РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PTHY 315, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК α -ФАКТОР НЕКРОЗА ОПУХОЛИ -ТИМОЗИН a Российский патент 1997 года по МПК C12N15/28 

Предполагаемое изобретение относится к биотехнологии и представляет собой сконструированную in vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую ген, кодирующий синтез гибридного белка, α-фактор некроза опухолей-тимозин-a₁ (ФНО-Т).

Известна рекомбинантная плазмидная ДНК pThy 314 авторов В.Г.Коробко, Е. Ф. Болдыревой, С. А.Филиппова, В.Н.Добрынина, О.А.Амосовой (Институт биоорганической химии им. М. М.Шемякина АН СССР, а.с. N1707078, кл.C12N 15/12, 1992). Указанная плазмида кодирует синтез гибридного белка ФНО-Т, а также белки устойчивости к антибиотикам лактамазу и хлорамфениколацетилтрансферазу. Гибридный белок ФНО-Т получают культивированием штамма E.coli SG 20050 (pThy 314) (Всесоюзная коллекция промышленных микроорганизмов, ВНИИ генетика) и используют для выщепления пептида, аналогичного тимозину α₁, бромциановым гидролизом. Недостатками использования плазмиды pThy 314 и штамма SG 20050 (pThy 314) являются: наличие в цитоплазме клеток наряду с гибридным белком ФНО-Т в равном количестве белка лорамфениколацетилтрансферазы (фиг. 2), что существенно затрудняет процесс очистки гибридного белка.

Задачей изобретения является: получение рекомбинантной плазмидной ДНК pThy 315, кодирующей синтез гибридного белка ФНО-Т, являющегося мажорным белком. Указанная задача решается за счет делеции участка между Hind III и xba I-сайтами плазмиды pThy 314. При этом удаляется вся последовательность гена хлораммфениколацетилтрансферазы, а терминатор транскрипции, находящийся между xba I сайтами, приближается к концу гена гибридного белка. Указанные изменения приводят к получению плазмиды pThy 315, имеющей молекулярную массу 2,1 МДа (3,23 т.п.н.), кодирующей гибридный белок α-фактор некроза опухолей-тимозин-a₁ с молекулярной массой 20,46 КДа и состоящей из:
фрагмента ДНК размером 3,23 т.п.н. плазмиды pThy 314, содержащего тандем ранних промоторов А2 и А3 бактериофага Т7, участок связывания рибосом, ген гибридного белка α-фактор некроза опухолей-тимозин-a₁, терминатор транскрипции фага;
генетического маркера селекции, гена β-лактамазы, придающего устойчивость к антибиотику ампициллину клетками Escherichia coli, трансформированным плазмидой pThy 315;
уникальных сайтов узнавания эндонуклеазами рестрикции, расположенных на расстоянии в т. п.н. EcoRI 0 и 0,11, BgIII 0,78, ClaI 0,27 и 0,73, Eco 47111 0,66, Eco 911 0,65, KpnI 0,25, Pst I 2,48, XbaI 0,83 и 0,93.

Предлагаемая плазмида обеспечивает увеличение синтеза гибридного белка на 50% Он является единственным мажорным белком клеток, содержащих плазмиду pThy 315.

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами.

Фиг. 1 схема получения рекомбинантной плазмидной ДНК pThy 315.

Фиг. 2 электрофореграмма в 15% ПААГ-ДСН лизатов клеток 20050, содержащих плазмиды: 1 pThy 314, 2 pThy 315, 3 маркеры молекулярных масс белков.

Пример 1.

Получение рекомбинантной плазмидной ДНК pThy 315.

Плазмидную ДНК pThy 314 в количестве 10 мкг растворяют в 100 мкл буфера, содержащего 50 Мм NaCl, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5 и 3 Мм b-меркаптоэтанола. Добавляют 10 ед. активности рестриктазы HindIII и 5 ед. XbaI, инкубируют при 37^oC в течение часа. После инкубации реакцию останавливают прогреванием при 70^oC в течение 10 мин. В реакционную смесь добавляют по 1 мкл растворов dАTP, dТТР, dGTP, dСТР с концентрацией 10 мМ и 5 ед. активности фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coli. Инкубируют 1 ч при 20^oC, после чего экстрагируют 200 мкл смеси равных объемов фенола и хлороформа. ДНК осаждают, добавляя 1 мкл 5 М NaCl и 250 мкл 96% этанола. После инкубации при -20^oC в течение часа и центрифугирования 10 мин при 8000 g спирт сливают. ДНК высушивают под вакуумом и растворяют в 200 мкл буфера, содержащего 66 мМ трис-HCl, рН 7,5, 5 мМ MgCl₂, 1 мМ АТФ и 5 мМ дитиотрейтола. Добавляют 10 ед. активности Т4 ДНК-лигазы и инкубируют 18 ч при 15^oC. 25 мкл этой смеси используют для трансформации компетентных клеток по следующей методике. Выращивают ночную культуру штамма НВ1010 в 5 мл бульона, содержащего 0,5% триптона, 1% дрожжевого экстракта, 1% NaCl рН 7,2 (LB), при температуре 37^oC. Разводят культуру свежим LB в 50 -100 раз и растят на качалке при температуре 37^oC до оптической плотности при 590 нм, равной 0,3. Переносят 100 мл культуры в стерильную центрифужную пробирку и осаждают клетки при 3000 g в течение 10 мин и температуре 4^oC. Супернатант сливают, клетки суспендируют в 50 мл 0,1 М кальция хлористого, охлажденного на льду. Инкубируют 20 мин на льду. Повторно осаждают в 3 мл 0,1 М кальция хлористого, осажденного на льду. Переносят 0,2 мл компетентных клеток в пробирку и добавляют плазмидную ДНК. Инкубируют на льду 1 ч, затем 5 мин при температуре 42^oC. Добавляют 2 3 мл теплого (37^oC) LB без антибиотика и инкубируют при температуре 37^oC 1 1,5 ч. Высевают по 0,1 мл на чашки Петри с L-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина, и инкубируют при 37^oC в течение ночи. Выросшие колонии перекладывают на чашки Петри, одну с ампициллином, другую с хлорамфениколом. Отбирают колонии, устойчивые к ампициллину и чувствительные к хлорамфениколу, засевают в 5 мл LB, содержащего 50 мкг/мл ампициллина, и выращивают при 37^oC. Осаждают клетки центрифугированием 5 мин при частоте вращения 6000 об/мин. Осадок суспендируют в 350 мкл мМ трис-HCl рН 7,5 с 0,1 М натрия хлористого. Добавляют по 0,3 мл фенола и хлороформа, перемешивают, центрифугируют 5 мин при частоте вращения 6000 об/мин. Переносят верхнюю фазу, добавляют 0,2 мл 5 М ацетата аммония и 1 мл 96% этанола, перемешивают, инкубируют 20 30 мин при температуре 4^oC. Центрифугируют 5 мин при частоте вращения 8000 об/мин. Спирт сливают, осадок высушивают под вакуумом, растворяют в 150 мкл 10 мМ трис-HCl рН 7,5. Добавляют 1 мкл РНК-азы (1 мг/мл), прогревают 10 мин при температуре 70 -75^oC. Анализируют 15 мкл электрофорезом в 0,7% агарозе. Полученные таким образом плазмидные ДНК анализируют с помощью рестриктаз Hind III, XbaI, EcoRI, BgIII при раздельном или совместном гидролизе в условиях, как указано выше. Отбирают варианты плазмидной ДНК, утратившие один EcoRI и Hind III сайты и фрагмент размером 0,75 т.п.н. расположенный между BgIII и XbaI сайтами, при этом должны быть сохранены оба XbaI сайта. Нуклеотидную последовательность области делеции между Clal и XbaI сайтами проверяют по методу Сенгера. Схема конструирования плазмиды pThy 315, ее рестрикционная карта и нуклеотидная последовательность в области делеции показаны на фиг. 1. Полученную указанным способом плазмидную ДНК pThy 315 и ДНК плазмиды pThy 314 трансформируют в клетки штамма E.coli SG 20050. Трансформированные клетки засевают в бульон, содержащий 50 мкг/мл ампициллина, и культивируют при 37^oС в течение 18 - 20 ч. Выращенные клетки анализируют на наличие гибридного белка в 15% ПААГ-ДСН. Спектр и количество синтезируемых белков показаны на фиг. 2.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: предложена рекомбинантная плазмида pThy 315, предназначенная для получения в бактериальных клетках гибридного белка "α фактор некроза опухоли-тимозин a₁", имеющая мол. массу 2,IМДа и содержащая фрагмент плазмиды pThy 314 размером 3,23 m.n.н. с тандемом ранних промоторов А2 и А3 бактериофага TZ, участком связывания рибосом, геном названного гибридного белка и терминатором транскрипции фага S, ген β-лактамазы в качестве генетического маркера и уникальные сайты рестрикции в следующих положениях (т.п.н.): Eco RI - 0 и 0,11; Bgl III - 0,78; Cla I - 0,27 и 0,73; Eco 47111 - 0,66; Eco 911 - 0,65; KpnI - 0,25; pst - 2,48 и XbaI - 0,83 и 0,93. 2 ил.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pThy 315, кодирующая гибридный белок α-фактор некроза опухоли тимозин a₁ размером 3,23 т.п.н. имеющая мол.м. 2,1 МДа и содержащая фрагмент ДНК плазмиды pThy 314 размером 3,23 т.п.н. с тандемом ранних промоторов А2 и А3 бактериофага Т7, участком связывания рибосом, геном гибридного белка α-фактор некроза опухоли тимозин a₁ и терминатором транскрипции фага λ;-генетический маркер ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции на расстоянии (в т.п.н.): EcoRI 0 или 0,11, BglIII 0,78, ClaI 0,27 и 0,73, Eco 47111 0,66, Eco 911 0,65, KpnI 0,25, PstI 2,48, XbaI 0,83 и 0,93.