Способ использования бинарной системы, состоящей из агентов различной природы, для разработки нового класса антибактериальных препаратов Российский патент 2023 года по МПК C12N15/63 C07K14/00 A61K38/12 A61P31/04 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[001] Настоящее изобретение относится к областям биохимии, молекулярной биологии и медицины. Более конкретно, в настоящем изобретении также предложены способы получения и применение бинарных систем ингибирования транскрипции. Новые способы ингибирования транскрипции согласно настоящему изобретению можно применять в медицине, в частности, для устранения бактериальных и вирусных патогенов, а также, например, в биотехнологии.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[002] Применение антибиотиков представляет собой основной подход для устранения инфекций. Широкое применение антибиотиков в свою очередь приводит к появлению и распространению множественной лекарственной устойчивости у болезнетворных грамположительных (G+) (например, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Mycobacteriaceae spp и Streptococcus pneumoniae) и грамотрицательных (G-) патогенных бактерий (например, Escherichia coli/, Enterobacter spp., Salmonella spp., Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa), а также патогенных грибов, например Candida spp. Соответственно, в связи возникновением устойчивости к антибиотикам у существующих патогенов и с обнаружением новых патогенов существует потребность в разработке новых классов противомикробных, в частности, антибактериальных и противовирусных, препаратов с новыми механизмами действия для дополнения и замещения имеющихся в настоящее время средств. Кроме того, существует потребность в оптимизации действия известных препаратов в отношении увеличения их эффективности и уменьшения нежелательного побочного действия.

[003] РНК полимераза является перспективной мишенью для ингибирования в целях контроля и устранения нежелательных патогенов. Известно несколько классов агентов, которые способны ингибировать действие бактериальной РНК полимеразы, включая вещества природного происхождения и синтезированные молекулы, которые способны связываться с РНК полимеразой и ингибировать различные стадии процесса транскрипции. Многие из указанных агентов также демонстрируют ингибирующее действие на РНК полимеразы вирусов и грибов. Новые подходы к ингибированию транскрипции можно также адаптировать для получения новых и увеличения эффективности существующих антибактериальных и противовирусных средств, а также для применения в области биотехнологии и медицине.

[004] Задачей настоящего изобретения является удовлетворения потребности в новых подходах к ингибированию активности РНК полимераз и преодоление по меньшей мере одного из недостатков предшествующего уровня техники.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[005] В настоящей заявке предложены новые подходы для ингибирования РНК полимеразы. Указанные подходы можно применять для ингибирования транскрипции в бактериях, эукариотах и ингибирования активности РНК полимераз, которые используют вирусы.

[006] Настоящее изобретение, в целом, основано на том, что ингибирующее действие соединения, которое связывается с РНК полимеразой, на транскрипцию проявляется или усиливается при увеличении количества или активности фактора элонгации (транскрипционного фактора), который используется указанной РНК полимеразой (РНКП).

[007] Соответственно, настоящее изобретения, относится к применению средств, которые увеличивают экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП для усиления или обеспечения ингибирования транскрипции соединением, которое способно связываться с РНКП.

[008] В настоящей заявке также предложены способы получения препаратов, которые могут представлять собой композиции и комбинации для ингибирования РНКП.

[009] Согласно одному из вариантов реализации способ согласно настоящему изобретению включает обеспечение соединения, которое способно связываться с РНКП; обеспечение средства, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации указанной РНКП; приведение в контакт эффективного количества указанного соединения и эффективного количества указанного средства с РНКП или клеткой, в которой присутствует РНКП, в условиях, которые позволяют связывание указанного соединения с РНКП и увеличение экспрессии и/или активности фактора элонгации указанной РНКП под действием указанного средства, и определение влияния, которое комбинация указанных соединения и средства оказывает на активность РНКП, причем комбинацию выбирают в качестве средства для ингибирования транскрипции, если влияние комбинации на активность является отрицательным (ингибирующим) и более сильным (выраженным), чем влияние только указанного соединения на активность указанной РНКП.

[0010] Согласно одному из вариантов реализации согласно настоящему изобретению обеспечивают ингибирование стадии элонгации транскрипции.

[0011] Согласно некоторым вариантам реализации указанное средство представляет собой агент или воздействие.

[0012] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения РНКП представляет собой бактериальную РНКП (бРНКП), факторы элонгации представляют собой факторы элонгации бРНКП, а предложенные в соответствии с настоящим изобретением комбинации обладают антибактериальным действием, например, отрицательно влияют на рост и/или жизнеспособность указанной бактерии.

[0013] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения РНКП представляет собой РНКП вируса (вРНКП), факторы элонгации представляют собой факторы элонгации, используемые вРНКП, например, белки вируса или эукариотической клетки, а предложенные в соответствии с настоящим изобретением комбинации обладают противовирусным действием.

[0014] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения РНКП представляет собой РНКП гриба (гРНКП), факторы элонгации представляют собой факторы элонгации гРНКП, а предложенные в соответствии с настоящим изобретением комбинации обладают антимикотическим действием, например, отрицательно влияют на рост и/или жизнеспособность указанного гриба.

[0015] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения указанные комбинации получают в виде препаратов, например, фармацевтических композиций, которые также содержат фармацевтически приемлемые носители и наполнители. Примеры носителей известны в данной области техники и описаны в настоящей заявке. В некоторых примерах реализации настоящего изобретения препарат или фармацевтическая композиция адаптированы для доставки композиции субъекту в область присутствия нежелательного микроорганизма (область инфекции), например, в определенный орган, ткань, область организма, оболочку, область повреждения, рану.

[0016] Также в настоящей заявке предложены способы скрининга для поиска новых средств для ингибирования РНК полимеразы и/или транскрипции. Указанные способы включают определение ингибирующего действия множества веществ, например, малых молекул, (поли)пептидов, нуклеотидов, обладающих способностью связываться с РНКП, когда ингибирующее действие указанных веществ определяют в комбинации с воздействием в эффективном количестве средства, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации (транскрипционного фактора) указанной РНКП в соответствии с настоящим изобретением. Те вещества из указанного множества веществ, ингибирующее действие которых проявляется или усиливается при увеличении экспрессии и/или активности фактора элонгации РНКП, применяют в качестве ингибиторов РНКП в комбинации с указанным средством.

[0017] В соответствии с одним из вариантов реализации настоящего изобретения предложены также способы скрининга для поиска новых антибактериальных средств. Эти способы включают определение антибактериального действия множества веществ, например, малых молекул, (поли)пептидов, нуклеотидов, обладающих способностью связываться с бРНКП, когда ингибирующее действие указанных веществ определяют в комбинации со средством, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации бРНКП (бактериального транскрипционного фактора) в соответствии с настоящим изобретением. Те вещества из указанного множества веществ, антибактериальное действие которых появляется или усиливается при увеличении экспрессии и/или активности фактора элонгации бРНКП, применяют в качестве антибактериальных препаратов (агентов) в комбинации с указанным средством.

[0018] В соответствии с одним из вариантов реализации настоящего изобретения предложены также способы скрининга для поиска новых противовирусных средств. Эти способы включают определение противовирусного действия множества веществ, например, малых молекул, (поли)пептидов, нуклеотидов, обладающих способностью связываться с вРНКП, когда ингибирующее действие указанных веществ определяют в комбинации со средством, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации вРНКП (например транскрипционного фактора эукариот) в соответствии с настоящим изобретением. Те вещества из указанного множества веществ, ингибирующее действие которых на вРНКП появляется или усиливается при увеличении экспрессии и/или активности фактора элонгации вРНКП, применяют в качестве противовирусных препаратов (агентов) в комбинации с указанным средством.

[0019] В некоторых своих аспектах настоящее изобретение раскрывает подходы к определению факторов элонгации бРНКП, а также их аналогов, гомологов, мутантов и вариантов, активность которых в комбинации с соединением, которое способно связываться с бРНКП обеспечивает или усиливает антибактериальное действие указанного соединения и/или такой комбинации. В других вариантах осуществления настоящее изобретение раскрывает подходы к определению факторов элонгации вРНКП, а также их аналогов, гомологов, мутантов и вариантов, активность которых в комбинации с соединением, которое способно связываться с вРНКП обеспечивают противовирусное действие такой комбинации.

[0020] Настоящее изобретение также обеспечивает средства ингибирования транскрипции, действие которых включает усиление или проявление ингибирующего действия соединения, которое связывается с РНК полимеразой, на транскрипцию при увеличении количества или активности фактора элонгации (транскрипционного фактора), который используется указанной РНК полимеразой (РНКП), в том числе средства, которые получены с применением способов согласно настоящему изобретению.

[0021] Подходы к ингибированию действия РНКП, лежащие в основе настоящего изобретения, имеют множество приложений, включая устранение нежелательных патогенов, включая бактерии, грибы и вирусы, а также ингибирование их развития, контроль систем экспрессии в биотехнологии, а также модуляция транскрипции и синтеза РНК в эукаритоических системах.

[0022] Все технические и/или научные термины, используемые в настоящем описании, имеют значение, общепринятое специалистами в области техники, к которой относится изобретение. В некоторых случаях используемым терминам даны дополнительные определения, которые также можно использовать при интерпретации сущности настоящего изобретения. Несмотря на то, что при реализации или исследовании вариантов реализации изобретения можно применять способы и материалы, схожие или эквивалентные тем, что описаны в настоящем документе, некоторые типовые способы и/или материалы описаны ниже. В случае противоречий следует учитывать описание настоящей заявки, включая определения. Кроме того, все приведенные в настоящем документе материалы, способы и примеры являются исключительно иллюстративными и не накладывают какие-либо ограничения на изобретательский замысел авторов настоящего изобретения.

[0023] Дополнительные варианты реализации и полный объем применимости настоящего изобретения станут понятными после изучения последующего подробного описания. Тем не менее, следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, хотя в них и указаны предпочтительные варианты реализации изобретения, приведены исключительно для иллюстрации, так как различные изменения и модификации, не выходящие за рамки сущности и объема изобретения, будут очевидны специалистам в данной области техники после ознакомления с описанием настоящей заявки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0024] На Фигуре 1А представлена схема экспериментальной установки и микрофлюидного чипа с пьезоэлементом для эксперимента с применением АСС: 1 - молекула ДНК, 2 - полистироловая микросфера, 3 - референсная микросфера, 4 - AFS-чип, 5 - объектив, 6 - светоделитель, 7 - светодиод, 8 - светочувствительная матрица, 9 - пьезоэлемент, 10 - стекло, 11 - зеркало, 12 - жидкость. На Фигуре 1Б - референсная и свободная микросферы, шкала 5 мкм.

[0025] Фигуре 2А представлена иллюстрация схемы эксперимента. Профили элонгации индивидуальных транскрибирующих комплексов РНКП регистрировали с использованием коммерческой установки AFS (Lumicks B.V., Амстердам). Конец молекулы ДНК, модифицированный дигоксигенином, прикрепляли к покрытой анти-дигоксигенином поверхности AFS-чипа. Гранулу полистирола, покрытую стрептавидином, присоединяли к остановленной РНК-полимеразе, модифицированной биотином. Поддерживали постоянное натяжение с силой 4-6 пН, подавая напряжение на пьезоэлемент. Удлинение РНК под действием РНКП возобновляли путем подачи на AFS-чип буфера, содержащего рибонуклеотиды, и динамику транслокации РНКП регистрировали путем отслеживания положения микросферы в 3D; 1 - молекула ДНК, 2 - полистироловая микросфера, 3 - референсная микросфера, 9 - пьезоэлемент, 10 - стекло, 13 - молекула РНК, 14 - бРНКП; На Фигуре 2Б представлены типичные элонгационные профили одиночных РНКП в отсутствии влияния ингибирующих факторов.

[0026] На Фигуре 3А приведена типичная гистограмма мгновенных скоростей при АСС; на Фигуре 3Б приведена аппроксимация функцией Гаусса распределения скоростей после вычитания шумового сигнала, соответствующее истинному распределению мгновенной скорости.

[0027] На Фигуре 4 показано, что стрептолидигин индуцирует длинные паузы в синтезе РНК: Фиг. 4А. Приведены типичные профили элонгации для индивидуальных транскрибирующих комплексов РНКП в присутствии 1 мМ НТФ в отсутствие (15) и при добавлении (16) 10 мкМ стрептолидигина; Фиг. 4Б. Мгновенная и средняя скорости элонгации для индивидуальных молекул РНКП при 1 мМ НТФ в отсутствие (незаштрихованные) и при добавлении (заштрихованные столбики) 10 мкМ стрептолидигина р-значение: *=≤0,001; n.s.=недостоверно.

[0028] На Фигуре 5 показано, что стрептолидигин влияет на длину промежуточных продуктов, синтезируемых РНКП: Приведены типичные профили элонгации для индивидуальных транскрибирующих комплексов РНКП: Фиг. 5А - профили элонгации в контрольных условиях: 1 мМ НТФ (17),, 200 мкМ ИТФ с 1 мМ НТФ (18), 400 мкМ НТФ (19); Фиг. 5Б - Репрезентативные профили элонгации для индивидуальных РНКП в присутствии 10 мкМ стрептолидигина: 1 мМ НТФ (20), 200 мкМ ИТФ с 1 мМ НТФ (21) 400 мкМ НТФ (22); Фиг. 5В - Мгновенная и средняя скорости элонгации: (23) - 1 мМ НТФ, (24) - 10 мкМ СТЛ, 1 мМ НТФ, (25) - 1 мМ НТФ, 200 мкМ ИТФ, (26) - 10 мкМ СТЛ, 1 мМ НТФ, 200 мкМ ИТФ, (27) - 400 мкМ НТФ, (28) - 10 мкМ СТЛ, 400 мкМ НТФ. Фиг. 5Г - Количество длинных пауз (>20 с) на профиль удлинения (элонгации); Фиг. 5Д. Количество коротких пауз (2,5 с - 20 с) на профиль удлинения (элонгации); для всех случаев р-значение: *=≤0,001; **=≤0,005; ***=≤0,01; ****=≤0,05; n.s.=недостоверно.

[0029] На Фигуре 6 приведены типичные профили элонгации для индивидуальных транскрибирующих комплексов РНКП. Фиг. 6А. профили элонгации в контрольных условиях: отсутствие стрептолидигина: 1 мМ НТФ (29), 1 мМ НТФ в присутствии факторов транскрипции 5 мкМ GreA (30) или 5 мкМ GreB (31); Фиг. 6Б. профили элонгации в присутствии 10 мкМ стрептолидигина: 1 мМ НТФ (32), 1 мМ НТФ + 5 мкМ GreA (33), 1 мМ НТФ + 5 мкМ GreB (34); Фиг. 6В. Мгновенная и средняя скорости элонгации: (35) - 1 мМ НТФ, (36) - 10 мкМ СТЛ, 1 мМ НТФ, (37) - 1 мМ НТФ, 200 мкМ ИТФ, (38) - 10 мкМ СТЛ, 1 мМ НТФ, 200 мкМ ИТФ, (39) - 400 мкМ НТФ, (40) - 10 мкМ СТЛ, 400 мкМ НТФ; Фиг. 6Г. Количество длинных пауз (>20 с) на профиль удлинения (элонгации). Для всех случаев р-значение: *=≤0,001; **=≤0,005; ***=≤0,01; ****=≤0,05; n.s.=недостоверно.

[0030] На Фигуре 7 приведены графики зависимостей оптической плотности от времени для культур клеток бактерий с добавлением 100 мкМ стрептолидигина и индуцированной экспрессией GreB, а также соответствующих контролей: (41) - -полимексин, (42) -+полимексин, (43) - -полимексин, +СТЛ, (44) - +полимексин, +СТЛ, (45) - +полимексин, +GreB, (46) - +полимексин, +GreB, +СТЛ.

[0031] На Фигуре 8 приведены примеры влияния ряда антибиотиков на профили элонгации для индивидуальных транскрибирующих комплексов РНКП. Кривые соответствуют элонгационным профилям при разных концентрациях и типах антимикробных агентов (микроцина J25, клебсидина и ацинетодина) и в отсутствие ингибиторов: (47) - 0 мкМ, (48) - 5 мкМ ацинетодин, (49) - 25 мкМ ацинетодин, (50) - 2.5 мкМ клебсидин, (51) - 2.5 мкМ микроцин J25, (47) - 5 мкМ клебсидин, (47) - 2.5 мкМ микроцин J25.

[0032] На Фигуре 9 показано ингибирование роста клеток под действием клебсидина и ацинетодина: (54) - Контроль арабиноза-, (55) - Ген ацинетодина, арабиноза-, (56) - Ген клебсидина, арабиноза-, (57) - Контроль арабиноза+, (58) - Ген ацинетодина, арабиноза+, (59) - Ген клебсидина, арабиноза+.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0033] Сокращения и аббревиатуры, используемые в настоящей заявке, могут включать:

BD - Бектон Дикинсон (Becton Dickinson)

BSA - бычий сывороточный альбумин

РНКП - ДНК-зависимая РНК полимераза; РНК полимераза

бРНКП - РНК полимераза бактерии

вРНКП - РНК полимераза вируса

гРНКП - РНК полимераза гриба

ФЭТ - фактор элонгации транскрипции

СТЛ - стрептолидигин

НТФ - нуклеотидтрифосфат

CDS - кодирующая последовательность

КОЕ - колониеобразующие единицы

БОЕ - бляшкообразующие единицы

мкМ - микроМоль

мМ - миллиМоль

АСС - акустическая силовая спектроскопия

ПЦР - полимеразная цепная реакция

пН - пиконьютоны

E. coli - Escherichia coli

АТФ, ГТФ, ЦТФ - аденин-5'-, гуанозин-5'-, циотзин-5'-трифосфат

АфУ - аденинфосфоурацил

ИТФ - инозинтрифосфат

ДМСО - диметилсульфоксид

НТФ - нуклеозидтрифосфат

ТП - триггерная петля

ВН-α - спиральный мостик

БСА - бычий сывороточный альбумин

ME - международная единица

NCBI - Национальный центр биотехнологической информации

NIBSC - Национальный институт биологических стандартов и контроля

PBS - фосфатно-солевой буфер

ПЦР - полимеразная цепная реакция

PFA - параформальдегид

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

[0034] Следует отметить, что используемые в настоящей заявке и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа также включают и формы множественного числа, если не указано иное. Таким образом, например, упоминание термина «реагент» включает в себя один или более различных реагентов, а упоминание термина «способ» включает эквивалентные стадии и способы, известные специалистам в данной области техники, которые могут быть изменены или заменены на способы, описанные в настоящей заявке. Равным образом, термин «клетка» включает множество клеток, в том числе их смеси. Аналогичным образом, применение «соединения» «агента», «воздействия» или «средства» для ингибирования, обеспечения или получения указанных в описании результатов в настоящем документе включает применение одного или более соединений, агентов, воздействий или средств согласно настоящему изобретению для обеспечения указанного результата или результатов, если иное явным образом не следует из контекста.

[0035] Если не указано иное, термин «по меньшей мере», предшествующий ряду элементов, следует понимать, как относящийся к каждому элементу в ряду. Специалисты в данной области техники распознают или смогут установить, используя не более чем обычные эксперименты, множество эквивалентов конкретных вариантов реализации изобретения, описанных в настоящей заявке. Такие эквиваленты предназначены для охвата настоящим изобретением.

[0036] Во всем описании и в формуле изобретения, которая следует ниже, подразумевается, что слово «содержать» и такие варианты, как «содержит» и «содержащий», включает указание целого числа или стадии, или группы целых чисел или стадий, но не исключение любого другого целого числа или стадии или группы целых чисел или стадий, если контекст не требует иного. При использовании в настоящей заявке термина «содержащий» может быть заменен термином «состоящий» или иногда при использовании в настоящей заявке термином «имеющий».

[0037] При использовании в настоящей заявке термина «состоящий из» исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не указанный в пункте формулы изобретения. При использовании в настоящей заявке выражения «состоящий по существу из» не исключает материалы или стадии, которые не оказывают существенного влияния на основные и новые характеристики формулы изобретения. Соответственно, композиция, состоящая по существу из элементов согласно определению в настоящем документе, не исключает присутствия следовых количеств примесей, обусловленных способом выделения и очищения, и фармацевтически приемлемые носители, такие как забуференный фосфатом солевой раствор, консерванты и т.п.

[0038] В настоящей заявке в каждом конкретном случае любой из терминов «содержащий», «состоящий по существу га» и «состоящий из» может быть заменен любым из двух других терминов. Термин «приблизительно» в отношении упоминаемой численной величины, а также его грамматические эквиваленты, в настоящем документе может включать собственно упоминаемую численную величину и величины в диапазоне ±10% от указанной упоминаемой численной величины. Например, термин «приблизительно 10» включает 10 и любые количества от 9 до 11, включительно. В некоторых случаях термин «приблизительно» в отношении упоминаемой численной величины может также включать величины в диапазоне ±10%, ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2% или ±1% от указанной упоминаемой численной величины. Согласно некоторым вариантам реализации «приблизительно», связанный с количеством или диапазоном, измеряемыми с применением конкретного способа, показывает, что заданная численная величина включает величины, определяемые вариабельностью измерений при применении указанного способа.

[0039] Термин «международная единица» (ME) применяют в настоящем документе в соответствии с признанным в данной области техники значением и соответствует количеству вещества (например, полипептида). Масса или объем, составляющие одну международную единицу, варьируют в зависимости от измеряемого вещества. Всемирная организация здравоохранения (WHO) предоставляет характеристики единиц биоактивных веществ и полипептидов.

[0040] В настоящем документе следующие термины и им родственные предпочтительно имеют следующие значения, если контекст явно не указывает иное:

[0041] Под «бактериями» в рамках настоящей заявки предпочтительно понимают любые грамотрицательные и грамположительные организмы, включая, но не ограничиваясь следующими, Acinetobacter spp., Citrobacter spp., Escheriachia coli, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Klebsiella spp., Morganella morganii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumonia. Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecalis, Clostridium spp. и Bifidobacterium spp., помимо прочих, которые могут вызывать заболевания или неблагоприятные состояния человека и/или животных, а также оказывать негативное воздействие на окружающую среду. В частности, грам-положительные (G+) (например, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Mycobacteriaceae spp и Streptococcus pneumoniae) или грам-отрицательные (например, Escherichia coli/, Enterobacter spp., Salmonella spp., Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas aeruginosa), в отношении которых существует очевидная и острая необходимость в новых препаратах и способах лечения инфекций, вызванных указанными устойчивыми к ряду известных антибиотиков бактериями.

[0042] В рамках настоящего изобретения в объем термина «бактерии» также включены различные виды пробиотических бактерий и бактерий, которые входят в состав нормальной микрофлоры человека и животных (например, Lactococcus, Lactobacillus или Bifidobacterium, Enterococcus, Streptococcus spp.). В настоящем документе указание конкретного рода или рода бактерий не ограничивает настоящее изобретения конкретным видом или подвидом; подразумевается, что включен любой из видов или подвидов указанных родов бактерий. В рамках настоящего изобретения в объем термина «бактерии» также включены различные виды бактерий, которые имеют положительное значение, например, симбионты, или отрицательное значение, например, патогены, в сельском хозяйстве или пищевой промышленности. Кроме того, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения термин «бактерии» относится бактериям, которые генетически-модифицированы содержат гетерологичные нуклеиновые кислоты для экспрессии желательных полипептидов или полинуклеотидов Например, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения термин «бактерии» относится бактериям, которые генетически-модифицированы для применения в медицине, сельском хозяйстве, пищевой промышленности или биотехнологии, например, содержат гетерологичные нуклеиновые кислоты для экспрессии желательных полипептидов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения бактерии являются устойчивыми к по меньшей мере одному антибиотику. В других вариантах реализации настоящего изобретения бактерии обладают МЛУ, то есть демонстрируют устойчивость к нескольким антибиотикам (классам антибиотиков).

[0043] Эффективность доступных в настоящее время способов терапии ограничена инфекционными штаммами с высокой устойчивостью. Указанные устойчивые бактерии являются основными причинами заболеваемости и смертности у пациентов. Helfand, β-lactams Against Emerging 'Superbugs': Progress and Pitfalls, Expert Rev. Clin. Pharmacol. 1(4): 559-571 (2008). Неограничивающими примерами патогенов, для которых является важным получение новых антибактериальных препаратов могут служить устойчивые к карбапенему Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, устойчивые к карбапенему Enterobacteriaceae spp (CRE); устойчивые к ванкомицину Enterococcus faecium (VRE), штаммы Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia и других Enterobacteriaceae с множественной лекарственной устойчивостью (МНУ); устойчивые к метициллину Staphylococcus aureus (MRSA), частично устойчивые и устойчивые к ванкомицину Helicobacter pylori, устойчивый к кларитромицину Campylobacter spp., устойчивые к фторхинолонам Сальмонеллы (Salmonellae spp), устойчивая к цефалоспоринам и к фторхинолонам Neisseria gonorrhoeae, нечувствительные к пенициллину Streptococcus pneumonia; устойчивые к ампициллину Haemophilus influenza; устойчивые к фторхинолонам Shigella spp., Mycobacterium tubercidosis с МЛУ (MDR-TB) и Acinetobacter baumannii с МЛУ.

[0044] «Бактерицидный» или «бактерицидная активность» относится к свойству вызывать гибель бактерий или способности уничтожать бактерии до степени по меньшей мере 3-log10 (99,9%) или большего снижения среди исходной популяции бактерий в течение 18-24-часового периода.

[0045] «Бактериостатическая» или «бактериостатическая активность» относится к свойству ингибирования бактериального роста, включая ингибирование роста бактериальных клеток, таким образом вызывая 2-log10 (99%) или лучше, и почти до снижения 3-log среди исходной популяции бактерий в течение 18-24 часового периода.

[0046] «Антибактериальный» относится как к бактериостатическим, так и к бактерицидным средствам.

[0047] «Антибиотик» относится к соединению, обладающему свойствами, которые оказывают отрицательное воздействие на бактерии, такое как летальность или снижение роста. Антибиотик может оказывать отрицательное воздействие на грамположительные бактерии, грамотрицательные бактерии, или на те и другие. В некоторых случаях под антибиотиком понимают противовирусное средство, под действием которым ингибируется пролиферация (цикл размножения) вируса и/или снижается вирусная нагрузка на субъекта.

[0048] «Противовирусный» относится к веществам и средствам, которые ингибируют или предотвращают жизненный цикл вируса, например, к веществам и средствам которые ингибируют синтез вирусных белков, синтез вирусных РНК и/или ДНК, сборку вирусных частиц.

[0049] «Антимикотический» относится к веществам и средствам, которые ингибируют или предотвращают жизненный цикл гриба.

[0050] Термин «IC50», или IC50 относится к ингибирующей дозе, которая вызывает 50% ингибирование данного количественно измеримого параметра. Указанное количественное значение означает, сколько конкретного лекарства или другого вещества (ингибитора) необходимо для ингибирования данного биологического, биохимического или химического параметра (или компонента параметра, т.е. фермента, клетки, клеточного рецептора или микроорганизма) наполовину.

[0051] Термин «MIC» означает минимальную ингибирующую концентрацию (мкг/мл), т.е. минимальную концентрация вещества, задерживающую видимый рост испытуемого штамма микроорганизма или вируса в стандартном опыте. Величина MIC является предпочтительным показателем чувствительности конкретного микроорганизма к антибиотику или антибактериальному препарату. Значения MIC для микроорганизмов можно определять с помощью различных методик. Например, можно использовать диско-диффузионный способ или другие градиентные диффузионные методы, метод серийных разведений, методы с применением Е-тестов или стрипов ХайКомб, метод пограничных концентраций и другие.

[0052] Критерием чувствительности при лечении инфекций условно является величина терапевтического индекса (Т):Т=МИК/К, где К - концентрация данного антибиотика (мкг/мл) в очаге инфекции (или в сыворотке крови) при введении терапевтических доз препарата. Микроорганизм чувствителен, а антибиотик обычно клинически эффективен, если Т менее 0,3. Значения «К» специалисты могут найти в специальных таблицах.

[0053] Специалистам в данной области техники известны различные подходы определения чувствительности микроорганизмов к препаратам (см., например, методические указания МУК 4.2. 1890-04: ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ; https://docs.cntd.ru/document/1200038583; Руководство по клинической лабораторной диагностике Министерства здравоохранения РФ, «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам»: http://antimicrob.net/wp-content/uploads/Opredelenie-chuvstvitelnosti-mikroorganizmov-k-antibakterialnym-preparatam-2015.pdf)

[0054] «Устойчивые к лекарствам» обычно относится к патогенам, например, бактериям, грибам, вирусам, которые устойчивы к антибактериальной активности лекарства. При применении определенным образом устойчивость к лекарствам может специфически относиться к устойчивости к антибиотикам. В некоторых случаях бактерия, которая обычно чувствительна к определенному антибиотику, может развить устойчивость к антибиотику, тем самым становясь устойчивым к лекарству микробом или штаммом. Патоген с «множественной лекарственной устойчивостью» («МЛУ») - это патоген, у которого развилась устойчивость по меньшей мере к двум классам антимикробных лекарств, каждое из которых применяется в качестве монотерапии. Например, было обнаружено, что определенные штаммы S. aureus устойчивы к нескольким антибиотикам, включая метициллин и/или ванкомицин (Antibiotic Resistant Threats in the United States, 2013, U.S. Department of Health and Services, Centers for Disease Control and Prevention). Специалист в данной области может легко определить, является ли конкретный микроорганизм устойчивой к лекарству, применяя обычные лабораторные техники, которые определяют чувствительность или устойчивость микроорганизма, например, бактерии или гриба, к лекарству или антибиотику.

[0055] В одном из вариантов реализации уменьшение вирусной инфекции представляет собой сокращение числа бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл, а уменьшение бактериальной инфекции представляет собой сокращение числа колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл. «Бляшкообразующие единицы» - количество частиц, способных образовывать бляшки, таких как частицы вируса, на единицу объема. Это скорее функциональный количественный показатель, чем показатель абсолютного количества частиц: вирусные частицы, которые являются дефектными или не способны инфицировать клетку-мишень, не образуют бляшку и, следовательно, не будут учитываться. Например, раствор вируса гриппа с концентрацией 1000 БОЕ/мкл указывает на то, что 1 мкл раствора содержит достаточно вирусных частиц, чтобы получить 1000 инфекционных бляшек в клеточном монослое. Применительно к настоящему изобретению, культура клеток, обработанная противовирусным средством согласно настоящему изобретению, демонстрирует уменьшенное количество бляшкообразующих единиц в культуре после обработки по сравнению с культурой до обработки таким средством.

[0056] Возможное «уменьшение количества бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл» анализируют следующим образом. Сначала культивируемые клетки, коинфицированные вирусом гриппа и бактерией, анализируются на их способность образовывать бляшкообразующие единицы (БОЕ)/мл, например, отбирают несколько клеток из чашки Петри и высевают их для подсчета бактериальных бляшек, которые будут образовываться. Данный результат затем сравнивают с количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл, образуемых клетками той же культуры после применения ингибитора. Если количество бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл после обработки ингибитором уменьшается по сравнению с количеством, образованным до применения ингибитора, имеет место сокращение числа бляшкообразующих единиц.

[0057] «Колониеобразующие единицы (КОЕ)/мл» - показатель количества жизнеспособных бактерий в образце. Существуют разные способы. Например, для создания колониеобразующих единиц образец (например, культивируемые клетки в небольшом объеме) распределяют по поверхности чашки с питательным агаром и дают возможность высохнуть перед инкубацией для подсчета. «Жизнеспособная бактерия» означает бактерия, способная размножаться посредством бинарного деления в контролируемых условиях. Чтобы колонию было видно, нужно чтобы она достаточно сильно выросла - при подсчете колоний неясно, возникла ли колония из одной клетки или из 1000 клеток. Следовательно, для отражения этой неясности результаты выражают в КОЕ/мл (колониеобразующих единиц на 1 миллилитр) для жидкостей и КОЕ/г (колониеобразующих единиц на 1 грамм) для твердых веществ (а не клеток/мл или клеток/г).

[0058] «Колониеобразующие единицы (КОЕ)/мл» можно анализировать следующим образом. Сначала культивируемые клетки, коинфицированные вирусом гриппа и бактерией или только одной бактерией, анализируют на их способность создавать колониеобразующие единицы (КОЕ)/мл, например, отбирая несколько клеток из чашки Петри и высевая их для подсчета. Полученный результат затем сравнивают с количеством колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл, образуемых клетками той же культуры после применения ингибитора. Если количество колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл уменьшается до количества, образованного до применения ингибитора, имеет место сокращение численности.

[0059] Как правило, специалист в данной области умеет применять эти широко известные методики анализа бактериальных и вирусных инфекций. Методика определения количества бляшкообразующих единиц (БОЕ)/мл и колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл, более подробно описана в литературе (Tuchscherr et al. 2011, Hrincius et al. 2010).

[0060] В настоящей заявке термин «приведение в контакт» относится к пространственному приближению клетки, вируса, гриба, бактерии или фермента, например, РНКП к указанному соединению или веществу. Это может означать, например, что ингибитор добавляют в среду или окружение, в которых находятся клетка, вирус, гриб или бактерия, или обеспечивают попадание/доставку указанных соединения или вещества в клетку, вирус, гриб или бактерию.

[0061] «Биопленка» относится к бактериям, которые прикрепляются к поверхностям и группируются в гидратированную полимерную матрицу, которая может содержать компоненты, происходящие из бактерий и/или хозяев. Биопленка - это группа микроорганизмов, в которой клетки прикрепляются друг к другу на биотической или абиотической поверхности. Такие адгезированные клетки часто встроены в матрицу, содержащую, без ограничения перечисленным, внеклеточную полимерную субстанцию, ВПС (EPS). Биопленка ВПС, которую также называют слизью (хотя не все, что описывается как слизь, является биопленкой) или налетом, является полимерным конгломератом, обычно состоящим из внеклеточной ДНК, белков и полисахаридов.

[0062] «Подходящий» в контексте антибиотика или средства, подходящего для применения против определенной бактерии, вируса или гриба относится к антибиотику, который оказался эффективным против этой бактерии, вируса или гриба, даже если впоследствии развилась устойчивость.

[0063] «Эффективное количество» относится к количеству, которое при применении или введении с соответствующей частотой или режимом введения доз является достаточным для предотвращения, уменьшения, подавления или устранения роста микроорганизмов, бактериального роста, размножения вирусов или бактериальной или вирусной нагрузки или предотвращения, уменьшения или облегчения начала, тяжести, продолжительности или прогрессирования расстройства, подвергающегося лечению (в данном случае состояния или последствий инфицирования бактериальными или вирусными патогенами, грибами), предотвращает прогрессирование расстройства, подвергающегося лечению, вызывает регресс расстройства, подвергающегося лечению, или усиливает или улучшает профилактический или терапевтический эффект (-ы) другой активности или терапии, такой как антибиотикотерапия, противовирусная или бактериостатическая терапия.

[0064] «Совместное введение» или «Совместное воздействие» относится к введению двух агентов и/или осуществлению указанных воздействий, последовательным образом, а также введению этих агентов и/или осуществлению указанных воздействий по существу одновременно, например в одной смеси/композиции или комбинации. Кроме того, в зависимости от применения совместное введение или воздействие не обязательно должно быть непрерывным или одновременным. Например, при использовании агента А и воздействия или средства В, например, А можно ввести только первоначально, а воздействие В можно оказывать или средство В можно вводить в последующие моменты времени без дальнейшего введения А и наоборот.

[0065] Бактериальные инфекции: в одном из вариантов реализации изобретения термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» относятся к инфекции у субъекта, вызванной грамотрицательной (G-) бактерией, также называемой «грамотрицателъной инфекцией». Согласно одному из аспектов указанного варианта реализации грамотрицательная инфекция представляет собой инфекцию, устойчивую к одному или более антибиотикам. Согласно одному из аспектов указанного варианта реализации грамотрицательная инфекция представляет собой инфекцию с множественной лекарственной устойчивостью. В определенных вариантах реализации грамотрицательная бактерия представляет собой Acinetobacter spp. В определенных вариантах реализации грамотрицательная бактерия представляет собой Acinetobacter spp., такую как Acinetobacter baumannii. В определенных вариантах реализации грамотрицательная бактерия представляет собой Burkholderia spp. В определенных вариантах реализации грамотрицательная бактерия представляет собой Burkholderia pseudomallei. В определенных вариантах реализации грамотрицательная бактерия представляет собой Pseudomonas aeruginosa. В определенных вариантах реализации грамотрицательная бактерия представляет собой Enterobacteriaceae. В любом из указанных вариантов реализации грамотрицательная инфекция вызвана патогеном или патогеном, экспрессирующим одну или более β-лактамаз. В любом из указанных вариантов реализации грамотрицательная инфекция вызвана патогеном или патогеном, экспрессирующим одну или более β-лактамаз класса А, класса С и/или класса D. В любом из указанных вариантов реализации грамотрицательная инфекция вызвана патогеном или патогеном, экспрессирующим одну или более β-лактамаз класса А. В любом из указанных вариантов реализации грамотрицательная инфекция вызвана патогеном или патогеном, экспрессирующим одну или более β-лактамаз класса С. В любом из указанных вариантов реализации грамотрицательная инфекция вызвана патогеном или патогеном, экспрессирующим одну или более β-лактамаз класса D.

[0066] Инфекция, вызванная «Enterobacteriaceae», относится к любой грамотрицательной бактерии, принадлежащей к указанному семейству бактерий, включая, но не ограничиваясь следующими, виды, такие как Salmonella spp., Escherichia coli, Yersinia pestis, Klebsiella spp., Shigella spp., Proteus spp., Enterobacter spp., Serratia spp. и Citrobacter spp. Таким образом, способ лечения бактериальной инфекции, вызванной «Enterobacteriaceae», включает лечение какой-либо инфекции, вызванной любыми одной или более бактериями, составляющими указанное семейство. В одном из вариантов реализации бактериальная инфекция, вызванная «Enterobacteriaceae», включает бактериальные инфекции, при которых присутствует по меньшей мере один патоген Salmonella spp. В одном из вариантов реализации бактериальная инфекция, вызванная «Enterobacteriaceae», включает бактериальные инфекции, при которых присутствует по меньшей мере один патоген Escherichia coli. В одном из вариантов реализации бактериальная инфекция, вызванная «Enterobacteriaceae», включает бактериальные инфекции, при которых присутствует по меньшей мере один патоген Yersinia pestis. В одном из вариантов реализации бактериальная инфекция, вызванная «Enterobacteriaceae», включает бактериальные инфекции, при которых присутствует по меньшей мере один патоген Klebsiella spp. В одном из вариантов реализации бактериальная инфекция, вызванная «Enterobacteriaceae», включает бактериальные инфекции, при которых присутствует по меньшей мере один патоген Shigella spp. В одном из вариантов реализации бактериальная инфекция, вызванная «Enterobacteriaceae», включает бактериальные инфекции, при которых присутствует по меньшей мере один патоген Proteus spp. В одном из вариантов реализации бактериальная инфекция, вызванная «Enterobacteriaceae», включает бактериальные инфекции, при которых присутствует по меньшей мере один патоген Enterobacter spp. В одном из вариантов реализации бактериальная инфекция, вызванная «Enterobacteriaceae», включает бактериальные инфекции, при которых присутствует по меньшей мере один патоген Serratia spp. В одном из вариантов реализации бактериальная инфекция, вызванная «Enterobacteriaceae», включает бактериальные инфекции, при которых присутствует по меньшей мере один патоген Citrobacter spp.

[0067] В определенных вариантах реализации термины «инфекция» и «бактериальная инфекция» относятся к инфекции, вызванной грамотрицательной бактерией, где грамотрицательная бактерия представляет собой Enterobacteriaceae, экспрессирующую одну или более β-лактамаз класса А, класса В, класса С и/или класса D. Согласно одному из аспектов указанного варианта реализации грамотрицательная бактерия представляет собой Enterobacteriaceae, экспрессирующую по меньшей мере одну β-лактамазу класса В.

[0068] В определенных вариантах реализации грамотрицательная бактерия представляет собой Acinetobacter spp., экспрессирующую одну или более β-лактамаз. В одном из вариантов реализации грамотрицательная бактерия представляет собой Acinetobacter baumannii, экспрессирующую одну или более β-лактамаз класса А, класса С и/или класса D. В одном из вариантов реализации грамотрицательная бактерия представляет собой Acinetobacter baumannii, экспрессирующую одну или более β-лактамаз класса А. В одном из вариантов реализации грамотрицательная бактерия представляет собой Acinetobacter baumannii, экспрессирующую одну или более β-лактамаз класса С. В одном из вариантов реализации грамотрицательная бактерия представляет собой Acinetobacter baumannii, экспрессирующую одну или более β-лактамаз класса D. В одном из вариантов реализации грамотрицательная бактерия представляет собой Acinetobacter baumannii, экспрессирующую ТЕМ-1 или KPC-2.

[0069] Согласно одному из аспектов термины «инфекция» и в частности «бактериальная инфекция» могут относиться к любому возбудителю заболевания или нежелательного состояния организма субъекта, в частности, к возбудителям, которые вызывают: инфекции дыхательных путей (RTI), гинекологические инфекции, заболевания, передающиеся половым путем, инфекции мочевыводящих путей (UTI), включая осложненные инфекции мочевыводящих путей (cUTI), бактриемию, острые приступы хронического бронхита (АСЕВ), острый средний отит, острый синусит, сепсис, внебольничную пневмонию (ВБП), внутрибольничную пневмонию (НАР), вентилятор-ассоциированную пневмонию (ВАП), осложненные инфекции кожи и структуры кожи (cSSSI), острую бактериальную инфекцию кожи и структуры кожи (ABSSSI), неосложненные инфекции кожи и структуры кожи (SSSI), внутрибрюшную инфекцию (IAI), эндокардиту, остеомиелит, лихорадочную нейтропению, цервицит, уретрит, мелиоидоз, туляремия, инфекции у хозяина с ослабленным иммунитетом, такие как абсцесс печени, инфекции желчевыводящих путей и бактериемия.

[0070] Все указанные выше инфекции могут быть вызваны разнообразными бактериями и/или вирусами, рост, размножение и/или жизнеспособность которых потенциально можно уменьшать согласно настоящему изобретению, включая полное устранение (эрадикацию) указанных бактериальных и вирусных патогенов.

[0071] «Вирусы», «Вирусное заболевание» или «вирусная инфекция», к которым также относится настоящее изобретение, может иметь место в рамках коинфекции или может возникать как самостоятельная инфекция, присутствующая у хозяина, например, субъекта и/или клетки. В рамках настоящей заявки в объем термина «вирусы» включены вирусы животных и птиц, вирусы растений, вирусы грибов, вирусы архей и бактерий (бактериофаги) Вирусное заболевание или вирусная инфекция могут быть опосредованы каким-либо вирусом; предпочтительно они опосредованы вирусом животных таким как РНК-вирус, например, короновирус, норовирус, рабдовирус, энтеровирус, гриппа, пикорнавирус, аренавирус, вирус Эбола, рабдовирус (в том числе стоматиты и бешенство), парамиксовирус, флавивирус, гепадновирус, предпочтительно, вирус гепатита С, ВИЧ или РНК-вирус, который вызывает кишечные инфекции или инфекции дыхательных путей. Предпочтительными вирусами, которые вызывает инфекции дыхательных путей являются, риновирусы, вирусы гриппа и коронавирусы. Предпочтительно, вирусная инфекция гриппа опосредована вирусом гриппа А или вируса гриппа В, при этом вирусы гриппа А являются предпочтительными. Особенно предпочтительными являются подтипы вируса гриппа А H1N1, H2N2, H3N2, H5N6, H5N8, H6N1, H7N2, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, N10N8 и/или H5N1. Предпочтительно, коронавирусная инфекция опосредована SARS-CoV, SARS-CoV2 или MERS-CoV.

[0072] В рамках настоящего описания термин «гриб» относится к любым представителям царства Fungi или Mycota. В некоторых вариантах реализации термин «грибы» относится к представителям царства Fungi которые имеют положительное или отрицательное (например, патогены) значение в сельском хозяйстве, промышленности, например, в пищевой и лесной промышленности, других областях экономики. В некоторых вариантах реализации термин «гриб(ы)» относится к патогенным грибам, например, грибам, которые вызывают микозы, в частности - дерматомикозы, глубокие микозы и микотоксикозы, у человека или животных. В некоторых вариантах реализации термин «гриб(ы)» относится к фитопатогенным грибам или грибам, которые вызывают порчу различных продуктов или материалов, например, древесины. Кроме того, некоторых вариантах реализации настоящего изобретения термин «грибы» относится грибам, например, дрожжам, которые генетически-модифицированы содержат гетерологичные нуклеиновые кислоты для экспрессии желательных полипептидов или полинуклеотидов Например, некоторых вариантах реализации настоящего изобретения термин «гриб» относится грибам, которые генетически-модифицированы для применения в медицине, сельском хозяйстве, пищевой промышленности или биотехнологии, например, содержат гетерологичные нуклеиновые кислоты для экспрессии желательных полипептидов. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения гриб является устойчивыми к по меньшей мере одному антибиотику или антимикотику.

[0073] «Лечение» относится к любому процессу, действию, приложению, терапии и т.п., при этом субъекту, включая человека, оказывается медицинская помощь с целью излечения расстройства, эрадикации (полного устранения) патогена или улучшения состояния субъекта, прямо или косвенно. Лечение также относится к снижению заболеваемости, облегчению симптомов, устранению рецидивов, предотвращению рецидивов, предотвращению заболеваемости, снижению риска заболеваемости, улучшению симптомов, улучшению прогноза или их комбинациям. «Лечение» может дополнительно охватывать уменьшение популяции, скорости роста или вирулентности бактерий у субъекта и, таким образом, контролирование или уменьшение бактериальной инфекции у субъекта, или бактериальной контаминации органа, ткани или окружающей среды. Таким образом, «лечение», которое снижает заболеваемость, может, например, быть эффективным для ингибирования роста по меньшей мере одной грамположительной или грамотрицательной бактерии в определенной среде, будь то субъект или окружающая среда. С другой стороны, «лечение» уже развившейся инфекции относится к уменьшению популяции, уничтожению, подавлению роста и/или эрадикации грамположительных бактерий, ответственных за инфицирование или заражение.

[0074] «Предотвращение» относится к предотвращению заболеваемости, рецидивирования, распространения, возникновения или развития расстройства, такого как бактериальная инфекция. Не предполагается, что настоящее изобретение ограничивается полным предотвращением или предотвращением развития инфекции. В некоторых вариантах осуществления наступление болезни отсрочено, или тяжесть впоследствии наступившего заболевания или вероятность заражения снижена, и это составляет примеры предотвращения.

[0075] «Наступившие заболевания» относится к заболеваниям, проявляющимся клиническими или субклиническими симптомами, такими как выявление лихорадки, сепсиса или бактериемии, а также заболеваний, которые могут быть обнаружены по росту бактериального патогена (например, в культуре), когда симптомы, связанные с такой патологией, пока не проявились.

[0076] «Субъект» относится к млекопитающему, растению, низшему животному, одноклеточному организму или культуре клеток. Например, термин «субъект» предназначен для того, чтобы включать организмы, например, прокариоты и эукариоты, которые чувствительны к бактериальным, вирусным или грибковым инфекциям или поражены ими, например грамположительными бактериальными инфекциями или инфекциями РНК-вирусво. Примеры субъектов включают млекопитающих, например, людей, собак, коров, лошадей, свиней, овец, коз, кошек, мышей, кроликов, крыс и трансгенных животных, не относящихся к человеку. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой человека, например, человека, страдающего, подверженного риску заражения или восприимчивого к инфицированию грамположительными бактериями, грибами или вирусами, независимо от того, является ли такая инфекция системной, местной или иным образом сконцентрированной или ограниченной определенным органом или тканью.

[0077] «Полипептид» относится к полимеру, состоящему из аминокислотных остатков и обычно имеющему по меньшей мере приблизительно 30 аминокислотных остатков. Термин «полипептид» применяется здесь взаимозаменяемо с терминами «белок» и «пептид». Термин включает не только полипептиды в выделенной форме, но также активные фрагменты и их производные. Термин «полипептид» также охватывает слитые белки или слитые полипептиды, включающие полипептид фактора элонгации транскрипции и поддерживающие (сохраняющие), например, функцию или активность фактора элонгации транскрипции. В зависимости от контекста полипептид, или белок, или пептид может быть природным полипептидом или рекомбинантным, сконструированным или синтетически произведенным полипептидом. Определенный полипептид обладающие активностью фактора элонгации транскрипции, например, может быть, например, получен из нативного белка путем ферментативного или химического расщепления, или может быть приготовлен с применением общепринятых методов пептидного синтеза (например твердофазного синтеза) или методов молекулярной биологии (таких как те, что описаны в Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)), или может быть стратегически усечен или сегментирован с получением активных фрагментов, поддерживающих, например, активность фактора элонгации транскрипции в отношении той же (целевой) РНКП.

[0078] «Производное» в контексте пептида или полипептида или его активного фрагмента предназначено для охвата, например, полипептида, модифицированного таким образом, чтобы он содержал один или более химических фрагментов, отличных от аминокислоты, которые по существу не оказывают неблагоприятного воздействия или не уничтожают активность или не препятствуют функции указанного полипептида, такую как активность фактора элонгации РНКП, например - экзонуклеазная активность. Химическая часть может быть ковалентно связана с пептидом, например через амино-концевой аминокислотный остаток, карбокси-концевой аминокислотный остаток или через внутренний аминокислотный остаток. Такие модификации могут быть природными или неприродными. В некоторых вариантах осуществления неприродная модификация может включать добавление защитной или кэпирующей группы к реакционноспособной части, добавление детектируемой метки, такой как антитело и/или флуоресцентная метка, добавление или модификация гликозилирования или добавление увеличивающей объем группы, такой как ПЭГ (пэгилирование), и другие изменения, известные специалистам в данной области. В некоторых вариантах осуществления неприродная модификация может быть кэпирующей модификацией, такой как N-концевое ацетилирование и С-концевое амидирование. Типовые защитные группы, которые могут быть добавлены к полипептидам, включают, без ограничения перечисленными, t-Boc и Fmoc. Обычно применяемые белки для флуоресцентного мечения, такие как, без ограничения перечисленными, зеленый флуоресцентный белок, ЗФБ (GFP), красный флуоресцентный белок, КФБ (RFP), голубой флуоресцентный белок, ГФБ (CFP), желтый флуоресцентный белок, ЖФБ (YFP) и mCherry, представляют собой компактные белки, которые могут быть связаны ковалентно или нековалентно с полипептидом или слиты с полипептидом без нарушения нормальных функций клеточных белков. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий флуоресцентный белок, вставлен выше или ниже полинуклеотидной последовательности. Это будет производить слитый белок (например полипептид ФЭТ::ЗФБ), который не мешает клеточной функции или функции полипептида, к которому он присоединен. Конъюгирование полиэтиленгликоля (ПЭГ) с белками применялось как способ увеличения периода полувыведения многих фармацевтических белков. Таким образом, в контексте производных полипептидов, термин «производное» охватывает полипептиды, такие как полипептиды ФЭТ, химически модифицированные ковалентным присоединением одной или более молекул ПЭГ. Ожидается, такие пэгилированные ФЭТ, будут демонстрировать более длительный период полувыведения по сравнению с непэгилированными полипептидами, сохраняя при этом биологическую и терапевтическую активность.

[0079] «Процент идентичности аминокислотной последовательности» относится к проценту аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в эталонной (референсной) полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и внесения пробелов, если необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей и без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотной последовательности может быть достигнуто различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, с применением общедоступного программного обеспечения, такого как средство поиска основного локального выравнивания (BLAST), или программного обеспечения, доступного на рынке, например от DNASTAR. Две или более полипептидные последовательности могут быть идентичны на 0-100% или на любое целое число между ними. В контексте настоящего изобретения два полипептида являются «по существу идентичными», если по меньшей мере 80% аминокислотных остатков (обычно по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90% и обычно по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% или по меньшей мере 99%) идентичны. Термин «процент (%) идентичности аминокислотной последовательности», описанный здесь, также применяется и к пептидам. Таким образом, термин «по существу идентичный» будет охватывать мутированные, усеченные, слитые или иным образом модифицированные варианты последовательностей выделенных полипептидов и пептидов, таких как описанные здесь, и их активные фрагменты, а также полипептиды с по существу идентичной последовательностью (например по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% идентичности, по меньшей мере 98% идентичности или по меньшей мере 99% идентичности, как измерено, например, одним или более способами, указанными выше) по сравнению с эталонным (дикого типа или другим интактным) полипептидом. Две аминокислотные последовательности «по существу гомологичны», если по меньшей мере приблизительно 80% аминокислотных остатков (обычно по меньшей мере приблизительно 85%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 98% идентичности или по меньшей мере приблизительно 99% идентичности) идентичны или представляют собой консервативные замены. Последовательности полипептидов по настоящему изобретению по существу гомологичны, если одна или более, или несколько, или до 10%, или до 15%, или до 20%) аминокислот в последовательности полипептида, такого как полипептиды ФЭТ, описанные в настоящем документе, заменены аналогичной или консервативной аминокислотной заменой, и при этом полученный полипептид, обладает по меньшей мере одной активностью, антибактериальным действием и/или бактериальной специфичностью эталонного полипептида ФЭТ.

[0080] В настоящем документе «консервативная аминокислотная замена» - предпочтительно является такой, при которой аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь с аналогичным зарядом. Семейства аминокислотных остатков, имеющих боковые цепи с аналогичными зарядами, были определены в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженные полярные боковые цепи (например глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

[0081] «Гибридный полипептид» относится к продукту экспрессии, полученному в результате слияния двух или более сегментов нуклеиновой кислоты, в результате чего слитый продукт экспрессии обычно имеет два или более домена или сегмента, которые обычно имеют разные свойства или функциональность. В некоторых аспектах настоящего изобретения термин «гибридный полипептид» также относится к полипептиду или пептиду, включающему два или более гетерологичных полипептида или пептида, ковалентно связанных либо напрямую, либо через аминокислотный или пептидный линкер. Полипептиды, формирующие слитый полипептид, обычно связаны С-концом с N-концом, хотя они также могут быть связаны С-концом с С-концом, N-концом с N-концом или N-концом с С-концом. Термин «гибридный полипептид» может применяться взаимозаменяемо с термином «слитый белок». Таким образом, выражение с открытым концом «полипептид, включающий» определенную структуру, подразумевает молекулы большего размера, чем указанная структура, такие как слитые полипептиды.

[0082] Термин «нуклеотил» в настоящей заявке относится к любому нуклеотиду, природному или синтетическому. Он включает обычные основания ДНК и РНК (A, G, С, Т, U), аналоги оснований, например, инозин, 5-нитроиндазол и другие, имидазол-4-карбоксамид, производные пуринов или пиримидинов, например, модифицированное пиримидиновое основание 6Н,8Н-3,4-дигидропиримидо[4,5-с][1,2]оксазин-7-он (иногда обозначаемый как основание "Р", связывающееся с А или G) и модифицированное пуриновое основание N6-метокси-2,6-диаминопурин (иногда обозначаемый как основание "K", связывающееся с С или Т), такие аналоги нуклеозидов как гипоксантин, N-4-метилдезоксигуанозин, 4-этил-2'дезоксицитидин, 4,6-дифторбензимидазол и 2,4-дифторбензен, несущие пиреновый флуорофор аналоги нуклеозидов, входящие в состав зондов на основе конформационно-блокированных («закрытых») нуклеиновых кислот (LNA - locked nucleic acids), деаза- или аза- модифицированные пурины и пиримидины, пиримидины с заместителями в положении 5 или 6 и пурины с заместителями в положениях 2, 6 или 8, 2-аминоаденин (nA), 2-тиоурацил (sU), 2-амино-6-метиламинопурин, O-6-метилгуанин, 4-тио-пиримидины, 4-аминопиримидины, 4-диметилгидразин-пиримидины, O-4-алкил-пиримидины и гидрофобные аналоги оснований, образующие дуплексную ДНК без образования водородных связей. Основания могут соединяться за счет различных связей и конформаций, включая фосфодиэфирные, тиофосфатные или метилфосфонатные связи, пептидо-нуклеиновые связи.

[0083] Термин «полинуклеотид» в настоящей заявке относится к мультимерному соединению, содержащему соединенные нуклеотиды, образующие полимер, включая обычные РНК, ДНК, «закрытые» нуклеиновые кислоты (LNA - locked nucleic acids), конформационно-блокированные за счет внутримолекулярных мостиков нуклеиновые кислоты (BNA - bridged nucleic acids), сополимеры всех вышеупомянутых соединений и их аналогов. Термин «нуклеиновая кислота» в настоящей заявке относится к одноцепочечным полинуклеотидам или к дуплексу из двух полинуклеотидов. Такие дуплексы не обязательно ренатурированы не всем протяжении и могут содержать разрывы (гэпы) и выпетливающиеся участки.

[0084] «Гетерологичный» относится к нуклеотидным или полипептидным последовательностям, которые не являются смежными в природе. Например, в контексте настоящего изобретения термин «гетерологичный» может быть применен для описания комбинации или слияния двух или более полипептидов, при этом слитый полипептид обычно не встречается в природе. Кроме того, термин «гетерологичный» также означает, что указанная молекула отсутствует в определенном окружении в природе. Например, употребление выражения «гетерологичный полинуклеотид» по отношению к клетке будет означать, что указанный полинуклеотид не свойственен указанной клетке, например, отсутствовал в ней в природе, то есть до того, как ее мутировали или целевым образом изменили.

[0085] Конструкции: Согласно одному варианту реализации настоящее изобретение включает использование стабильно трансфицированных клеток или организмов, например, стабильно трансфицированных микроорганизмов, в которых гетерологичный или дополнительный ген, кодирующий полипептид фактора элонгации РНКП, были интегрированы в геном клетки-хозяина или всех клеток организма. Методики создания стабильно трансфицированных (микро)организмов известны в данной области техники. Например, ген полипептида фактора элонгации РНКП может быть клонирован в геном хозяина, например, в хромосому, путем гомологичной рекомбинации. Согласно некоторым вариантам реализации имеющий существенное значение ген хозяина разрушают с применением гомологичной рекомбинации, например, делеции указанного гена, одной или более замен аминокислот, приводящих к получению неактивной формы белка, кодируемого указанным имеющим существенное значение геном, или мутации со сдвигом рамки, приводящей к получению усеченной формы белка, кодируемого указанным имеющим существенное значение геном. Предпочтительная техника описана, например, в WO 02/090551, который включен в настоящий документ полностью посредством ссылки. Указанная плазмида может быть самореплицирующейся, может нести, например, один или более представляющих интерес генов и один или более маркеров устойчивости. Далее, трансформирующая плазмида может представлять собой любую плазмиду, при условии, что она не способна дополнять разрушенный имеющий существенное значение ген. Как вариант, указанная плазмида представляет собой интегративную плазмиду. В последнем случае интегративная плазмида сама по себе может быть использована для разрушения имеющего существенное значение гена за счет интеграции в локус указанного имеющего существенное значение гена. В некоторых случаях указанный имеющий существенное значение ген посредством двойной гомологичной рекомбинации заменяют кассетой, содержащей ген или гены, представляющие интерес, фланкированные нацеливающими последовательностями, которые нацеливают инсерцию (вставку) на имеющий существенное значение ген. Следует понимать, что указанные нацеливающие последовательности обладают достаточной длиной и достаточной гомологией, чтобы позволять интеграцию представляющего интерес гена в целевой сайт.

[0086] В случаях, когда генетическая конструкция, кодирующая полипептид фактора элонгации РНКП, может быть интегрирована в микробную геномную ДНК, например, бактериальную хромосому, может быть интегрирована одна или несколько копий нуклеиновой кислоты; интеграция может происходить в случайном сайте хромосомы или, согласно описанию выше, в заранее заданном сайте хромосомы. Соответственно, согласно варианту реализации указанная генетическая конструкция, может дополнительно содержать последовательности, способные осуществлять инсерцию указанной генетической конструкции в геном клетки-хозяина, например, в хромосому.

[0087] Согласно некоторым примерам реализации инсерцию (вставку) указанной генетической конструкции в конкретные сайты в геноме, например, в хромосоме клетки-хозяина может облегчать гомологичная рекомбинация. Например, генетическая конструкция согласно настоящему изобретению может содержать одну или более областей гомологии указанному сайту интеграции в геноме, например, в хромосоме клетки-хозяина. Последовательность в указанном геномном, например, хромосомном сайте может быть естественной, т.е. встречающейся в природе, или может представлять собой экзогенную последовательность, введенную путем генетического конструирования ранее. Например, размер указанной области или областей гомологии может составлять по меньшей мере 50 п.о., 100 п.о., 200 п.о., 300 п.о., 400 п.о., 500 п.о., 600 п.о. 700 п.о., 800 п.о., 900 п.о., 1000 п.о. или более.

[0088] Согласно одному примеру реализации настоящего изобретения могут быть включены две области гомологии, по одной фланкирующей области с каждой стороны релевантных экспрессионных единиц, присутствующих в генетической конструкции согласно настоящему изобретению. Такая конфигурация может обеспечивать благоприятное встраивание релевантных последовательностей, т.е. по меньшей мере тех последовательностей, которые кодируют и осуществляют экспрессию представляющего интерес антигена, в клетки-хозяева. Способы проведения гомологичной рекомбинации, в частности, у бактериальных хозяев, и отбор рекомбинантных хозяев общеизвестны в данной области техники.

[0089] В настоящем документе термин «экспрессирующий» ген, полипептид или полинуклеотид, или «продуцирующий» полипептид или полинуклеотид означает образование достаточных количеств указанного полипептида, полинуклеотида или продукта указанного гена в указанных целях, например, для осуществления настоящего изобретения и достижения его технического результата.

[0090] В настоящем документе термин «конститутивный» в контексте промотора (или, в более широком смысле, в отношении генной экспрессии или секреции полипептида) относится к промотору, который позволяет обеспечивать постоянную транскрипцию ассоциированного с ним гена. Конститутивному промотору противопоставлен «индуцируемый» промотор, активность, которого можно модулировать посредством определенного агента, например, полипептида, пептида, полинуклеотида, олигонуклеотида, молекулы, соединения или воздействия. Специалистам в данной области техники известны различные системы индуцируемой экспрессии.

[0091] Специалисту в данной области техники известны способы получения генетически модифицированных клеток растений, грибов и животных. Кроме того, специалисту в данной области техники известны способы трансформации микроорганизмов, такие как, например трансформация протопластов и электропорация.

[0092] Высокая степень экспрессии может быть достигнута с применением гомологичных сигналов экспрессии и/или секреции на экспрессионных векторах, присутствующих в микроорганизме. Сигналы экспрессии очевидны для специалиста в данной области техники. Указанный экспрессионный вектор может быть оптимизирован для экспрессии с учетом конкретного микроорганизма или клетки, в который его включают. Специалистам известны специфические экспрессионные векторы, которые оптимизированы для экспрессии полипептидов в определенных клетках хозяевах.

[0093] «Активный фрагмент» относится к части полипептида или молекулы, которая сохраняет одну или более функций или биологических активностей выделенного полипептида или молекулы, из которого был взят такой фрагмент, например, экзонуклеазную активность, способность связывать РНКП, способность ингибировать РНКП.

[0094] «Увеличение активности» включает как увеличение удельной активности, то есть увеличение соответствующих свойств молекулы, например, за счет ее модификации, удаления блокирующей или инактивирующей группы или переведения молекулы в активную конформацию или состояние, так и суммарное увеличение активности за счет увеличения общего количества молекул в клетке или в определенном окружении. В случае полипептидов такое суммарное увеличение активности можно, например, достичь за счет увеличения уровня их экспрессии, например, в случае индуцибельной экспрессии или как результат трансфекции или трансдукции, накопления активных форм полипептидов в клетке или доставки полипептидов в клетку.

[0095] «Уменьшение» может относиться к любому изменению, которое приводит к уменьшению параметра, состояния или активности. Также считается, что вещество снижает активность фермента или полипептида, когда уменьшается количество продукта, образующегося в результате биохимической реакции, в которой участвуют указанные фермент или полипептид по сравнению с выходом продукта без вещества. Также, например, уменьшение может быть изменением симптомов расстройства, так что симптомы выражены меньше, чем наблюдались ранее. Под «снижением» или другими формами слова, подразумевается уменьшение события или характеристики (например, активности РНКП, КОЕ, БОЕ и тд). Понятно, что это обычно относится к некоторому стандартному или ожидаемому значению, другими словами, это относительное значение, но не всегда необходимо ссылаться на стандартное или относительное значение. Например, «уменьшает эффективность транскрипции» означает снижение скорости транскрипции по сравнению со стандартом или контролем.

[0096] Уменьшение может быть любым индивидуальным, средним или средним уменьшением состояния, симптома, активности, состава в статистически значимой величины. Таким образом, уменьшение может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70. 75, 80, 85, 90, 95 или 100%.

[0097] «Ингибировать», «ингибирование» и «снижение» означают уменьшение измеримого количества, например, уменьшение активности, количества, скорости, ответа, состояния, заболевания или другого биологического параметра. Это может включать, но не ограничивается этим, полное устранение активности, реакции, состояния или заболевания. Это также может включать, например, снижение активности, реакции, состояния или заболевания на 10% по сравнению с нативным или контрольным уровнем. Таким образом, снижение может составлять 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% или любое промежуточное снижение по сравнению с нативным или контрольным уровнями.

[0098] Под «усилением» действия в рамках настоящей заявки понимается как соответствующее увеличение выраженности определенного параметра, которое можно определить качественным или количественным образом, так и приобретение определенного свойства или получение определенного результата воздействия, которые ранее отсутствовали. Под усилением ингибирующего воздействия понимается соответствующее изменение, обычно уменьшение, того параметра или свойства, которые используют для оценки ингибирования.

[0099] «Бинарный» означает, что применяют по меньшей мере два компонента или средства, в результате совместного действия или активности которых обеспечивается достижение указанного эффекта или результата. Предпочтительно, указанные два компонента имеют различную природу и/или механизмы действия, но при совместном использовании обеспечивают аддитивный или синергетический эффект.

[00100] «Синергический» или «супераддитивный» относится к положительному эффекту, вызываемому двумя веществами в комбинации, который превышает сумму эффектов двух агентов, действующих независимо. В некоторых вариантах осуществления синергический или супераддитивный эффект значимо, т.е. статистически значимо, превышает сумму эффектов двух агентов, действующих независимо. Один или оба активных ингредиента могут использоваться на подпороговом уровне, т.е. на уровне, на котором, если активное вещество используется индивидуально, оно не дает эффекта или имеет очень ограниченный эффект. Эффект можно измерить посредством любых известных специалистам методик.

[00101] Например, для оценки эффекта от совместного использования двух средств можно применять значения показателя аддитивности (CI), основанные на модели аддитивности Леве, которые могут быть аддитивными (CI=1), антагонистическими (CI>1) или синергетическими (CI<1) для различных концентраций лекарств и уровней эффекта (итоговое количество КОЕ, БОЕ, доля погибших клеток; ингибирование активности РНКП, ингибирование транскрипции, ингибирование стадии элонгации транскрипта, ингибирование пролиферации или жизнеспособности бактерии, гриба, ингибирование динамики размножения вируса). Значения CI можно, например, рассчитывать по линиям тренда линейной регрессии с помощью программного обеспечения CompuSyn (ComboSyn Inc., Парамус, штат Нью-Джерси, www.combosyn.com), с преобразованием затем в котором гиперболических и сигмоидальных кривые зависимости эффекта от дозы в линейную форму способом Chou et al., (Chou ТС (2010) Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cancer Res 70: 440-6).

[00102] Синергетический эффект обеспечивает возможность эффективного достижения желательного действия или результата с применением сниженных количеств (доз) по сравнению использованием только одного из используемых средств (монотерпией). Более низкие дозы обеспечивают уменьшение токсичности без снижения эффективности. Кроме того, синергетический эффект может обусловливать повышенную эффективность. В некоторых случаях синергетический эффект будет появления желательного свойства или активности, которые до этого не проявлялись, по существу не проявлялись, или присутствовали на недетектируемом уровне. Наконец, синергия может приводить к улучшению предотвращения или облегчения заболевания, по сравнению с любой монотерапией. Термин «аддитивный» относится к сумме действий любых двух или более агентов в комбинации. При использовании в данной заявке термин «антагонистический» относится к блокированию (например, снижению или предотвращению) биологической активности.

[00103] Термин «синергетический» также относится к комбинации двух или более терапевтических агентов, воздействий или агентов и воздействий, которая является более эффективной, чем аддитивное действие любых двух или более отдельных агентов и/или воздействий. В некоторых случаях синергия фармакологических агентов и/или воздействий может быть количественно определена расчетом значений показателя аддитивности (CI).

[00104] В некоторых случаях клетка или бактерия конститутивным образом экспрессирует полипептид фактора элонгации РНКП, используемый в соответствии с настоящим изобретением. Применение конститутивного промотора позволяет избежать необходимости добавления индуктора или другого регуляторного сигнала для осуществления экспрессии. Такая экспрессия может предпочтительным образом осуществляться на увеличенном уровне. Например, указанный уровень экспрессии может приводить к накоплению указанного продукта экспрессии на уровне менее чем приблизительно 10% клеточного белка, приблизительно или менее чем приблизительно 5%, например, приблизительно 1-3%. Указанный промотор может быть гомологичным для используемой бактерии, т.е. представлять собой промотор, обнаруживаемый в указанной бактерии в природе.

[00105] Под термином «РНК полимераза» понимают полипептид или несколько полипептидов (субъединиц), которые способны синтезировать полимеры рибонуклеотидов. Структура РНКП и общий механизм синтеза РНК высоко консервативны и в основных чертах очень сходны у бактерий, архей и эукариот. В клетках прокариот имеется только одна РНКП, которая синтезирует все типы РНК в клетке. Выделяют две формы РНКП: кор- и холофермент. Кор-фермент имеет относительную молекулярную массу около 400 кДа и состоит из пяти субъединиц: двух α, β, β' и ω. Холофермент бРНКП состоит из кор-фермента и σ-субъединицы. Кор-фермент бРНКП обладает каталитической активностью, но не способен к инициации транскрипции. Инициация транскрипции происходит за счет σ-субъединицы. Между β'- и β-субъединицей находится главный канал бРНКП, в котором происходит связывание ДНК и РНК, внутри него также располагается активный центр фермента. В активном центре бРНКП расположены два подвижных домена: триггерная петля (ТП) и α-спиральный мостик (ВН), оба этих домена играют важную роль в процессе транслокации и присоединении нуклеотидов. Латерально от главного канала расположен вторичный канал, который соединяется с главным в области активного центра. Вторичный канал служит местом связывания многих регуляторных факторов, и основным путем поступления нуклеотидов в активный центр РНКП

[00106] Под выражением «элонгация транскрипции» понимают процесс удлинения молекулы РНК под действием РНК полимеразы. В случае ДНК-зависимой РНКП на стадии элонгации происходит присоединение нуклеотидов, комплементарных матричной цепи ДНК, кор-ферментом. Комплекс РНКП с ДНК и синтезируемой РНК называется элонгационным комплексом (ЭК). Продвижение РНКП по ДНК происходит неравномерно. В ходе элонгации этот фермент может делать временные остановки (паузы), прекращать движение (перманентная остановка) или терминировать синтез РНК в ответ на регуляторные воздействия со стороны белковых факторов и/или сигналов, закодированных в ДНК и РНК. Также кор-фермент способен осуществлять редактирование ошибок удлинения цепи РНК для этого осуществляется бэктрэкинг.Бэктрэкинг представляет собой явление, при котором РНКП смещается в обратном направлении вдоль цепи матричной ДНК и за счет экзонуклеазной активности исправляет ошибку.

[00107] Под выражением «фактор элонгации» понимают полипетид/белок, который взаимодействует с РНК полимеразой на стадии элонгации транскрипции и способствует увеличению эффективности синтеза молекулы РНК, которое может выражаться в образовании более длинных молекул РНК, более быстром ходе транскрипции. При серьезных ошибках в ходе работы элонгационного комплекса возникает состояние ареста, для выхода из которого необходимы специализированные транскрипционные факторы (факторы элонгации транскрипции), в частности те, которые обладают экзонуклеазной активностью. Примерами факторов элонгации, экспрессию или активность которых можно увеличивать при осуществлении настоящего изобретения являются белки GreA и GreB E. coli (а также их гомологи), которые представляют собой очень консервативные транскрипционные факторы и гены, кодирующие их присутствуют в большом количестве, если не во всех, отсеквенированных бактериальных геномов (См., например результаты поиска по базе данных последовательностей NCBI. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=GreB, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/?term=GreA). В частности, консервативная структура и активность «Gre-факторов» показана для Deinococcus radiodurans, Thermus aquaticus, Mycobacterium smegmatis, P. aeruginosa, Salmonella enterica serovar Typhimurium, Mycobacterium tuberculosis, клинических изолятах Staphylococcus aureus (MRSA), Francisella tularensis (G-), Thermus thermophiles и многих других G- и G+ бактерий.

[00108] Указанные факторы элонгации обладают экзонуклеазной активностью отвечают и за процессивность бРНКП, при этом GreA позволяет отщеплять от 2 до 5, тогда как GreB от 10 до 15 нуклеотидов. Гомологу и аналоги (включая функциональные аналоги) этих факторов будут известны или могут быть с легкостью идентифицированы специалистами в данной области техники.

[00109] Специалисту в данной области техники будет понятно, что оптимальное количество полипептида фактора элонгации РНКП, например, GreA или GreB или аналога или гомолога указанных факторов, который обладает по существу аналогичной функцией или активностью, при осуществлении настоящего изобретения варьирует, например, в зависимости от конкретной РНКП, активность которой ингибируют, микроорганизма или клетки, экспрессирующих такой полипептид, генетических конструкций, например, силы промотора, используемого в генетических конструкциях, а также и конкретного соединения согласно настоящему изобретению, которое связывается с РНКП и приобретает усиленную активность в отношении ингибирования транскрипции и/или ингибирующего действия на рост и жизнеспособность соответствующего микроорганизма. Во всех случаях осуществления настоящего изобретения специалисты смогут определить эффективные концентрации и/или количества веществ и силу или степень воздействия, которые требуются для обеспечения ингибирования транскрипции и/или ингибирующего действия на рост и жизнеспособность соответствующего патогена. Конкретные значения концентрация и параметров не влияют на изобретательский замысел авторов настоящего изобретения.

[00110] Под «аналогом полипептида (фактора элонгации)» в настоящей заявке предпочтительно понимают полипептид, который выполняет аналогичную функцию при транскрипции, но, например, происходит из другого микроорганизма или клетки, или имеет искусственное или рекомбинантное происхождение. В некоторых случаях аналог демонстрирует гомологию последовательности с упоминаемым полипептидом (фактором элонгации), как определено в настоящем описании.

[00111] При указании на применение «средства для» совместно с назначением такого средства или характеристикой получаемого вследствие применения или использования указанного средства результата, изменения или эффекта, в рамках настоящей заявке понимают использование любого агента или воздействия, с помощью которых специалист сможет обеспечить достижение указанного результата, изменения или эффекта. Средства, которые специалисты могут использовать для осуществления настоящего изобретения не являются частью настоящего изобретения, поскольку с учетом описания настоящей заявки и общих знаний в области использования настоящего изобретения специалисты в соответствующих областях техники при осуществлении настоящего изобретения могут выбрать и использовать любые средства и способы их применения, которые существенным образом не влияют на технический результат настоящего изобретения.

[00112] В рамках настоящей заявки под «агентом» понимают любые вещество, соединение, молекулу, например, малую молекулу ион, комплекс или композицию, пептид, полинуклеотид, липидный комплекс, генетическую и/или белковую конструкцию, которое при его приведении в контакт с соответствующей и подходящей мишенью обеспечивает достижение желаемого результата. Под «воздействием» понимают любое влияние, которое изменяет состояние среды, веществ, клетки или ее окружения, компратмента или микроокружения в клетке, которое приводит к изменению их физических, химических или физико-химических характеристик. Неограничивающими примерами воздействий могут служить нагрев, облучение, включая облучение в видимом, УФ или ИК спектрах, приложение магнитного или электрического поля, изменение рН, тоничности или концентраций веществ (молекул), разделение фаз, например - разделение фаз в жидкости. В данной области техники известны различные примеры воздействий, которые влияют на состояние и активность био молекулярных комплексов и экспрессию генов, что неограничивающим образом включает: изменение температуры в случае термоиндуцибельных промоторов, механическое воздействие в случае механочувствительных ионных каналов, изменение концентраций ионов в случае ионных каналов, изменение концентрации свободных радикалов в случае окислительного стресса, изменение концентрации кислорода в случае гипоксии, тепловой шок, охлаждение, гамма-облучение и высокочастотное облучение, которые приводят к индукции «sos-ответов».

[00113] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения средство которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП, например, бРНКП, вРНКП или гРНКП, может представлять собой агент, который, например, выбран из: генетической конструкции, которая обеспечивает экспрессию фактора элонгации РНКП, вируса, в частности - бактериофага, который доставляет в клетку или бактерию генетическую конструкцию, которая обеспечивает экспрессию фактора элонгации РНКП, малой молекулы, нуклеотида, пептида или полипептида, которые обеспечивают индукцию или увеличение экспрессии фактора элонгации РНКП или переход фактора элонгации РНКП в активную форму и/или указанный агент обеспечивает увеличение количества фактора элонгации РНКП в клетке. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения средство которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП может представлять собой воздействие, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП, например, представляет собой изменение температуры, облучение, включая оптическое облучение и высокочастотное излучение, изменение физико-химических характеристик среды или жидкости в области или в окружении, в которых находится клетка, в частности - бактерия.

[00114] В рамках настоящего изобретения «доставку» генетических конструкций или полипептидов в клетку можно осуществить любым известным специалистам образом. В случае доставки полинуклеотидов это может быть трансдукция или трансфекция, например, трансфекция с применением солей, например, кальций-фосфатная трансфекция, трансфекция с применением липидных комплексов, включая липосомы, трансфекция с применением положительно заряженных полимеров, например, ДЭАЭ-декстрана или полиэтилениминов, электропорация, инфекция соответствующим вирусов, например, аденовирусом в случае эукариот и бактериофагом в случае бактерий, применение мембрано-проникающих пептидов или канало-образующих агентов.

[00115] Для обеспечения увеличенного уровня активности и/или экспрессии определенного белка, например, фактора элонгации бРНКП такого как GreA или GreB, в бактерии можно, например, использовать активацию или увеличение уровня экспрессии соответствующих генов, трансформацию бактерий с внедрением соответствующей генетической конструкции под контролем конститутивного или индуцибельного промотора или доставку соответствующих полипептидов в клетки. Активацию генов факторов элонгации, например, greA и/или greB или их гомологов, присутствующих в геноме бактерии, например, в Escherichia coli, можно осуществлять специфичным и неспецифичным образом. В первом случае, активируют или увеличивают степень активности промоторов ограниченного числа генов или только промоторов целевых генов. Во втором случае, воздействие на клетку приводит к активации и увеличению уровня активности промоторов широкого круга генов, которые в том числе включают и целевые гены/промоторы. Примером такой неспецифичной активации генов может служить тепловой шок, высокочастотное облучение, осмотический шок.

[00116] Для доставки генетических конструкций и полинуклеотидов в бактерии можно использовать бактериофаги и агенты на их основе. В рамках этого подхода можно использовать умеренные бактериофаги или их производные (например, фагмиды), способные встраиваться в геном бактерии и таким образом доставлять в бактерию требуемый ген, например, гены greA и/или greB или их гомолог, или полинуклеотид или экспрессионную конструкцию, кодирующие желательный фактор элонгации транскрипции или его функциональный аналог целью повышения уровня их экспрессии. Неограничивающие примеры таких систем доставки раскрыты, например, в: Principi N. Et al., 2019, https://doi.org/10.3389/fphar.2019.00513; Westwater С. et al., 2003, doi: 10.1128/AAC.47.4.1301-1307.2003; Karimi M et al., 2017, doi: 10.1016/i.addr.2016.03.003. В случае бактерий также известны способы передачи генетических конструкций от донора к реципиенту in vivo, например, описанные в публикации Ronda et al., 2019 (doi: 10.1038/s41592-018-0301-у).

[00117] Кроме того, специалистам будут известны способы доставки самих полипептидов факторов элонгации транскрипции, например, GreA и/или GreB в клетки. Неограничивающие примеры таких систем доставки с применением наночастиц раскрыты, например, в Gao W. et al., 2014, doi: 10.1002/wnan.l282. Неограничивающие примеры таких систем доставки с применением (поли)пептидов раскрыты, например, в: Якимов А.П. и др., ACTA NATURAE | ТОМ 8 №4 (31), 2016; Rajarao, G.K. et al., 2002, DOI: 10.1111/j.1574-6968.2002.tb11401.x; Lee, H.-M., et al., 2021, https://doi.org/10.1038/s42003-021-01726-w.

[00118] Термин «Экзонуклеазная активность» означает ферментативную активность, которая обеспечивает отщепление нескольких последовательных нуклеотидов с 3' конца молекулы полинуклеотида, в предпочтительном случае - молекулы РНК.

[00119] Под указанием на «по существу аналогичную функция/активность» каких-либо двух или боле агентов или воздействий понимают их взаимозаменяемость в рамках некоторого варианта реализации настоящего изобретения, при которой выбор любого из указанных агентов или воздействий не влияет на возможность достижения технического результата изобретения.

[00120] В настоящей заявке первое соединение (например, ингибитор РНКП), как полагают, «связывается» со вторым соединением (например, РНКП), если оно имеет константу диссоциации Kd в отношении указанного второго соединения 1 мМ или менее, предпочтительно 100 мкМ или менее, предпочтительно 50 мкМ или менее, предпочтительно 10 мкМ или менее, предпочтительно 5 мкМ или менее, более предпочтительно 1 мкМ или менее, более предпочтительно 500 нМ или менее, более предпочтительно от 200 нМ или менее, еще более предпочтительно 50 нМ или менее.

[00121] Выражение «условия, которые позволяют» означает обеспечение указанного результата или активности, но не влияют на технический результат изобретения. Например, фраза «обеспечение контакта соединения X с РНКП в условиях, которые позволяют ингибирование активности РНКП» будет означать обеспечение доставки соединения X к РНКП в таких количестве/концентрации и при других условиях, например, нативных условиях для РНКП, и физико-химических параметрах окружения, что будет происходить ингибирование активности РНКП.

[00122] Аналогичным образом фраза: «в условиях, которые позволяют увеличение экспрессии и/или активности фактора элонгации РНКП под действием Y» будет означать, что Y обеспечивают в нужном месте и количестве для того, чтобы в результате увеличилась экспрессия и/или активность фактора элонгации РНКП. Специалистам в данной области техники будут известны способы и средства, с помощью которых можно обеспечить «условия, которые позволяют» достигнуть определенный результат, и такие способы и средства могут быть любыми и не являются частью настоящего изобретения.

[00123] Термины «эффективный» или «терапевтически эффективный» относятся к действию, достаточному для инициации требуемого биохимического или биологического ответа. Специалистам в данной области техники понятно, что действие комбинации согласно настоящему изобретению может варьироваться в зависимости от таких факторов как требуемая биологическая конечная точка, фармакокинетика доставляемых агентов, РНКП подлежащая ингибированию, конкретная клетка, бактерия или вирус, транскрипцию в которых требуется ингибировать, заболевание, подлежащее лечению, способ введения и конкретный пациент. Лечение обычно является «эффективным», если уменьшается один или более симптомов или клинических маркеров. Альтернативно, лечение является «эффективным», если прогрессирование заболевания, расстройства или медицинского состояния замедлено или остановлено.

[00124] Под «эффективной концентрацией» понимаю количество вещества на единицу объема, которое обеспечивает желательное действие или результат. Предпочтительно, под эффективной концентрацией понимают локальную концентрацию, то есть количество активного вещества в месте или объеме, в котором желательно обеспечить его действие.

[00125] Эффективное количество: Ингибитор или ингибиторы предпочтительно вводятся в терапевтически эффективном количестве. «Терапевтически эффективное количество» для каждого активного соединения/ингибитора может варьировать в зависимости от факторов, включающих, но не ограничивающихся следующим: активность используемого соединения, стабильность активного соединения в организме пациента, тяжесть состояния, которое необходимо облегчить, общая масса пациента, получающего лечение, путь введения, легкость всасывания, распространения и выведения соединения организмом, возраст и чувствительность пациента, подлежащего лечению, нежелательные явления и т.п., что должно быть очевидным для специалиста в данной области. Вводимое количество может корректироваться, так как различные факторы меняются с течением времени. Ингибиторы, способы и области применения, описанные в настоящей заявке, применимы как для лечения человека, так и для применения в ветеринарии.

[00126] В случае соединений, которые связывают РНКП в соответствии с настоящим изобретением и обеспечивают ингибирование транскрипции при увеличении экспрессии и/или активности фактора элонгации РНКП эффективное количество может соответствовать MIC или IC50 в области ингибирования транскрипции или в клетке-мишени. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения указанное соединение присутствует в области ингибирования транскрипции или в клетке-мишени в количестве или концентрации, которые эффективны для существенного или полного ингибирования транскрипции при увеличении экспрессии и/или активности фактора элонгации РНКП. Под существенным ингибированием транскрипции может, например, пониматься такое ингибирование транскрипции, которое обеспечивает уменьшение роста, размножения и/или жизнеспособности соответствующего патогена или нежелательного организма (клетки) или предотвращение роста и/или размножения патогена или нежелательного организма. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения под существенным ингибированием транскрипции понимают замедление процесса транскрипции до необходимого значения или уровня. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения эффективное количество соединения, которое связывается с и/или ингибирует РНКП в случае увеличения экспрессии и/или активности фактора элонгации РНКП существенно меньше, например, в два, пять, десять, сто, двести, пятьсот, тысячу или более раз меньше, чем количество указанного соединение, которое обеспечивает ингибирование транскрипции в случае, когда экспрессия и/или активность фактора элонгации РНКП не увеличены.

[00127] Специалистам будет понятно, что эффективное количество соединений, которые применяют в соответствии с настоящим изобретением может быть различным в зависимости от конкретной РНКП, конкретного микроорганизма, того, находится ли он в биопленке или каком-либо компартменте, клетке, ткани, микроокружении, или дополнительных веществ, молекул или воздействий, которые присутствуют в месте или клетке, где происходит ингибирование активности РНКП и/или ингибирование транскрипции. Например, MIC стрептолидигина составляет приблизительно 2-3 микрограмма на миллилитр в случае E. coli, приблизительно 1.6 и 6.25 миллиграмм на литр в случае Streptococcus salivarius и Mycobacterium smegmatis, соответственно, и приблизительно 100 миллиграмм на литр в случае Mycobacterium tuberculosis. Добавление двухвалентных катионов, например, MgCl2 может приводить к уменьшению значений MIC в 10-20 раз. MIC различных производных тетрамовой кислоты по отношению к метициллин-чувствительному Staphylococcus aureus 8325 (MSSA), Enterococcus faecalis ATCC 33186 (EF) и Bacillus anthracis Sterne 34F2 (BA) существенным образом отличаются и составляют от 0.4 до более 200 микрограмм на миллилитр (см.„ например, Таблицы 2.1, 2.2 в Wilson, Jason В., 2008, http://dx.doi.org/10.21007/etd.cghs.2008.0354). Эффективные концентрации различных производных тетрамовой кислоты в отношении некоторых G+ бактерий, например, также раскрыты в публикации Yendapally R et al., 2008, https://doi.org/10.1021/jm701356q. Действие производных ройтерициклина на Staphylococcus aureus с МЛУ, находящийся в биопленке, раскрыто, например в Hurdle et al., 2009, DOI: https://doi.org/10.1128/AAC.00457-09. В каждом конкретном случае осуществления настоящего изобретения специалист сможет определить эффективное количество соединения, которое связывается с РНКП.

[00128] Под термином «влияние» понимают изменение или изменения, которые произошли при осуществлении указанных действий или как результат упоминаемых события, комбинации параметров или процесса, и которых бы не было в случае отсутствия по меньшей мере части указанных действий или отсутствия такого события, комбинации параметров или процесса. В рамках настоящего изобретения результат осуществления определенной операции, ряда операций, влияния/воздействия или степень изменений можно определять качественно или количественно на основе анализа конкретных измеримых характеристик. В большинстве случаев специалистам будут известны средства и методы для измерения таких характеристик, в том числе характеристик и параметров по которым можно судить о достижении технического результата настоящего изобретения. Тем не менее, в некоторых случая можно осуществлять качественную оценку результата осуществления определенной операции, ряда операций, влияния/воздействия или степени изменений. Неограничивающими примерами качественной оценки влияния специалистами или субъектами, которую они могут осуществить в дополнение или вместо количественной оценки, могут служить определение наличия изменений по принципу «есть/нет», суждения об изменении вкуса, запаха, цвета, других осязаемых параметров.

[00129] Термин «носитель» относится к растворителю, добавке, вспомогательному веществу, дисперсионной среде, солюбилизирующему агенту, покрытию, консерванту, изотоническому агенту и агенту, замедляющему абсорбцию, поверхностно-активному веществу, пропелленту, разбавителю, основе и тому подобному, с чем вводят активное соединение. Такие носители могут быть стерильными жидкостями, такими как вода, физиологические растворы, водные растворы декстрозы, водные растворы глицерина, и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное.

[00130] При использовании в настоящем документе фраза «фармацевтически приемлемый» относится к соединениям, материалам, композициям и/или лекарственным формам, которые по результатам тщательного медицинского обследования подходят для применения в контакте с тканями человека и животных, не вызывая избыточную токсичность, раздражение, аллергический ответ или другую проблему или осложнение, и имеют приемлемое отношение благоприятное действие/риск. Так, «фармацевтически приемлемый носитель» относится к любому и всем растворителям, добавкам, вспомогательным веществам, дисперсионным средам, солюбилизирующим агентам, покрытиям, консервантам, изотоническим агентам и агентам, замедляющим абсорбцию, поверхностно-активным веществам, пропеллентам, разбавителям, основам и тому подобному, что является физиологически совместимым. Носитель (-и) должен быть «приемлемым» в смысле отсутствия вреда для субъекта, подлежащего лечению, в количествах, обычно применяемых в медикаментах. Фармацевтически приемлемые носители совместимы с другими ингредиентами композиции, не делая композицию непригодной для ее предполагаемого назначения. Кроме того, фармацевтически приемлемые носители подходят для применения к субъектам, как предложено здесь, без чрезмерных неблагоприятных побочных эффектов (таких как токсический эффект, раздражение и аллергическая реакция). Побочные эффекты являются «чрезмерными», если их риск превышает пользу, обеспечиваемую композицией. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ включают любые из стандартных фармацевтических носителей, такие как забуференные фосфатом физиологические растворы, вода и эмульсии, такие как эмульсии масло/вода и микроэмульсии. Подходящие фармацевтические носители описаны, например, в «Remington's Pharmaceutical Sciences», Е.W. Martin, 18th Edition. Фармацевтически приемлемый носитель может быть носителем, не существующим в природе.

[00131] Для целей настоящего изобретения активное соединение, как определено в настоящему описании, также включает в себя его соль, например, фармацевтически приемлемую(ые) соль(и). В контексте настоящей заявки фраза «фармацевтически или косметически приемлемая(ые) соль(и)» означает соли соединений по настоящему изобретению, которые безопасны и эффективны для желаемой формы введения. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, образованные анионами, например, соли, полученные из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.п., и соли, образованные катионами, например, соли натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.п.

[00132] Термин «фармацевтически приемлемые соли» в настоящей заявке включает соли активных соединений, полученные из относительно нетоксичных кислот или оснований, в зависимости от того, какие замещающие группы присутствуют в конкретных соединениях, описанных в настоящем документе. Если соединения согласно настоящему изобретению содержат функциональные группы, обуславливающие их относительно кислотные свойства, можно получить их соли за счет присоединения оснований, приводя в контакт нейтральную форму таких соединений с достаточным количеством требуемого основания, либо в чистом виде, либо в подходящем инертном растворителе. Примеры фармацевтически приемлемых солей, получаемых присоединением оснований, включают соли натрия, калия, кальция, аммония, органических аминов или магния, или подобные соли. Если соединения согласно настоящему изобретению содержат функциональные группы, обуславливающие их относительно основные свойства, можно получить их соли за счет присоединения кислот, приводя в контакт нейтральную форму таких соединений с достаточным количеством требуемой кислоты, либо в чистом виде, либо разбавленной в подходящем инертном растворителе. Примеры фармацевтически приемлемых солей, получаемых присоединением кислот, включают соли неорганических кислот, таких как соляная, бромистоводородная, азотная, угольная, однозамещенная угольная, фосфорная, однозамещенная фосфорная, двухзамещенная фосфорная, серная, однозамещенная серная, йодистоводородная или фосфорные кислоты и т.п., а также соли относительно нетоксичных органических кислот, таких как уксусная, пропионовая, изомасляная, щавелевая, малеиновая, малоновая, бензойная, янтарная, субериновая, фумаровая, миндальная, фталевая, бензолсульфоновая, п-толилсульфоновая, лимонная, винная, метансульфоновая и т.п. Также включены соли аминокислот, такие как аргинат и т.п., и соли органических кислот, таких как глюкуроновая или галактуроновая кислоты и т.п. (см., например, Berge S.M. et al., "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19). Некоторые конкретные соединения согласно настоящему изобретению содержат и основную, и кислотную функциональные группы, что позволяет получать соли этих соединений за счет присоединения как оснований, так и кислот.

[00133] В рамках настоящей заявки под «ингибитором РНКП» понимают любое соединение, которое способно связываться с РНКП и препятствовать или полностью прекращать синтез РНК. Известно несколько классов агентов, которые способны связывать и ингибировать действие бактериальной РНК полимеразы, включая вещества природного происхождения и синтезированные молекулы, такие как анзамицины ansamycins (например, стрептоварицины и рифамицины (streptovaricins, rifamycins)) сорангицин (sorangicin) и рипостатины, стрептолидигин (streptolydigin) и другие производные тетрамовой кислоты, микроцины и лассо-пептиды бактерий (такие как, например, ацинетодин и клебсидин, см.. Фиг. 6), пиронины (например, миксопиронин (myxopyronin), корллопиронин (corallopyronin) а также многочисленные синтетические молекулы (например аналоги CBR703, GE23077, SB2 (фенил-фуранил-роданины), уреидотиофен (ureidothiophene), которые способны связываться с РНК полимеразой и ингибировать различные стадии процесса транскрипции.

[00134] В рамках настоящего изобретения предпочтительными являются соединения, которые связываются с РНКП, в частности, ингибиторы РНК полимеразы, которые связываются с активным центром РНКП, например, поступают в активный центр через вторичный канал. В случае бРНКП предпочтительными соединения, область связывания которых с бРНКП по меньшей мере частично перекрывается с областью связывания стрептолидигина.

[00135] Производные тетрамовой кислоты: Под «производным тетрамовой кислоты» понимают любые соединения, которые содержат группу пирролидин-2,4-диона (тетрамовой кислоты)

[00136] Различные производные тетрамовой кислоты могут быть выделены из природных источников или синтезированы. Способы синтеза таких производных известны специалистам в данной области техники, см., например, Isao Mizota et al., Org. Lett. 2020, https://doi.org/10.1021/acs.orglett.0c00824; Jeong & Moloney, Synlett 2009(15): 2487-2491, doi: 10.1055/s-0029-1217745; Singh et al., 2006, Belastein Journal of Organic Chemistry, doi: 10.1186/1860-5397-2-24; Wilson, Jason В., "Synthesis and Evaluation of Tetramic Acids as Antimicrobial Agents" (2008). Theses and Dissertations (ETD). http://dx.doi.org/10.21007/etd.cghs.2008.0354

[00137] Неограничивающими примерами производных тетрамовой кислоты являются:

[00138] тенуазоновая кислота (Tenuazonic acid) Org Biomol Chem, 2, 2004, 3524; ройтерициклин (Reutericyclin) Synthesis, 2006, 3902; мелофлин В (Melophlin В) Tetrahedron, 61, 2005, 2301; макроцидин A (Macrocidin A) Org Lett, 18, 2016, 6352; равеновая кислота (Ravenic acid) Chem Eur J, 16, 2010, 2599; эпикокамид D (Epicoccamide D) Chem Eur J, 19, 2013, 10619; пеницилленол C1 (Penicillenol С₁) J Org Chem, 78, 2013, 2455; торрубиелон D (Torrubiellone D) Org Lett, 18, 2016, 1136; аурантозид G (Aurantoside G) Angew Chem IE, 55, 2016, 10122; метиосетин (Methiosetin) J Org Chem, 81, 2016, 7336; ригидиускуламид В (Rigidiusculamide В) Org Biomol Chem, 14, 2016, 9262; F-14329* Chem Eur J, 23, 2017, 5692; спиросциталин (Spiroscytalin) J Org Chem, 82, 2017, 7791; анкоринозид A (Ancorinoside A) Chem Eur J, 23, 2017, DOI: 10.1002/chem.201704379; кладозин С (Cladosin С) Org Biomol Chem, 15, 2017, 7672, производные указанных соединений, а также соединения раскрытые в публикациях: Jiang et al., Mar Drugs, 2020 18(2): 114, (doi: 10.3390/md18020114); US 4,169,096, 25.09.1979; WO 01/51465 A1, 19.07.2001; US 6,962,943 B2, 8.11.2005; US 6,599,930 B2 of 29.07.2003; WO 2014/001775 A1, 03.01.2014, Yendapally R et al., 2008, https://doi.org/10.1021/jm701356q; Hurdle et al., 2009, DOI: https://doi.org/10.1128/AAC.00457-09, включая содержание источников, указанных посредством ссылки в этих публикациях.

[00139] Под аналогом упоминаемого соединения или малой молекулы может пониматься их структурный, химический или функциональный аналог. Таким образом, данный термин охватывает соединения, химическая или пространственная структура которых отличается от упоминаемого соединения, но такие отличия не влияют или в существенной степени не влияют на функцию или активность, которая обеспечивает возможность осуществления настоящего изобретения. Такие аналоги могут включать изомеры, химически модифицированные производные или миметики упоминаемого соединения. Например, аналог соединения, которое связывается с РНКП может представлять собой молекулу или вещество любой природы, которые связываются с теми же частями молекулы РНКП и оказывают при связывании такое же влияние на структуру или активность РНКП, что и упоминаемое соединение.

[00140] В настоящем описании термин «пролекарство» относится к любому соединению, которое при введении в биологическую систему образует соединение согласно настоящему описанию, которое ингибирует активность ВГС («активное ингибирующее соединение»). Соединение может образовываться из пролекарства в результате: (i) спонтанной(ых) химической(их) реакции(й), (ii) катализируемой(ых) ферментами химической(их) реакции(й), (iii) фотолиза и/или (iv) метаболической(их) химической(их) реакции(й).

[00141] Термин «фрагмент пролекарства» относится к лабильной функциональной группе, которая отделяется от активного ингибирующего соединения в процессе метаболизма, в организме, внутри клетки, в результате гидролиза, ферментного расщепления или в ходе другого процесса (Bundgaard, Hans, «Design and Application of Prodrugs» в A Textbook of Drug Design and Development (1991), P. Krogsgaard-Larsen and H. Bundgaard, Eds. Harwood Academic Publishers, pp. 113-191). Ферменты, способные осуществлять ферментную активацию пролекарств соединений согласно настоящему описанию включают, но не ограничиваются ими, амидазы, эстеразы, микробные ферменты, фосфолипазы, холинэстеразы и фосфазы. Фрагменты пролекарства способны увеличивать растворимость, абсорбцию и липофильность для оптимизации доставки лекарственного средства, его биодоступности и эффективности. Фрагмент пролекарства может содержать активный метаболит или указанное лекарственное средство само по себе.

[00142] Сольваты: Дополнительно, соединения, которые применяют согласно настоящему изобретению, соли или пролекарства таких соединений, могут существовать в гидратированной или негидратированной (безводной) форме или в виде сольватов с молекулами других растворителей. Неограничивающие примеры гидратов включают моногидраты, дигидраты и т.д. Неограничивающие примеры сольватов включают этанольные сольваты, ацетоновые сольваты и т.д.

Подробное раскрытие сущности и аспектов настоящего изобретения

[00143] В соответствии с настоящим изобретением предложены новые подходы к ингибированию активности РНК полимеразы, а также соответствующе средства и способы ингибирования транскрипции, которые можно применять, в частности, в целях получения новых классов антибактериальных, антимикотических и противовирусных средств.

[00144] В рамках работы над настоящим изобретением авторы обнаружили, что транскрипционные факторы, которые отвечают за процессивность РНК полимеразы, неожиданным образом обеспечивают или усиливают ингибирующее действие соединений, которые связываются с РНК полимеразой, на процесс транскрипции.

[00145] Таким образом, настоящее изобретение, в целом, основано на том, что ингибирующее действие соединения, которое связывается с РНК полимеразой, на транскрипцию проявляется или усиливается при увеличении количества и/или активности фактора элонгации (транскрипционного фактора), который используется указанной РНК полимеразой (РНКП). Предпочтительно, указанное проявление или усиление ингибирующего действия на РНКП имеет синергетический характер.

[00146] Соответственно, настоящее изобретения, относится к применению средств, которые увеличивают экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП для усиления или обеспечения ингибирования транскрипции соединением, которое способно связываться с РНКП.

[00147] В качестве технического результата настоящего изобретения, например, можно рассматривать усиление или проявления ингибирующего действия, которое оказывает соединение, связывающееся в РНКП на синтез РНК. В качестве еще одного технического результата настоящего изобретения можно рассматривать расширение спектра средств (препаратов) для ингибирования транскрипции. В качестве еще одного технического результата настоящего изобретения можно рассматривать увеличение эффективности существующих средств ингибирования транскрипции.

[00148] В случае, когда обеспечивается эффективное ингибирование транскрипции для применения в медицине, например, для устранения бактериальных, дрожжевых и/или вирусных патогенов, качестве еще одного технического результата настоящего изобретения можно рассматривать как уменьшение или устранение негативных последствий и симптомов инфицирования указанными бактериями, грибами и/или вирусами, так и уменьшение нежелательного побочного действия используемых антибактериальных, антимикотических или противовирусных средств, например, за счет уменьшения их количества или времени действия, которые требуются для обеспечения желательного результата.

[00149] В случае осуществления способов скрининга согласно настоящему изобретению технический результат настоящего изобретения может заключаться в определении ряда (библиотеки) кандидатных веществ/соединений (перспективных, потенциально пригодных веществ) для ингибирования транскрипции (ингибирования активности РНКП) в комбинации со средством в комбинации со средством, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП. Технический результатом способов скрининга согласно настоящему изобретения также может заключаться в исключении ряда веществ или классов веществ/соединений как подходящих для применения для ингибирования транскрипции в соответствии с настоящим изобретением.

[00150] В случае бРНКП ингибирование синтеза РНК в бактерии будет приводить к подавлению роста и/или уменьшению жизнеспособности бактерии. В случае вРНКП ингибирование синтеза РНК вируса будет приводить к подавлению размножения или цикла развития вируса. В случае гРНКП ингибирование синтеза РНК гриба, например, дрожжей или плесени, будет приводить к подавлению размножения или цикла развития самого гриба или вируса гриба. В случае эРНКП ингибирование синтеза РНК можно использовать для модуляции транскрипции, например подавлению синтеза нежелательной РНК или общей РНК в клетке.

[00151] В настоящей заявке также раскрыты способы получения препаратов, которые могут представлять собой композиции и комбинации для ингибирования РНКП, которые включают по меньшей мере два компонента. В случаях, когда указанные препараты оказывают ингибирующее воздействие на РНК полимеразы бактерий (бРНКП) их можно применять в качестве антибактериальных средств. В случаях, когда указанные препараты оказывают ингибирующее воздействие на РНК полимеразы грибов (гРНКП) их можно применять в качестве антимикотических средств. В случаях, когда указанные препараты оказывают ингибирующее воздействие на РНК полимеразы, которые используют вирусы (вРНКП) их можно применять в качестве противовирусных средств.

[00152] Специалистам будет понятно, что настоящее изобретение не ограничено только теми соединениями, которые способны связывать и предпочтительно ингибировать РНКП, и только теми средствами, обеспечивающими увеличение количества и/или активности фактора элонгации (транскрипционного фактора), используемого указанной РНКП, которые непосредственно раскрыты в настоящей заявке, а также распространяется на те соединения и средства, взаимное влияние которых на РНКП специалисты смогут обнаружить после ознакомления с настоящей заявкой, например, с применением раскрытых в настоящем описании способов получения и скрининга. Соответственно, конкретные варианты реализации настоящего изобретения и мишени для средств (препаратов), которые можно получить в соответствии с настоящим изобретениям, будут зависеть от происхождения (источника, например, конкретной бактерии, вируса, гриба или клетки) конкретной РНКП, на которую будет оказывать ингибирующее воздействие соединение согласно настоящему изобретению при увеличении активности и/или количества соответствующего фактора элонгации (транскрипционного фактора РНКП.

[00153] Соответственно, в качестве аналогов настоящего изобретения можно рассматривать соединения, для которых показана способность связываться с РНКП и/или ингибировать активность РНКП и их применение для ингибирования РНКП, в частности, соединения, раскрытые в настоящей заявке.

Сущность настоящего изобретения

[00154] Таким образом, в целом, настоящее изобретение относится к применению средства, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП для усиления или обеспечения ингибирующего действия соединения, которое способно связываться указанной РНКП.

[00155] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соединение, которое связывается (взаимодействует) с РНК полимеразой представляет собой малую молекулу. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соединение, которое связывается (взаимодействует) с РНК полимеразой и которое применяют в соответствии с настоящим изобретением, увеличивает время жизни одной из конформаций РНКП и/или способствует увеличению длительности переходного состояния между конформациями РНКП (времени жизни промежуточной конформаций РНКП) и/или опосредует возникновение новой структурной конформаций РНКП при осуществлении процесса транскрипции. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соединение, которое связывается (взаимодействует) с РНК полимеразой представляет собой ингибитор РНК полимеразы.

[00156] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения соединение, которое связывается (взаимодействует) с РНК полимеразой и которое применяют в соответствии с настоящим изобретением, приобретает свойство ингибировать элонгацию транскрипции РНК полимеразы в случае увеличения экспрессии и/или активности фактора элонгации РНКП.

[00157] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения ингибитор РНК полимеразы представляет собой ингибитор транскрипции на стадии инициации, элонгации или терминации транскрипции.

[00158] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения РНК полимераза представляет собой бактериальную РНК полимеразу, РНК полимеразу гриба, например, дрожжей, или вирусную РНК полимеразу. В некоторых аспектах настоящего изобретения РНК полимераза может представлять собой эукариотическую РНК полимеразу.

[00159] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения РНК полимераза представляет собой вирусную РНК полимеразу из РНК-вируса, например, короновируса, норовируса, рабдовируса, энтеровируса, вируса гриппа, пикорнавируса, аренавируса, вирус Эбола, рабдовируса, парамиксовируса, флавивируса, гепадновируса, например, РНК полимеразу из SARS-Cov-2, РНК полимеразу вируса гриппа или РНК полимеразу, которую использует вирус гепатита С или ВИЧ.

[00160] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения ингибитор РНК полимеразы не ингибирует или в существенной степени не ингибирует эукариотическую РНК полимеразу.

[00161] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения ингибитор РНК полимеразы представляет собой производное тетрамовой кислоты. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения ингибитор РНК полимеразы представляет собой производное тетрамовой кислоты, которое способно связываться с бРНКП и предпочтительно обладает антибактериальным действием, или сольват, соль, пролекарство или производное указанного производного тетрамовой кислоты, которое обладает аналогичными свойствами и/или антибактериальной активностью

[00162] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения производное тетрамовой кислоты представляет собой стрептолидигин

[00163] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения агент, который увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП представляет собой генетическую конструкцию, которая обеспечивает экспрессию фактора элонгации РНКП в клетке. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения агент, который увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП представляет собой вирус, который содержит генетическую конструкцию, которая обеспечивает экспрессию фактора элонгации РНКП в клетке. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения агент, который увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП представляет собой генетическую конструкцию, которая обеспечивает экспрессию фактора элонгации РНКП и интегрирована в геном клетки. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения указанная конструкция находится под контролем индуцибельного промотора.

[00164] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения агент, который увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП представляет собой малую молекулу, которая индуцирует экспрессию фактора элонгации РНКП. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения агент, который увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП представляет собой малую молекулу, нуклеотид, пептид или полипептид, которые обеспечивают экспрессию фактора элонгации РНКП или переход фактора элонгации РНКП в активную форму.

[00165] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения агент, который увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП представляет собой бактериофаг, которые доставляет в бактерию генетическую конструкцию, которая обеспечивает экспрессию фактора элонгации бРНКП.

[00166] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения агент или воздействие, которые увеличивают экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП обеспечивают увеличение количества фактора элонгации РНКП в клетке. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения увеличение активности фактора элонгации РНКП обеспечивают посредством увеличение количества фактора элонгации РНКП в клетке. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения увеличение активности фактора элонгации РНКП обеспечивают посредством доставки фактора элонгации РНКП в клетку.

[00167] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения воздействие, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП представляет собой изменение температуры, облучение, включая оптическое и высокочастотное облучение, изменение физических и/или химических характеристик среды или жидкости в области или в окружении, в которых находится клетка.

[00168] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП, увеличивают с помощью агента или воздействия, которые увеличивают экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП, например, посредством активации промотора гена фактора элонгации РНКП, уже присутствующего в геноме указанной клетки; трансформации или трансдукции указанной клетки с внедрением клетку гетерологичного гена фактора элонгации РНКП; доставки белков ФЭТ в указанную клетку.

[00169] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения агент, который увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП выбран из: генетической конструкции, которая обеспечивает экспрессию фактора элонгации РНКП, вируса, который доставляет в клетку генетическую конструкцию, которая обеспечивает экспрессию фактора элонгации РНКП, малой молекулы, нуклеотида, пептида или полипептида, которые обеспечивают экспрессию фактора элонгации РНКП или переход фактора элонгации РНКП в активную форму и/или указанный агент обеспечивает увеличение количества фактора элонгации РНКП в клетке; и/или воздействие, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП представляет собой изменение температуры, облучение, включая оптическое облучение, изменение физико-химических характеристик среды или жидкости в области или в окружении, в которых находится указанная клетка.

[00170] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения указанная клетка представляет собой клетку бактерии или гриба. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения РНКП представляет собой РНКП бактерии, эукариотическую РНКП, например, РНКП гриба, или РНКП, которую использует вирус, например, вРНКП, кодируемую вирусом.

[00171] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения фактор элонгации РНКП представляет собой фактор элонгации или транскрипционный фактор РНКП, которые обладают экзонуклеазной активностью. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения фактор элонгации РНКП обеспечивает отщепление по меньшей мере приблизительно 2-3 или по меньшей мере приблизительно до 10-15 рибонуклеотидов с конца молекулы РНК, которую синтезирует РНК полимераза.

[00172] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения фактор элонгации РНКП представляет собой GreA или GreB из E. coli или аналог или гомолог указанных факторов, который обладает по существу аналогичной функцией или активностью.

[00173] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения гомолог GreA или GreB или производное, которое сохраняет активность GreA или GreB имеет по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98%, по меньшей % идентичности последовательности с GreA или GreB из Е. coli.

Способы получения

[00174] В настоящей заявке также предложены способы получения средств, которые могут представлять собой композиции и комбинации для ингибирования РНКП.

[00175] Согласно одному из вариантов реализации способ согласно настоящему изобретению включает обеспечение соединения, которое способно связываться с РНКП; обеспечение средства, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации указанной РНКП; приведение в контакт эффективного количества указанного соединения и эффективного количества указанного средства с РНКП или клеткой, в которой присутствует РНКП, в условиях, которые позволяют связывание указанного соединения с РНКП и увеличение экспрессии и/или активности фактора элонгации указанной РНКП под действием указанного средства, и определение влияния, которое комбинация указанных соединения и средства оказывает на активность РНКП, причем комбинацию выбирают в качестве средства для ингибирования транскрипции, если влияние комбинации на активность РНКП является отрицательным (ингибирующим) и более сильным (выраженным), чем влияние только самого указанного соединения на активность указанной РНКП.

[00176] Согласно одному из вариантов реализации согласно настоящему изобретению обеспечивают ингибирование стадии элонгации транскрипции.

[00177] Согласно некоторым вариантам реализации указанное средство, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП представляет собой агент или воздействие.

[00178] В некоторых вариантах реализации РНКП представляет собой бактериальную РНКП (бРНКП), факторы элонгации представляют собой факторы элонгации бРНКП, а предложенные в соответствии с настоящим изобретением композиции или комбинации обладают антибактериальным действием, например, отрицательно влияют на рост и/или жизнеспособность указанной бактерии. В вариантах реализации, когда бРНКП используется вирусом (фагом), указанные комбинации предотвращают или ингибируют развитие вируса в клетке бактерии.

[00179] В других вариантах реализации РНКП представляет собой РНКП вируса (вРНКП), факторы элонгации представляют собой факторы элонгации, используемые вРНКП, например, белки эукариотической клетки, а предложенные в соответствии с настоящим изобретением композиции или комбинации обладают противовирусным действием, например, предотвращают или ингибируют развитие вируса в клетке.

[00180] В некоторых вариантах реализации РНКП представляет собой РНКП гриба (гРНКП), факторы элонгации представляют собой факторы элонгации, которые использует гРНКП, а предложенные в соответствии с настоящим изобретением композиции или комбинации обладают антимикотическим действием, например, отрицательно влияют на рост и/или жизнеспособность указанного гриба. В вариантах реализации, когда бРНКП используется вирусом (фагом), указанные комбинации предотвращают или ингибируют развитие вируса в клетке гриба.

Способы скрининга

[00181] Также в настоящей заявке предложены способы скрининга для поиска новых ингибиторов РНК полимеразы для применения в комбинации со средством, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации, или выявления существующих ингибиторов РНКП, эффективность которых увеличивается в указанной комбинации. Указанные способы включают определение ингибирующего действия множества веществ, например, малых молекул, (поли)пептидов, нуклеотидов, обладающих способностью связываться с РНКП в комбинации с воздействием в эффективном количестве средства, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации (транскрипционного фактора) указанной РНКП в соответствии с настоящим изобретением. Те вещества из указанного множества веществ, ингибирующее действие которых проявляется или усиливается при увеличении экспрессии и/или активности фактора элонгации РНКП выбирают для применения в качестве ингибиторов РНКП в комбинации с указанным средством.

[00182] В соответствии с одним из вариантов реализации предложены способы скрининга для поиска новых антибактериальных средств. Эти способы включают определение антибактериального действия множества веществ, например, малых молекул, (поли)пептидов, нуклеотидов, обладающих способностью связываться с бРНКП в комбинации со средством, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации бРНКП (бактериального транскрипционного фактора) в соответствии с настоящим изобретением. Те вещества из указанного множества веществ, антибактериальное действие которых появляется или усиливается при увеличении экспрессии и/или активности фактора элонгации бРНКП выбирают для применения в качестве антибактериальных препаратов (агентов) в комбинации с указанным средством.

[00183] В соответствии с одним из вариантов реализации предложены способы скрининга для поиска новых противовирусных средств. Эти способы включают определение противовирусного действия множества веществ, например, малых молекул, (поли)пептидов, нуклеотидов, обладающих способностью связываться с вРНКП или РНКП, которую использует вирус, в комбинации со средством, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации вРНКП или фактора элонгации или РНКП, которую использует вирус, (например транскрипционного фактора эукариот) в соответствии с настоящим изобретением. Те вещества из указанного множества веществ, ингибирующее действие которых на вРНКП или РНКП, которую использует вирус появляется или усиливается при увеличении экспрессии и/или активности фактора элонгации, который использует указанная РНКП увеличении экспрессии и/или активности фактора элонгации вРНКП выбирают для применения в качестве противовирусных препаратов (агентов) в комбинации с указанным средством.

[00184] В соответствии с одним из вариантов реализации предложены способы скрининга для поиска новых антимикотических средств. Эти способы включают определение антимикотического действия множества веществ, например, малых молекул, (поли)пептидов, нуклеотидов, обладающих способностью связываться с гРНКП в комбинации со средством, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации гРНКП в соответствии с настоящим изобретением. Те вещества из указанного множества веществ, ингибирующее действие которых на гРНКП появляется или усиливается при увеличении экспрессии и/или активности фактора элонгации гРНКП выбирают для применения в качестве антимикотических препаратов (агентов) в комбинации с указанным средством.

[00185] В рамках некоторых вариантов реализации способов скрининга согласно настоящему изобретению указанные вещества из указанного множества веществ, ингибирующее действие которых на соответствующую РНКП появляется или усиливается при увеличении экспрессии и/или активности фактора элонгации, который использует указанная РНКП, первоначально выбирают в качестве кандидатных веществ (перспективных, потенциально пригодных веществ) для применения в комбинации с указанным средством для ингибирования соответствующей РНКП. После определения совокупности таких кандидатных веществ в некоторых вариантах реализации их дополнительно проверяют на наличие желаемого свойства, например, фармацевтическую приемлемость, биодоступность, стабильность, отсутствие токсичности и тп, и/или модифицируют для обеспечения наличия указанного желательного свойства, и отбирают те вещества, которые обладаю указанным желательным свойством.

[00186] В некоторых вариантах реализации получают модификации, модифицированные формы, производные или аналоги части или всех таких кандидатных веществ с целью модулирования их действия на РНКП, например, усиления их связывания с или ингибирующего действия на РНКП. После отбора и/или получения модификаций, модифицированных форм, производных или аналогов по меньшей мере части из первоначально выбранной совокупности кандидатных веществ, к таким отобранным, модифицированным, производным или аналогичным веществам можно применить способы скрининга или способы получения согласно настоящему изобретению.

[00187] В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение относится к библиотеке (совокупности) веществ, которые определили в результате применения способов скрининга согласно настоящему изобретению. Соответственно, в некоторых вариантах реализации способы скрининга согласно настоящему изобретению представляют собой способы получения библиотеки веществ для применения для ингибирования РНКП в соответствии с настоящим изобретением.

[00188] В некоторых своих аспектах настоящее изобретение раскрывает способы определения (идентификации) факторов элонгации РНКП, и/или их аналогов, гомологов, мутантов и вариантов, активность которых в комбинации с соединением, которое способно связываться с РНКП обеспечивает или усиливает ингибирующее действие такой комбинации на РНКП или на процесс транскрипции. РНКП, в отношении факторов элонгации которой осуществляют указанные способы выбирают из бРНКП, вРНКП, гРНКП, или РНКП, которую используют вирусы. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение раскрывает способы определения факторов элонгации вРНКП или факторов элонгации, которые использует вРНКП, а также их аналогов, гомологов, мутантов и вариантов, активность которых в комбинации с соединением, которое способно связываться с вРНКП обеспечивают противовирусное действие такой комбинации. В некоторых своих аспектах настоящее изобретение раскрывает способы определения факторов элонгации гРНКП, а также их аналогов, гомологов, мутантов и вариантов, активность которых в комбинации с соединением, которое способно связываться с гРНКП обеспечивает или усиливает антимикотическое действие такой комбинации.

[00189] В рамках указанных способов определяют ингибирующее действие вещества, например, малой молекулы, (поли)пептида, нуклеотида, обладающего способностью связываться с РНКП в комбинации с воздействием в эффективном количестве средства, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации (транскрипционного фактора) указанной РНКП, причем указанную стадию определения ингибирующего действия осуществляют для нескольких (ряда) факторов элонгации РНКП, и/или их аналогов, гомологов, мутантов или вариантов, и те факторы элонгации РНКП, и/или их аналоги, гомологи, мутанты или варианты, экспрессия и/или активность которых в комбинации с указанным веществом обеспечивает проявление или усиление ингибирующего действия на РНКП или процесс транскрипции выбирают для усиления их экспрессии и/или активности при ингибировании с применением указанного вещества средств увеличения экспрессии или активности согласно настоящему изобретению.

[00190] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения указанные аналоги или варианты представляют собой гибридные полипептиды или факторы элонгации РНКП, которые являются гетерологичными для определенной РНКП или клетки. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения указанные аналоги или варианты представляют собой полипептиды, которые содержат дополнительную непептидную группу.

Средств и препараты для ингибирования транскрипции

[00191] Настоящее изобретение также охватывает средства для ингибирования транскрипции, которые включают в эффективном количестве соединение, которое способно взаимодействовать с РНК полимеразой (РНКП), где указанное соединение определено в настоящей заявке; и средство, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП, который использует или может использовать указанная РНКП, причем комбинация указанного соединения и средства на РНКП обеспечивает уменьшение эффективности транскрипции указанной РНКП, которое более сильное, чем уменьшение эффективности транскрипции только под действием только указанного соединения.

[00192] В некоторых вариантах реализации указанное соединение само по себе не уменьшает или в существенной степени не уменьшает эффективность транскрипции.

[00193] В некоторых вариантах реализации средства согласно настоящему изобретению могут представлять собой композицию или комбинацию двух веществ, одно из которых представляет соединение, которое способно взаимодействовать с РНК полимеразой (РНКП), где указанное соединение определено в настоящей заявке, а второе представляет собой соединение, молекулу, генетическую конструкцию, белковую конструкцию или вещество, которые обеспечивают увеличение экспрессии и/или активности фактора элонгации указанной РНКП.

[00194] Неограничивающими примерами указанных соединения, молекулы, генетической конструкции, белковой конструкции, липидного комплекса или вещества могут, например, служить полинуклеотид, вектор, вирус, липосома, которые включают полинуклеотид, кодирующий указанный фактор элонгации и адаптированы для его передачи и экспрессии ФЭТ в целевой клетке. Другими примерами указанных соединения, молекулы, генетической конструкции, белковой конструкции или вещества могут, например служить различные малые молекулы, полипептиды, пептиды, олиго и полинуклеотиды, которые представляют собой индукторы экспрессии соответствующих ФЭТ в клетке, например, ФЭТ, кодируемых гетерологичными полинуклеотидами.

[00195] В некоторых вариантах реализации средства согласно настоящему изобретению могут представлять собой комбинацию вещества, которое представляет соединение, которое способно взаимодействовать с РНК полимеразой (РНКП), где указанное соединение определено в настоящей заявке, и воздействия, которое обеспечивает увеличение экспрессии и/или активности фактора элонгации указанной РНКП.

[00196] Неограничивающими примерами таких воздействий является температура и облучение, которые можно например использовать в случае термо- или фото- индуцибельной экспрессии ФЭТ.

[00197] В некоторых вариантах реализации средства согласно настоящему изобретению могут представлять собой композицию или комбинацию двух веществ, одно из которых представляет соединение, которое способно взаимодействовать с РНК полимеразой (РНКП), где указанное соединение определено в настоящей заявке, второе представляет собой соединение, молекулу, генетическую конструкцию, белковую конструкцию или вещество, которые обеспечивают увеличение экспрессии и/или активности фактора элонгации указанной РНКП, в сочетании с воздействием, которое.

[00198] В некоторых вариантах реализации средства ингибирования транскрипции согласно настоящему изобретению получают в виде препаратов, например, дезинфицирующих средств или фармацевтических композиций, которые также содержат фармацевтически приемлемые носители и наполнители. Примеры носителей известны в данной области техники и описаны в настоящей заявке. Композиции, согласно настоящему изобретению, могут содержать по меньшей мере одно средство ингибирования транскрипции согласно настоящему изобретению в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем. Примеры таких носителей и технологий изготовления лекарственных препаратов можно найти в Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th Ed., Lippincott, Williams & Wilkins, Daniel Limmer, editor) и они в целом хорошо понятны для специалиста в данной области техники. В некоторых примерах реализации настоящего изобретения препарат или фармацевтическая композиция адаптированы для доставки композиции субъекту в область присутствия нежелательного микроорганизма (область инфекции), например, в определенный орган, ткань, область организма, оболочку, область повреждения, рану.

[00199] Чтобы составить препарат или фармацевтически приемлемую композицию, пригодные для введения или нанесения на желательную область, данные композиции должны содержать эффективное количество активного соединения или соединений. В целях настоящего изобретения под эффективным количеством активного соединения понимают такое количество активного соединения, которое достаточно для обеспечения ингибирования транскрипции, опосредуемой РНКП в случае увеличения активности и/или экспрессии фактора элонгации транскрипции, который использует указанная РНКП. В случае если эффективное количество обеспечивает положительный терапевтический результат, также используют термин «терапевтически эффективное количество».

Дополнительные аспекты настоящего изобретения

[00200] Специалистам будет понятно, что композиции и средства для ингибирования транскрипции в соответствии с настоящем изобретением можно применять в медицине и различных областях техники. Задачи, которые можно решать с применением средств для ингибирования транскрипции согласно настоящему изобретению могут зависеть от конкретной РНКП, эффективность транскрипции которой уменьшают (РНКП, которую ингибируют). Так, например, препараты и средства согласно настоящему изобретению можно адаптировать и применять в рамках способов лечения нежелательных инфекций или устранения нежелательных микроорганизмов (например, патогенов) у нуждающихся в этом субъектов. В некоторых случаях, подходы к ингибированию транскрипции/РНКП и соединения, связывающие с РНКП, можно применять для селективного ингибирования роста и элиминации трансформированных клеток млекопитающих, таких как раковые клетки. Кроме того, подходы к ингибированию РНКП и/или ингибированию транскрипции могут быть полезны в сельском хозяйстве, пищевой промышленности и биотехнологии.

[00201] Помимо ингибирования и/или устранения нежелательных патогенов, которые наносят вред растениям, грибам и сельскохозяйственным животным, подходы к ингибированию активности РНКП могут быть полезны в биотехнологии например, в организмах продуцентах, которые генетически модифицированы для обеспечения конститутивной или индуцибельной экспрессии фактора элонгации РНКП. В частности, модулирование скорости транскрипции может быть полезно для оптимизации уровня экспрессии генов при биотехнологическом получении рекомбинантных белков; регуляции экспрессии определенных ферментов в искусственных биореакторах; оптимизации процессов синтеза и сборки рекомбинантных вирусных частиц. Аналогичным образом, специалистам будут понятны и другие варианты применения средств для ингибирования вРНКП, гРНКП, эРНКП.

[00202] Специалисту в данной области будет понятно, что по мере развития технологии изобретательский замысел настоящего изобретения может быть реализован различными способами. Изобретение и варианты его реализации не ограничиваются конкретными вариантами реализации, которые непосредственно раскрыты в данном описании, но могут варьировать в пределах объема формулы изобретения.

ПРИМЕРЫ

[00203] Следующие примеры приведены для того, чтобы продемонстрировать принципы, лежащие в основе настоящего изобретения и дополнительно проиллюстрировать некоторые аспекты настоящего изобретения и не должны истолковываться как ограничивающие объем настоящего описания или формулы изобретения.

Методика акустической силовой спектроскопии

[00204] Результаты экспериментов in situ получены с использованием методики изучения транскрипции на одномолекулярном уровне и последующего анализа элонгационных профилей транскрипции методом акустической силовой спектроскопии (АСС). Для понимания того, что данные приведенные в примерах получены с помощью адекватной экспериментальной модели изучения транскрипции и активности РНКП ниже приводится подробное описание основных разделов методики АСС.

Используемое оборудование и материалы

[00205] Очистка РНКП и GreA/GreB: Биотинилированную РНКП очищали, как описано ранее (см., например Metelev, M. et al., 2017). Для очистки рекомбинантных белков GreA и GreB клетки Е. coli Rosetta, содержащие плазмиды, кодирующие GreA или GreB, выращивали до 0,6 OD, затем экспрессию белка индуцировали добавлением 1 мМ IPTG и клетки инкубировали при 37°С в течение 5 часов. Белки очищали с использованием «Me-affinity»- (HisTrap Hp, Cytivia) и «SEC» - (Superdex 75 GE) хроматографии.

[00206] Метод акустической силовой спектроскопии (ACC): АСС является наиболее новым среди подходов к изучению синтеза полинуклеотидов на уровне отдельных молекул. Впервые данный метод был представлен в конце 2014 года. При осуществлении данной методики в примерах использовали установка Lumicks AFS. Суть метода состоит в следующем: молекулы ДНК закрепляются между поверхностью стекла и микросферами (Фигура 1А). Сила, имеющая акустическую природу, позволяет манипулировать микросферами. Эксперимент проводится с использованием специального AFS-чипа, который представляет собой ячейку, ограниченную двумя стеклянными пластинами, между которыми находится жидкость. Пьезо-генератор, расположенный на AFS-чипе, при подаче напряжения, создает плоскую акустическую волну, действующую на полимерные микросферы, их смещение фиксируется с помощью инвертированного микроскопа и камеры.

[00207] Акустическая волна, распространяющаяся внутри AFS-чипа, создает силу, действующую на микросферу. Величина данной силы зависит от размера микросферы, частоты акустической волны и ее амплитуды, которая в свою очередь зависит от напряжения, подающегося на пьезо-элемент.

ρ - звуковое давление

ν - скорость звука

- отношение плотностей микросферы и среды

- отношение коэффициентов упругости микросферы и среды

[00208] Как правило диапазон сил при использовании этого метода находится в пределах от единиц до десятков и даже сотен пН, что дает возможность применять его к исследованиям биологических объектов. Для изучения транскрипции микросфера должна взаимодействовать с РНК-полимеразой (см. Фиг. 2А) С помощью этого метода регистрируют элонгационные профили РНКП, которые представляют собой графическую интерпретацию характерного движения одиночных комплексов РНКП, осуществляющих элонгацию транскрипции, представленную в форме зависимости транскрибируемой длины ДНК (в нанометрах либо нуклеотидах) от времени (секунды). Элонгационные профили отражают динамические характеристики одиночной РНКП такие как скорость, наличие остановок/пауз и их продолжительность. Типичные виды элонгационных профилей РНКП, которые были получены в отсутствие влияния ингибирующих факторов приведены на Фигуре 2Б.

Конструкция остановленного комплекса

[00209] Для исследования элонгационных профилей РНКП в контрольных условиях в отсутствие дополнительных химических агентов использовали ДНК субстрат (4400 н.п.), который представлял собой конструкцию, состоящую из Т7А1 промотора, участка гена rpoB, двух терминаторов rrnB Т1 и rrnB Т2. Для прикрепления конструкции к поверхности покрытой соответствующими антителами в нее на конце противоположном промотору включали модифицированные нуклеотиды, содержащие дигоксигенин. Фермент, осуществляющий транскрипцию, РНК-полимераза (РНКП) Е. coli., модифицировали биотином для дальнейшего прикрепления к микросфере покрытой стрептавидином. Для формирования остановленного транскрипционного комплекса 25 нМ РНКП и 5 нМ ДНК матрицы, инкубировали при 37°С в присутствии рибонуклеотидов АТФ, ГТФ, ЦТФ, а также дирибонуклеотида АфУ в транскрипционном буфере А (40 мМ Tris-HCl, 40 мМ KCl, 0,5 мМ DTT, 5 мМ MgCl₂). В этих условиях происходила инициация и элонгация транскрипции на расстояние 20 нуклеотидов от стартовой точки транскрипции до положения, где для продолжения элонгации необходимы рибонуклеотиды урацилтрифосфат (УТФ). После нескольких последовательных стадий пассивации AFS-чипа сформированные конструкции с остановленным комплексом закреплялись на его поверхности. Далее в AFS-чип подавали суспензию полистироловых микросфер диаметром 2.1 мкм покрытых стрептавидином (Spherotech), которые связывались с модифицированной биотином РНКП «остановленной» на ДНК матрице. Камеру промывали транскрипционным буфером Б (40 mM Tris-HCl, 80 мМ KCl, 0.5 мМ DTT, 10 мМ MgCl2, 0.02% плюроника (pluronic), 0.02% казеина, 50 мкг/мл гепарина, 1% ДМСО) для удаления микросфер, которые не связались с РНКП.

[00210] С помощью специального программного обеспечения осуществляли определение точек крепления полученных конструкций к поверхности и производили все необходимые калибровки. В ходе эксперимента использовали минимальную постоянную силу порядка 5 пН, величина которой была недостаточна для оказания влияния на процесс транскрипции. В контрольном эксперименте, после введения в камеру исследований смеси рибонуклеотидов с концентрацией 1 мМ растворенной в буфере Б, процесс элонгации возобновлялся. Регистрацию движения одиночных РНКП осуществляли по изменению положений микросфер. В результате серии экспериментов были получены элонгационные профили одиночных молекул РНКП в контрольных условиях, по которым оценивали следующие параметры транскрипции: среднюю скорость (отношение пути пройденной полимеразой (длина элонгационного профиля) к общему времени затраченному РНКП на его прохождение); мгновенную скорость (скорость между паузами продолжительностью более 2,5 с); продолжительность пауз (время пребывания РНК-полимеразы без движения); и количество пауз за время прохождения 500 нм по ДНК-матрице после начала транскрипции.

Алгоритм обработки данных

[00211] Распознавание пауз: После усреднения и повторного сглаживания фильтром Савицкого-Голая содержащих шумы элонгационных профилей устанавливали предельные скорости, и все временные промежутки, на которых значения скоростей были меньше порогового, рассматривали как паузы. Эти паузы сортировали на «длинные», продолжительность которых была больше 20 секунд, и «короткие» продолжительность которых составляла от 2.5 секунд до 20 секунд. Пороговое значение выбирали равным 0,5σ, где σ - величина стандартного отклонения среднего полученная из распределения Гаусса для мгновенных скоростей (см. ниже). Полученные значения усредняли по всему ансамблю пауз и представляли в виде среднего ± s.e.m. В качестве критерия статистической достоверности использовали критерий Манна-Уитни.

[00212] Определение мгновенных скоростей: В результате обработки с выбранным предельным порогом скорости формировали распределение мгновенных скоростей. Основываясь на этом распределении, в программном обеспечении OriginPro строили гистограмму мгновенных скоростей (Фигура 3А).

[00213] В общем случае в распределении скоростей будут присутствовать сигналы соответствующие производным элонгационных профилей от шумового и полезного сигналов. Шумовая составляющая определяется параметрами экспериментальной установки и ее спектр соответствует распределению производных тех участков элонгационного профиля, когда движение полимеразы остановлено, т.е. когда она находится в паузированных состояниях. Производная шума имеет симметричное распределение относительно нуля скорости и для учета ее вклада использовали его отрицательную часть распределения, на которую не накладывается полезный сигнал. Так как положительные значения шумового сигнала по абсолютной величине равны ее отрицательным значениям, то истинное распределение мгновенных скоростей получали путем вычитания из суммарного распределения скоростей абсолютных значений шумового сигнала.

[00214] Приведенная на Фигуре 3А гистограмма имеет характерное бимодальное распределение. Разложение этого распределения с использованием функций Гаусса позволяет выделить распределение вблизи нуля (левый пик), соответствующее шумовой составляющей сигнала и истинной мгновенной скорости (правый пик).

[00215] Для уточнения параметров мгновенной скорости использовали приведенную выше процедуру вычитания шумового сигнала. На Фигуре 3Б приведена аппроксимация функцией Гаусса распределения скоростей после вычитания шумового сигнала. Как видно из результатов аппроксимации, значение мгновенной скорости при такой обработке несколько больше, что ближе к истинным значениям мгновенной скорости движения РНК полимеразы. После проведения данных манипуляций для каждого полученного элонгационного профиля данные для всех профилей соответствующих данным условиям эксперимента усредняли и представляли в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (s.e.m.).

[00216] Пп Определение средних скоростей: Значение средней скорости транскрипции для каждой РНК полимеразы равно отношению пути пройденной полимеразой (длина элонгационного профиля) к общему времени затраченному на его прохождение. Полученные значения усредняли по всему ансамблю скоростей для каждого из экспериментальных условий и представляли в виде среднее ± s.e.m. В качестве критерия статистической достоверности использовали критерий Манна-Уитни.

ПРИМЕР 1

Стрептолидигин индуцирует длинные паузы

[00217] Ингибирование Е. coli РНК полимеразы стрептолидигином (СТЛ) исследовано с помощью Методики АСС. Проведено сравнение результатов измерений в контрольных условиях без СТЛ в транскрипционном буфере Б с добавлением одномолярной концентрации рибонуклеотидов НТФ (АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ) и в условиях присутствия 10 мкМ СТЛ в контрольной смеси. Репрезентативные элонгационные профили для обоих случаев приведены на Фигуре 4А, Б. Обработка результатов измерений показала, что в присутствии СТЛ значительно снижается средняя скорость элонгации транскрипции и появляются редкие долгоживущие паузы длительностью более 20 секунд Фигуре 4А, Б. Средняя продолжительность таких пауз составляет 192±44 секунды (среднее значение ± (SE)), частота их появления 1±0,2 на элонгационный профиль

ПРИМЕР 2

Стрептолидигин взаимодействует с промежуточными состояниями РНКП

[00218] Исследовали зависимость эффективности ингибирования СТЛ таких промежуточных состояний РНК полимеразы как «бэктреккинг» и элементарные паузы, количество которых варьировалось изменением состава рибонуклеотидов. Добавление искусственного нуклеотида инозина (ИТФ) стимулировало бэктреккинговые паузы, поскольку данный нуклеотид является нетипичным для РНКП, а снижение концентрации рибонуклеотидов стимулировало увеличение элементарных пауз.

[00219] В присутствии 200 мкМ инозина и 1 мМ рибонуклеотидов наблюдали продолжительные паузы длительностью более 20 секунд (Фигура 5А). Добавление 10 мкМ СТЛ к этой среде не изменяло мгновенную скорость и количество коротких пауз, но уменьшало среднюю скорость в основном за счет увеличения количества длинных пауз. Количество длинных пауз не превышало суммы пауз, образованных отдельно СТЛ и инозином. (Фигура 5Б, В).

[00220] При понижении концентрации НТФ с 1 мМ до 400 мкМ наблюдали заметное уменьшение как мгновенной, так и средней скорости из-за значительного увеличения количества коротких элементарных пауз (Фигура 5А, В, Г). С добавлением СТЛ было зафиксировано резкое увеличение количества и продолжительности длинных пауз (Фигура 5Б, Г).

ПРИМЕР 3

Ингибирующее действие стрептолидигина усиливается в присутствии факторов GreA and GreB.

[00221] Исследовали влияние СТЛ на элонгацию транскрипции РНК полимеразы в присутствии факторов транскрипции GreA или GreB. Для этого провели сравнение результатов измерений элонгационных профилей в среде содержащей одномолярную концентрацию НТФ и 5 мкМ GreA или GreB и при добавлении в эти среды 10 мкМ СТЛ. Мгновенные скорости транскрипции измеренные в отсутствии СТЛ составили 18,4±1,4 нт /с и 9,1±0,7 нт / при добавлении GreA и GreB, соответственно (Фигура 6А, В). В присутствии GreA мгновенная скорость по сравнению с контрольными условиями уменьшалась не существенно, а средняя скорость была близка к мгновенной. В присутствии GreB мгновенная скорость была намного меньше по сравнению с контрольными условиями и ее значение приближалось к значению средней скорости. Эти результаты свидетельствуют о том, что GreA и GreB индуцируют очень короткие паузы длительностью менее 2.5 секунд, которые не регистрируются методикой АСС. Мгновенная скорость элонгации транскрипции в среде содержащей 5 мкМ GreB и 1 мМ НТФ практически не менялась при добавлении 10 мкМ СТЛ тогда как средняя скорость резко уменьшалась из-за появления большого количества длинных пауз, средняя продолжительность которых достигает ~400 с (Фигура 6В, Г), а в ряде случаев, наблюдали полную остановку (арест) РНК полимеразы, свидетельствующую о максимально выраженном эффекте синергии СТЛ и GreB. Немногим менее выраженный эффект наблюдали и для случая с GreA, когда средняя скорость в присутствии СТЛ снижается в 2-3 раза (Фигура 6В)

ПРИМЕР 4

Ингибирование бактериальной транскрипции бинарным комплексом состоящим из стрептолидигина и GreB in vivo

[00222] В связи с полученными из одномолекулярных экспериментов данными, свидетельствующими о синергетическом действии антибиотика стрептолидигина и транскрипционного фактора GreB, было принято решение изучить влияние их совместного действия на бактериальные клетки E. coli. in vivo. Эксперименты по исследованию стрептолидигина и транскрипционного фактора GreB на жизнеспособность бактериальных клеток E. coli in vivo осуществляли с использованием мультимодального планшетного считывающего устройства (ридера) CLARIOstar plus (BMG LABTECH) которое позволяет работать с небольшими объемами культур клеток.

[00223] На планшет наносили клетки E. coli штамма Rosetta содержащие плазмиду pET15b-GB для экспрессии GreB под контролем индуцируемого промотора. При добавлении индуктора IPTG начинался синтез GreB. Далее в лунки планшета добавляли 100 микромоль стрептолидигина и 700 наномоль полимиксина. В контрольных экспериментах варьировали оптическую плотность клеток при добавлении индуктора, использовали условия без индукции, а также условия без полимиксина и без стрептолидигина. Планшет с заполненными образцами ячейками инкубировали в ридере в течение 17 часов при 37°С с периодическим перемешиванием на вихревой мешалке (Vortex). Каждые 10 мин производили определение оптической плотности клеток на длине волны 600 нм. По окончании инкубации формировали графики зависимости оптической плотности образцов от времени.

[00224] Из графиков на Фиг. 7 видно, что стрептолидигин (как с добавлением, так и без полимиксина) не оказывает существенного влияния на рост бактериальных клеток. Индукции экспрессии GreB изменения оптической плотности также не наблюдали, что указывает на то, что GreB не менял характеристик роста бактерий. При индукции экспрессии GreB и добавлении стрептолидигина - коричневая кривая, оптическая плотность образца со временем начинает падать, что свидетельствует о гибели клеток и усилении антибактериального действия СТЛ при увеличении общей активности GreB.

ПРИМЕР 5

Влияние микроцинов и лассо-пептидов на транскрипцию In vitro

[00225] Исследовали ингибирующее влияние микроцина J25 и лассо пептидов клебсидин и ацинетодин на элонгацию транскрипции РНКП Е. coli. На Фигуре 8 приведены результаты экспериментов с добавлением различных концентраций лассо пептидов полученные с помощью методики АСС.

[00226] Средняя скорость транскрипции в отсутствии пептидов составила 19,9±3,9 нт/сек (среднее ± стандартное отклонение). Добавление микроцина J25, клебсидина и ацинетодина вызывало зависимое от концентрации увеличение частоты и длительности наблюдаемых пауз и неизменностью мгновенной скорости элонгации РНКП. Активность клебсидина сопоставима с активностью микроцина J25, в то время как ацинетодин был менее активен. Средние скорости транскрипции составили 2,9±1,4 нт / сек и 1,2±0,4 нт / сек для 2,5 мкМ и 5 мкМ микроцина J25 соответственно. Эти значения для 2,5 мкМ и 5 мкМ клебсидина составили 6±2,4 нт/сек и 1,9±0,7 нт/сек и 10,7±4,2 нт/сек и 4,6±1,9 нт /сек для 5 мкМ и 25 мкМ ацинетодина. Характер зависимостей приведенных на Фигуре 9, при том что численные значения заметно разнятся, представляется весьма похожими, что указывает на общий механизм их действия связывания НТФР во вторичном канале РНКП, через который субстраты попадают в каталитический центр.

[00227] Клебсидин активен против штаммов K. pneumoniae в высокой концентрации с MIC 256 мкМ в среде М9. На Фигуре 9 приведены данные по внутриклеточной токсичности клебсидина и ацинетодина при накоплении в клетках Е. coli (Фигура 9). Кривые роста показывают ингибирующее действие на рост клеток при накопления ацинетодина и клебсидина в ответ на экспрессию плазмидных генов aciABC и kleABC.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПУТЕМ ССЫЛКИ

[00228] Все публикации, патенты и патентные заявки в данном документе включены посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или патентная заявка была специально и индивидуально указана как включенная посредством ссылки. В случае противоречия между термином в настоящей заявке и термином в источнике, включенном посредством ссылки, термин в настоящей заявке имеет преимущественную силу.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу использования бинарной системы для увеличения эффективности воздействия антибактериального средства. Способ предусматривает воздействие на бактериальную клетку в произвольном порядке бинарной системой, которая состоит из антибактериального средства, которое способно связываться с активным центром бактериальной РНК полимеразы (бРНКП), и агента, увеличивающего экспрессию и/или активность фактора элонгации в бактерии. Изобретение эффективно для получения средств, антибактериальное действие которых основано на усилении действия ингибитора бРНКП при увеличении экспрессии и/или активности фактора элонгации бРНКП. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 9 ил., 5 пр.

1. Способ использования бинарной системы для увеличения эффективности воздействия антибактериального средства, при котором воздействуют на бактериальную клетку в произвольном порядке, с обеспечением одновременного присутствия, эффективным количеством соединения 1 и эффективным количеством агента 2, образующими бинарную систему 3, для обеспечения синергии ингибирующего действия на элонгацию транскрипции бРНКП и жизнеспособность бактериальных клеток, при этом соединение 1 является антибактериальным средством, способным связываться с активным центром бактериальной РНК полимеразой (бРНКП) внутри бактерии на стадии элонгации транскрипции, а агент 2 увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации в бактерии.

2. Бинарная система 3, предназначенная для ингибирования бРНКП, которая включает два компонента, в эффективном количестве:

А) Соединение 1, являющееся антибактериальным средством, которое способно связываться с активным центром бРНКП на стадии элонгации транскрипции; и

Б) Агент 2, который увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации бРНКП,

причем комбинированное воздействие А) и Б) на бактерию обеспечивает уменьшение роста и/или жизнеспособности указанной бактерии.

3. Бинарная система 3 по п. 2, согласно которому соединение 1 представляет собой малую молекулу.

4. Бинарная система 3 по любому из пп. 2, 3, согласно которым соединение 1 представляет собой производное тетрамовой кислоты.

5. Бинарная система 3 по любому из пп. 2-4, согласно которым соединение 1 представляет собой производное тетрамовой кислоты которое способно связываться с бРНКП и ингибировать бРНКП, предпочтительно, указанное соединение 1 представляет собой стреиголидигин, или сольват, соль, пролекарство или производное указанного производного тетрамовой кислоты, которое обладает по существу аналогичными свойствами в отношении ингибирования бРНКП и/или антибактериальной активностью.

6. Бинарная система 3 по любому из пп. 2-5, согласно которым указанный фактор элонгации бРНКП обладает экзонуклеазной активностью.

7. Бинарная система 3 по любому из пп. 2-6, согласно которым указанный фактор элонгации бРНКП представляет GreA или GreB из E.coli или аналог или гомолог указанных факторов, который обладает по существу аналогичной функцией или активностью.

8. Бинарная система 3 по любому из пп. 2-7, согласно которым указанный агент 2 увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации бРНКП, обеспечивает: активацию промотора гена фактора элонгации бРНКП, присутствующего в геноме указанной бактерии; трансформацию бактерии с внедрением гетерологичного гена фактора элонгации бРНКП; доставку белков GreA и/или GreB в бактериальную клетку.

9. Бинарная система 3 по любому из пп. 2-8, согласно которому указанный агент 2 увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации бРНКП, предпочтительно, указанный агент 2 выбран из: генетической конструкции, которая обеспечивает экспрессию фактора элонгации РНКП, бактериофага, который доставляет в бактерию генетическую конструкцию, которая обеспечивает экспрессию фактора элонгации РНКП, малой молекулы, нуклеотида, пептида или полипептида, которые обеспечивают экспрессию фактора элонгации РНКП или переход фактора элонгации РНКП в активную форму и/или указанный агент 2 обеспечивает увеличение количества фактора элонгации РНКП в клетке; и/или указанный агент 2 представляет собой воздействие, которое увеличивает экспрессию и/или активность фактора элонгации РНКП, где указанное воздействие предпочтительно представляет собой изменение температуры, облучение, включая оптическое облучение и высокочастотное облучение, изменение физико-химических характеристик среды или жидкости в области или в окружении, в которых находится бРНКП или бактерия.