РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА PET32a-TNF-Thy, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ ГИБРИДНОГО БЕЛКА α-ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ - ТИМОЗИН АЛЬФА 1, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)/PET32A-THF-Thy - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО БЕЛКА TNF-Thy Российский патент 2023 года по МПК C12N15/00 C12N15/70 C12N15/12 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии и касается нового штамма бактерий Escherichia coli BL 21/РЕТ32а- TNF-Thy, который может быть использован для получения гибридного белка α-фактор некроза опухолей - тимозин альфа 1 (далее белок TNF-Thy), применяемого в медицинской промышленности.

Гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ известен из уровня техники и обладает рядом преимуществ по сравнению с α-фактором некроза опухоли в качестве терапевтического препарата: имеет низкую системную токсичность, сохраняя противоопухолевую активность природного α-фактора некроза опухоли, и кроме того, показывает иммуностимулирующие свойства. (Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина АН СССР, а.с. N1707078, C12N 15/12, 1992)

Из уровня техники известна рекомбинантная плазмидная ДНК pThy315, кодирующая гибридный белок TNF-Thy, а так же известен способ получения гибридного белка TNF-Thy (RU 2077586, C12N 15/12, 20.04.1997; RU 2055896, С 12 Р 21/00, 03.10.1996). Рекомбинантная плазмидная ДНК pThy315 имеет молекулярную массу 2,1 МДа (3,23 т.п.н.), кодирует гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ с молекулярной массой 20,46 кДа и состоит из: фрагмента ДНК размером 3,23 т.п.н. плазмиды pThy314, содержащего тандем ранних промоторов А2 и A3 бактериофага Т7, участок связывания рибосом, ген гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ и терминатор транскрипции фага λ, а также имеет генетический маркер селекции, ген β-лактамазы, придающий устойчивость к антибиотику ампициллину клеткам Escherichia coli, трансформированным плазмидой pThy315.

Недостатком рекомбинантной плазмиды является то, что маркер ампициллинрезистентности, приводит к недостаточно эффективной селекции. Фермент β-лактамаза, расщепляющий ампициллин, является секретируемым белком, то есть β-лактамаза в ходе культивирования штамма накапливается в культуральной среде. Это приводит к инактивации как имевшегося изначально в среде, так и добавляемого вновь ампициллина. В результате в ферментере накапливаются клетки штамма, утратившие плазмиду и неспособные синтезировать рекомбинантный белок. Что, в свою очередь, ведет к падению продуктивности трансформированного штамма.

Известен способ получения гибридного белка TNF-Thy, который включает культивирование клеток трансформированного штамма Escherichia coli SG20050 введением плазмиды pThy315, кодирующей синтез указанного белка, в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой белка (RU 2055896, С12Р 21/00, 29.07.1992). При этом культивирование проводят при 36-38°С в среде, содержащей до 1,4% пептона или триптона, до 1,6% дрожжевого экстракта, до 1,15% NaCl и 50 мкг/мл ампициллина. При этом используют свежеполученные трансформанты или отобранные на начальной фазе экспоненциального роста и хранившиеся при минус 20-40°С в бульоне с 40% глицерина. После лизиса клеток осадок отмывают 1-3 М растворами мочевины и растворяют в 7 М растворе мочевины, полученный раствор наносят на анионообменный сорбент при рН 5,6-5,8 с элюцией тем же буфером с добавлением 150 мМ NaCl, после чего фракции с гибридным белком наносят на сорбент с иммобилизованным красителем (голубой), уравновешенный буфером с 7 М мочевины при рН 5,5-5,8 и элюируют белок буфером с градиентом рН 7,0-8,5 в присутствии 7 М мочевины и 1,0 М NaCl, с последующим диализом при рН 7,2-7,4 против раствора, содержащего 150 мМ NaCl и 10 мМ Na-фосфата.

Недостатком такого способа получения является использование при хроматографической очистке белка сорбента с иммобилизованным красителем (голубой). Этого типа сорбенты подвергаются в процессе использования частичной деградации, при этом краситель (голубой) отделяется от сорбента и самопроизвольно элюируется с колонки в виде связанного с белком комплекса. Такие примеси недопустимы для приготовления лекарственных препаратов.

Наиболее близкими аналогами к заявляемым объектам изобретения являются рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая синтез, способ получения и препарат рекомбинантного гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁ (RU, 2225443, C12N 1/70, 25.07.2002). Рекомбинантная плазмидная ДНК pThy316 для экспрессии в клетках Escherichia coli гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, имеющая размер 3,77 т.п.н. и содержащая промоторы А2 и A3 фага Т7, обеспечивающие конститутивную экспрессию гена гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁; расположенный после промотора A3 рибосомосвязывающий сайт; ген, кодирующий гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-α₁, заключенный между сайтами рестрикции XbaI и ClaI и включающий второй сайт рестрикции ClaI; следующую за геном гибридного белка и ограниченную двумя сайтами рестрикции XbaI терминаторную область; ген устойчивости к ампицилину; ген устойчивости к аминогликозидам (канамицину, неомицину и G-418), содержащий третий сайт рестрикции ClaI; а также уникальные сайты рестрикции: PstI в гене р-лактамазы; XhoI, HindIII и SmaI, находящиеся в гене аминогликозидфосфотрансферазы; KpnI между промотором A3 и рибосомсвязывающим сайтом; EcoRI между промоторами A3 и А2. А способ основан на культивировании клеток штамма Escherichia coli SG20050 или BL21, который трансформирован введением плазмиды pThy316, являющегося модификацией ранее описанной плазмиды pThy315, в жидкой питательной среде с последующим выделением и очисткой гибридного белка TNF-Thy. При этом культивирование штамма, трансформированого введением плазмиды pThy316, проводят при 37°С в среде, содержащей 1% пептона или триптона, 1% дрожжевого экстракта, 1% NaCl и 50 мкг/мл канамицина. После лизиса клеток лизат центрифугируют, осадок отмывают 1-2 М растворами мочевины и растворяют в 7 М растворе мочевины с 10 мМТрис-НС1, полученный раствор наносят на анионообменный сорбент при рН 7,5 с элюцией тем же буфером в градиенте концентрации 0-1 М NaCl, после чего фракции с гибридным белком наносят на гидроксидапатит, уравновешенный 20 мМ натрий фосфатным буфером рН 6,8 с 7 М мочевины и элюируют белок градиентом концентрации 20-400 мМ натрий фосфатного буфера рН 6,8 с 7 М мочевиной. Полученный раствор наносят на сорбент Сефадекс G-50, уравновешенный 10 мМ натрий фосфатным буфером рН 7,2 с 150 мМ натрия хлористого, проводят хроматографию для удаления мочевины и ренатурации гибридного белка.

Недостатком данного способа является отсутствие штамма-продуцента и применение в качестве основы для создания плазмидного вектора плазмиды pThy315. В качестве промотора в ней применяется тандем ранних промоторов А2 и A3 бактериофага Т7. Данный тандем является неоптимальным для экспрессии рекомбинантных белков. Кроме того, с его помощью обеспечивается конститутивная экспрессия белка, что создает дополнительное метаболическое давление на клетки продуцента Escherichia coli. Это, в свою очередь, приводит к достижению ими более низких плотностей по сравнению с продуцентами с индуцибельными промоторами и снижает продуктивность. В итоге конечная продуктивность указанного способа получения гибридного белка TNF-Thy оказывается низкой, что делает эффективность производства на его основе довольно низкой, а трудоемкость - высокой.

Штамм на основе плазмид для продуцирования гибридного белка TNF-Thy из уровня техники не известен.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является создание впервые штамма -продуцента гибридного белка TNF-Thy на основе сконструированной плазмиды, направляющей синтез гибридного белка TNF-Thy с целью повышения эффективности и снижения трудоемкости получения гибридного белка TNF-Thy, увеличении выхода и чистоты гибридного белка TNF-Thy.

Поставленная задача достигается за счет создания рекомбинантной плазмиды pET32a-TNF-Thy - размером 5929 пар оснований (п.о.), обеспечивающая синтез белка имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1 размером 20,5кДа и содержащая структурные элементы: промотор Т7 и оператор 1асО, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ориджин репликации бактериофага f1 (f1 ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (Laclpromoter),

Так же заявляется штамм Escherichia coli BL 21/pET32a-TNF-Thy- продуцент гибридного белка TNF-Thy, полученного трансформацией рекомбинантной плазмидой pET32a-TNF-Thy.

Еще одним заявляемым объектом настоящего изобретения является способ получения гибридного белка TNF-Thy, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/ pET32a-TNF-Thy, при этом после 3-5 часов культивирования проводят индукцию биосинтеза рекомбинантного белка клетками Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy и выдерживают 4-6 часов, с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего гибридный белок TNF-Thy, выделение из полученной биомассы клеток штамма-продуцента гибридного белка TNF-Thy, последующую очистку выделенного гибридного белка TNF-Thy, путем анионно-обменной и гель-проникающей хроматографии в денатурирующих условиях, ренатурацию гибридного белка TNF-Thy путем разбавления мочевинного раствора и очистку ренатурированного гибридного белка TNF-Thy анионообменной хроматографией и с получением гибридного белка с чистотой не менее 97%

При этом, культивирование клеток Escherichia coli BL21 (DE3)/ pET32a-TNF-Thy можно проводить в ростовой среде на протяжении по меньшей мере 7 часов, но не более 10 часов

А индукцию биосинтеза предпочтительно осуществлять изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом.

Выделение гибридного белка TNF-Thy можно осуществлять путем отделения клеток от культуральной жидкости, дезинтеграции клеток, выделения тел включений из полученного дезинтеграта и солюбилизацию тел включений.

Очистку гибридного белка TNF-Thy предпочтительно осуществлять с использованием анионно-обменной и гель-проникающей хроматографии при концентрации мочевины 7М-9М, рН 7,2-8,5

А разбавление мочевинного раствора предпочтительно осуществлять до концентрации мочевины не более 0,4 М

Настоящее изобретение относится к гибридному белку TNF-Thy, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, содержащему α-фактор некроза опухолей и тимозин-al.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими фигурами:

На Фиг. 1 представлены SEQ ID NO 1 и SEQ ID NO 2 (аминокислотная последовательность TNF-Thy и нуклеотидная последовательность синтетического фрагмента, кодирующая TNF-Thy)

На Фиг. 2 изображена Карта плазмиды, содержащая:

f1 ori - ориджин репликации бактериофага f1,

AmpR - ген резистентности к ампициллину (ген β-лактамазы),

ori- ориджин репликации colE1,

Т7 promoter - промотор бактериофага Т7,

TNF-Thy - ген гибридного белка TNF-Thy,

Т7 terminator - терминатор бактериофага Т7,

LacI - ген лактозного репрессора LacI.

На Фиг. 3 представлена фотография электрофоретического разделения тотального клеточного лизата:

1 -- до начала индукции

2 - в момент индукции

3 - 2 часа после индукции

4 - 4 часа после индукции

5 - 5 часов после индукции

6 - стандарты молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610

Заявляемый штамм имеет преимущество в том, что впервые получен путем трансформации клеток штамма Escherichia coli BL 21(DE3) рекомбинантной плазмидной ДНК pET32a-TNF-Thy согласно настоящему изобретению. Необходимо отметить, что штамм - продуцент был получен только за счет оригинального конструирования уникальной плазмиды pET32a-TNF-Thy, что обеспечивает эффективную экспрессию гена, позволяющую нарабатывать значительное количество биомассы, содержащей гибридный белок TNF-Thy

В заявляемом техническом решении поставленная задача решается посредством создания рекомбинантной плазмиды pET32a-TNF-Thy для экспрессии указанного гибридного белка, впервые полученным высокопродуктивным бактериальным штаммом-продуцентом BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy, а также способа получения гибридного белка TNF-Thy, позволяющего получать гибридный белок TNF-Thy с высоким выходом и высокой степенью чистоты.

Предложенный штамм и способ очистки имеют ряд существенных преимуществ по сравнению с известными из уровня техники, в т.ч. ранее указанными источниками.

Т.к. гибридный белок используется при производстве лекарственных средств, надо учитывать, что для обеспечения постоянства свойств лекарственного препарата, содержащего допустимые примеси в определенном диапазоне, должен соблюдаться целый ряд требований при ферментации, экспрессии белка и очистке.

Получение для ферментации трансформационной смеси, как в ближайшем аналоге, а не штамма, не позволяет проводить процесс в строго определенных условиях, описанных в стандартных операционных процедурах, что сказывается на качестве получаемого гибридного белка, соответственно это сказывается и на лекарственном препарате. Создание впервые штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy позволяет получить эталонную культуру, заложить на хранение рабочую культуру клеток штамма и проводить процесс ферментации при стандартизованных условиях. В настоящее время это является одним из требований надлежащей производственной практики (GMP). В заявляемом изобретении выход биомассы с 1 л культуральной жидкости составляет от 50 до 80 г. А в вышеуказанном патенте получают биомассу 8 г/л. Соответственно, эффективность заявляемой ферментации увеличилась в 6-10 раз.

Необходимо отметить, что проведение хроматогафии на колонне с сорбентом SepraPrep™Q более эффективно по сравнению с ДЕАЕ-целлюлозой, т.к. позволяет значительно сократить время проведения стадии.

Так же впервые заявлен способ хроматографии на Сефадексе G-100 в денатурирующих условиях. Растворенные и даже очищенные от посторонних примесей тельца включений дают гибридный белок TNF-Thy в различных олигомерных формах. Описанная в ближайшем аналоге хроматография на гидроксилапатите не позволяет разделить эти формы и не является способом, значительно увеличивающим чистоту гибридного белка. Заявляемый способ с использованием хроматографии в мочевине на Сефадексе G-100 позволил разделить олигомеры TNF-Thy и тримерную активную форму гибридного белка. Кроме того, во время проведения этой стадии происходит очистка от посторонних высокомолекулярных примесей. Выход активной тримерной формы составляет 25-30% от всего белка. Чистота на данном этапе составляет 90%, что позволяет проводить эффективно следующую важную стадию процесса - получение правильно свернутого гибридного белка TNF-Thy

Последующая хроматография описанная в ближайшем аналоге проводится на колонке Сефадексе G-50, уравновешенном 10 мМ натрий фосфатным буфером рН 7,2 с 150 мМ натрия хлористого, выполняют для удаления мочевины и ренатурации гибридного белка. При этом колоночная хроматография не позволяет получить высокий уровень ренатурации гибридного белка. Как показали проведенные исследования, способ, описанный в ближайшем аналоге с учетом не отделения от олигомеров дает низкий выход ренатурированного гибридного белка за счет его агрегации (20-50%). Заявляется более точный и упрощенный способ ренатурированного гибридного белка, путем разбавления мочевинного раствора, без использования дорогих сорбентов, при сокращении времени процесса, что позволяет увеличить выход правильно свернутого гибридного белка до 90-100%, при этом чистота гибридного белка составляет 97%.

После проведения хроматографии ренатурированного белка получаем продукт со следующими параметрами:

- Молекулярная масса мономера составляет 20,5±0,2кДа. Содержание мономера продукта с молекулярной массой около 20,5 кДа должно быть не менее 97%.(электрофорез 17,5% ПААГ, ДСН)

- Положение основной полосы иммунокомплекса в иммуноблотинге должно быть выше полосы иммунокомплекса сертифицированного референсного образца ФИО (CRS). Разница в положении полос должна соответствовать примерно 3 кДа.

- Примеси белковой природы, олигомеры, агрегаты и мономеры - не более 3%;Содержание клеточной и векторной ДНК не более 100 пкг/10⁶ЕД

- Молекулярно- массовое распределение не менее 97% тримера (61±2)кДа

- Бактериальные эндотоксины не более 0,5 ЕЭ на 10⁴ ЕД активности

Удельная активность 2,0×10^бЕД/1 мг белка

Техническим результатом заявленного изобретения является повышение эффективности получения белка TNF-Thy, а именно, увеличение выхода гибридного белка TNF-Thy из биомассы штамма с чистотой не менее 97% за счет создания рекомбинантного штамма Escherichia coli - продуцента гибридного белка TNF-Thy, полученного на основе сконструированной рекомбинантной плазмиды, что обеспечивает повышенный выход гибридного белка TNF-Thy за счет увеличения количества получаемой в ходе культивирования биомассы в 10 раз при сохранении содержания общего белка и доли гибридного белка TNF-Thy в общем белке клетки.

Указанный технический результат достигается созданием штамма на основе сконструированной рекомбинантной плазмиды pET32a-TNF-Thy и способом получения белка с использованием такого штамма.

Рекомбинантная плазмида pET32a-TNF-Thy для экспрессии гибридного белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, имеющей длину 5929 пар оснований и состоящей из следующих ключевых генетических элементов:

- промотора Т7 и оператора 1асО;

- синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQIDNO 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy;

- гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpRpromoter);

- гена лактозного репрессора LacI и бактериального промотора гена лактозного репрессора (Laclpromoter);

- ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori).

В качестве вектора экспрессии выбрана плазмида рЕТ32а. Для получения плазмиды по изобретению последовательность SEQ ID NO 2, полученную полным нуклеотидным синтезом, встраивают в плазмидный вектор рЕТ-32а по сайтам рестрикции XhoI и NdeI.

Указанная плазмида, далее обозначаемая как pET32a-TNF-Thy, состоит из следующих ключевых генетических элементов, расположенных в соответствии с Фиг. 1:

- гена устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериального промотора гена устойчивости к ампициллину (AmpRpromoter);

- ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori);

- промотора Т7 и оператора 1асО;

- гена лактозного репрессора LacI и бактериального промотора гена лактозного репрессора (Laclpromoter);

- синтетической нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO 2, кодирующей гибридный белок Tnf-Thy (SEQ ID NO 1), включающий в себя α-фактор некроза опухолей и тимозин-α₁.

Структура указанной плазмидной ДНК (плазмиды), состоящей из указанных ключевых генетических элементов, представлена на Фиг. 2.

В вышеуказанной плазмиде ген AmpR предназначен для селекции стабильных клеток Escherichia coli. Бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpRpromoter) предназначен для его экспрессии.

Ориджин репликации бактериофага f1 /AnalysisofGenesandGenomes, JohnWiley&Sons, 2004, S. 140/ широко используется для создания экспрессионных векторов.

Продуктом трансляции синтетической последовательности SEQ IDN O 2 является полипептид последовательности SEQ ID NO 1, включающий α-фактор некроза опухолей и тимозин-α₁.

После клонирования синтезированной последовательности в составе вектора, полученной рекомбинантной плазмидой была проведена трансформация бактериальных клеток Escherichia coli BL 21(DE3).

Исходным материалом для создания штамма-продуцента по изобретению является известный из уровня техники штамм Е. coli BL21 (DE3) Генотип Е. coli six. В /HaeyoungJeong, ValerieBarbe, ChoongHoonLee, DavidVallenet, DongSuYu, Sang-HaengChoi, ArnaudCouloux, Seung-WonLee, SungHoYoon, LaurenceCattolico, Cheol-GooHur, Hong-SeogPark, BeatriceSegurens, SunChangKim, TaeKwangOh, RichardE. Lenski, F. WilliamStudier, PatrickDaegelen, JihyunF. Kim, Genome Sequences of Escherichia coli BstrainsREL606 and BL21(DE3), JournalofMolecularBiology, Volume 394, Issue 4, 2009, 644-652/. Экспрессионной плазмидой длиной 5929 п. о., состоящей из ключевых генетических элементов, расположенных друг относительно друга так, как представлено наФиг.2, трансформируют клетки штамма E.coli BL21 (DE3). Для введения плазмиды в клетки Е. coli BL21 (DE3) могут использоваться методы трансформации, известные из уровня техники, например, электропорация, метод с использованием полиэтиленгликоля, кальций-хлоридный метод. Также для целей настоящего изобретения для введения в клетки Е. coli BL21 (DE3) плазмиды, представленной на Фиг. 2, могут использоваться и другие методы трансформации, не упомянутые в настоящем описании в явном виде, которые известны в уровне техники в настоящее время или будут созданы впоследствии. При осуществлении конкретных воплощений настоящего изобретения специалист, основываясь на существующем уровне знаний, может выбрать наиболее оптимальный метод трансформации клеток.

Другим объектом настоящего изобретения является способ получения гибридного белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, включающий стадии:

a) культивирования штамма-продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy согласно настоящему изобретению с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего гибридный белок TNF-Thy согласно настоящему изобретению;

b) выделения гибридного белка TNF-Thy согласно настоящему изобретению из биомассы клеток штамма-продуцента, полученных на стадии а);

c) очистки гибридного белка TNF-Thy, полученного на стадии Ь).

В предпочтительном воплощении, однако, без ограничения, культивирование клеток Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy, в ростовой среде осуществляют на протяжении по меньшей мере 7 часов, но не более 10 часов.

В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, индукцию биосинтеза рекомбинантного белка клетками Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy осуществляют на 3 часе культивирования при помощи изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида

Важным этапом получения более чистого гибридного белка явилось применение гель-проникающей хроматографии в денатурирующих условиях, позволяющей разделить олигомеры и тример белка, что повышает чистоту гибридного белка TNF-Thy (не менее 97% чистоты).

Для лучшего понимания сущности предлагаемого изобретения ниже приведены примеры его осуществления.

Все стандартные генно-инженерные и микробиологические манипуляции, а также амплификацию и секвенирование ДНК проводили по известным методикам [Маниатис Т., Фрич Э, Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование, М.: Мир, 1984; Клонирование ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера, Пер. с англ., Москва, Мир, 1988; Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S., Sharf S.J., Higuehi R., Horn G.T., Mullis K.B., Eriich H.A. Science, 1988. V.239, №4839, p.487-491; Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, V. 74, p.5463-5467.].

Пример 1. Конструирование экспрессионной плазмиды

Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов - 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода. Для приготовления вектора ДНК плазмиды рЕТ32а (3 мкг, 1 пмоль) обрабатывают в 40 мкл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой XhoI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-НС1, 10 мМ MgCb, 100 мкг/мл БСА рестриктазой NdeI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractll. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE. Олигонуклеотидную последовательность SEQ ID NO 2, кодирующую гибридный белок SEQ ID NO 1, получают полным нуклеотидным синтезом. Полученную синтетическую последовательность SEQ ID NO 2 обрабатывают в 40 мкл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой XhoI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl₂, 100 мкг/мл БСА рестриктазой NdeI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Синтетический фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течении 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractll. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.

Описанный выше полученный синтетический фрагмент в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг, полученного из ДНК плазмиды рЕТ32а, описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ Трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl₂, 0,2 мМ гАТР, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед.акт.Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С. Помещают на лед пробирки с компетентными клетками (XL 1-Blue, Евроген) до полного размораживания содержимого из расчета одна пробирка на трансформацию. Аккуратно перемешивают суспензию клеток легким встряхиванием. Добавляют в каждую пробирку полученную после обработки Т4-ДНК-лигазой алкивоту реакционной смеси, аккуратно перемешивают содержимое легким встряхиванием. Инкубируют пробирки во льду в течение 20--30 мин. Переносят пробирки в водяную баню (плюс 42°С) на 30-45 сек. Быстро переносят пробирки из водяной бани в лед и инкубируют в течение 3-5 мин. Добавляют не менее 3-х объемов предварительно подогретую до 37°С среду SOB, перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 40-60 мин в орбитальном шейкере-инкубаторе (Multitron, Infors) при скорости 225-250 об/мин. Высеивают содержимое пробирок на чашки Петри диамтером 60 мм (Перинт).

Аликвоту полученной плазмидной ДНК используют для трансформации компетентных клеток E.coli BL21 (DE3). Трансформанты высевают на чашки с агаризованной средой LB, в которую добавляют ампициллин до конечной концентрации ампициллина 50 мкг/мл. Из клонов выделяют ДНК плазмиды pET32a-TNF-Thy. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования.

Пример 2. Получение штамма-продуцента E.coli BL21 (DE3)/ pET32a-TNF-Thy и характеристика его продуктивности

Штамм-продуцент E.coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy получают трансформацией компетентных клеток E.coli BL21 (DE3) плазмидой, получение которой описано в Примере 1.

Предпочтительно (без ограничения), для введения указанной плазмиды в клетки штамма Е. coli BL21 (DE3) используют метод электропорации, известный из уровня техники /TamaraKleber-Janke, Wolf-MeinhardBecker, UseofModifiedBL21(DE3) Escherichia coli Cellsfor High-LevelExpressionofRecombinantPeanutAllergensAffectedbyPoorCodonUsage, Protein Expression and Purification, Volume 19, Issue 3,2000, 419-424/ и включенный в настоящее описание посредством ссылки.

Штамм-продуцент E.coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy культивируют при 37°С в 100 мл жидкой питательной среды LB с добавкой ампициллина до конечной концентрации ампициллина 100 мкг/мл в течение 3 ч в колбах Ерленмейера (1 л, Corning) в орбитальном шейкере-инкубаторе со скоростью вращения 220 об/мин до достижения оптической плотности культуральной жидкости при длине волны 600 нм 0,7-0,8 ед. Затем осуществляют индукцию биосинтеза рекомбинантного белка прибавлением изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида до конечной концентрации изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида 0,5 мМ и инкубируют в течение 4 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, количество культуры, соответствующее 1 мл, центрифугируют в течение 10 мин при 6000 об/мин. Осажденные клетки переносят в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим, с добавлением 2-меркаптоэтонола, инкубируют 5 мин при 98°С, аликвоты по 3 мкл используют для электрофореза в 14% SDS-ПААГ. Гель окрашивают добавлением 0,1% раствора Кумасси R-250 и сканируют с помощью денситометра ShimadzuCS-930. Результаты представлены на Фиг. 3. 5 -- клеточный лизат, 6 - стандарты молекулярных масс. Выход гибридного белка TNF-Thy по результатам денситометрического анализа составляет не менее 20% относительно суммарного белка клетки.

Предлагаемый штамм-продуцент Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy характеризуется следующими признаками:

а) Морфологические признаки. Клетки палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

б) Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаризованной среде «LB» (на 1 литр 10 г пептон, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 20 г агара) - колонии сероватые, слабовыпуклые, влажные, блестящие, пастообразной консистенции.

в) Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4°С до 40°С при оптимальном значении рН от 6,8 до 7,5. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения, включающие пептон, триптон, дрожжевой экстракт, аминокислоты и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

г) Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к пенициллиновым антибиотикам (до 500 мкг/мл).

Пример 3. Способ получения гибридного белка TNF-Thy Культивирование штамма- продуцента

Используют ферментер объемом 20 л при условиях по Примеру 2. После окончания культивирования клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С).

100 г биомассы суспендируют в 10 л 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 с 0,15 М натрия хлористого и охлаждают до плюс (6±2)°С. Суспензию клеток пропускают два раза через фильеру дезинтегратора Ranie под давлением 300 и 600 bar. Суспензию разрушенных клеток центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА- 0,15М NaCl, 1% тритон Х-100, рН 7,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С.Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С. К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0, 15М NaCl, 0,5% тритон Х-100, рН 8,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Затем суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 1М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

Осадки растворяют добавлением буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 7 М мочевина, рН 7,0и инкубируют 18 ч при (6±2)°С. Полученный раствор белка осветляют центрифугированием в роторе JA-14 при 13000 об/мин в течение 60 мин при плюс (6±2)°С. Далее проводят очистку на колонке объемом 2 л, упакованной сорбентом SepraPrep Q и уравновешенной буфером 20 мМ Трис-HCl, 7 М мочевина, рН 6,8. После нанесения белка колонку промывают тем же буфером и пропускают 4 л буфера 20 мМ Трис-HCl, 20 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 6,8, затем 20 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 и 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8. Во фракции, полученной после элюции буфером 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 увеличивают концентрацию мочевины с 7 М до 9 М выдерживают при плюс 16°С в течение 18 ч. Далее проводят процесс концентрирования раствора белка TNF-Thy на «полых волокнах» в аппарате АР-1-15ПС, уменьшая объем до 0,5 л концентрата белка. Хроматографическая очистка белка TNF-Thy на Sephadex G-100

Наносят в колонну ПСК 200/1000 с 28,3 л SephadexG-100 500 мл концентрата белка TNF-Thy и проводят элюцию с помощью буфера для гель-фильтрации 20 мМ Трис⋅HCl, 150 мМ NaCl, 9 М мочевина, рН 7,2 со скоростью 3,0 мл/мин.

В собранных фракциях определяют спектрофотометрически А₂₈₀, А₂₆₀. Наличие TNF-Thy подтверждают с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН). Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН более 90% TNF-Thy, объединяют.

В объединенной фракции высокоочищенного препарата TNF-Thy определяют спектрофотометрически: А₂₈₀, А₂₅₄, белок. Чистоту препарата TNF-Thy определяют по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН, а также по данным ВЭЖХ в колонке с силикагелем C₁₈.

Объединенную фракцию, содержащую TNF-Thy с чистотой больше 90%, передают на стадию ренатурации.

Ренатурация белка TNF-Thy

Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 50 л фосфатного буфера с хлористым натрием с рН (7,3±0,1) и охлаждают до плюс (12±1)°С. Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью (50±5) мл/мин 2 л раствора очищенного белка TNF-Thy. После внесения всего раствора белка проводят инкубацию при работающей мешалке. В процессе ренатурации с помощью системы охлаждения поддерживают температуру раствора (12±1)°С. Длительность процесса (18±1) часов.

Хроматографическая очистка ренатурированного гибридного белка TNF-Thy на сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow

Используют колонку с DEAE SepharoseFast Flow объемом 2 л. Уравновешивают 20 мМ фосфатным буфером, рН 7,3. Затем наносят раствор ренатурированного гибридного белка, в фосфатном буфере и промывают уравновешивающим буфером.

Через колонну с сорбентом последовательно пропускают 20 мМ фосфатный буфер, 80 мМ NaCl, рН 7,3и 20 мМ фосфатный буфер, 300 мМ NaCl, рН 7,3.

Все элюируемые белки собирают фракциями объемом по 0,4 л и анализируют с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ-ДСН. Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН не менее 95% TNF-Thy, объединяют. После объединения раствор TNF-Thy передают настерилизующую фильтрации и контролируют параметры (белок, э/ф, ВЭЖХ).Также отбирают пробу на определение биологической активности. Полученный раствор TNF-Thy хранят при минус (20±2) С.

Определение активности

Для исследования противоопухолевой активности белка использовали штамм диплоидных клеток подкожной соединительной ткани мыши (NCTCclone 929 [Lcell, L-929, derivativeofStrainL], ATCC® CCL-1™). Ампулу с клетками переносят из жидкого азота в водяную баню с температурой (40±0,1)°С.Клетки после оттаивания асептически переносят в пластиковый матрац, вместимостью 500 мл и в него с интервалом 1,5-2 мин добавляют ростовую среду (среда ДМЕМ - 90% по, эмбриональная телячья сыворотка жидкая - 10%) в количестве 0,25; 0,25; 0,5; 0,5; 0,75; 1,0; 1,0; 2,0; 2,0; 10,0 мл. После подсчета количества клеток концентрацию клеток в суспензии доводят до посевной путем добавления ростовой среды с добавлением антибиотиков (канамицина 100 ЕД/мл, гентамицина 80-160 ЕД/мл). Клетки формируют монослой с типичной морфологией на 4-е сутки.

Для определения активности препарата контролируют количество пассажей культуры клеток, которых должно быть не более 30 пассажей.

Монослой клеток, полученный в матраце вместимостью 500 мл снимают со стекла 0,125% раствором трипсина и суспендируют в 40 мл ростовой среды и подсчитывают количество клеток в камере Горяева. Взвесь разводят ростовой средой из расчета, чтобы в 1,0 мл содержалось 200 тыс.клеток. В лунки микропланшетов вносят по 0,1 мл суспензии клеток. Приготовленный планшет инкубируют в течение 48-72 часов при температуре (37±1,0)°С и концентрации СО2 (5,0±0,5) %.

Для определения активности готовят сначала десятикратные разведения: 1:10, 1:100, 1.Т000 и 1:10000, а затем последовательные двукратные разведения: 1:20000, 1:40000, 1:80000,1:160000, 1:320000, 1:640000, 1:1280000, 1:2560000 исследуемого образца в ростовой среде. Из планшета с монослоем клеток удаляют среду в стакан для отходов и вносят в лунки по 100 мкл последовательных разведений образца и по 100 мкл поддерживающей среды с актиномицином Д в концентрации 2 мкг/мл. На каждое разведение используют не менее 4 лунок с культурой клеток. 4 лунки с культурой оставляют в качестве контрольных. В контрольные лунки дополнительно вносят по 100 мкл поддерживающей среды с актиномицином Д. Приготовленный планшет инкубируют в течение 48 часов при температуре (37±1,0)°С и концентрации СО₂ (5,0±0,5) %.

Предварительную оценку состояния монослоя проводят через 24 часа. Дальнейший учет активности TNF-Thy проводят, если нет признаков дегенерации в контрольной культуре. Окончательный учет проводят через 48 часов. Для этого монослой отмывают от погибших клеток стерильным физиологическим раствором. Для этого из лунок сначала удаляют ростовую среду, вносят по 200 мкл физраствора, который также удаляют. Повторяют 2-3 раза. Затем содержимое лунок окрашивают 0,2% раствором кристаллического фиолетового. Для этого, после удаления ростовой, в лунки вносят по 100 мкл спирта этилового 96% и выдерживают в течение 10 минут. Спирт удаляют и промывают лунки водой очищенной, внося по 100 мкл в лунку и удаляя ее стряхиванием. Процедуру промывки повторяют три раза. Затем планшеты высушивают на воздухе в течение 30 минут. Затем в каждую лунку вносят по 200 мкл 0,2% раствора кристаллического фиолетового и выдерживают планшет в течение 20 минут при энергичном покачивании. Краситель удаляют стряхиванием и промывают планшеты водой очищенной как указано выше. Для удаления связавшегося красителя в лунки вносят по 100 мкл кислоты уксусной 10%, которую затем удаляют стряхиванием. Учет результатов проводят визуально (с помощью инвертированного микроскопа) или автоматически, на планшетном спектрофотометре, при длине волны 540 нм.

За активность испытуемого образца принимают величину, обратную разведению, при котором имеет место 50±5% гибель клеток.

Расчет специфической активности проводят по формуле

где - разведение образца, при котором наблюдается 50% повреждение монослоя (снижение оптической плотности на 50% контрольной).

Расчет удельной активности:

где - специфическая активность образца препарата, ЕД;

- количество белка в образце препарата, мг

Получают гибридный белок с чистотой 97, 5% и удельной биологической активностью не менее 2,0×10⁶ ЕД на 1 мг белка.

Пример 4. Способ получения гибридного белка TNF-Thy

Культивирование штамма- продуцента

Используют ферментер объемом 20 л при условиях по Примеру 2, но после индукции биосинтеза рекомбинантного белка прибавлением изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида до конечной концентрации изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида 0,5 мМ культуральную жидкость инкубируют в течение 6 часов. После окончания культивирования клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С).

100 г биомассы суспендируют в 10 л 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 с 0,15 М натрия хлористого и охлаждают до плюс (6±2)°С.Суспензию клеток пропускают два раза через фильеру дезинтегратора Ranie под давлением 300 и 600 bar. Суспензию разрушенных клеток центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА- 0,15М NaCl, 1% тритон Х-100, рН 7,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С. К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0, 15М NaCl, 0,5% тритон Х-100, рН 8,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Затем суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 1М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе J А-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

Осадки растворяют добавлением буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 7 М мочевина, рН 7,0и инкубируют 18 ч при (6±2)°С. Полученный раствор белка осветляют центрифугированием в роторе JA-14 при 13000 об/мин в течение 60 мин при плюс (6±2)°С.Далее проводят очистку на колонке объемом 2 л, упакованной сорбентом SepraPrep Q и уравновешенной буфером 20 мМ Трис⋅HCl, 7 М мочевина, рН 6,8. После нанесения белка колонку промывают тем же буфером и пропускают 4 л буфера 20 мМ Трис⋅HCl, 20 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 6,8, затем 20 мМ Трис-HCl, 50 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 и 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8. Во фракции, полученной после элюциибуфером20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 увеличивают концентрацию мочевины с 7 М до 9 М выдерживают при плюс 16°С в течение 18 ч. Далее проводят процесс концентрирования раствора белка TNF-Thy на «полых волокнах» в аппарате АР-1-15ПС, уменьшая объем до 0,5 л концентрата белка. Хроматографическая очистка белка TNF-Thy на Sephadex G-100

Наносят в колонну ПСК 200/1000 с 28,3 л SephadexG-100 500 мл концентрата белка TNF-Thy и проводят элюцию с помощью буфера для гель-фильтрации 20 мМ Трис⋅HCl, 150 мМ NaCl, 9 М мочевина, рН 7,2 со скоростью 3,0 мл/мин.

В собранных фракциях определяют спектрофотометрически А₂₈₀, А₂₆₀. Наличие TNF-Thy подтверждают с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН). Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН более 90% TNF-Thy, объединяют.

В объединенной фракции высокоочищенного препарата TNF-Thy определяют спектрофотометрически: А₂₈₀, А₂₆₀, белок. Чистоту препарата TNF-Thy определяют по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН, а также по данным ВЭЖХ в колонке с силикагелем C₁₈.

Объединенную фракцию, содержащую TNF-Thy с чистотой больше 90%, передают на стадию ренатурации.

Ренатурация белка TNF-Thy

Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 50 л фосфатного буфера с хлористым натрием с рН (7,3±0,1) и охлаждают до плюс (12±1)°С. Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью (50±5) мл/мин 2 л раствора очищенного белка TNF-Thy. После внесения всего раствора белка проводят инкубацию при работающей мешалке. В процессе ренатурации с помощью системы охлаждения поддерживают температуру раствора (12±1)°С. Длительность процесса (18±1) часов.

Хроматографическая очистка ренатурированного гибридного белка TNF-Thy на сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow

Используют колонку с DEAE Sepharose Fast Р1о\уобъемом 2 л. Уравновешивают 20 мМ фосфатным буфером, рН 7,3. Затем наносят раствор белка со стадии ренатурации в фосфатном буфере и промывают уравновешивающим буфером.

Через колонну с сорбентом последовательно пропускают 20 мМ фосфатный буфер, 80 мМ NaCl, рН 7,3 и 20 мМ фосфатный буфер, 300 мМ NaCl, рН 7,3.

Все элюируемые белки собирают фракциями объемом по 0,4 л и анализируют с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ-ДСН. Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН не более 95% TNF-Thy, объединяют. После объединения раствор TNF-Thy передают на стерилизующую фильтрации и контролируют параметры (белок, э/ф, ВЭЖХ). Также отбирают пробу на определение биологической активности.

Полученный раствор TNF-Thy хранят при минус (20±2)°С.

Определение активности проводят как описано в Примере 3.

Получают гибридный белок с чистотой 98% и удельной биологической активностью не менее 2,0×10^б ЕД на 1 мг белка.

Пример 5. Способ получения гибридного белка TNF-Thy

Культивирование штамма- продуцента

Используют ферментер объемом 20 л при условиях по Примеру 2. После окончания культивирования клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С).

100 г биомассы суспендируют в 10 л 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 с 0,15 М натрия хлористого и охлаждают до плюс (6±2)°С. Суспензию клеток пропускают два раза через фильеру дезинтегратора Ranie под давлением 300 и 600 bar. Суспензию разрушенных клеток центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА- 0,15М NaCl, 1% тритон Х-100, рН 7,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе J А-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С. К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0, 15М NaCl, 0,5% тритон Х-100, рН 8,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Затем суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 1М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

Осадки растворяют добавлением буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 7 М мочевина, рН 7,0и инкубируют 18 ч при (6±2)°С.Полученный раствор белка осветляют центрифугированием в роторе JA-14 при 13000 об/мин в течение 60 мин при плюс (6±2)°С. Далее проводят очистку на колонке объемом 2 л, упакованной сорбентом SepraPrep Q и уравновешенной буфером 20 мМ Трис⋅HCl, 7 М мочевина, рН 6,8. После нанесения белка колонку промывают тем же буфером и пропускают 4 л буфера 20 мМ Трис⋅HCl, 20 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 6,8, затем 20 мМ Трис⋅HCl, 50 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 и 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8. Во фракции, полученной после элюциибуфером20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 увеличивают концентрацию мочевины с 7 М до 9 М выдерживают при плюс 16°С в течение 18 ч. Далее проводят процесс концентрирования раствора белка TNF-Тпуна «полых волокнах» в аппарате АР-1-15ПС, уменьшая объем до 0,5 л концентрата белка. Хроматографическая очистка белка TNF-Thy на Sephadex G-100

Наносят в колонну ПСК 200/1000 с 28,3 л SephadexG-100 500 мл концентрата белка TNF-Thyu проводят элюцию с помощью буфера для гель-фильтрации 20 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 8,5 со скоростью 3,0 мл/мин.

В собранных фракциях определяют спектрофотометрически А₂₈₀, А₂₆₀. Наличие TNF-Thy подтверждают с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН). Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН более 90% TNF-Thy, объединяют.

В объединенной фракции высокоочищенного препарата TNF-Thy определяют спектрофотометрически: А₂₈₀, А₂₆₀, белок. Чистоту препарата TNF-Thy определяют по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН, а также по данным ВЭЖХ в колонке с силикагелем С₁₈.

Объединенную фракцию, содержащую TNF-Thyc чистотой больше 90%, передают на стадию ренатурации.

Ренатурация белка TNF-Thy

Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 50 л фосфатного буфера с хлористым натрием с рН (7,3±0,1) и охлаждают до плюс (12±1)°С. Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью (50±5) мл/мин 2 л раствора очищенного белка TNF-Thy. После внесения всего раствора белка проводят инкубацию при работающей мешалке. В процессе ренатурации с помощью системы охлаждения поддерживают температуру раствора (12±1)°С. Длительность процесса (18±1) часов.

Хроматографическая очистка ренатурированного гибридного белка TNF-Thy на сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow

Используют колонку с DEAE Sepharose Fast Flowo объемом 2 л. Уравновешивают 20 мМ фосфатным буфером, рН 7,3. Затем наносят раствор белка, полученного на стадии ренатурации в фосфатном буфере и промывают уравновешивающим буфером. Через колонну с сорбентом последовательно пропускают 20 мМ фосфатный буфер, 80 мМ NaCl, рН 7,3и 20 мМ фосфатный буфер, 300 мМ NaCl, рН 7,3.

Все элюируемые белки собирают фракциями объемом по 0,4 л и анализируют с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ-ДСН. Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН не более 95% TNF-Thy, объединяют. После объединения раствор TNF-Thy передают на стерилизующую фильтрации и контролируют параметры (белок, э/ф, ВЭЖХ). Также отбирают пробу на определение биологической активности. Полученный раствор TNF-Thy хранят при минус (20±2) С. Определение активности проводят как описано в Примере 3.

Получают гибридный белок с чистотой 98,5% и удельной биологической активностью не менее 2,0×10⁶ ЕД на 1 мг белка.

Пример 6. Способ получения гибридного белка TNF-Thy

Культивирование штамма- продуцента

Используют ферментер объемом 20 л при условиях по Примеру 2. После окончания культивирования клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) отделяют центрифугированием (5000 g, 20 мин, 4°С).

100 г биомассы суспендируют в 10 л 0,05 М фосфатного буфера рН 7,2 с 0,15 М натрия хлористого и охлаждают до плюс (6±2)°С. Суспензию клеток пропускают два раза через фильеру дезинтегратора Ranie под давлением 300 и 600 bar. Суспензию разрушенных клеток центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА- 0,15М NaCl, 1% тритон Х-100, рН 7,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С. К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 0, 15М NaCl, 0,5% тритон Х-100, рН 8,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Затем суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 2 мМ ЭДТА, 1М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

К осадкам в центрифужных стаканах добавляют по 400 мл буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 2 М мочевина, рН 6,0. Осадки суспендируют и инкубируют 30 мин при (6±2)°С. Суспензию «телец включений» центрифугируют в роторе JA-10 при 9000 об/мин в течение 30 мин при плюс (6±2)°С.

Осадки растворяют добавлением буфера 20 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА, 7 М мочевина, рН 7,0и инкубируют 18 ч при (6±2)°С. Полученный раствор белка осветляют центрифугированием в роторе JA-14 при 13000 об/мин в течение 60 мин при плюс (6±2)°С. Далее проводят очистку на колонке объемом 2 л, упакованной сорбентом SepraPrep Q и уравновешенной буфером 20 мМ Трис⋅HCl, 7 М мочевина, рН 6,8. После нанесения белка колонку промывают тем же буфером и пропускают 4 л буфера 20 мМ Трис⋅HCl, 20 мМ NaCl, 7 М мочевина, рН 6,8, затем 20 мМ Трис⋅HCl, 50 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8 и 20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl, 7 М мочевина рН 6,8. Во фракции, полученной после элюциибуфером20 мМ Трис⋅HCl, 200 мМ NaCl,7 М мочевина рН 6,8 увеличивают концентрацию мочевины с 7 М до 9 М выдерживают при плюс 16°С в течение 18 ч.Далее проводят процесс концентрирования раствора белка TNF-Thy нa «полых волокнах» в аппарате АР-1-15ПС, уменьшая объем до 0,5 л концентрата белка. Хроматографическая очистка белка TNF-Thy на Sephadex G-100

Наносят в колонну ПСК 200/1000 с 28,3 л SephadexG-100 500 мл концентрата белка TNF-Thyu проводят элюцию с помощью буфера для гель-фильтрации 20 мМ Трис⋅HCl, 150 мМ NaCl, 9 М мочевина, рН 7,2 со скоростью 3,0 мл/мин.

В собранных фракциях определяют спектрофотометрически А₂₈₀, А₂₆₀. Наличие TNF-Thy подтверждают с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН).

Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН более 90% TNF-Thy, объединяют.

В объединенной фракции высокоочищенного препарата TNF-Thy определяют спектрофотометрически: А₂₈₀, А₂₆₀, белок. Чистоту препарата TNF-Thy определяют по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН, а также по данным ВЭЖХ в колонке с силикагелем C₁₈. Объединенную фракцию, содержащую TNF-Thyc чистотой больше 90%, передают на стадию ренатурации.

Ренатурация белка TNF-Thy

Для проведения ренатурации используют стеклянный реактор фирмы Simax с перемешивающим устройством и системой охлаждения. В очищенный реактор загружают 90 л фосфатного буфера с хлористым натрием с рН (7,3±0,1) и охлаждают до плюс (12±1)°С. Через фильтр с порами 0,22 мкм внутрь реактора с охлажденным буфером подают со скоростью (50±5) мл/мин 2 л раствора очищенного белка TNF-Thy. После внесения всего раствора белка проводят инкубацию при работающей мешалке. В процессе ренатурации с помощью системы охлаждения поддерживают температуру раствора (12±1)°С. Длительность процесса (18±1) часов.

Хроматографическая очистка ренатурированного гибридного белка TNF-Thy на сорбенте DEAE Sepharose Fast Flow

Используют колонку с DEAESepharoseFastFlow объемом 2 л. Уравновешивают 20 мМ фосфатным буфером, рН 7,3. Затем наносят раствор белка, полученного на стадии ренатурации в фосфатном буфере и промывают уравновешивающим буфером. Через колонну с сорбентом последовательно пропускают 20 мМ фосфатный буфер, 80 мМ NaCl, рН 7,3и 20 мМ фосфатный буфер, 300 мМ NaCl, рН 7,3.

Все элюируемые белки собирают фракциями объемом по 0,4 л и анализируют с помощью электрофореза в 17,5% ПААГ-ДСН. Фракции, содержащие по данным электрофореза в 17,5% ПААГ с ДСН не более 95% TNF-Thy, объединяют. После объединения раствор TNF-Thy передают на стерилизующую фильтрации и контролируют параметры (белок, э/ф, ВЭЖХ).Также отбирают пробу на определение биологической активности.

Полученный раствор TNF-Thy хранят при минус (20±2)°С.

Определение активности проводят как описано в Примере 3.

Получают гибридный белок с чистотой 97% и удельной биологической активностью не менее 2,0×10^бЕДна 1 мг белка.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генной инженерии, и касается нового штамма бактерий Escherichia coli BL21/PET32a-TNF-THY, который может быть использован для получения гибридного белка альфа-фактор некроза опухолей - тимозин альфа 1 (TNF-Thy), применяемого в медицинской промышленности. Рекомбинантная плазмида pET32a-TNF-Thy - размером 5929 пар оснований (п.о.), обеспечивает синтез белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 размером 20,5 кДа, и содержит структурные элементы: промотор Т7 и оператор 1асО, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ориджин репликации бактериофага f1 (f1 ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (Laclpromoter). Изобретение позволяет повысить эффективность получения белка TNF-Thy, а именно увеличение выхода гибридного белка TNF-Thy из биомассы штамма с чистотой не менее 97% за счет создания рекомбинантного штамма Escherichia coli - продуцента гибридного белка TNF-Thy, полученного на основе сконструированной рекомбинантной плазмиды, что обеспечивает повышенный выход гибридного белка TNF-Thy за счет увеличения количества получаемой в ходе культивирования биомассы в 10 раз при сохранении содержания общего белка и доли гибридного белка TNF-Thy в общем белке клетки. 3 н. и 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 6 пр.

1. Рекомбинантная плазмида pET32a-TNF-Thy - размером 5929 пар оснований (п.о.), обеспечивающая синтез белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 размером 20,5 кДа, и содержащая структурные элементы: промотор Т7 и оператор 1асО, синтетическую нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, кодирующую гибридный белок TNF-Thy, ген устойчивости к антибиотику ампициллину (AmpR) и бактериальный промотор гена устойчивости к ампициллину (AmpR промотор) для проведения отбора рекомбинантных клеток, ориджин репликации бактериофага f1 (f1 ori), ген лактозного репрессора LacI и бактериальный промотор гена лактозного репрессора (Laclpromoter).

2. Штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy - продуцент гибридного белка TNF-Thy, полученный трансформацией родительского штамма Е. coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидой pET32a-TNF-Thy по п. 1.

3. Способ получения гибридного белка TNF-Thy, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, включающий культивирование штамма - продуцента Escherichia coli BL21(DE3)/pET32a-TNF-Thy, при этом после 3-5 часов культивирования проводят индукцию биосинтеза рекомбинантного белка клетками Escherichia coli BL21 (DE3)/pET32a-TNF-Thy и выдерживают 4-6 часов с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего гибридный белок TNF-Thy, выделение из полученной биомассы клеток штамма-продуцента гибридного белка TNF-Thy, последующую очистку выделенного гибридного белка TNF-Thy путем анионообменной и гель-проникающей хроматографии в денатурирующих условиях, ренатурацию гибридного белка TNF-Thy путем разбавления мочевинного раствора и очистку ренатурированного гибридного белка TNF-Thy анионообменной хроматографией с получением гибридного белка с чистотой не менее 97%.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что культивирование клеток Escherichia coli BL21 (DE3)/рЕТ32а-TNF-Thy проводят в ростовой среде на протяжении по меньшей мере 7 часов, но не более 10 часов.

5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что индукцию биосинтеза осуществляют изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом.

6. Способ по п. 3, отличающийся тем, что выделение гибридного белка TNF-Thy осуществляют путем отделения клеток от культуральной жидкости, дезинтеграции клеток, выделения тел включений из полученного дезинтеграта и солюбилизации тел включений.

7. Способ п. 3, отличающийся тем, что очистку гибридного белка TNF-Thy осуществляют с использованием анионообменной и гель-проникающей хроматографии при концентрации мочевины 7-9 М, рН 7,2-8,5.

8. Способ по п. 3, отличающийся тем, что разбавление мочевинного раствора осуществляют до концентрации мочевины не более 0,4 М.