РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/pET32A-TNF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2023 года по МПК C12N15/70 C12N15/00 C12N15/62 C12N15/28 C07K19/00 C07K14/525 C07K14/77 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии и касается нового штамма бактерий Escherichia coli BL 21/рЕТ32а-TNF-Thy, который может быть использован для получения гибридного белка α-фактор некроза опухолей - тимозин альфа1 (белок TNF-Thy), применяемого в медицинской промышленности для получения лекарственного препарата.

Поиск эффективных и безопасных препаратов для лечения заболеваний, характеризующихся высокой летальностью или приводящих к тяжелой инвалидизации пациентов, является одной из важнейших задач медицинской науки.

На сегодняшний день в клинической практике существует большое количество противоопухолевых препаратов, но эффективность большинства из них недостаточна и поэтому остается актуальным вопрос о разработке новых более активных препаратов, а также поиск веществ, эффективных при опухолях с первичной и приобретенной резистентностью к лекарственной терапии. В связи с этим решение о продвижении нового препарата с противоопухолевой активностью принимается на основании следующих критериев: механизм действия, высокая противоопухолевая активность, избирательная цитотоксичность в отношении определенных культур опухолевых клеток in vitro и ксенографтов опухолей человека, отсутствие перекрестной устойчивости с известными веществами.

Постоянно ведется поиск новых препаратов, которые могли бы повысить качество лечения пациентов с онкологической патологией.

Гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ известен из уровня техники и обладает рядом преимуществ по сравнению с α-фактором некроза опухоли в качестве терапевтического препарата: имеет низкую системную токсичность, сохраняя противоопухолевую активность природного α-фактора некроза опухоли, и кроме того, показывает иммуностимулирующие свойства. (SU, 1707078, A1, C12N 15/12, 1992)

Фактор некроза опухолей-тимозин альфа1 (ФНО-Т) представляет собой гибридный белок, состоящий из фактора некроза опухолей альфа и тимозина альфа1. Из уровня техники известно получение нескольких гибридных белков (RU, 2077586, С1, C12N 15/28, 1992; RU, 2055896, CI, С12Р 21/00, 1992).

Технология получения субстанции рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин альфа1 основана на его микробиологическом синтезе рекомбинантным штаммом Escherichia coli SG 200-50, трансформированным плазмидой pThy (RU,2225443, C1, C12N 15/70, 2002). Белок выделяют и очищают колоночной хроматографией. Препарат обладает прямым противоопухолевым действием in vivo и in vitro на различных линиях опухолевых клеток. По спектру цитотоксического и цитостатического действия на опухолевые клетки препарат соответствует фактору некроза опухолей альфа (ФИО) человека, однако, имеет в 100 раз меньшую общую токсичность, чем ФИО. Сконструированный слитый белок - фактор некроза опухолей-тимозин-a1 (ФНО-Т) имеет удельную цитотоксичность на клетках фибросаркомы L-929, составляющую 2000000 ЕД на мг белка и проявляет большое иммуностимулирующее действие. По спектру и активности цитотоксического и цитостатического действия на опухолевые клетки препарат ФНО-Т не уступает, а на некоторых опухолях превосходит ФНО человека. При этом ФНО-Т имеет в 100 раз меньшую общую токсичность, чем ФНО.

Из уровня техники известна рекомбинантная плазмидная ДНК pThy315, кодирующая гибридный белок TNF-Thy, а так же известен способ получения гибридного белка TNF-Thy (RU 2077586, C12N 15/12, 20.04.1997; RU 2055896, С12Р 21/00, 03.10.1996). Рекомбинантная плазмидная ДНК pThy315 имеет молекулярную массу 2,1 МДа (3,23 т.п.н.), кодирует гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ с молекулярной массой 20,46 кДа и состоит из: фрагмента ДНК размером 3,23 т.п.н. плазмиды pThy314, содержащего тандем ранних промоторов А2 и A3 бактериофага Т7, участок связывания рибосом, ген гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ и терминатор транскрипции фага λ, а также имеет генетический маркер селекции, ген β-лактамазы, придающий устойчивость к антибиотику ампициллину клеткам Escherichia coli, трансформированным плазмидой pThy315. Недостатком рекомбинантной плазмиды является то, что маркер ампициллинрезистентности, приводит к недостаточно эффективной селекции. Фермент β-лактамаза, расщепляющий ампициллин, является секретируемым белком, то есть β-лактамаза в ходе культивирования штамма накапливается в культуральной среде. Это приводит к инактивации как имевшегося изначально в среде, так и добавляемого вновь ампициллина. В результате в ферментере накапливаются клетки штамма, утратившие плазмиду и неспособные синтезировать рекомбинантный белок. Что, в свою очередь, ведет к падению продуктивности трансформированного штамма.

Известен способ получения гибридного белка TNF-Thy, который включает культивирование клеток трансформированного штамма Escherichia coli SG 200 50 введением плазмиды pThy315, кодирующей синтез указанного белка, в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой белка (RU 2055896, С12Р 21/00, 29.07.1992). При этом культивирование проводят при 36-38°С в среде, содержащей до 1,4% пептона или триптона, до 1,6% дрожжевого экстракта, до 1,15% NaCl и 50 мкг/мл ампициллина. При этом используют свежеполученные трансформанты или отобранные на начальной фазе экспоненциального роста и хранившиеся при минус 20-40°С в бульоне с 40% глицерина. После лизиса клеток осадок отмывают 1-3 М растворами мочевины и растворяют в 7 М растворе мочевины, полученный раствор наносят на анионообменный сорбент при рН 5,6-5,8 с элюцией тем же буфером с добавлением 150 мМ NaCl, после чего фракции с гибридным белком наносят на сорбент с иммобилизованным красителем (голубой), уравновешенный буфером с 7 М мочевины при рН 5,5-5,8 и элюируют белок буфером с градиентом рН 7,0-8,5 в присутствии 7 М мочевины и 1,0 М NaCl, с последующим диализом при рН 7,2-7,4 против раствора, содержащего 150 мМ NaCl и 10 мМ Na-фосфата.

Недостатком такого способа получения является использование при хроматографической очистке белка сорбента с иммобилизованным красителем (голубой). Этого типа сорбенты подвергаются в процессе использования частичной деградации, при этом краситель (голубой) отделяется от сорбента и самопроизвольно элюируется с колонки в виде связанного с белком комплекса. Такие примеси недопустимы для приготовления лекарственных препаратов.

Наиболее близким аналогом к заявляемым объектам изобретения, в отношении плазмиды, способа получения и препарата, является рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез, способ получения и препарат рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ (RU, 2225443, C12N 1/70, 25.07.2002). Рекомбинантная плазмидная ДНК pThy316 для экспрессии в клетках Escherichia coli гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, имеющая размер 3,77 т.п.н. и содержащая промоторы А2 и A3 фага Т7, обеспечивающие конститутивную экспрессию гена гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁; расположенный после промотора A3 рибосомосвязывающий сайт; ген, кодирующий гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ заключенный между сайтами рестрикции XbaI и Clal и включающий второй сайт рестрикции Clal; следующую за геном гибридного белка и ограниченную двумя сайтами рестрикции XbaI терминаторную область; ген устойчивости к ампицилину; ген устойчивости к аминогликозидам (канамицину, неомицину и G-418), содержащий третий сайт рестрикции ClaI; а также уникальные сайты рестрикции: PstI в гене β-лактамазы; XhoI, HindIII и SmaI, находящиеся в гене аминогликозидфосфотрансферазы; KpnI между промотором A3 и рибосомсвязывающим сайтом; EcoRI между промоторами A3 и А2. А способ основан на культивировании клеток штамма Escherichia coli SG20050 или BL21, который трансформирован введением плазмиды pThy316, являющегося модификацией ранее описанной плазмиды pThy315, в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой гибридного белка TNF-Thy. При этом культивирование штамма, трансформированого введением плазмиды pThy316, проводят при 37°С в среде, содержащей 1% пептона или триптона, 1% дрожжевого экстракта, 1% NaCl и 50 мкг/мл канамицина. После лизиса клеток лизат центрифугируют, осадок отмывают 1-2 М растворами мочевины и растворяют в 7 М растворе мочевины с 10 мМ Трис-HCl, полученный раствор наносят на анионообменный сорбент при рН 7,5 с элюцией тем же буфером в градиенте концентрации 0-1 М NaCl, после чего фракции с гибридным белком наносят на гидроксидапатит, уравновешенный 20 мМ натрий фосфатным буфером рН 6,8 с 7 М мочевины и элюируют белок градиентом концентрации 20-400 мМ натрий фосфатного буфера рН 6,8 с 7 М мочевиной. Полученный раствор наносят на сорбент Сефадекс G-50, уравновешенный 10 мМ натрий фосфатным буфером рН 7,2 с 150 мМ натрия хлористого, проводят хроматографию для удаления мочевины и ренатурации гибридного белка. А лиофилизированный препарат, согласно ближайшему аналогу, состоит из гибридного белка ФНО-Т, наполнителя и соли. В качестве наполнителя используется шестиатомный спирт, относящийся к сахарам, маннит. Препарат получали путем смешивания раствора очищенного гибридного белка с 15% стерильным раствором маннита и физиологическим раствором (150 мМ натрия хлористого). Состав препарата включает в расчете на одну дозу: гибридного белка 15, 25 или 50 мкг (30000, 50000 и 100000 ЕД соответственно), маннита 1,2-1,5%, 150 мМ натрия хлористого до 1 мл.

Недостатком известного способа является отсутствие штамма-продуцента и применение в качестве основы для создания плазмидного вектора плазмиды pThy315. В качестве промотора в ней применяется тандем ранних промоторов А2 и A3 бактериофага Т7. Данный тандем является не эффективным для экспрессии рекомбинантных белков. Кроме того, с его помощью обеспечивается конститутивная экспрессия белка, что создает дополнительное метаболическое давление на клетки продуцента Escherichia coli. Это, в свою очередь, приводит к достижению ими более низких плотностей по сравнению с продуцентами с индуцибельными промоторами и снижает продуктивность. В итоге конечная продуктивность указанного способа получения гибридного белка TNF-Thy оказывается низкой, что делает эффективность производства на его основе довольно низкой, а трудоемкость - высокой. Недостатком лекарственного препарата является то, что система не является забуференной, что может приводить к деградации белка после растворения. Это приводит к потере активности белка и может вызвать проблемы при лечении. Данный состав не образует после лиофилизации устойчивой таблетки, а представляет собой порошкообразную массу, снижающую потребительские свойства В качестве наполнителя используется маннит, который чаще используют для поддержания изотоничности.

Штамм на основе плазмид для продуцирования гибридного белка TNF-Thy из уровня техники не известен.

При создании лекарственного средства необходимо учитывать, что человеческий рекомбинантный гибридный белок TNF-Thy должен обладать следующими параметрами, характерными для гибридного белка TNF-Thy:

- Молекулярная масса мономера составляет 20,5±0,2 кДа. Содержание мономера с молекулярной массой около 20,5 кДа должно быть не менее 97% (электрофорез 17,5%) ПААГ, ДСН)

- Положение основной полосы иммунокомплекса в иммуноблотинге должно быть выше полосы иммунокомплекса сертифицированного референсного образца ФНО (CRS). Разница в положении полос должна соответствовать примерно 3 кДа.

- Примеси белковой природы, олигомеры, агрегаты и мономеры - не более 3%. Содержание клеточной и векторной ДНК не более 100 пкг/10⁶ ЕД

- Молекулярно- массовое распределение: не менее 97% тримера (61±2)кДа

- Бактериальные эндотоксины не более 0,5 ЕЭ на 10⁴ ЕД активности

-Удельная активность не менее 1,7×10⁶ ЕД/мг белка.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является создание впервые штамма - продуцента гибридного белка TNF-Thy на основе сконструированной плазмиды, направляющей синтез гибридного белка TNF-Thy с целью повышения эффективности и снижения трудоемкости получения гибридного белка TNF-Thy, увеличении выхода и чистоты гибридного белка TNF-Thy. и соответствующего вышеуказанным характерным параметрам, а так же получение более химически и биологически чистого и стабильного при хранении лекарственного средства на основе рекомбинантного гибридного белка TNF-Thy, имеющего хорошую переносимость, минимальный побочный эффект, и обладающего высокой активностью при использовании в лечении различных заболеваний.

Поставленная задача достигается за счет создания рекомбинантной плазмиды рЕТ32а-TNF-Thy - размером 5929 пар оснований (п.о.), обеспечивающей синтез белка имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1 размером 20,5 кДа и содержащая структурные элементы: промотор Т7 и оператор lacO, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ориджин репликации бактериофага f1 (f1 ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (LacIpromoter),

Еще одним заявляемым объектом является штамм Escherichia coli BL 21/pET32a-TNF-Thy- продуцент гибридного белка TNF-Thy, полученный трансформацией рекомбинантной плазмидой pET32a-TNF-Thy.

Так же заявляется способ получения гибридного белка TNF-Thy, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/ pET32a-TNF-Thy, при этом после 3-5 часов культивирования проводят индукцию биосинтеза рекомбинантного белка клетками Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy и выдерживают 4-6 часов, с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего гибридный белок TNF-Thy, выделение из полученной биомассы клеток штамма-продуцента гибридного белка TNF-Thy, последующую очистку выделенного гибридного белка TNF-Thy, путем анионно-обменной и гель-проникающей хроматографии в денатурирующих условиях, ренатурацию гибридного белка TNF-Thy путем разбавления мочевинного раствора и очистку ренатурированного гибридного белка TNF-Thy анионообменной хроматографией и с получением гибридного белка с чистотой не менее 97%.

При этом, культивирование клеток Escherichia coli BL21 (DE3)/ pET32a-TNF-Thy можно проводить в ростовой среде на протяжении по меньшей мере 7 часов, но не более 10 часов. А индукцию биосинтеза предпочтительно осуществлять изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом.

Выделение гибридного белка TNF-Thy молено осуществлять путем отделения клеток от культуральной жидкости, дезинтеграции клеток, выделения тел включений из полученного дезинтеграта и солюбилизацию тел включений.

Очистку гибридного белка TNF-Thy предпочтительно осуществлять с использованием анионнообменной и гель-проникающей хроматографии при концентрации мочевины 7М-9М, рН 7,2- 8,5. А разбавление мочевинного раствора предпочтительно осуществлять до концентрации мочевины не более 0,4 М.

Еще одним объектом заявленного изобретения является лекарственное средство, представляющее собой лиофилизат, содержащий натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенного 12-водного, натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водного, маннит и высокоочищенный гибридный белок TNF-Thy с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1, причем гибридный белок TNF-Thy получен культивированием штамма-продуцента Escherichia coli, BL21(DE3)/ рЕТ32а-TNF-Thy, где после 3 -5 часов культивирования проводят индукцию биосинтеза в клетках Escherichia coli BL21(DE3)/ pET32a-TNF-Thy изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом и выдерживают 4-6 часов, с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего белок TNF-Thy, выделение из полученной биомассы клеток штамма-продуцента белка TNF-Thy, последующую очистку выделенного гибридного белка TNF-Thy путем анионообменной и гель-проникающей хроматографии в денатурирующих условиях, ренатурацию гибридного белка TNF-Thy путем разбавления мочевинного раствора и очистку ренатурированного гибридного белка TNF-Thy анионообменной хроматографией с получением гибридного белка с чистотой не менее 97%, а штамм Escherichiacoli BL 21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy- продуцент гибридного белка TNF-Thy, получен трансформацией родительского штамма Е. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидой pET32a-TNF-Thy размером 5929 пар оснований (п.о.), обеспечивающей синтез белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1 размером 20,5 кДа и содержащей структурные элементы: промотор Т7 и оператор lacO, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ориджин репликации бактериофага f1 (f1 ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (LacIpromoter) при следующем соотношении компонентов (масс. %):

Фактор некроза опухолей - тимозин альфа 1 рекомбинантный с удельной активностью не менее 1,7×10⁶ ЕД/мг 0,18-0,22 Натрий хлористый 27-35 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 8-12 Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 0,3-1,8 2 Маннит остальное

При этом, после очистки гибридный белок TNF-Thy может быть заморожен и в последующем разморожен при приготовлении раствора для розлива.,

Таким образом, заявленная группа изобретений объединена единым изобретательским замыслом, направленным на создание лекарственного средства, которое получено с использованием рекомбинантной плазмиды рЕТ32а- TNF-Thy, обеспечивающей синтез гибридного белка, а так же впервые созданным штаммом бактерий Escherichia coli BL 21(DE3)/pET32a- TNF-Thy - продуцентом гибридного белка TNF-Thy, а так же способом получения гибридного белка TNF-Thy,

При производстве лекарственных средств, надо учитывать, что для обеспечения постоянства свойств лекарственного препарата, содержащего допустимые примеси в определенном диапазоне, должен соблюдаться целый ряд требований при ферментации, экспрессии белка и очистке.

Заявляемый штамм имеет преимущество в том, что впервые получен путем трансформации клеток штамма Escherichia coli BL 21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ32а-TNF-Thy согласно настоящему изобретению. Необходимо отметить, что штамм - продуцент был впервые получен только за счет оригинального конструирования уникальной плазмиды pET32a-TNF-Thy, что обеспечивает эффективную экспрессию гена, позволяющую нарабатывать значительное количество биомассы, содержащей гибридный белок TNF-Thy.

Штамм Escherichia coli 21(DE3)/pET32a- TNF-Thy задепонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-10277.

Настоящее изобретение относится к гибридному белку TNF-Thy, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1:

Ниже представлена нуклеотидная последовательность синтетического фрагмента, кодирующая гибридный белок TNF-Thy SEQ ID NO 2 экспрессионного вектора

Изобретение иллюстрируется следующими графическими фигурами:

На Фиг. 1 изображена Карта плазмиды, содержащая:

f1 ori - ориджин репликации бактериофага f1,

AmpR - ген резистентности к ампициллину (ген β-лактамазы),

ori - ориджин репликации co1E1,

Т7 promoter - промотор бактериофага Т7,

TNF-Thy - ген гибридного белка TNF-Thy,

Т7 terminator - терминатор бактериофага Т7,

LacI - ген лактозного репрессора LacI.

На Фиг. 2 представлена фотография электрофоретического разделения тотального клеточного лизата:

1 - до начала индукции

2 - в момент индукции

3 - 2 часа после индукции

4 - 4 часа после индукции

5 - 5 часов после индукции

6 - стандарты молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610.

На Фиг 3 представлена хроматограмма гибридного белка α-фактор некроза опухолей - тимозин-α₁, полученного по способу, указанному в ближайшем аналоге.

На Фиг. 4 представлена хроматограмма гибридного белка α-фактор некроза опухолей - тимозин-α₁ (TNF-Thy), полученного из заявляемого штамма Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy.

При этом, представленные на Фиг. 3, Фиг. 4 результаты, получены методом высокоэффективной эксклюзионной хроматографии. Метод используется для определения качества белка по показателю «Чистота. Родственные соединения и посторонние примеси».

В заявляемом техническом решении поставленная задача решается посредством создания рекомбинантной плазмиды рЕТ32а-TNF-Thy для экспрессии указанного гибридного белка, впервые полученным высокопродуктивным бактериальным штаммом-продуцентом Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy, а также способа получения гибридного белка TNF-Thy, позволяющего получать гибридный белок TNF-Thy с высоким выходом и высокой степенью чистоты. Это позволяет использовать гибридный белок α-фактор некроза опухолей - тимозин-α₁ в лекарственном средстве, обладающем длительным сроком хранения с сохранением биологической активности при отсутствии побочного действия на организм человека.

Созданный впервые штамм и способ очистки имеют ряд существенных преимуществ по сравнению с известными из уровня техники, в т.ч. ранее указанными источниками.

Т.к. гибридный белок используется при производстве лекарственных средств, надо учитывать, что для обеспечения постоянства свойств лекарственного препарата, содержащего допустимые примеси в определенном диапазоне, должен соблюдаться целый ряд требований при ферментации, экспрессии белка и очистке.

Получение для ферментации трансформационной смеси, как в ближайшем аналоге, а не штамма, не позволяет проводить процесс в строго определенных условиях, описанных в стандартных операционных процедурах, что сказывается на качестве получаемого гибридного белка, соответственно это сказывается и на лекарственном препарате. Создание впервые штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy позволяет получить эталонную культуру, заложить на хранение рабочую культуру клеток штамма и проводить процесс ферментации при стандартизованных условиях. В настоящее время это является одним из требований надлежащей производственной практики (GMP). В заявляемом изобретении выход биомассы с 1 л культуральной жидкости составляет от 50 до 80 г. А в ближайшем аналоге получают биомассу 8 г/л. Соответственно, эффективность заявляемой ферментации увеличилась в 6-10 раз.

Необходимо отметить, что проведение хроматогафии на колонне с сорбентом SepraPrep™ Q более эффективно по сравнению с ДЕАЕ-целлюлозой, т.к. позволяет значительно сократить время проведения стадии.

Так же впервые заявлен способ хроматографии на Сефадексе G-100 в денатурирующих условиях. Растворенные и даже очищенные от посторонних примесей тельца включений дают гибридный белок TNF-Thy в различных олигомерных формах. Описанная в ближайшем аналоге хроматография на гидроксилапатите не позволяет разделить эти формы и не является способом, значительно увеличивающим чистоту гибридного белка. Заявляемый способ с использованием хроматографии в мочевине на Сефадексе G-100 позволил разделить олигомеры TNF-Thy и тримерную активную форму гибридного белка. Кроме того, во время проведения этой стадии происходит очистка от посторонних высокомолекулярных примесей. Выход активной тримерной формы составляет 25-30% от всего белка. Чистота на данном этапе составляет 90%, что позволяет проводить эффективно следующую важную стадию процесса - получение правильно свернутого гибридного белка TNF-Thy.

Последующая хроматография описанная в ближайшем аналоге проводится на колонке Сефадексе G-50, уравновешенном 10 мМ натрий фосфатным буфером рН 7,2 с 150 мМ натрия хлористого, выполняется для удаления мочевины и ренатурации гибридного белка. При этом колоночная хроматография не позволяет получить высокий уровень ренатурации гибридного белка. Как показали проведенные исследования, способ, описанный в ближайшем аналоге с учетом не отделения от олигомеров дает низкий выход ренатурированного гибридного белка за счет его агрегации (20-50%). Заявляется более точный и упрощенный способ ренатурации гибридного белка, путем разбавления мочевинного раствора, без использования дорогих сорбентов, при сокращении времени процесса, что позволяет увеличить выход правильно свернутого гибридного белка до 90-100%), при этом чистота гибридного белка составляет 97%.

Таким образом, заявляется рекомбинантный гибридный белок TNF-Thy с чистотой не менее 97%.

Также заявленный гибридный белок TNF-Thy соответствует параметрам представленным выше и стабилен при рН от 7 до 8,5, при этом удельная активность составляет не менее 1,7×10⁶ ЕД на 1 мг белка.

Лекарственное средство, полученное на основе α-фактора некроза опухолей -тимозин-α1 полученного по данному изобретению, нетоксично и апирогенно при испытаниях на острую и хроническую токсичность и пирогенность у мышей и кроликов, обладает контролируемой активностью при испытаниях на культурах клеток. Не оказывает побочных эффектов. По всей видимости, это обусловлено отсутствием примесей белковой природы и эндотоксинов.

На Фиг. 3 показаны результаты анализа гибридного белка α-фактор некроза опухолей - тимозин-α1, полученного по ближайшему аналогу. Из представленной хроматограммы следует, что в гибридном белке TNF-Thy присутствуют примеси белковой природы, количество которых составляет 6,6%. Таким образом, чистота целевого белка составляет 93,4%.

Результаты анализа гибридного белка α-фактор некроза опухолей - тимозин-α1, полученного из заявленного штамма Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy показаны на Фиг. 4. Как видно из хроматограммы, примеси в данном образце практически отсутствуют и чистота составляет 100%.

Необходимо отметить, что за счет получения высокоочищенного белка TNF-Thy и за счет экспериментально подобранных компонентов: маннита, натрия хлористого, натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного и натрия фосфорнокислого однозамещенного 2-водного, заявленное лекарственное средство не обладает побочным действием и является изотоничным, физиологичным. Данный факт подтверждается проведенными исследованиями, ни у одного из испытуемых не возникло никакого побочного действия (зуда, жжения, воспаления в месте инъекции, аллергических реакций и т.п.), что подтверждается ниже приведенными примерами.

При создании лекарственного средства важным является не только чистота белка для снижения побочного действия, но и сохранение рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей - тимозин-α1 в активной форме в течение продолжительного периода времени.

Основной проблемой, связанной с любыми белковыми композициями, является преодоление физической неустойчивости белков. Физическая неустойчивость не вызывает изменений ковалентных связей в белках. Физическая неустойчивость скорее предполагает изменение структуры белков более высокого порядка, например, вторичной структуры. Такие изменения включают денатурацию, адсорбцию на поверхностях, агрегацию и осаждение.

Известно, что устойчивость белка можно улучшить, вводя в композицию соли соединений и их ионные разновидности. Такие соединения помогают устранить денатурацию белков, образуя неспецифические связи с белками и повышая термостабильность. Соли (например, NaCl, KCl), аминокислоты (например, гистидин, аргинин), уменьшают изменение вторичных структур белков. Другие примеры обычно используемых добавок включают многоатомные спирты, сахара, поверхностно-активные вещества. Однако, проведенные эксперименты показали, что введение различных добавок вызывают возникновение побочного действия лекарственных средств. Поэтому экспериментальным путем был определен количественный и компонентный состав, который с одной стороны стабилизирует высокоочищенный рекомбинантный гибридный белок TNF-Thy в границах от 90000 до 110000 ЕД/мг, а с другой стороны не наносит вред организму человека.

Заявляемое лекарственное средство полученное по примеру №7 имеет высокую стабильность гибридного белка TNF-Thy при хранении (см. Таблица 1). При этом, срок годности препарата увеличен на 1 год по сравнению с ближайшим аналогом (Таблица 1, 2).

Из представленных результатов таблиц по стабильности видно, что при одних и тех же условиях хранения, дозировках срок годности заявляемого лекарственного средства составляет 3 года, без существенной потери активности, т.е. на 1 год больше по сравнению с ближайшим аналогом.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение лекарственного средства содержащего более чистый химически и биологически стабилизированный гибридный белок TNF-Thy, что повысило эффективность действия и уменьшило его побочное действие, за счет оптимально подобранного как состава компонентов, так и их количества, а так же позволило увеличить срок хранения лекарственного средства до 3-х лет при температуре от 2 до 8°С. Так же техническим результатом заявленного изобретения является повышение эффективности получения гибридный белок TNF-Thy, а именно, увеличение выхода белка из биомассы штамма с чистотой конечного продукта не менее 97%, за счет создания рекомбинантного штамма Escherichia coli - продуцента гибридного белка α-фактор некроза опухолей - тимозин-α1, полученного на основе сконструированной рекомбинантной плазмиды, что обеспечивает повышенный выход TNF-Thy, за счет увеличения количества получаемой в ходе культивирования биомассы в 6-10 раз, при сохранении содержания общего белка и доли гибридного белка TNF-Thy в общем белке клетки.

Указанный технический результат достигается за счет создания впервые штамма на основе сконструированной рекомбинантной плазмиды рЕТ32а-TNF-Thy и способом получения белка с использованием такого штамма.

Также указанный технический результат достигается созданием лекарственного средства на основе высокоочищенного гибридного белка TNF-Thy, при этом, гибридный белок TNF-Thy, полученный по данному изобретению практически не имеет в составе эндотоксинов, ковалентных олигомеров, мономеров и агрегатов, но и по заявленной совокупности объектов изобретения в процессе производства удалось не только получить гибридный белок TNF-Thy биологически и химически чистым, но и стабилизировать его, за счет оптимально подобранных компонентов.

При этом срок хранения и стабильность заявляемого лекарственного средства намного выше, чем у ближайшего аналога. Это подтверждается результатами изучения стабильности при увеличенном сроке хранения, представленными в Таблице 1 и Таблице 2.

Рекомбинантная плазмида рЕТ32а-TNF-Thy для экспрессии гибридного белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, имеющей длину 5929 пар оснований и состоящей из следующих ключевых генетических элементов:

- промотора Т7 и оператора lacO;

- синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQIDNO 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy;

- гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpRpromoter);

- гена лактозного репрессора LacI и бактериального промотора гена лактозного репрессора (LacIpromoter);

- ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori),

В качестве вектора экспрессии выбрана плазмида рЕТ32а. Для получения плазмиды по изобретению последовательность SEQ ID NO 2, полученную полным нуклеотидным синтезом, встраивают в плазмидный вектор рЕТ-32а по сайтам рестрикции XhoI и NdeI.

Указанная плазмида, далее обозначаемая как pET32a-TNF-Thy, состоит из следующих ключевых генетических элементов, расположенных в соответствии с Фиг. 1:

- гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpRpromoter);

- ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori);

- промотора Т7 и оператора lacO;

- гена лактозного репрессора LacI и бактериального промотора гена лактозного репрессора (LacIpromoter);

- синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO 2, кодирующей гибридный белок Tnf-Thy (SEQ ID NO 1), включающий в себя α-фактор некроза опухолей и тимозин-α₁.

Структура указанной плазмидной ДНК (плазмиды), состоящей из указанных ключевых генетических элементов, представлена на Фиг. 2.

В вышеуказанной плазмиде ген AmpR предназначен для селекции стабильных клеток Escherichia coli. Бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpRpromoter) предназначен для его экспрессии.

Ориджин репликации бактериофага f1 /AnalysisofGenesandGenomes, JohnWiley&Sons, 2004, S. 140/ широко используется для создания экспрессионных векторов.

Продуктом трансляции синтетической последовательности SEQIDNO 2 является полипептид последовательности SEQIDNO 1, включающий α-фактор некроза опухолей и тимозин-α₁

После клонирования синтезированной последовательности в составе вектора, полученной рекомбинантной плазмидой была проведена трансформация бактериальных клеток Escherichia coli BL 21(DE3).

Исходным материалом для создания штамма-продуцента по изобретению является известный из уровня техники штамм Е. coliBL21 (DE3) Генотип

/HaeyoungJeong, ChoongHoonLee, DavidVallenet, DongSuYu, Sang-HaengChoi, ArnaudCouloux, Seung-WonLee, SungHoYoon, LaurenceCattolico, Cheol-GooHur, Hong-SeogPark, SunChangKim, TaeKwangOh, RichardE. Lenski, F. WilliamStudier, PatrickDaegelen, JihyunF. Kim, Genome Sequences of Escherichia coli BstrainsREL606 and BL21(DE3), Journal of Molecular Biology, Volume 394, Issue 4, 2009, 644-652/. Экспрессионной плазмидой длиной 5929 п. о., состоящей из ключевых генетических элементов, расположенных друг относительно друга так, как представлено на Фиг. 2, трансформируют клетки штамма E.coliBL21 (DE3). Для введения плазмиды в клетки Е. coli BL21 (DE3) могут использоваться методы трансформации, известные из уровня техники, например, электропорация, метод с использованием полиэтиленгликоля, кальций-хлоридный метод. Также для целей настоящего изобретения для введения в клетки Е. coli BL21 (DE3) плазмиды, представленной на Фиг. 2, могут использоваться и другие методы трансформации, не упомянутые в настоящем описании в явном виде, которые известны в уровне техники в настоящее время или будут созданы впоследствии. При осуществлении конкретных воплощений настоящего изобретения специалист, основываясь на существующем уровне знаний, может выбрать наиболее оптимальный метод трансформации клеток.

Важным этапом получения более чистого гибридного белка явилось применение гель-проникающей хроматографии в денатурирующих условиях, позволяющей разделить олигомеры и тример белка, что повышает чистоту гибридного белка TNF-Thy (не менее 97% чистоты).

Для лучшего понимания сущности заявленной группы изобретений ниже приведены примеры.

Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию и секвенирование ДНК проводили по известным методикам (Маниатис Т., Фрич Э, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера, Пер. с англ., Москва, Мир, 1988; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Sharf S.J., Higuehi R., Horn G.T., Mullis K.B., Eriich H.A. Science, 1988. V.239, №4839, p.487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, V. 74, p. 5463-5467).

Пример 1. Конструирование экспрессионной плазмиды

Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода. Для приготовления вектора ДНК плазмиды рЕТ32а (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой XhoI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-НС1, 10 мМ MgCl₂, 100 мкг/мл БСА рестриктазой NdeI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE. Олигонуклеотидную последовательность SEQIDNO 2, кодирующую гибридный белок SEQIDNO 1, получают полным нуклеотидным синтезом. Полученную синтетическую последовательность SEQIDNO 2 обрабатывают в 40 мкл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой XhoI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-НС1, 10 мМ MgCl₂, 100 мкг/мл БСА рестриктазой Ndel (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Синтетический фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.

Описанный выше полученный синтетический фрагмент в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг, полученного из ДНК плазмиды рЕТ32а, описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl₂, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С. Помещают на лед пробирки с компетентными клетками (XL1-Blue, Евроген) до полного размораживания содержимого из расчета одна пробирка на трансформацию. Аккуратно перемешивают суспензию клеток легким встряхиванием. Добавляют в каждую пробирку полученную после обработки Т4-ДНК-лигазой алкивоту реакционной смеси, аккуратно перемешивают содержимое легким встряхиванием. Инкубируют пробирки во льду в течение 20-30 мин. Переносят пробирки в водяную баню (плюс 42°С) на 30-45 сек. Быстро переносят пробирки из водяной бани в лед и инкубируют в течение 3-5 мин. Добавляют не менее 3-х объемов предварительно ме и инкубируют при 37°С в течение 40-60 мин в орбитальном шейкере-инкубаторе (Multitron, Infors) при скорости 225-250 об/мин. Высеивают содержимое пробирок на чашки Петри диаметром 60 мм (Перинт). Аликвоту полученной плазмидной ДНК используют для трансформации компетентных клеток E.coliBL21 (DE3). Трансформанты высевают на чашки с агаризованной средой LB, в которую добавляют ампициллин до конечной концентрации ампициллина 50 мкг/мл. Из клонов выделяют ДНК плазмиды pET32a-TNF-Thy. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования.

Пример 2. Получение штамма-продуцента E.coliBL21 (DE3)/pET32a-NF-Thy и характеристика его продуктивности

Штамм-продуцент E.coliBL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy получают трансформацией компетентных клеток E.coliBL21 (DE3) плазмидой, получение которой описано в Примере 1.

Предпочтительно (без ограничения), для введения указанной плазмиды в клетки штамма Е. coliBL21 (DE3) используют метод электропорации, известный из уровня техники /TamaraKleber-Janke, Wolf-MeinhardBecker, UseofModifiedBL21(DE3) Escherichia coli Cellsfor High-LevelExpressionofRecombinantPeanutAllergensAffectedbyPoorCodonUsage, Protein Expression and Purification, Volume 19, Issue 3, 2000, 419-424/ и включенный в настоящее описание посредством ссылки.

Штамм-продуцент E.coliBL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy культивируют при 37°С в 100 мл жидкой питательной среды LB с добавкой ампициллина до конечной концентрации ампициллина 100 мкг/мл в течение 3 ч в колбах Ерленмейера (1 л, Corning) в орбитальном шейкере-инкубаторе со скоростью вращения 220 об/мин до достижения оптической плотности культуральной жидкости при длине волны 600 нм 0,7-0,8 ед. Затем осуществляют индукцию биосинтеза рекомбинантного белка прибавлением изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида до конечной концентрации изопропил-β-В-1-тиогалактоприанозида 0,5 мМ и инкубируют в течение 4 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, количество культуры, соответствующее 1 мл, центрифугируют в течение 10 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки переносят в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим, с добавлением 2-меркаптоэтонола, инкубируют 5 мин при 98°С, аликвоты по 3 мкл используют для электрофореза в 14% SDS-ПААГ. Гель окрашивают добавлением 0,1% раствора Кумасси R-250 и сканируют с помощью денситометра ShimadzuCS-930. Результаты представлены на Фиг. 3. 5 - клеточный лизат, 6 - стандарты молекулярных масс. Выход гибридного белка TNF-Thy по результатам денситометрического анализа составляет не менее 20% относительно суммарного белка клетки.

Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy характеризуется следующими признаками:

а) Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

б) Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаризованной среде «LB» (на 1 литр 10 г пептон, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 20 г агара) - колонии сероватые, слабовыпуклые, влажные, блестящие, пастообразной консистенции.

в) Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимальном значении рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения, включающие пептон, триптон, дрожжевой экстракт, аминокислоты и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

г) Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).

Пример 3. Способ получения гибридного белка TNF-Thy

Культивирование штамма- продуцента

Используют ферментер объемом 20 л при условиях по Примеру 2. После окончания культивирования клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С).

100 г биомассы суспендируют в 10 л 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 с 0,15 М натрия хлористого и охлаждают до плюс (6±2)°С. Суспензию клеток пропускают два раза через фильеру дезинтегратора Ranie под давлением 300 и 600 bar. Суспензию разрушенных клеток центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА-0,15 M NaCl, 1% тритон Х-100, рН 7,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С. К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0, 15 М NaCl, 0,5% тритон Х-100, рН 8,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Затем суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 1 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

Осадки растворяют добавлением буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 7 М мочевина, рН 7,0 и инкубируют 18 ч при (6±2)°С. Полученный раствор белка осветляют центрифугированием в роторе JA-14 при 13000 об/мин в течение 60 мин при плюс (6±2)°С. Далее проводят очистку на колонке объемом 2 л, упакованной сорбентом SepraPrep Q и уравновешенной буфером 20 мМ Трис-НС1, 7 М мочевина, рН 6,8. После нанесения белка колонку промывают тем же буфером и пропускают 4 л буфера 20 мМ Трис-HCl, 20 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 6,8, затем 20 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 и 20 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8. Во фракции, полученной после элюции буфером 20 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl,7 М мочевина рН 6,8 увеличивают концентрацию мочевины с 7 М до 9 М выдерживают при плюс 16°С в течение 18 ч. Далее проводят процесс концентрирования раствора белка TNF-Thy на «полых волокнах» в аппарате АР-1-15ПС, уменьшая объем до 0,5 л концентрата белка.

Хроматографическая очистка белка TNF-Thy на Sephadex G-100

Наносят в колонну ПСК 200/1000 с 28,3 л SephadexG-100 500 мл концентрата белка TNF-Thy и проводят элюцию с помощью буфера для гель-фильтрации 20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 9 М мочевина, рН 7,2 со скоростью 3,0 мл/мин. В собранных фракциях определяют спектрофотометрически A₂₈₀, А₂₆₀. Наличие TNF-Thy подтверждают с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН). Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН более 90% TNF-Thy, объединяют. В объединенной фракции высокоочищенного препарата TNF-Thy определяют спектрофотометрически: A₂₈₀, А₂₅₄, белок. Чистоту препарата TNF-Thy определяют по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН, а также по данным ВЭЖХ в колонке с силикагелем С₁₈.

Объединенную фракцию, содержащую TNF-Thy с чистотой больше 90%, передают на стадию ренатурации.

Ренатурация белка TNF-Thy

Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 50 л фосфатного буфера с хлористым натрием с рН 7,3 и охлаждают до плюс (12±1)°С. Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью (50±5) мл/мин 2 л раствора очищенного белка TNF-Thy. После внесения всего раствора белка проводят инкубацию при работающей мешалке. В процессе ренатурации с помощью системы охлаждения поддерживают температуру раствора (12±1)°С. Длительность процесса (18±1) часов.

Хроматографическая очистка ренатурированного гибридного белка TNF-Thy на сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow

Используют колонку с DEAE SepharoseFast Flow объемом 2 л. Уравновешивают 20 мМ фосфатным буфером, рН 7,3. Затем наносят раствор ренатурированного гибридного белка, в фосфатном буфере и промывают уравновешивающим буфером.

Через колонну с сорбентом последовательно пропускают 20 мМ фосфатный буфер, 80 мМ NaCl, рН 7,3и 20 мМ фосфатный буфер, 300 мМ NaCl, рН 7,3. Все элюируемые белки собирают фракциями объемом по 0,4 л и анализируют с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ-ДСН. Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН не менее 95% TNF-Thy, объединяют. После объединения раствор TNF-Thy передают настерилизующую фильтрации и контролируют параметры (белок, э/ф, ВЭЖХ).Также отбирают пробу на определение биологической активности. Полученный раствор TNF-Thy хранят при минус (20±2)°С.

Определение активности

Для исследования противоопухолевой активности белка использовали штамм диплоидных клеток подкожной соединительной ткани мыши (NCTCclone 929 [Lcell, L-929, derivativeofStrainL], ATCC® CCL-1™). Ампулу с клетками переносят из жидкого азота в водяную баню с температурой (40±0,1)°С. Клетки после оттаивания асептически переносят в пластиковый матрац, вместимостью 500 мл и в него с интервалом 1,5-2 мин добавляют ростовую среду (среда ДМЕМ - 90%о по, эмбриональная телячья сыворотка жидкая - 10%) в количестве 0,25; 0,25; 0,5; 0,5; 0,75; 1,0; 1,0; 2,0; 2,0; 10,0 мл. После подсчета количества клеток концентрацию клеток в суспензии доводят до посевной путем добавления ростовой среды с добавлением антибиотиков (канамицина 100 ЕД/мл, гентамицина 80-160 ЕД/мл). Клетки формируют монослой с типичной морфологией на 4-е сутки.

Для определения активности препарата контролируют количество пассажей культуры клеток, которых должно быть не более 30 пассажей.

Монослой клеток, полученный в матраце вместимостью 500 мл снимают со стекла 0,125% раствором трипсина и суспендируют в 40 мл ростовой среды и подсчитывают количество клеток в камере Горяева. Взвесь разводят ростовой средой из расчета, чтобы в 1,0 мл содержалось 200 тыс.клеток. В лунки микропланшетов вносят по 0,1 мл суспензии клеток. Приготовленный планшет инкубируют в течение 48-72 часов при температуре (37±1,0)°С и концентрации CO₂ (5,0±0,5)%.

Для определения активности готовят сначала десятикратные разведения: 1:10, 1:100, 1:1000 и 1:10000, а затем последовательные двукратные разведения: 1:20000, 1:40000, 1:80000, 1:160000, 1:320000, 1:640000, 1:1280000, 1:2560000 исследуемого образца в ростовой среде. Из планшета с монослоем клеток удаляют среду в стакан для отходов и вносят в лунки по 100 мкл последовательных разведений образца и по 100 мкл поддерживающей среды с актиномицином Д в концентрации 2 мкг/мл. На каждое разведение используют не менее 4 лунок с культурой клеток. 4 лунки с культурой оставляют в качестве контрольных. В контрольные лунки дополнительно вносят по 100 мкл поддерживающей среды с актиномицином Д. Приготовленный планшет инкубируют в течение 48 часов при температуре (37±1,0)°С и концентрации СО₂ (5,0±0,5)%.

Предварительную оценку состояния монослоя проводят через 24 часа. Дальнейший учет активности TNF-Thy проводят, если нет признаков дегенерации в контрольной культуре. Окончательный учет проводят через 48 часов. Для этого монослой отмывают от погибших клеток стерильным физиологическим раствором. Для этого из лунок сначала удаляют ростовую среду, вносят по 200 мкл физраствора, который также удаляют. Повторяют 2-3 раза. Затем содержимое лунок окрашивают 0,2% раствором кристаллического фиолетового. Для этого, после удаления ростовой, в лунки вносят по 100 мкл спирта этилового 96% и выдерживают в течение 10 минут. Спирт удаляют и промывают лунки водой очищенной, внося по 100 мкл в лунку и удаляя ее стряхиванием. Процедуру промывки повторяют три раза. Затем планшеты высушивают на воздухе в течение 30 минут. Затем в каждую лунку вносят по 200 мкл 0,2% раствора кристаллического фиолетового и выдерживают планшет в течение 20 минут при энергичном покачивании. Краситель удаляют стряхиванием и промывают планшеты водой очищенной как указано выше. Для удаления связавшегося красителя в лунки вносят по 100 мкл кислоты уксусной 10%), которую затем удаляют стряхиванием. Учет результатов проводят визуально (с помощью инвертированного микроскопа) или автоматически, на планшетном спектрофотометре, при длине волны 540 нм.

За активность испытуемого образца принимают величину, обратную разведению, при котором имеет место 50±5% гибель клеток.

Расчет специфической активности проводят по формуле

где Р - разведение образца, при котором наблюдается 50% повреждение монослоя (снижение оптической плотности на 50% контрольной). Расчет удельной активности:

где А - специфическая активность образца препарата, ЕД;

В - количество белка в образце препарата, мг

Получают гибридный белок с чистотой 97, 5% и удельной биологической активностью 1,9×10⁶ ЕД на 1 мг белка.

Пример 4. Способ получения гибридного белка TNF-Thy

Культивирование штамма- продуцента

Используют ферментер объемом 20 л при условиях по Примеру 2, но после индукции биосинтеза рекомбинантного белка прибавлением изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида до конечной концентрации изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида 0,5 мМ культуральную жидкость инкубируют в течение 6 часов. После окончания культивирования клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С).

100 г биомассы суспендируют в 10 л 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 с 0,15 М натрия хлористого и охлаждают до плюс (6±2)°С. Суспензию клеток пропускают два раза через фильеру дезинтегратора Ranie под давлением 300 и 600 bar. Суспензию разрушенных клеток центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА- 0,15М NaCl, 1% тритон Х-100, рН 7,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С. К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0, 15М NaCl, 0,5% тритон Х-100, рН 8,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)С. Затем суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 1М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С.

Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

Осадки растворяют добавлением буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 7 М мочевина, рН 7,0 и инкубируют 18 ч при (6±2)°С. Полученный раствор белка осветляют центрифугированием в роторе JA-14 при 13000 об/мин в течение 60 мин при плюс (6±2)°С. Далее проводят очистку на колонке объемом 2 л, упакованной сорбентом SepraPrep Q и уравновешенной буфером 20 мМ Трис-НС1, 7 М мочевина, рН 6,8. После нанесения белка колонку промывают тем же буфером и пропускают 4 л буфера 20 мМ Трис-HCl, 20 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 6,8, затем 20 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 и 20 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8. Во фракции, полученной после элюции буфером 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 увеличивают концентрацию мочевины с 7 М до 9 М выдерживают при плюс 16°С в течение 18 ч. Далее проводят процесс концентрирования раствора белка TNF-Thy на «полых волокнах» в аппарате АР-1-15ПС, уменьшая объем до 0,5 л концентрата белка.

Хроматографическая очистка белка TNF-Thy на Sephadex G-100

Наносят в колонну ПСК 200/1000 с 28,3 л SephadexG-100 500 мл концентрата белка TNF-Thy и проводят элюцию с помощью буфера для гель-фильтрации 20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 9 М мочевина, рН 7,2 со скоростью 3,0 мл/мин.

В собранных фракциях определяют спектрофотометрически А₂₈₀, А₂₆₀. Наличие TNF-Thy подтверждают с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН). Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН более 90% TNF-Thy, объединяют.

В объединенной фракции высокоочищенного препарата TNF-Thy определяют спектрофотометрически: А₂₈₀, А₂₆₀, белок. Чистоту препарата TNF-Thy определяют по данным электрофореза в 17,5%) ПААГ с ДСН, а также по данным ВЭЖХ в колонке с силикагелем С₁₈. Объединенную фракцию, содержащую TNF-Thy с чистотой больше 90%, передают на стадию ренатурации.

Ренатурация белка TNF-Thy

Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 50 л фосфатного буфера с хлористым натрием с рН 7,3 и охлаждают до плюс (12±1)°С. Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью (50±5) мл/мин 2 л раствора очищенного белка TNF-Thy. После внесения всего раствора белка проводят инкубацию при работающей мешалке. В процессе ренатурации с помощью системы охлаждения поддерживают температуру раствора (12±1) С. Длительность процесса (18±1) часов.

Хроматографическая очистка ренатурированного гибридного белка TNF-Thy на сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow

Используют колонку с DEAE Sepharose Fast Flowo6beMOM 2 л. Уравновешивают20 мМ фосфатным буфером, рН 7,3. Затем наносят раствор белка со стадии ренатурации в фосфатном буфере и промывают уравновешивающим буфером.

Через колонну с сорбентом последовательно пропускают 20 мМ фосфатный буфер, 80 мМ NaCl, рН 7,3и 20 мМ фосфатный буфер, 300 мМ NaCl, рН 7,3. Все элюируемые белки собирают фракциями объемом по 0,4 л и анализируют с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ-ДСН. Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН не более 95% TNF-Thy, объединяют. После объединения раствор TNF-Thy передают на стерилизующую фильтрации и контролируют параметры (белок, э/ф, ВЭЖХ).Также отбирают пробу на определение биологической активности. Полученный раствор TNF-Thy хранят при минус (20±2)°С.

Определение активности проводят как описано в Примере 3.

Получают гибридный белок с чистотой 98% специфической активностью 1,2×10⁶ ЕД /мл и удельной биологической активностью 2,0×10⁶ ЕД на 1 мг белка.

Пример 5. Способ получения гибридного белка TNF-Thy

Культивирование штамма- продуцента

Используют ферментер объемом 20 л при условиях по Примеру 2. После окончания культивирования клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С).

100 г биомассы суспендируют в 10 л 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 с 0,15 М натрия хлористого и охлаждают до плюс (6±2)°С, Суспензию клеток пропускают два раза через фильеру дезинтегратора Ranie под давлением 300 и 600 bar. Суспензию разрушенных клеток центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА - 0,15М NaCl, 1% тритон Х-100, рН 7,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С. К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0, 15М NaCl, 0,5% тритон Х-100, рН 8,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Затем суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 1М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

Осадки растворяют добавлением буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 7 М мочевина, рН 7,0 и инкубируют 18 ч при (6±2)°С. Полученный раствор белка осветляют центрифугированием в роторе JA-14 при 13000 об/мин в течение 60 мин при плюс (6±2)°С. Далее проводят очистку на колонке объемом 2 л, упакованной сорбентом SepraPrep Q и уравновешенной буфером 20 мМ Трис-НС1, 7 М мочевина, рН 6,8. После нанесения белка колонку промывают тем же буфером и пропускают 4 л буфера 20 мМ Трис-HCl, 20 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 6,8, затем 20 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 и 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8. Во фракции, полученной после элюциибуфером20 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 увеличивают концентрацию мочевины с 7 М до 9 М выдерживают при плюс 16°С в течение 18 ч. Далее проводят процесс концентрирования раствора белка TNF-Thy на «полых волокнах» в аппарате АР-1-15ПС, уменьшая объем до 0,5 л концентрата белка.

Хроматографическая очистка белка TNF-Thy на Sephadex G-100

Наносят в колонну ПСК 200/1000 с 28,3 л SephadexG-100 500 мл концентрата белка TNF-Thy и проводят элюцию с помощью буфера для гель-фильтрации 20 мМ Трис-НС1, 150 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 8,5 со скоростью 3,0 мл/мин.

В собранных фракциях определяют спектрофотометрически А₂₈₀, А₂₆₀. Наличие TNF-Thy подтверждают с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН). Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН более 90% TNF-Thy, объединяют.

В объединенной фракции высокоочищенного препарата TNF-Thy определяют спектрофотометрически: А₂₈₀, А₂₆₀, белок. Чистоту препарата TNF-Thy определяют по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН, а также по данным ВЭЖХ в колонке с силикагелем C₁₈. Объединенную фракцию, содержащую TNF-Thyc чистотой больше 90%, передают на стадию ренатурации.

Ренатурация белка TNF-Thy

Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 50 л фосфатного буфера с хлористым натрием с рН 7,3 и охлаждают до плюс (12±1)°С. Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью (50±5) мл/мин 2 л раствора очищенного белка TNF-Thy. После внесения всего раствора белка проводят инкубацию при работающей мешалке. В процессе ренатурации с помощью системы охлаждения поддерживают температуру раствора (12±1)°С. Длительность процесса (18±1) часов.

Хроматографическая очистка ренатурированного гибридного белка TNF-Thy на сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow

Используют колонку с DEAE Sepharose Fast Flowo объемом 2 л. Уравновешивают 20 мМ фосфатным буфером, рН 7,3. Затем наносят раствор белка, полученного на стадии ренатурации в фосфатном буфере и промывают уравновешивающим буфером. Через колонну с сорбентом последовательно пропускают 20 мМ фосфатный буфер, 80 мМ NaCl, рН 7,3и 20 мМ фосфатный буфер, 300 мМ NaCl, рН 7,3.

Все элюируемые белки собирают фракциями объемом по 0,4 л и анализируют с помощью электрофореза в 17,5%) ПААГ-ДСН. Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН не более 95% TNF-Thy, объединяют. После объединения раствор TNF-Thy передают на стерилизующую фильтрации и контролируют параметры (белок, э/ф, ВЭЖХ).Также отбирают пробу на определение биологической активности. Полученный раствор TNF-Thy хранят при минус (20±2) С.Определение активности проводят как описано в Примере 3.

Получают гибридный белок с чистотой 98,5%, специфической активностью 1,3×10⁶ ЕД /мл и удельной биологической активностью 2,0×10⁶ ЕД на 1 мг белка.

Пример 6. Способ получения гибридного белка TNF-Thy

Культивирование штамма-продуцента

Используют ферментер объемом 20 л при условиях по Примеру 2. После окончания культивирования клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С).

100 г биомассы суспендируют в 10 л 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 с 0,15 М натрия хлористого и охлаждают до плюс (6±2)°С. Суспензию клеток пропускают два раза через фильеру дезинтегратора Ranie под давлением 300 и 600 bar. Суспензию разрушенных клеток центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА- 0,15М NaCl, 1% тритон Х-100, рН 7,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе J А-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С. К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0, 15М NaCl, 0,5% тритон Х-100, рН 8,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Затем суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 1 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

Осадки растворяют добавлением буфера 20 мМТрис, 5 мМ ЭДТА, 7 М мочевина, рН 7,0 и инкубируют 18 ч при (6±2)°С. Полученный раствор белка осветляют центрифугированием в роторе JA-14 при 13000 об/мин в течение 60 мин при плюс (6±2)°С. Далее проводят очистку на колонке объемом 2 л, упакованной сорбентом SepraPrep Q и уравновешенной буфером 20 мМ Трис⋅НС1, 7 М мочевина, рН 6,8. После нанесения белка колонку промывают тем же буфером и пропускают 4 л буфера 20 мМ Трис-HCl, 20 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 6,8, затем 20 мМ Трис-FICl, 50 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 и 20 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8. Во фракции, полученной после элюции буфером 20 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl,7 М мочевина рН 6,8 увеличивают концентрацию мочевины с 7 М до 9 М выдерживают при плюс 16°С в течение 18 ч. Далее проводят процесс концентрирования раствора белка TNF-Thy на «полых волокнах» в аппарате АР-1-15ПС, уменьшая объем до 0,5 л концентрата белка.

Хроматографическая очистка белка TNF-Thy на Sephadex G-100

Наносят в колонну ПСК 200/1000 с 28,3 л SephadexG-100 500 мл концентрата белка TNF-Thy и проводят элюцию с помощью буфера для гель-фильтрации 20 мМ Трис⋅НС1, 150 мМ NaCl, 9 М мочевина, рН 7,2 со скоростью 3,0 мл/мин.

В собранных фракциях определяют спектрофотометрически A₂₈₀, А₂₆₀. Наличие TNF-Thy подтверждают с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН).

Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН более 90% TNF-Thy, объединяют.

В объединенной фракции высокоочищенного препарата TNF-Thy определяют спектрофотометрически: A₂₈₀, А₂₆₀, белок. Чистоту препарата TNF-Thy определяют по данным8 электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН, а также по данным ВЭЖХ в колонке с силикагелем С₁₈. Объединенную фракцию, содержащую TNF-Thy c чистотой больше 90%, передают на стадию ренатурации.

Ренатурация белка TNF-Thy

Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 90 л фосфатного буфера с хлористым натрием с рН (7,3±0,1) и охлаждают до плюс (121)°С. Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью (50±5) мл/мин 2 л раствора очищенного белка TNF-Thy. После внесения всего раствора белка проводят инкубацию при работающей мешалке. В процессе ренатурации с помощью системы охлаждения поддерживают температуру раствора (12±1)°С. Длительность процесса (18±1) часов.

Хроматографическая очистка ренатурированного гибридного белка TNF-Thy на сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow

Используют колонку с DEAESepharoseFastFlowo6beMOM 2 л. Уравновешивают 20 мМ фосфатным буфером, рН 7,3. Затем наносят раствор белка, полученного на стадии ренатурации в фосфатном буфере и промывают уравновешивающим буфером. Через колонну с сорбентом последовательно пропускают 20 мМ фосфатный буфер, 80 мМ NaCl, рН 7,3 и 20 мМ фосфатный буфер, 300 мМ NaCl, рН 7,3.

Все элюируемые белки собирают фракциями объемом по 0,4 л и анализируют с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ-ДСН. Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5%о ПААГ с ДСН не более 95% TNF-Thy, объединяют. После объединения раствор TNF-Thy передают на стерилизующую фильтрации и контролируют параметры (белок, э/ф, ВЭЖХ).Также отбирают пробу на определение биологической активности.

Полученный раствор TNF-Thy хранят при минус (20±2)°С.

Определение активности проводят как описано в Примере 3.

Получают гибридный белок с чистотой 97%о, специфической активностью 1,2×10⁶ ЕД /мл и удельной биологической активностью 1,85×10⁶ ЕД на 1 мг белка

Пример 7. Получение лиофилизированного лекарственного средства.

На весах взвешивают 0,277 кг натрия хлорида. Засыпают навеску в емкость и добавляют 0,091 кг натрия фосфата двузамещенного 12-водного, 0,0094 кг натрия фосфата однозамещенного 2-водного, 0,515 кг маннита. Затем добавляют в ту же емкость 3,0 л воды для инъекций и устанавливают емкость на магнитную мешалку. Перемешивание содержимого емкости проводят до полного растворения солей, после чего объем растворенной навески доводят водой для инъекций до 5,0 л.

В реактор с мешалкой вносят 3 л воды для инъекций, затем количественно переносят 5,0 л раствора солей с маннитом, перемешивают. К содержимому реактора, осторожно, избегая вспенивания, приливают 2,6 л раствора высокоочищенного гибридного белка, полученного из штамма Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy по примеру 5, предварительно разморозив его при температуре от 8 до 10°С в течение 16-24 часов. Раствор перемешивают не менее 10 минут. Величина рН должна быть в пределах от 7,0 до 7,5 единиц. Если значение рН выходит за указанные пределы, проводят его корректировку. Затем доводят объем до 12,0 л водой для инъекций. Полученный материал передается на стадию стерилизующей фильтрации. Затем проводят асептический розлив препарата во флаконы по 0,35 мл на флакон. Далее, предукупореные и предварительно охлажденные до температуры от минус 2 до плюс 2°С флаконы, загружают в лиофилизатор.

Фаза замораживания продукта начинается сразу же после его загрузки и длится 6

часов, температура полок при этом понижается ниже минус 45°С. Температура продукта ниже минус 35°С. При достижении на всех полках данных параметров, дают выдержку замороженного продукта в течение 2-3 часов. Через один час после начала фазы выдержки продукта в замороженном состоянии, включают компрессоры конденсатора. Температура в конденсаторе понижается до минус 60°С. Охлаждение в конденсаторе происходит за счет поступления фреона. За полчаса до завершения выдержки включают вакуумные насосы. В системе «камера-конденсатор-вакуумный насос» создается вакуум глубиной до от 70 до 90 Па. Далее наступает фаза проморозки продукта под вакуумом, которая длится два часа. Температура в конденсаторе снижается до минус 70°С, температура продукта понижается ниже минус 38°С. По окончании фазы проморозки продукта под вакуумом, начинают процесс сушки, при этом отключают охлаждение полок и включают нагрев. Сушка препарата идет в полуавтоматическом режиме по заданным программам. При достижении температуры плюс 20°С и истечении времени, основной процесс сушки заканчивается. Далее производят досушивание продукта в ручном режиме в течение 3-5 часов, температура в системе нагрева полок лиофилизатора поддерживается постоянной от плюс 20 до 21°С. Далее флаконы укупоривают и завальцовывают.

Определяют активность лекарственного средства.

Препарат должен оказывать цитотоксическое действие в культуре клеток L-929.

Штамм диплоидных клеток подкожной соединительной ткани мыши (NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L], ATCC® CCL-1™) хранят в виде замороженной суспензии. Одну криопробирку с клетками тест-культуры достают из сосуда Дьюара с жидким азотом и помещают в водяную баню до полного оттаивания суспензии (не более чем на 2 минуты) при температуре (37±2)°С. В ламинарном боксе в асептических условиях содержимое пробирки переносят в одноразовую стерильную центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 6 мл поддерживающей среды (см. примечание 3). После центрифугирования при 2000 об/мин 10 мин, надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 10 мл ростовой среды (см. примечание 2), осадок ресуспендируют и переносят суспензию во флакон площадью 25 см² для культивирования. Флакон помещают в CO₂-инкубатор для культивирования в стандартных условиях (при температуре (37±2)°С, и (5,0±0,5) % углекислого газа) на 48-72 часа до образования монослоя.

После формирования монослоя на поверхности дна культурального флакона, проводят процедуру пассирования клеток, т.е. переноса части клеток монослоя во второй культуральный флакон со средой роста. Перенос клеток необходимо производить, не допуская образования плотного слоя для того, чтобы клетки находились в логарифмической фазе роста.

Из флакона со сформированным клеточным монослоем удаляют культуральную среду и трижды промывают его 5-6 мл 0,25% раствора Трипсин-ЭДТА, прогретым до температуры (37±2)°С. Последнюю внесенную во флакон порцию раствора удаляют не полностью, а оставляют около 1 мл и равномерно распределяют по всей поверхности монослоя. Флакон с клетками помещают в СО₂-инкубатор до тех пор, пока клетки полностью не отслоятся от дна культурального флакона. Вносят 2 мл ростовой среды, суспендируют клетки пипетированием, переносят в чашку Петри и отбирают пробу для подсчета количества клеток в камере Горяева. Переносят 1-1,5 мл клеточной суспензии в новый флакон и добавляют ростовую среду 5-6 мл до посевной концентрации клеток 100 тыс.клеток/мл. После переноса отслоившихся клеток в новый флакон с ростовой средой, их оба помещают в стандартные условия культивирования на 24-48 часов. При образовании на дне флаконов монослоя, один флакон используют для повторного переноса клеток и определения специфической активности, а с другим повторяют процедуру снятия клеток для закладки в рабочий банк клеток.

Перед каждой процедурой работы с клетками при помощи инвертированного микроскопа оценивают морфологию клеток и чистоту культуры в культуральном флаконе.

При отсутствии посторонней микрофлоры и нормальной морфологии клеток определяют культуру, как пригодную к использованию.

Далее готовят исследуемый образец. Содержимое флакона с исследуемым препаратом растворяют в 1 мл воды для инъекций. Готовят три десятикратных разведения. Для этого в пробирки типа Эппендорф вносят по 900 мкл поддерживающей среды с актиномицином Д. В пробирку №1 вносят 100 мкл раствора исследуемого препарата, тщательно перемешивают. В пробирку №2 переносят 100 мкл раствора из пробирки №1, тщательно перемешивают. В пробирку №3 переносят 100 мкл раствора из пробирки №2, тщательно перемешивают.

Из пробирки №3 готовят двукратные рабочие разведения испытуемого образца. Для этого в 8 пробирок типа Эппендорф вносят по 500 мкл поддерживающей среды с актиномицином Д. Из пробирки №3 с раствором испытуемого препарата переносят 500 мкл в пробирку №4, тщательно перемешивают. Из пробирки №4 переносят 500 мкл раствора в пробирку №5, тщательно перемешивают. Повторяют процедуру для пробирок №6-11. Получают следующие разведения: 1:2×10³, 1:4×10³, 1:8×10³, 1:16×10³, 1:32×10³, 1:64×10³, 1:128×10³, 1:256×10³. Разведения в пробирках №4-11 приготовлены для внесения в планшет.

Для определения пригодности ранее полученного клеточного монослоя по окончании инкубации визуально оценивают его состояние с помощью микроскопа. Клетки должны иметь типичную морфологию, должна отсутствовать посторонняя микрофлора.

Из полученного монослоя клеток удаляют культуральную среду. Для этого переворачивают планшет над емкостью с рабочим раствором перекиси водорода.

По окончании инкубации визуально с помощью микроскопа оценивают состояние клеточного монослоя.

Учет активности стандартного и испытуемого образцов осуществляют при отсутствии признаков дегенерации в лунках с контрольными клетками (Кк), не подвергавшимися воздействию препаратов.

Оценка результата

Оценку осуществляют с помощью инвертированного микроскопа.

За активность стандартного и испытуемого образца принимают величину, обратную разведению, которое вызывает повреждение 50% клеток аденокарциномы мыши L-929.

Расчет активности (X) стандартного и испытуемого образца проводят по формуле:

где Р - разведение образца препарата, при котором произошло 50% повреждение клеток.

Полученное лекарственное средство имеет специфическую активность при титровании в культуре клеток L-929 100000 ЕД во флаконе.

Пример 8. Получение лиофилизированного лекарственного средства.

На весах взвешивают 0,274 кг натрия хлорида. Засыпают навеску в емкость и добавляют 0,082 кг натрия фосфата двузамещенного 12-водного, 0,0034 кг натрия фосфата однозамещенного 2-водного, 0,566 кг маннита. Затем добавляют в ту же емкость 3,0 л воды для инъекций и устанавливают емкость на магнитную мешалку. Перемешивание содержимого емкости проводят до полного растворения солей, после чего объем растворенной навески доводят водой для инъекций до 5,0 л. В реактор с мешалкой вносят 3 л воды для инъекций, затем количественно переносят 5,0 л раствора солей с маннитом, перемешивают. К содержимому реактора, осторожно, избегая вспенивания, приливают 2,9 л раствора высокоочищенного гибридного белка, полученного из штамма Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy по примеру 4, предварительно разморозив его при температуре от 8 до 10°С в течение 16-24 часов. В том случае, если специфическая активность TNF-Thy составляет 1,2×10⁶ ЕД/мл, вносят 2,9 л раствора высокоочищенного белка (субстанции). Раствор перемешивают не менее 10 минут. Величина рН должна быть в пределах от 7,0 до 7,5 единиц. Если значение рН выходит за указанные пределы, проводят его корректировку. Затем доводят объем до 12,0 л водой для инъекций. Полученный материал передается на стадию стерилизующей фильтрации. Затем проводят асептический розлив препарата во флаконы по 0,35 мл на флакон. Далее, предукупореные и предварительно охлажденные до температуры от минус 2 до плюс 2°С флаконы, загружают в лиофилизатор.

Фаза замораживания продукта начинается сразу же после его загрузки и длится 6 часов, температура полок при этом понижается ниже минус 45°С. Температура продукта ниже минус 35°С. При достижении на всех полках данных параметров, дают выдержку замороженного продукта в течение 2-3 часов. Через один час после начала фазы выдержки продукта в замороженном состоянии, включают компрессоры конденсатора. Температура в конденсаторе понижается до минус 60°С. Охлаждение в конденсаторе происходит за счет поступления фреона. За полчаса до завершения выдержки включают вакуумные насосы. В системе «камера-конденсатор-вакуумный насос» создается вакуум глубиной до от 70 до 90 Па. Далее наступает фаза проморозки продукта под вакуумом, которая длится два часа. Температура в конденсаторе снижается до минус 70°С, температура продукта понижается ниже минус 38°С. По окончании фазы проморозки продукта под вакуумом, начинают процесс сушки, при этом отключают охлаждение полок и включают нагрев. Сушка препарата идет в полуавтоматическом режиме по заданным программам. При достижении температуры плюс 20°С и истечении времени, основной процесс сушки заканчивается. Далее производят досушивание продукта в ручном режиме в течение 3-5 часов, температура в системе нагрева полок лиофилизатора поддерживается постоянной от плюс 20 до 21°C. Далее флаконы укупоривают и завальцовывают. Определяют активность как в примере 7,

Полученное лекарственное средство имеет специфическую активность при титровании в культуре клеток L-929 90000 ЕД во флаконе»

Пример 9. Получение лиофилизированного лекарственного средства.

На весах взвешивают 0,329 кг натрия хлорида. Засыпают навеску в емкость и добавляют 0,117 кг натрия фосфата двузамещенного 12-водного, 0,017 кг натрия фосфата однозамещенного 2-водного, 0,463 кг маннита. Затем добавляют в ту же емкость 3,0 л воды для инъекций и устанавливают емкость на магнитную мешалку. Перемешивание содержимого емкости проводят до полного растворения солей, после чего объем растворенной навески доводят водой для инъекций до 5,0 л. В реактор с мешалкой вносят 3 л воды для инъекций, затем количественно переносят 5,0 л раствора солей с маннитом, перемешивают. К содержимому реактора, осторожно, избегая вспенивания, приливают 2,9 л раствора высокоочищенного гибридного белка, полученного из штамма Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy по примеру 6, предварительно разморозив его при температуре от 8 до 10°С в течение 16-24 часов. В том случае, если специфическая активность TNF-Thy составляет 1,2×10⁶ ЕД/мл, вносят 2,9 л раствора высокоочищенного белка (субстанции). Раствор перемешивают не менее 10 минут. Величина рН должна быть в пределах от 7,0 до 7,5 единиц. Если значение рН выходит за указанные пределы, проводят его корректировку. Затем доводят объем до 12,0 л водой для инъекций. Полученный материал передается на стадию стерилизующей фильтрации. Затем проводят асептический розлив препарата во флаконы по 0,35 мл на флакон. Далее, предукупореные и предварительно охлажденные до температуры от минус 2 до плюс 2°С флаконы, загружают в лиофилизатор.

Фаза замораживания продукта начинается сразу же после его загрузки и длится 6 часов, температура полок при этом понижается ниже минус 45°С. Температура продукта ниже минус 35°С. При достижении на всех полках данных параметров, дают выдержку замороженного продукта в течение 2-3 часов. Через один час после начала фазы выдержки продукта в замороженном состоянии, включают компрессоры конденсатора. Температура в конденсаторе понижается до минус 60°С. Охлаждение в конденсаторе происходит за счет поступления фреона. За полчаса до завершения выдержки включают вакуумные насосы. В системе «камера-конденсатор-вакуумный насос» создается вакуум глубиной до от 70 до 90 Па. Далее наступает фаза проморозки продукта под вакуумом, которая длится два часа. Температура в конденсаторе снижается до минус 70°С, температура продукта понижается ниже минус 38°С. По окончании фазы проморозки продукта под вакуумом, начинают процесс сушки, при этом отключают охлаждение полок и включают нагрев. Сушка препарата идет в полуавтоматическом режиме по заданным программам. При достижении температуры плюс 20°С и истечении времени, основной процесс сушки заканчивается. Далее производят досушивание продукта в ручном режиме в течение 3-5 часов, температура в системе нагрева полок лиофилизатора поддерживается постоянной от плюс 20 до 21°С. Далее флаконы укупоривают и завальцовывают. Определяют активность как в примере 7.

Полученное лекарственное средство имеет специфическую активность при титровании в культуре клеток L-929 110000 ЕД во флаконе.

Пример 10 Сравнительные результаты клинического применения лиофилизированного лекарственного средства, полученного по примеру 8 и препарата рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, полученного по ближайшему аналогу.

Лиофилизированное лекарственное средство, полученное по примеру 8 и препарат рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, полученный по ближайшему аналогу, применялись в 2 группах по 250 пациентов в возрасте 22-87 лет с онкологическими заболеваниями различной локализации, различных стадий (I-IV), с метастазами различной локализации или без метастазов.

Лиофилизированное лекарственное средство, полученное по примеру 8 и препарат рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, полученный по ближайшему аналогу, назначались на фоне базовой химиотерапии 1 раз в сутки в дозировке от 100000 ЕД до 400000 ЕД по различным схемам, согласно инструкции по медицинскому применению препарата рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁.

Все пациенты наблюдались около двух месяцев. Терапия лиофилизированным лекарственным средством, полученным по примеру 8 и препаратом рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, полученным по ближайшему аналогу, показала сопоставимую эффективность: была отмечена положительная клиническая динамика, стабилизация динамики по RECIST, стабилизация динамики метастазов.

У пациентов, для лечения которых применялся препарат рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, полученный по ближайшему аналогу, наиболее часто (у 10% пациентов) встречалось нежелательное явление «повышение температуры». При применении лекарственного средства, полученного по примеру 8, повышение температуры наблюдалось у 1% пациентов.

Полученные результаты свидетельствуют о превосходящем профиле безопасности лиофилизированного лекарственного средства, полученного по примеру8.

Пример 11. Клиническое исследование лиофилизированного лекарственного средства, полученного по примеру 9.

Заявленное в примере 9, лиофилизированное лекарственное средство применяли в клиническом исследовании, в котором участвовало 78 пациенток с клиническим диагнозом: рак молочной железы.

Больных разделили на две группы лечения.

Для группы I. Подкожно вводили растворенное в 1 мл воды для инъекций лиофилизированное лекарственное средство, полученное по примеру9: 10 инъекций по 100000 ЕД ежедневно. Терапия начиналась за 2 дня до химиотерапии, дни химиотерапии пропускались. Среднее число курсов составило 2 (от 1 до 8).

Для группы II: Подкожно вводили растворенный в 1 мл воды для инъекций препарат рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, полученный по ближайшему аналогу: 10 инъекций по 100000 ЕД ежедневно. Терапия начиналась за 2 дня до химиотерапии, дни химиотерапии пропускались. Среднее число курсов составило 2 (от 1 до 8).

Частота объективных ответов в I группе составила 45,4%. Контроль опухолевого роста зарегистрирован в 27,27% случаев. У одного пациента полный регресс опухоли в ответ на терапию. Медиана выживаемости без прогрессирования составила 107 месяцев (95% ДИ 25-189 месяцев). Медиана общей выживаемости составила 115 месяцев (95% ДИ 47-183 месяцев).

Частота объективных ответов во II группе составила 41,2%. Контроль опухолевого роста зарегистрирован в 11,76% случаев. Медиана выживаемости без прогрессирования составила 80 месяцев (95% ДИ 38-128 месяцев). Медиана общей выживаемости составила 67 месяцев (95% ДИ 32-102 месяцев).

В группе I отмечена тенденция к увеличению безрецидивной и общей выживаемости пациентов (приблизительно в 1,5 раза). При дальнейшем наблюдении обнаружено, что в группе I общее число пациентов с метастазами по итогам лечения несколько меньше, при этом чаще наблюдается поражение 1 или 2 органов, в то время как во II группе преобладают пациенты с метастазами в 3 и более органах.

Число нежелательных явлений в группе I было ниже, чем в группе II. В обеих группах не было отмечено серьезных нежелательных явлений. Все возникшие нежелательные явления не требовали отмены терапии.

Пример 12. Клиническое исследование лиофилизированного лекарственного средства, полученного по примеру7.

Заявленное в примере7 лиофилизированное лекарственное средство применяли в клиническом исследовании, в котором участвовало 215 пациентов с различными формами злокачественных новообразований преимущественно с местно-распространенными формами заболевания (стадии 2А-3В), закончившие основной курс противоопухолевого лечения.

Больных разделили на две группы лечения (108 и 107 пациентов соответственно).

Для группы I: Подкожно вводили растворенное в 1 мл воды для инъекций лиофилизированное лекарственное средство, полученное по примеру 7: 100000 ЕД в сутки подкожно через день, с 1 по 19 день. Затем перерыв 10 дней. Всего на 1 курс 10 введений. Всего 6 курсов терапии.

Для группы II: Подкожно вводили растворенный в 1 мл воды для инъекций препарат рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, полученный по ближайшему аналогу: 100000 ЕД в сутки подкожно через день, с 1 по 19 день. Затем перерыв 10 дней. Всего на 1 курс 10 введений. Всего 6 курсов терапии.

Безрецидивная выживаемость оказалась статистически значимо выше (р<0.05) среди пациентов, закончивших основной курс противоопухолевого лечения и получавших затем лиофилизированное лекарственное средство, полученное по примеру 7 в течение 6 месяцев. Вторичные злокачественные новообразования возникли у 3 и 11 пациентов в группах I и II соответственно. Обнаружена статистически значимая разница при сравнении частоты развития рецидива между группами (3% против 10% пациентов; р=0.0291; 95% ДИ: 0.044-0.988; отношение шансов: 0,251). Выживаемость без прогрессирования была значимо выше у больных, получавших лиофилизированное лекарственное средство, полученное по примеру 7.

Ни в одной из групп не было зарегистрировано ни одного серьезного нежелательного явления. Общее количество пациентов, отметивших нежелательные явления, в группе II было незначительно выше (0.06% против 0.03%). Больные жаловались на повышение температуры на фоне терапии, слабость и артралгию. Все нежелательные явления характеризовались легкой степенью выраженности и купировались, не требуя отмены терапии.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, и касается лекарственного средства, представляющего собой лиофилизат, содержащий натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный, маннит и высокоочищенный гибридный белок TNF-Thy с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1, причем гибридный белок TNF-Thy получен культивированием штамма-продуцента Escherichia coli, BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy, где после 3-5 часов культивирования проводят индукцию биосинтеза в клетках Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом и выдерживают 4-6 часов с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего белок TNF-Thy, выделение из полученной биомассы клеток штамма-продуцента белка TNF-Thy, последующую очистку выделенного гибридного белка TNF-Thy путем анионообменной и гель-проникающей хроматографии в денатурирующих условиях, ренатурацию гибридного белка TNF-Thy путем разбавления мочевинного раствора и очистку ренатурированного гибридного белка TNF-Thy анионообменной хроматографией с получением гибридного белка с чистотой не менее 97,% а штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy - продуцент гибридного белка TNF-Thy - получен трансформацией родительского штамма Е. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидой рЕТ32а-TNF-Thy размером 5929 пар оснований (п.о.), обеспечивающей синтез белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1 размером 20,5 кДа, и содержащей структурные элементы: промотор Т7 и оператор lacO, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ориджин репликации бактериофага f1 (f1 ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (Laclpromoter) при следующем соотношении компонентов (масс.%): фактор некроза опухолей – тимозин альфа 1 рекомбинантный с удельной активностью не менее 1,7×10⁶ ЕД/мг 0,18-0,22; натрий хлористый 27-35; натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 8-12; натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 0,3-1,8; маннит – остальное. Изобретение позволяет получить средство, содержащее более чистый химически и биологически стабилизированный гибридный белок TNF-Thy, что повышает эффективность действия и уменьшает его побочное действие за счет оптимально подобранного как состава компонентов, так и их количества, а также позволяет увеличить срок хранения лекарственного средства до 3-х лет при температуре от 2 до 8°С. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 12 пр.

1. Лекарственное средство, обладающее активностью гибридного белка альфа-фактор некроза опухолей - тимозин альфа 1 (TNF-Thy), представляющее собой лиофилизат, содержащий натрий хлористый, натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный, маннит и высокоочищенный гибридный белок TNF-Thy с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1, причем гибридный белок TNF-Thy получен культивированием штамма-продуцента Escherichia coli, BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy, где после 3-5 часов культивирования проводят индукцию биосинтеза в клетках Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy изопропил-b-D-1-тиогалактопиранозидом и выдерживают 4-6 часов с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего белок TNF-Thy, выделение из полученной биомассы клеток штамма-продуцента белка TNF-Thy, последующую очистку выделенного гибридного белка TNF-Thy путем анионообменной и гель-проникающей хроматографии в денатурирующих условиях, ренатурацию гибридного белка TNF-Thy путем разбавления мочевинного раствора и очистку ренатурированного гибридного белка TNF-Thy анионообменной хроматографией с получением гибридного белка с чистотой не менее 97%, а штамм Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy- продуцент гибридного белка TNF-Thy - получен трансформацией родительского штамма Е. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидой pET32a-TNF-Thy размером 5929 пар оснований (п.о.), обеспечивающей синтез белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1 размером 20,5 кДа, и содержащей структурные элементы: промотор Т7 и оператор lасО, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ориджин репликации бактериофага fl (fl ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (LacIpromoter) при следующем соотношении компонентов (масс.%):

Альфа-фактор некроза опухолей - тимозин альфа 1 рекомбинантный с удельной активностью не менее 1,7×10⁶ ЕД/мг 0,18-0,22 Натрий хлористый 27-35 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный 8-12 Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный 0,3-1,8 Маннит остальное

2. Лекарственное средство по п. 1, отличающееся тем, что после очистки гибридный белок TNF-Thy может быть заморожен и в последующем разморожен при приготовлении раствора для розлива.