которые раздельно подвергают изотопному масс-спектрометрическому анализу с установлением отношений распространенностей стабильных изотопов конкретного элемента (¹³С/¹²С, ¹⁸O/¹⁶O, D/H), сравнивают полученные количественные характеристики и характеристики контрольных образцов и по степени совпадения или отклонения судят о происхождении этанола.

Способ осуществляют следующим образом. В перегонную круглодонную колбу вместимостью 50 см³ помещают 25 см³ пробы ферментированного образца меда и проводят экстракцию этанола при температуре не выше 78,5°С. Собирают дистиллят при температуре (78,0-78,2) °С. Если температура превышает 78,5 °С, операцию останавливают на 5 минут. Когда температура снизится до 78,0 °С, снова продолжают отбор дистиллята до очередного повышения температуры. Полная дистилляция длится до 1 часа. Такой способ позволяет рекуперировать до 98-98,5 % общего спирта из пробы.

Отогнанный этанол разделяют на три аликвоты по 1,5-2,0 см³, каждую аликвоту раздельно подвергают изотопному масс-спектрометрическому анализу с установлением отношений распространенностей стабильных изотопов конкретного элемента (¹³С/¹²С, ¹⁸О/¹⁶О, D/H), сравнивают полученные количественные характеристики и характеристики контрольных образцов и по степени совпадения или отклонения судят о происхождении этанола

Первую аликвоту подвергают изотопному масс-спектрометрическому анализу с установлением распространенностей стабильных изотопов углерода ¹³С/¹²С и их соотношений, сравнивают полученные количественные характеристики и характеристики контрольных образцов и по степени совпадения или отклонения судят о происхождении этанола. Характеристики изотопного состава углерода диоксида углерода, полученного при сжигании этанола пробы, относительно международного углеродного стандарта V-PDB определяют в относительных единицах δ¹³C_VPDB (‰), используя формулу (1), включенную в программное обеспечение для масс-спектрометра Delta V Advantage, следующего вида:

R_обр и R_ст - отношения распространенностей стабильных изотопов ¹³С и ¹²С в анализируемом диоксиде углерода, полученном при сжигании этанола пробы, и международного углеродного стандарта V-PDB соответственно.

В процессе изотопного масс-спектрометрического анализа углерода δ ¹³C_VPDB регистрируют попеременно токи, обусловленные количеством ионов с (m/z 44 (¹²C¹⁶O2 ), m/z 45 (¹³C¹⁶O₂ и ¹²C¹⁷O¹⁶O), m/z 46 (¹²C¹⁶O¹⁸O)), характерных для всех изотопных комбинаций элементов в газообразном диоксиде углерода (СО₂), образованном при полном сжигании в элементном анализаторе спирта этилового, полученного путем дистилляции, и в референтном газе CO₂.

Вторую аликвоту подвергают изотопному масс-спектрометрическому анализу с установлением распространенностей стабильных изотопов кислорода ¹⁸O/¹⁶О и их соотношений, сравнивают полученные количественные характеристики и характеристики контрольных образцов и по степени совпадения или отклонения судят о происхождении этанола.

Характеристики изотопного состава кислорода оксида углерода, полученного при сжигании пробы этанола ферментированного образца меда относительно международного кислородного стандарта VSMOW2 определяют в относительных единицах δ¹⁸OVSMOW2 (‰), используя формулу (2), включенную в программное обеспечение для масс-спектрометра Delta V Advantage, следующего вида:

Rобр и Rст - отношения распространенностей стабильных изотопов ¹⁸О и ¹⁶О в анализируемом оксиде углерода, полученном при сжигании этанола пробы, и международного углеродного стандарта VSMOW2 соответственно.

В процессе изотопного масс-спектрометрического анализа кислорода δ¹⁸O_VSMOW2 регистрируют попеременно токи, обусловленные количеством ионов с (m/z 28 (¹²С¹⁶О) и m/z 30 (¹²С¹⁸О) в оксиде углерода (СО), образованном в процессе высокотемпературного разложения (пиролиза) этилового спирта, полученного путем дистилляции, и в референтном газе СО.

Третью аликвоту подвергают изотопному масс-спектрометрическому анализу с установлением распространенностей стабильных изотопов водорода D/H и их соотношений, сравнивают полученные количественные характеристики и характеристики контрольных образцов и по степени совпадения или отклонения судят о происхождении этанола.

Характеристики изотопного состава водорода молекулярного водорода, полученного при сжигании этанола пробы, относительно международного кислородного стандарта VSMOW2 определяют в относительных единицах δD_VSMOW2 (‰), используя формулу (3), включенную в программное обеспечение для масс-спектрометра Delta V Advantage, следующего вида:

R_обр и R_ст - отношения распространенностей стабильных изотопов D и Н в анализируемом молекулярном водороде, полученном при сжигании этанола пробы, и международного углеродного стандарта VSMOW2 соответственно.

В процессе изотопного масс-спектрометрического анализа водорода δD_VSMOW2 регистрируют попеременно токи, обусловленные количеством ионов с (m/z 2 (¹Н₂) и m/z 3 (¹H²H)) в водороде (Н₂), образованном в процессе высокотемпературного разложения (пиролиза) этилового спирта, полученного путем дистилляции, и в референтном газе Н₂.

Для калибровки готовят контрольные образцы этанола, полученного путем ферментации натурального меда и сахаров различного происхождения: этанол из образца натурального меда, этанол из кукурузного сиропа, этанол из тростникового сахара, этанол из свекловичного сахара, этанол из свекловичной мелассы, этанол из рисового сиропа. Приготовленные смеси используют для верификации всей схемы пробоподготовки и измерения изотопных характеристик этанола ферментированных образцов, полученного из различных видов сырья. Причем, изотопные характеристики легких элементов (¹³С/¹²С, ¹⁸O/¹⁶O, D/H) всех контрольных образцов этанола различного происхождения должны быть предварительно определены.

Изотопные характеристики легких элементов этанола (¹³С/¹²С, ¹⁸O/¹⁶O, D/H) являются показателями происхождения этилового спирта в меде. Полученные отношения распространенностей стабильных изотопов легких элементов (¹³С/¹²С, ¹⁸О/¹⁶О, D/H) контрольных образцов сопоставляют с результатами анализируемой пробы натурального меда и по степени совпадения или отклонения судят о происхождении спирта и, соответственно, аутентичности меда.

По разнице в значениях количественных изотопных характеристик легких элементов (¹³С/¹²С, ¹⁸О/¹⁶О, D/H) для каждого анализируемого образца, превышающей 0,7 ‰, судят о происхождении спирта в нем.

Пример 1.

В перегонную круглодонную колбу вместимостью 50 см³ помещают 25 см³ ферментированного образца натурального меда и проводят экстракцию этанола при температуре не выше 78,5°С. Собирают дистиллят при температуре (78,0-78,2) °С. Если температура превышает 78,5°С, операцию останавливают на 5 минут. Когда температура снизится до 78,0°С, снова продолжают отбор дистиллята до очередного повышения температуры. Полная дистилляция длится до 1 часа. Такой способ позволяет рекуперировать до 98-98,5% общего спирта из пробы.

Отогнанный спирт разделяют на три аликвоты по 1,5-2,0 см³, каждую аликвоту раздельно подвергают изотопному масс-спектрометрическому анализу с установлением отношений распространенностей стабильных изотопов конкретного элемента (¹³С/¹²С, ¹⁸О/¹⁶О, D/H)

Первую аликвоту подвергают изотопному масс-спектрометрическому анализу с установлением распространенностей стабильных изотопов углерода ¹³С/¹²С и их соотношений, сравнивают полученные количественные характеристики и характеристики контрольных образцов и по степени совпадения или отклонения судят о происхождении этанола.

Характеристики изотопного состава углерода диоксида углерода, полученного при сжигании этанола пробы, относительно международного углеродного стандарта VPDB определяют в относительных единицах δ¹³C_VPDB (‰)>, используя формулу (1), включенную в программное обеспечение для масс-спектрометра Delta V Advantage, следующего вида:

Rобр и Rст - отношения распространенностей стабильных изотопов ¹³С и ¹²С в анализируемом диоксиде углерода, полученном при сжигании этанола пробы, и международного углеродного стандарта V-PDB соответственно.

В процессе изотопного масс-спектрометрического анализа углерода δ¹³C_VPDB регистрируют попеременно токи, обусловленные количеством ионов с (m/z 44 (¹²C¹⁶O₂), m/z 45 (¹³C¹⁶O₂ и ¹²C¹⁷O¹⁶O), m/z 46 (¹²C¹⁶O¹⁸O)), характерных для всех изотопных комбинаций элементов в газообразном диоксиде углерода (CO₂), образованном при полном сжигании в элементном анализаторе спирта этилового, полученного путем дистилляции, и в референтном газе CO₂.

Вторую аликвоту подвергают изотопному масс-спектрометрическому анализу с установлением распространенностей стабильных изотопов кислорода ¹⁸О/¹⁶О и их соотношений, сравнивают полученные количественные характеристики и характеристики контрольных образцов и по степени совпадения или отклонения судят о происхождении этанола.

Характеристики изотопного состава кислорода оксида углерода, полученного при сжигании этанола пробы, относительно международного кислородного стандарта VSMOW2 определяют в относительных единицах δ¹⁸O_VSMOW2 (‰), используя формулу (2), включенную в программное обеспечение для масс-спектрометра Delta V Advantage, следующего вида:

R_oбp и R_ст - отношения распространенностей стабильных изотопов ¹⁸О и ¹⁶О в анализируемом оксиде углерода, полученном при сжигании этанола пробы, и международного углеродного стандарта VSMOW2 соответственно.

В процессе изотопного масс-спектрометрического анализа кислорода δ¹⁸O_VSMOW2 регистрируют попеременно токи, обусловленные количеством ионов с (m/z 28 (¹²С¹⁶0) и m/z 30 (¹²С¹⁸0) в оксиде углерода (СО), образованном в процессе высокотемпературного разложения (пиролиза) этилового спирта, полученного путем дистилляции, и в референтном газе СО.

Третью аликвоту подвергают изотопному масс-спектрометрическому анализу с установлением распространенностей стабильных изотопов водорода D/H и их соотношений, сравнивают полученные количественные характеристики и характеристики контрольных образцов и по степени совпадения или отклонения судят о происхождении этанола.

Характеристики изотопного состава водорода молекулярного водорода, полученного при сжигании этанола пробы, относительно международного кислородного стандарта VSMOW2 определяют в относительных единицах δD_VSMOW2 (‰), используя формулу (3), включенную в программное обеспечение для масс-спектрометра Delta V Advantage, следующего вида:

R_обр и R_ст - отношения распространенностей стабильных изотопов D и Н в анализируемом молекулярном водороде, полученном при сжигании этанола пробы, и международного углеродного стандарта VSMOW2 соответственно.

В процессе изотопного масс-спектрометрического анализа водорода δD_VSMOW2 регистрируют попеременно токи, обусловленные количеством ионов с (m/z 2 (¹Н₂) и m/z 3 (¹Н²Н)) в водороде (Н₂), образованном в процессе высокотемпературного разложения (пиролиза) этилового спирта, полученного путем дистилляции, и в референтном газе Н₂.

Полученные результаты измерений приведены в таблице 1.

Пример 2.

Способ осуществляется аналогично примеру 1, только используется образец, приготовленный из натурального меда и инвертного сиропа, приготовленного из тростникового сахара путем кислотного гидролиза сахарозы (100 г сахара смешивали с 40 мл воды и 1 г лимонной кислоты, после чего нагревали при температуре 108-110 °С в течение часа). После этого полученный сироп смешивали с медом с последующей ферментацией и отгонкой спирта из продукта. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Пример 3.

Способ осуществляется аналогично примеру 1, только используется образец, приготовленный из натурального меда и кукурузного сиропа. Кукурузный сироп смешивали с медом с последующей ферментацией и отгонкой спирта из продукта. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Пример 4.

Способ осуществляется аналогично примеру 1, только используется образец, приготовленный из натурального меда и инвертного сиропа, приготовленного из свекловичного сахара путем кислотного гидролиза сахарозы (100 г сахара смешивали с 40 мл воды и 1 г лимонной кислоты, после чего нагревали при температуре 108-110 °С в течение часа). После этого полученный сироп смешивали с медом с последующей ферментацией и отгонкой спирта из продукта. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Пример 5.

Способ осуществляется аналогично примеру 1, только используется образец, приготовленный из натурального меда и свекловичной мелассы. Мелассу смешивали с медом с последующей ферментацией и отгонкой спирта из продукта. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Пример 6.

Способ осуществляется аналогично примеру 1, только используется образец, приготовленный из натурального меда и рисового сиропа. Рисовый сироп смешивали с медом с последующей ферментацией и отгонкой спирта из продукта. Полученные результаты приведены в таблице 1.

Сравнивают полученные соотношения распространенностей стабильных изотопов легких элементов (¹³С/¹²С, ¹⁸О/¹⁶О, D/H) для каждого анализируемого образца и по разнице в значениях изотопных характеристик углерода, кислорода и водорода, превышающей 0,7 ‰, судят о природе спирта в образце алкогольной продукции.

Таблица 1 - Характеристика изотопного состава легких элементов этанола, полученного из ферментированных образцов меда натурального меда и меда с добавлением сахаросодержащих веществ различного происхождения № примера Величина δ¹³С_VPDB, (‰) Величина
δ¹⁸O_VSMOW, (‰) Величина
δD_VSMOW, (‰) 1 -28,05±0,2 9,88±0,3 -290,14±0,5 2 -20,04±0,2 8,21±0,3 -262,11±0,5 3 -19,91±0,2 11,22±0,3 -258,42±0,5 4 -27,74±0,2 8,57±0,3 -282,63±0,5 5 -27,86±0,2 5,62±0,3 -291,61±0,5 6 -28,19±0,2 12,84±0,3 -276,08±0,5

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность и достоверность анализа на 90% за счет получения ранее неизвестных характеристик этанола ферментированных образцов меда, основанных на определении изотопных отношений легких элементов (¹³С/¹²С, ¹⁸О/¹⁶О, D/H).

Изобретение относится к пищевой промышленности. Образцы меда ферментируют дрожжами Saccharamyces cerevisiae с последующей отгонкой этанола, с целью определения изотопных характеристик в этаноле углерода, водорода и кислорода. Брожение проводится при температуре 20±2°С. Отгонка производится следующим образом. В колбу вместимостью 50 см³ помещают 25 см³ сброженного медового сусла и проводят экстракцию этанола при температуре от 78,0°С до 78,5°С, собирая не менее 98% дистиллята из пробы. При этом установка, используемая для экстракции этанола, не должна приводить к фракционированию изотопов углерода, водорода и кислорода в получаемой пробе. Далее аликвоты дистиллята раздельно подвергают изотопному масс-спектрометрическому анализу с установлением отношений распространенностей стабильных изотопов конкретного элемента: ¹³С/¹²С, ¹⁸О/¹⁶О, D/H. Полученные количественные характеристики сравнивают между собой и c предварительно определенными характеристиками контрольных образцов. В качестве контрольных образцов используют образцы этанола из известных источников, а именно натурального меда, кукурузного сиропа, свекловичного сахара, тростникового сахара, мелассы и глюкозно-фруктозного сиропа. О природе образующегося этанола в меде судят по степени совпадения или отклонения полученных изотопных характеристик образца. Изобретение обеспечивает точный и достоверный анализ, позволяющий судить о происхождении этанола в ферментированных образцах меда. 1 табл., 6 пр.

Способ идентификации меда на основе изотопной масс-спектрометрии, включающий ферментацию меда, последующую экстракцию этанола из ферментированного меда, разделение этанола на аликвоты и проведение изотопного масс-спектрометрического анализа, отличающийся тем, что пробу меда подвергают ферментации, проводят экстракцию образовавшегося этанола при температуре 78,0-78,5°С, собирают отогнанный этанол при этой температуре, отогнанный этанол разделяют на три аликвоты, которые раздельно подвергают изотопному масс-спектрометрическому анализу с установлением отношений распространенностей стабильных изотопов конкретного элемента ¹³С/¹²С, ¹⁸О/¹⁶О, D/H, сравнивают полученные количественные характеристики с характеристиками контрольных образцов; по степени совпадения судят о происхождении меда.