Способ диагностики полиморфизма g.114437192-114439942del гена SLAC4A2, обуславливающего летальный генетический дефект остеопетроза крупного рогатого скота Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к молекулярной генетике, а именно к способам определения полиморфизма гена SLC4A2, обуславливающего летальный рецессивный генетический дефект остеопетроза (OS), проявляющегося у крупного рогатого скота абердин-ангусской, герефордской, голштинской, фризской и симментальской пород [https://omia.org/OMIA000755/9913/], и может быть использовано в селекции крупного рогатого скота.

Одним из направлений Федеральной научно-технической программы развития сельского хозяйства на 2017-2025 годы является создание и внедрение отечественных конкурентоспособных технологий по направлениям контроля качества сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия, и экспертизы генетического материала, в результате чего ожидается снижение уровня импортозависимости не менее чем на 50 процентов [Постановление правительства Российской Федерации от 25 августа 2017 г. №996].

Одной из проблем современного скотоводства является проявление у животных генетических дефектов, что приводит к появлению мертворожденных или нежизнеспособных телят, нанося тем самым, огромный экономический ущерб [Gholap P.N., Kale D.S. and Sirothia A.R. Genetic Diseases in Cattle: A Review. Research Journal of Animal, Veterinary and Fishery Sciences. 2014; 2(2): 24-33]. В связи с этим, разработка средств диагностики с целью дальнейшей профилактики врожденных аномалий является актуальным и своевременным.

Одним из летальных генетических дефектов крупного рогатого скота является остеопетроз (Osteopetrosis, OS, мраморная болезнь костей). Летальный гаплотип был картирован на хромосоме 4 [OMIA, Online Mendelian Inheritance in Animals // URL: https://omia.org/OMIA000755/9913/ (дата обращения 19.02.2019)].

Причиной OS является делеция g.114437192_114439942del (2784 п.о.), охватывающая полностью экзон 2 и почти половину экзона 3 гена SLC4A2 [Meyers et al., 2010].

Телята, гомозиготные по мутантному аллелю, обычно рождаются мертворожденными раньше срока (на 250-275 день стельности). Они часто имеют небольшой размер тела, плоский череп, плотно сжатые коренные зубы, укороченную нижнюю челюсть, выступающий язык; длинные кости очень хрупкие и легко ломаются, так как не содержат костномозговых полостей, при гистологическом исследовании имеют вид мрамора (отсюда второе название дефекта «мраморная болезнь») [Meyers et al., 2010; McClure M., McClure J., 2016].

Анализ коров и быков, зарегистрированных в Американской ассоциации абердин-ангусской породы, проведенный по данным 2008-2017 гг., показал, что 1,7% животных являлись носителями остеопетроза [Konovalova E.N., Gladyr` Е.А., Kostiunina O.V., Zinovieva N.A. Congenital defects of beef cattle breeds and general principles of their prevention. Veterinariya, Zootekhniya i Biotekhnologiya, 2017, p. 49].

Известен способ диагностики полиморфизма в гене SLC4A2, ассоциированного с OS, и взятый в качестве прототипа, заключающийся в том, что выделенная из биоматериала животных (кожа, кровь, сперма, молоко и пр.) ДНК исследуется методом аллель-специфичной ПЦР с использованием трех олигонуклеотидных праймеров: одного прямого и двух обратных, имеющих длину 21 нуклеотид, температуру плавления 64°С и содержание гуанина-цитозина 52,4%. При этом у животных-носителей порока выявляется два фрагмента ДНК: 475 п.о., соответствующий здоровому аллелю, и 330 п.о., соответствующий мутантному аллелю [Meyers et al., 2010].

Данный способ является высокоспецифичным и позволяет выявлять животных-носителей остеопетроза независимо от пола и возраста, однако, его недостатками является длина олигонуклеотидных праймеров, превышающая 20 п.н., и относительно низкое содержание в праймерах гуанина-цитозина.

При создании настоящего изобретения задача состояла в разработке отечественного способа обнаружения дефектного аллеля гена SLC4A2, ассоциированного с гаплотипом OSC, с целью идентификации скрытых носителей OS и разработки программ их использования в селекции без риска получения нежизнеспособных телят.

Задача нашего изобретения - создание простого, не требующего использования дорогостоящего оборудования, специфичного способа идентификации полиморфизма g.114437192_114439942del в гене SLC4A2, ассоциированного с гаплотипом OSC, для использования в селекции крупного рогатого скота.

Технический результат изобретения достигается тем, что предложен способ диагностики полиморфизма g.114437192_114439942del гена SLC4A2, обуславливающего летальный генетический дефект остеопетроза крупного рогатого скота абердин-ангусской, герефордской, фризской, голштинской и симментальской пород, включающий анализ выделенной из биоматериала животных (кожа, кровь, сперма, молоко и пр.) ДНК методом аллель-специфичной ПЦР с использованием трех праймеров: одного прямого и двух обратных с последующим электрофорезом в агарозном геле, отличающийся тем, что для амплификации искомых фрагментов ДНК используют олигонуклеотидные праймеры длиной 20 пар нуклеотидов с температурой плавления 62°С и содержанием гуанина-цитозина 55%, и амплифицированные фрагменты ДНК длиной 532 п.о. для здорового аллеля и 229 п.о. - для мутантного.

Данный подход имеет следующие преимущества: 1) использование олигонуклеотидных праймеров меньшей длины снижает себестоимость анализа; 2) более высокое содержание гуанина-цитозина в праймерах делает их более термостабильными, что снижает риск образования в ходе ПЦР праймер-димеров или других вторичных структур; 3) разница в длине между нормальным и мутантным аллелем составляет 303 п.о., что очень четко визуализируется на электрофореграмме и облегчает интерпретацию результатов.

Принцип действия разрабатываемого способа основан на использовании двух обратных праймеров, специфичных для здорового и дефектного аллеля и одного общего прямого праймера. При этом мутантному аллелю, ассоциированному с OSC, соответствует фрагмент длиной 229 п.о., а нормальному (не мутантному аллелю) - фрагмент длиной 532 п.о., что позволяет дифференцировать мутантный и нормальный аллели полиморфизма g.114437192_114439942del гена SLC4A2 методом электрофореза в агарозном геле.

Разрабатываемый способ базируется на определении делеции, охватывающей экзон 2 и около половины экзона 3 гена SLC4A2, размером 2781 п.о. С этой целью был выбран участок гена SLC4A2 крупного рогатого скота внутри делеции и за ее пределами.

Для создания серии референтных образцов с известными генотипами по SLC4A2 (n=79) были использованы образцы ткани (ушной выщип) быков и коров абердин-ангусской породы. ДНК выделяли при помощи набора реагентов «ДНК-Экстран-1» (ЗАО «Синтол», Россия) согласно инструкции. Создание серии референтных генотипов проводили посредством использования способа-прототипа. С этой целью проводили амплификацию фрагментов длиной 330 п.о., характерного для мутантного аллеля, и 475 п.о., характерного для здорового аллеля.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - теоретическая модель тест-системы определения гаплотипа OSC на основе метода ПЦР (А) и результаты генотипирования образцов (Б).

В результате проведенного генотипирования была создана серия референтных образцов (n=79), в том числе 1 образец с генотипом OSC (носитель OS) и 78 образцов с генотипом OSF (не носитель).

Определение полиморфизма g.114437192_114439942del гена SLC4A2 предложенным способом выполняли следующим образом:

1. Исходя из локализации делеции были подобраны два обратных специфичных для амплификации здорового и дефектного аллеля праймера (OSRn, OSRm) и одного общего прямого праймера (OSF):

Продукт амплификации праймеров OSF и OSRn характерен для «здорового» аллеля и имеет длину 532 п.о., продукт амплификации праймеров OSF и OSRm характерен для «мутантного» аллеля и имеет длину 229 п.о. Участок делеции помечен звездочками. Фиг. 1А иллюстрирует описанный выше вариант настоящего изобретения.

2. Выполняли 37 циклов ПЦР в 10 мкл реакционной смеси следующего состава: 1хПЦР буфер (16.6 мМ (NH₄)₂SO₄, 67.7 мМ Трис-HCl, рН=8.8, 0.1% (v/v) Tween 20, 1.5 мМ MgCl₂), 0,2 мМ дНТФ, 10 пмол каждого из праймеров, 1 Ед Taq-полимеразы и 1 мкл ДНК при следующем температурно-временном режиме: начальная денатурация при 95°С - 3 мин, 35 циклов последовательно - 95°С - 0,75 мин, 60,0°С - 0,5 мин, 72°С - 0,5 мин, заключительная элонгация при 72°С - 7 мин;

3. Определение аллелей OSC и OSF гена SLC4A2 осуществляли методом гель-электрофореза, нанося по 5 мкл амплификата в 3% агарозный гель, электрофоретически разделяли в 1x ТАЕ буфере 25 мин при 110 В и детектировали под ультрафиолетовым светом (УФ). При этом генотипу OSF (не носителю OS) соответствует фрагмент длиной 532 п.о., генотипу АМС (носителю OS) - два фрагмента длиной 532 и 229 п.о. и генотипу OSA (летальный, может быть выявлен только среди плодов или новорожденных телят) - фрагмент длиной 229 п.о. (Фиг. 1Б). Длины фрагментов сравнивали в сопоставлении с K- - отрицательный контроль ПЦР и М - маркером длины 100 п.о. (500×2), Биосан, Россия;

4. Результативность разработанной тест-системы оценивали посредством сравнения результатов генотипирования референтных образцов.

Пример. Контрольное использование предложенного способа определения полиморфизма g.114437192_114439942del гена SLC4A2 было апробировано на выборке племенного поголовья крупного рогатого скота абердин-ангусской (n=424, три популяции), герефордской (n=49, одна популяция), голштинской (n=63, одна популяция) и симментальской (n=52, одна популяция) пород. Исследование выявило наличие 3 животных с генотипом OSC (носители OS) в одной из популяций абердин-ангусской породы. Таким образом, разработанный способ может быть использован для выявления животных, являющихся скрытыми носителями делеции в гене SLC4A2, ассоциированной с гаплотипом OSC.

Положительный результат изобретения заключается в том, что с применением технически простых методов, не требующих использования дорогостоящих реактивов, оборудования, больших затрат сил и времени, возможно выявление мутантного аллеля OSC гена SLC4A2, что позволит применить данный метод в селекции животных.

Предложенный способ применим в генетике сельскохозяйственных животных для выявления полиморфизма g.114437192_114439942del в гене SLC4A2 крупного рогатого скота, ассоциированного с гаплотипом OSC, с целью последующего использования полученных результатов в разведении и селекции крупного рогатого скота в племенных и товарных хозяйствах отрасли мясного скотоводства.

Изобретение относится к молекулярной генетике, в частности к способам определения полиморфизма генов, ассоциированных с летальными рецессивными генетическими дефектами крупного рогатого скота. Предложен способ диагностики полиморфизма g.114437192_114439942del гена SLC4A2, обуславливающего летальный генетический дефект остеопетроза крупного рогатого скота абердин-ангусской, герефордской, голштинской, фризской и симментальской пород. Способ включает анализ выделенной из биоматериала животных, а именно кожи, крови, спермы, молока и пр., ДНК методом аллель-специфичной ПЦР с использованием трех праймеров: одного прямого и двух обратных с последующим электрофорезом в агарозном геле. Для амплификации искомых фрагментов ДНК используют олигонуклеотидные праймеры длиной 20 пар нуклеотидов с температурой плавления 62°С и содержанием гуанина-цитозина 55% и амплифицированные фрагменты ДНК длиной 532 п. о. для здорового аллеля и 229 п. о. для мутантного. Изобретение позволяет выявить полиморфизм g.114437192_114439942del в гене SLC4A2 крупного рогатого скота, ассоциированного с гаплотипом носителя генетического дефекта остеопетроза (OS), что позволяет затем использовать полученные результаты в разведении и селекции крупного рогатого скота в племенных и товарных хозяйствах отрасли мясного скотоводства. 1 ил., 1 пр.

Способ диагностики полиморфизма g.114437192_114439942del гена SLC4A2, обуславливающего летальный генетический дефект остеопетроза крупного рогатого скота, проявляющегося у животных абердин-ангусской, герефордской, голштинской, фризской и симментальской пород, включающий анализ ДНК методом аллель-специфичной ПЦР с использованием трех праймеров: одного прямого и двух обратных с последующим электрофорезом в агарозном геле, отличающийся тем, что для амплификации искомых фрагментов ДНК используют олигонуклеотидные праймеры длиной 20 пар нуклеотидов с температурой плавления 62°С и содержанием гуанина-цитозина 55%: прямой праймер OSF 5'-AGC ССС ТАС AGT САС AGT СА; обратные праймеры: OSRn 5'- AGC AGC AGA GAT CAG CTT GG и OSRm 5' - CCG ACC ССС TCA CAT TCA AA; и амплифицированные фрагменты ДНК длиной 532 п. о. для здорового аллеля и 229 п. о. - для мутантного.