АППЛИКАЦИОННЫЙ ГЕМОСТАТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ И СПОСОБ ЕГО ПРОИЗВОДСТВА Российский патент 2023 года по МПК A61K31/05 A61K31/122 A61K38/39 A61K47/42 A61F13/00 A61F13/02 A61L24/04 A61P7/04 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение касается аппликационного гемостатического материала и способа его производства. Более конкретно, настоящее изобретение касается аппликационного гемостатического материала с улучшенными гемостатическими характеристиками, адгезивными характеристиками, запечатывающими характеристиками и адсорбционными характеристиками, и способа производства этого аппликационного гемостатического материала.

Уровень техники

Современные хирургические методики продвинулись очень далеко, но гемостатические методики для остановки кровотечений при хирургических операциях всё ещё находятся на ранних стадиях развития. Главной задачей гемостатического агента является остановка кровотечения. Для надлежащего применения, гемостатические агенты должны обладать многими функциями. В частности, гемостатические агенты должны обладать функцией остановки кровотечения. Гемостатические агенты должны быть прочно прикреплены к целевым местам в тканях, где необходимо достижение гемостаза, так чтобы была возможность реализовать их гемостатическую функцию. Гемостатические агенты должны обладать дополнительными функциями впитывания крови и уменьшения кровопотери.

Многие гемостатические агенты широко известны и коммерчески доступны в настоящее время. Такие гемостатические агенты включают гемостатические агенты на основе фибрина, использующие фибрин на финальной стадии механизма свертывания крови в организме, гемостатические агенты на основе цианоакрилатов, основанные на тех же компонентах и принципе работы как у мгновенных адгезивов для достижения гемостаза (см., например, публикацию патента Кореи No. 2009-0077759), и гемостатические агенты, образованные из природных полимерных материалов, таких как хитозан, желатин и коллаген, для работы в качестве физических барьеров для гемостаза. Однако, гемостатические агенты на основе фибрина несут риск развития инфекции из-за ингредиентов, полученных из живых организмов, и их затруднительно применять для пациентов, принимающих антикоагулянты, для гемостаза. Гемостатические агенты на основе цианоакрилатов выделяют токсичные вещества, такие как формальдегид, при разложении in vivo. Гемостатические агенты, образованные из природных полимерных материалов, обладают не лучшими гемостатическими характеристиками и меньшей силой адгезии к живым тканям, чем ожидается. Кроме того, некоторые из этих полимеров уступают по запечатывающим характеристикам и впитывающей способности.

Нерастворимые в крови губкоподобные структуры известны в качестве медицинских продуктов для гемостаза. Эти медицинские продукты впитывают кровь из места кровотечения и останавливают кровотечение благодаря механизму коагуляции крови in vivo. Эти медицинские продукты удобно использовать, потому что они не прилипают к хирургическим инструментам из-за отсутствия адгезивности. Эти медицинские продукты могут отводить кровь от места кровотечения благодаря своей способности впитывать кровь. Однако эти медицинские продукты требуют отдельных средств для обеспечения их плотного контакта с тканями в местах кровотечений, потому что сами они не обладают адгезией к живым тканям. Другим недостатком этих медицинских продуктов являются их слабые гемостатические характеристики.

Другим известным медицинским продуктом для гемостаза является растворимая в крови мембранная структура. При контакте с кровью в месте кровотечения данный медицинский продукт растворяется с образованием физической пленки на месте кровотечения и приклеивается к месту кровотечения. Благодаря такому механизму, данный медицинский продукт обеспечивает достижение гемостаза. Благодаря своей адгезивной функции, данный медицинский продукт устраняет неудобство использования отдельного средства для адгезии к живым тканям. Преимуществом данного медицинского продукта являются прекрасные гемостатические характеристики, но он имеет склонность к прилипанию к хирургическим инструментам, вызывая неудобства в применении, и не может отводить кровь от места кровотечения.

Раскрытие изобретения

В одном аспекте настоящего изобретения описан аппликационный гемостатический материал, содержащий: слой пористой матрицы, содержащий биосовместимый полимер; гемостатический слой, нанесенный на слой пористой матрицы и содержащий полимер, в который введены фрагменты, содержащие бензольное кольцо, содержащее одну или больше гидроксильных групп; и связующий слой, расположенный между слоем пористой матрицы и гемостатическим слоем, предотвращающий отделение слоя пористой матрицы от гемостатического слоя.

В другом аспекте настоящего изобретения описан способ производства аппликационного гемостатического материала. В одном варианте осуществления, данный способ включает (a) растворение полимера, содержащего введенные в него фенол- или многоатомный фенол-содержащие фрагменты, в воде с получением раствора для формирования гемостатического слоя, (b) обеспечение пористой матрицы, образованной из биосовместимого полимера, (c) введение раствора для формирования гемостатического слоя в контакт с поверхностью пористой матрицы так, чтобы раствор для формирования гемостатического слоя импрегнировался в поры пористой матрицы, и (d) высушивание раствора для формирования гемостатического слоя с одновременным образованием гемостатического слоя на поверхности пористой матрицы и связующего слоя на границе между пористой матрицей и гемостатическим слоем.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 изображен схематический вид в поперечном разрезе, иллюстрирующий один вариант осуществления аппликационного гемостатического материала.

На Фиг. 2 изображена схематическая диаграмма, иллюстрирующая процесс гемостаза и запечатывания крови при применении аппликационного гемостатического материала по одному варианту осуществления к месту кровотечения.

На Фиг. 3 изображены структуры гемостатической многослойной губки, полученной путем импрегенирования в желатиновый слой хитозан-катехинового раствора, имеющего низкую вязкость, и гемостатической многослойной губки, полученной путем импрегнирования в желатиновый слой хитозан-катехинового раствора, имеющего высокую вязкость.

На Фиг. 4 приведены изображения поперечного разреза многослойной губки, полученные методом сканирующей электронной микроскопии.

На Фиг. 5 изображены фотографии с результатами анализа запечатывающих свойств гемостатических губок.

Осуществление изобретения

Если не указано иное, все технические и научные термины, использующиеся в настоящем тексте, имеют значения, хорошо известные квалифицированным специалистам в той области, к которой относится настоящее изобретение. В целом, используемая в настоящем тексте номенклатура хорошо известна и широко применяется в данной области техники.

Раскрытые в настоящей заявке варианты осуществления будут далее описаны более подробно с привлечением соответствующих чертежей.

В одном аспекте настоящего изобретения описан аппликационный гемостатический материал. На Фиг. 1 изображен схематический поперечный разрез, иллюстрирующий один вариант осуществления аппликационного гемостатического материала. На Фиг. 1, аппликационный гемостатический материал 100 включает: слой 110 пористой матрицы, содержащий биосовместимый полимер; гемостатический слой 130, нанесенный на слой 110 пористой матрицы и содержащий полимер, в который введены многоатомный фенол-содержащие фрагменты; и связующий слой 120, расположенный между слоем 110 пористой матрицы и гемостатическим слоем 130 для предотвращения отделения слоя 110 пористой матрицы от гемостатического слоя 130.

Слой 110 пористой матрицы может быть в форме тканого материала, нетканого материала, вспененного полимера или губки. Слой 110 пористой матрицы может находиться в контакте с местом травмы, таким как место кровотечения, и может иметь множество пор для размещения абсорбированных биологических жидкостей. Слой 110 пористой матрицы может удерживать кровь, экссудаты и другие поступающие в него жидкости, предотвращая заливание ими места травмы и обеспечивая наступление гемостаза (остановки кровотечения). Матрица предпочтительно образована из биосовместимого полимера, который достаточно эластичный и обладает хорошей смачиваемостью и впитывающей способностью для жидкостей, таких как кровь. Поры могут быть взаимосвязаны друг с другом в матрице с образованием трехмерной структуры.

Биосовместимый полимер предпочтительно представляет собой материал, который может адсорбироваться in vivo с течением времени посредством ферментативного разложения, биологического разложения или гидролиза после применения in vivo.

Биосовместимый полимер предпочтительно представляет собой нерастворимый в крови материал. В частности, биосовместимый полимер нерастворим в воде при нейтральном значении pH при температуре примерно 37°C, что представляет собой условия in vivo. Биосовместимый полимер биологически разлагается в течение 3 месяцев, предпочтительно в течение 8 недель после применения in vivo. Предпочтительно, биосовместимый полимер естественным образом разлагается в течение указанного выше периода времени после того как достигнуто целевое назначение после закрывания раны.

Биосовместимый полимер может представлять собой природный или синтетический биоразлагаемый полимер. В частности, природный биоразлагаемый полимер может быть выбран из группы, состоящей из коллагена, фибронектина, фибрина, желатина, эластина, хитина, хитозана, крахмала, декстрозы, декстрана, альгиновой кислоты, гиалуроновой кислоты, целлюлозы, их производных и их сополимеров. В частности, синтетический биоразлагаемый полимер может быть выбран из группы, состоящей из поли(молочной кислоты) (PLA), поли(гликолевой кислоты) (PGA), поли(D,L-лактид-со-гликолида) (PLGA), поли(ε-капролактона) (PCL), полигидроксиалканоата, полиангидрида, полиортоэфира, полиамина, их производных и их сополимеров. Перечисленные выше биоразлагаемые полимеры приведены исключительно в иллюстративных целях. Без ограничений может использоваться любой полимер, имеющий гидролизуемый скелет, такой как амидный, из алифатических сложных эфиров, мочевинный, уретановый, простоэфирный или пептидный скелет (основную цепь).

Производными биосовместимых полимеров могут быть соли биосовместимых полимеров. Альтернативно, производными биосовместимых полимеров могут быть продукты модификации, образующиеся путем замены или модификации функциональных групп (например, -OH, -SH, -NH₂, -COOH или -NHC(O)CH₃) в биосовместимых полимерах на другие гидрофильные группы или другие биосовместимые полимеры, или соли продуктов модификации.

Матрица, содержащая биосовместимый полимер, может представлять собой, например, желатиновую или коллагеновую прокладку, которая обуславливает меньший воспалительный ответ и обеспечивает прекрасную биофункциональность и биоразлагаемость после трансплантации in vivo. Желатиновые и коллагеновые прокладки разлагаются с высокой скоростью, как указано выше, благодаря работе протеаз, обильно экспрессируемых в соответствующих тканях после гемостаза. Матрица оказывает первичный гемостатический эффект благодаря биосовместимому полимеру. Вторичный гемостатический эффект матрицы обусловлен адсорбцией биологических жидкостей и эффективным сжиманием расширяющейся матрицей. Кроме того, матрица имеет прекрасные запечатывающие характеристики.

Биосовместимый полимер может быть сшитым или несшитым. Биосовместимый полимер предпочтительно имеет сшитую структуру, которая не растворяется в воде и может сохранять свою форму даже при контакте с кровью. Биосовместимый полимер может формировать пористую структуру, которая адсорбирует кровь, сохраняя свою форму. Пористая структура может придавать матрице запечатывающие кровь свойства.

Биосовместимый полимер может быть получен из волокнистого, порошкового или жидкого сырья, которое может быть переработано в пористую матрицу. Получение биосовместимого полимера может включать подкисление до pH 1,5 - 4 и нейтрализацию щелочным раствором. Пористая матрица, использующая биосовместимый полимер, может быть получена лиофилизацией геля, суспензии или раствора биосовместимого полимера. Матрица может быть подвергнута сшиванию путем смешивания исходного материала со сшивающим агентом в органическом растворителе и полимеризации исходного материала. Сшивающий агент может представлять собой, например, глутаровый альдегид, формальдегид, ацетальдегид, этиленформальдегид, ацетальдегид или этилен изопропанол.

Толщина слоя 110 пористой матрицы не ограничивается каким-либо специальным образом, но она составляет от 1 до 20 миллиметров (мм), предпочтительно от 1 до 15 миллиметров. Если толщина меньше указанного нижнего предела, то слой пористой матрицы не может служить достаточным адсорбционным барьером для крови. А если толщина превышает указанный верхний предел, может потребоваться слишком долгое время для разложения in vivo.

Гемостатический слой 130 существует в виде отдельного слоя от слоя 110 пористой матрицы и может быть сложен со слоем 110 пористой матрицы через связующий слой 120 без отделения от слоя 110 пористой матрицы. Гемостатический слой 130 содержит полимер, в который введены фрагменты, содержащие бензольное кольцо, имеющее одну или больше гидроксильных групп (т.е. фенол- или многоатомный фенол-содержащие фрагменты). Фрагменты, содержащие бензольное кольцо, представляют собой многоатомный фенол-содержащие фрагменты, которые являются предпочтительными по своим гемостатическим характеристикам и адгезивным характеристикам. Многоатомный фенол означает бензольное кольцо, содержащее две или больше гидроксильных групп (-OH). Многоатомный фенол предпочтительно представляет собой катехин, содержащий две гидроксильные группы (-OH), или галлол, содержащий три гидроксильные группы (-OH). В некоторых вариантах осуществления, некоторые из атомов водорода в феноле или многоатомном феноле могут быть заменены на другие гидрофильные функциональные группы.

Полимер предпочтительно представляет собой биосовместимый полимер. Биосовместимый полимер может представлять собой природный или синтетический биоразлагаемый полимер. Конкретнее, биосовместимый полимер является таким же как описано выше для полимера, используемого в слое 110 пористой матрицы.

Полимер может быть выбран из группы, состоящей из желатина, коллагена, фибрина, эластина, гиалуроновой кислоты, альгиновой кислоты, альгината, карбоксиметил целлюлозы, карбоксиэтил целлюлозы, гидроксиметил целлюлозы, фибрина, гепарина, хитина, хитозана и их производных, которые являются предпочтительными по своим гемостатическим характеристикам, биоразлагаемости и эффекту регенерации тканей.

Фенол-содержащие фрагменты или многоатомные фенол-содержащие фрагменты, такие как катехин или галлол, могут быть присоединены к боковым цепям или концам полимерного скелета, например, через такие функциональные группы как -NH₂, -SH, -OH или -COOH. Фенол- или многоатомный фенол-содержащий фрагмент может быть представлен фрагментом “фенол-L-” или “многоатомный фенол-L-”, где L может представлять собой простую связь, C₁-C₁₀ алифатическую углеводородную цепь, необязательно содержащую -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)O- или -C(O)NH-, или C₃-C₁₀ алициклическую углеводородную цепь, необязательно содержащую -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)O- или -C(O)NH-.

В типичном случае, фенол- или многоатомные фенол-содержащие фрагменты могут быть конъюгированы с биосовместимым полимером посредством реакции между функциональными группами биосовместимого полимера и концевыми группами фенол- или многоатомный фенол-содержащего соединения. Реакция может быть проведена различными путями, такими как химический синтез, электрохимический синтез и энзиматический синтез.

Фенол- или многоатомные фенол-содержащие фрагменты могут присутствовать в количестве 1 - 50 мол.%, 1 - 40 мол.%, 1 - 30 мол.% или 2 - 25 мол.%, из расчета на общее число молей повторяющихся звеньев в биосовместимом полимере. Если содержание фенол- или многоатомный фенол-содержащих фрагментов меньше указанного нижнего предела, это может привести к низкой растворимости в крови и слабым гемостатическим характеристикам и адгезивным характеристикам. В то же время, если содержание фенол- или многоатомный фенол-содержащих фрагментов превышает указанный верхний предел, то катехин может окисляться.

Различные материалы подходят для гемостатического слоя 130. На Схемах реакции 1 и 2 показаны методы синтеза хитозановых полимеров, в которые катехин-содержащие фрагменты введены реакцией между хитозановым полимером и катехин-содержащим соединением.

Схема реакции 1

Схема реакции 2

где x, y и z все представляют собой целые числа, и m представляет собой целое число от 50 до 6000.

На Схеме реакции 1 показано образование амидных фрагментов посредством карбодиимидного сочетания, в котором катехин с концевой карбоксильной группой, такой как 3,4-дигидроксигидрокоричная кислота (т.е. гидрокофеиновая кислота) конъюгируется с аминными группами хитозанового скелета. Реакцию проводят при pH от 5 до 6, чтобы предотвратить окисление катехина. Используется протонный растворитель, такой как этанол, чтобы предотвратить выпадение в осадок нерастворимого в воде хитозана во время реакции. В результате этого амидного сочетания катехин обычно вводится в скелет полимера со степенью замещения от 4 до 30 мол.% относительно аминных групп. Катехин может быть введен со степенью замещения 80 мол.% или больше при проведении реакции в течение длительного времени до нескольких дней.

На Схеме реакции 2 показана реакция восстановительного аминирования, в которой катехин с концевой альдегидной группой, такой как 3,4-дигидроксибензальдегид, реагирует с аминными группами хитозанового скелета, и образующиеся иминные связи (C=N-) восстанавливают до -C-N- связей с помощью восстановителя, такого как NaBH₄. В результате этого восстановительного аминирования катехин может быть введен в скелет полимера со степенью замещения от 18 до 80 мол.% за короткое время.

Материал, который растворяется при контакте с кровью и формирует гель, может быть использован для гемостатического слоя. Такие материалы включают хитозан-катехин, гиалуроновая кислота-катехин, желатин-катехин, коллаген-катехин, полиамин-катехин, хитозан-галлол, гиалуроновая кислота-галлол, желатин-галлол, коллаген-галлол и полиамин-галлол.

Из числа перечисленных выше разных полимеров, полимерные соединения, например, такие как хитозан, известны как останавливающие кровотечение. В частности, положительно заряженный фрагмент -NH₃⁺ в хитозане притягивает отрицательно заряженные тромбоциты в крови, и в результате тромбоциты быстро агрегируют, обеспечивая быстрое наступление гемостаза. Однако, поскольку это свойство ограничено только экстремально кислой средой с pH 2, у хитозана практически нет гемостатического потенциала в живом организме со средой близкой к нейтральной (pH 7). Однако полимер, используемый в гемостатическом слое аппликационного гемостатического материала по настоящему изобретению, модифицирован многоатомным фенолом, таким как катехин или галлол, чтобы обеспечить адгезивные свойства даже в нейтральной водной среде, такой как кровь. В результате модифицированный полимер растворяется в крови и через некоторое время он обладает электрическими силами притяжения с эритроцитами для образования гемостатической пленки в месте кровотечения в ткани. Эта гемостатическая пленка сохраняется несколько дней и может естественным образом разлагаться ферментами в организме.

Благодаря присутствию ароматики и -OH группы в феноле или многоатомном феноле, твердый гемостатический слой 130 может легко растворяться в крови и затем формировать гель. Механизм гемостаза и адгезии гемостатического слоя 130 может быть объяснен различным образом. Гемостатический слой 130 позволяет достичь быстрого и сильного гемостаза и адгезии к ткани вследствие π-π взаимодействия между ароматическими группами, водородной связи и координационной связи с ионами металлов, или катион-π связывания между ионами металлов и ароматическими кольцами без необходимости использования отдельного специального сшивающего агента или использования энергии ультрафиолета или тепла.

В предпочтительном варианте осуществления, гемостатический слой 130 может содержать и фенол- или многоатомный фенол-содержащие фрагменты, и их окисленные формы. В результате бензольные кольца, содержащие –OH, и бензольные кольца, содержащие =O, могут сосуществовать в полимере гемостатического слоя 130. Например, гидроксильные группы (-OH) катехиновых фрагментов (), введенных в полимер гемостатического слоя 130, могут искусственным или естественным образом окисляться при производстве аппликационного гемостатического материала 100, превращая некоторые из катехиновых фрагментов в хиноновые фрагменты ().

Хинон-содержащие фрагменты могут реагировать с -NH₂, присутствующими в органических материалах, таких как белки тканей, белки крови или полимер гемостатического слоя, растворенный в крови, с образованием ковалентных связей между белками и катехиновыми фрагментами. Образование ковалентных связей может дополнительно усилить способность гемостатического слоя прикрепляться к ткани и останавливать кровотечение. После образования ковалентных связей, оксо-группы (=O) хиноновых фрагментов восстанавливаются до гидроксильных групп (-OH). Гидроксильные группы могут образовывать водородные связи с атомами азота и кислорода в органических материалах. Хинон может реагировать с амином, образуя ковалентную связь, например, по механизму присоединения по Михаэлю (Схема реакции 3) или реакции образования основания Шиффа (Схема реакции 4).

Схема реакции 3

Схема реакции 4

В одном варианте осуществления, содержание окисленных фрагментов в гемостатическом слое 130 может составлять 50 мол.% или меньше, предпочтительно 40 мол.% или меньше, более предпочтительно 30 мол.% или меньше, из расчета на общее число молей фенол- или многоатомных фенол-содержащих фрагментов и окисленных фрагментов. Нижняя граница содержания окисленных фрагментов предпочтительно составляет 0,1 мол.% или больше. В этом диапазоне способность гемостатического слоя 130 присоединяться к ткани и останавливать кровотечение может быть оптимизирована. При увеличении содержания окисленных фрагментов увеличивается число сильных связей, таких как ковалентные связи, как описано выше. Однако с точки зрения быстрого гемостаза необходимо поддерживать более высокое содержание -OH. Поэтому предпочтительно поддерживать содержание -OH в нужном диапазоне.

Хотя механизм связывания посредством ковалентного связывания работает медленнее, чем описанный выше механизм катион-π связывания, он может обеспечить очень высокую силу адгезии к белкам живых тканей. Соответственно, способность аппликационного гемостатического материала 100, содержащего гемостатический слой 130, останавливать кровотечение и запечатывать кровь может быть улучшена, когда аппликационный гемостатический материал 100 применяется к кровоточащим тканям человека.

По мере увеличения числа -OH групп, связанных с одним бензольным кольцом в фенол- или многоатомных фенол-содержащих фрагментах, введенных в биосовместимый полимер, вероятность окисления до хиноновых форм с течением времени повышается, но увеличивается число сайтов, способных взаимодействовать с чужеродными белками, что улучшает гемостатические характеристики и адгезивные характеристики.

Связующий слой 120 расположен между слоем 110 пористой матрицы 110 и гемостатическим слоем 130. Аппликационный гемостатический материал 100 имеет многослойную структуру, в которой слой 110 пористой матрицы, способный впитывать кровь, связан с гемостатическим слоем 130, имеющим гемостатические свойства и адгезивные свойства. Очень важно, что эти два слоя хорошо связаны между собой, не отделяясь друг от друга при транспортировке и использовании аппликационного гемостатического материала 100. Однако, поскольку водорастворимый материал в слое 110 пористой матрицы и нерастворимый в воде материал в гемостатическом слое 130 имеют разные физические свойства, может вызвать сложности соединение этих двух слоев друг с другом без использования отдельного адгезива. Чтобы предотвратить отделение этих двух слоев друг от друга, могут быть приготовлены полуфабрикаты этих слоев и они могут быть соединены между собой дополнительным адгезивом. Однако использование адгезива может быть ограничено токсичностью и неэффективностью процесса.

Составляющие компоненты гемостатического слоя 130 могут быть просто нанесены в виде покрытия на поверхность слоя 110 пористой матрицы без использования дополнительного адгезива. В этом случае, однако, эти два слоя могут недостаточно взаимодействовать друг с другом, что приводит к слабой адгезии между ними. В результате эти два слоя могут отделяться или отсоединяться друг от друга при транспортировке и использовании аппликационного гемостатического материала 100, что серьезно влияет на качество финального продукта.

Соответственно, связующий слой 120 служит для предотвращения отделения слоя 110 пористой матрицы от гемостатического слоя 130. Связующий слой 120 предпочтительно сформирован с использованием материала, который является смешиваемым со слоем 110 пористой матрицы и гемостатическим слоем 130. То есть, связующий слой сформирован с использованием материала, который может взаимодействовать с различными функциональными группами (например, -OH, - NH₂ и -COOH) белков или полисахаридов в слое 110 пористой матрицы и функциональными группами белков в гемостатическом слое 130 посредством водородных связей или ковалентного связывания в результате реакций конденсации. Материал связующего слоя предпочтительно представляет собой материал, полученный из составных компонентов слоя 110 пористой матрицы и гемостатического слоя 130. Например, материал связующего слоя может представлять собой смесь или сополимер основного составного компонента слоя 110 пористой матрицы и основного составного компонента гемостатического слоя 130.

Связующий слой 120 может быть введен различными способами. Например, связующий слой 120 может быть введен путем ламинирования пленки, образованной из материала для связующего слоя между двумя слоями 110 и 130, нанесения покрытия из материала связующего слоя на слой 110 пористой матрицы или импрегнирования материала связующего слоя в слой 110 пористой матрицы.

В предпочтительном варианте осуществления, связующий слой 120 может быть сформирован посредством достаточного импрегнирования компонентов гемостатического слоя 130 в слой 110 пористой матрицы. В результате связующий слой 120 может включать смешанный участок из биосовместимого полимера и полимера, содержащего введенные в него фенол- или многоатомный фенол-содержащие фрагменты. Жидкие компоненты гемостатического слоя 130 проникают глубоко в слой 110 пористой матрицы во время импрегнирования, так чтобы гидрофильные группы биосовместимого полимера, составляющего слой 110 пористой матрицы, могут сильно взаимодействовать с гидроксильными группами компонента гемостатического слоя 130 посредством водородных связей, давая возможность связующему слою 120 выполнить свою задачу. Поэтому связующий слой 120 может быть сформирован с использованием составных компонентов слоев 110 и 130 без отдельного адгезива, что позволяет избежать проблем, таких как токсичность и низкая биоразлагаемость или биоадсорбция, возникающих при использовании дополнительного адгезива. Смешиваемость связующего слоя с другими слоями 110 и 130 также достаточно высокая, чтобы предотвратить отделение слоев 110 и 130 друг от друга.

В одном варианте осуществления, градиент концентрации, в котором концентрация многоатомный фенол-содержащих фрагментов снижается в направлении от гемостатического слоя 130 к слою 110 пористой матрицы, образованного из биосовместимого полимера, может быть создан в смешанном участке, в зависимости от того как формировать связующий слой 120. За счет такого градиента концентрации слой 110 пористой матрицы и гемостатический слой 130 могут быть более прочно связаны друг с другом через связующий слой 120, расположенный между ними.

Толщина связующего слоя 120 не ограничена каким-либо особым образом и обычно составляет от 1 до 1500 микрометров (мкм), предпочтительно от 100 до 1200 микрометров, более предпочтительно от 200 до 1000 микрометров. Если толщина связующего слоя 120 меньше указанного нижнего предела, то слой пористой матрицы и гемостатический слой могут отделяться друг от друга. При этом, если толщина связующего слоя 120 превышает верхний предел, то слой пористой матрицы может не достигаться, что приводит к ослаблению его адсорбционных и запечатывающих свойств.

Как описано выше, присутствие связующего слоя обеспечивает достаточную силу связывания между слоями без создания проблем, которые появляются при использовании дополнительного адгезива, при этом сохраняются требуемые физические свойства слоев, составляющих аппликационный гемостатический материал. Присутствие связующего слоя также выгодно для достижения желаемых характеристик продукта.

Аппликационный гемостатический материал по настоящему изобретению обладает следующими эффектами, обеспечивающими преимущество. Связывание гемостатического слоя, имеющего адгезивные свойства, и слоя пористой матрицы, имеющего запечатывающие свойства, позволяет аппликационному гемостатическому материалу одновременно обладать адгезивными свойствами и запечатывающими свойствами, и дает аппликационному гемостатическому материалу возможность проявлять адгезию к месту кровотечения в ткани без вспомогательных средств, в то же время не давая аппликационному гемостатическому материалу прилипать к хирургическим инструментам во время хирургических операций. Поэтому данный аппликационный гемостатический материал удобен в использовании, обладает прекрасными гемостатическими характеристиками и способен запечатывать кровь от места кровотечения.

Использование гемостатических агентов на основе фибрина, действие которых основано на механизме свертывания крови в организме, обладает тем недостатком, что гемостаз невозможно обеспечить у пациентов, принимающих антикоагулянты. Напротив, в аппликационном гемостатическом материале по настоящему изобретению используются многоатомный фенол-содержащие фрагменты, являющиеся мимиками 3,4-дигидроксифенилаланина (DOPA) – белка, полученного из двустворчатых моллюсков, который проявляет прекрасные адгезивные свойства в воде, обеспечивая высокую силу адгезии к месту кровотечения. Благодаря одновременному присутствию ароматических колец и -OH функциональных групп в многоатомный фенол-содержащих фрагментах, гемостатический компонент связывается с белками крови по различным механизмам связывания, включая водородные связи, сильные координационные связи с металлами, ковалентное связывание и катион-π связывание, а не только по гемостатическому механизму in vivo, позволяя использовать данный аппликационный гемостатический материал для любого пациента и достигая быстрого гемостаза.

Гемостатический слой и слой пористой матрицы не просто связаны вместе, а связаны друг с другом через связующий слой. Присутствие связующего слоя предотвращает отделение гемостатического слоя от слоя пористой матрицы при транспортировке и использовании аппликационного гемостатического материала.

В частности, использование для гемостатического слоя полимера, в который введены фрагменты, содержащие бензольное кольцо, имеющее гидроксильные группы, дает гемостатическому слою способность быстрого обеспечения гемостаза по такому механизму как катион-π связывание. Кроме того, совместное присутствие хиноноподобных фрагментов, способных к ковалентному связыванию с чужеродными белками, позволяет одновременно обеспечить прекрасный гемостаз и сильную адгезию. Присутствие слоя пористой матрицы, прочно связанного с гемостатическим слоем через связующий слой, позволяет аппликационному гемостатическому материалу по настоящему изобретению обладать способностью адсорбировать и запечатывать кровь, а также иметь гемостатические свойства и адгезивные свойства.

Аппликационный гемостатический материал по настоящему изобретению может храниться при комнатной температуре длительное время, и его качество не изменяется даже в среде с высокой влажностью, в отличие от традиционных гемостатических продуктов предшествующего уровня техники, которые необходимо транспортировать в условиях охлаждения, чтобы сохранить их свойства. После того как аппликационный гемостатический материал по настоящему изобретению использован in vivo в целях обеспечения гемостаза и запечатывания, он разлагается на материалы, которые безопасны для людей и адсорбируются in vivo. Поэтому аппликационный гемостатический материал по настоящему изобретению является в высокой степени биосовместимым.

На Фиг. 2 изображена схематическая диаграмма, иллюстрирующая процесс гемостаза и запечатывания крови, когда аппликационный гемостатический материал нанесен на место кровотечения.

В другом аспекте настоящего изобретения описан способ производства аппликационного гемостатического материала. В одном варианте осуществления, данный способ включает (a) растворение полимера, содержащего введенные в него фенол- или многоатомный фенол-содержащие фрагменты, в воде с получением раствора для формирования гемостатического слоя, (b) обеспечение пористой матрицы, образованной из биосовместимого полимера, (c) введение раствора для формирования гемостатического слоя в контакт с поверхностью пористой матрицы так, чтобы раствор для формирования гемостатического слоя импрегнировался в поры пористой матрицы, и (d) высушивание раствора для формирования гемостатического слоя с одновременным образованием гемостатического слоя на поверхности пористой матрицы и связующего слоя на границе между пористой матрицей и гемостатическим слоем

На стадии (a) полимер, содержащий введенные в него фенол- или многоатомные фенол-содержащие фрагменты, растворяют в воде с получением раствора для формирования гемостатического слоя. Полимер используется в количестве от 0,1 до 3 массовых частей на 100 массовых частей воды. Раствор для формирования гемостатического слоя имеет вязкость от 10 до 2500 сП, предпочтительно от 10 до 1500 сП, более предпочтительно от 10 до 1000 сП, при измерении на ротационном вискозиметре при 4 °C.

Раствор для формирования гемостатического слоя, имеющий соответствующую вязкость в указанном выше диапазоне, может хорошо адсорбироваться и импрегнироваться в пористую матрицу. Если вязкость меньше указанного нижнего предела, то может образоваться связующий слой, имеющий слишком большую толщину, и раствор для формирования гемостатического слоя может импрегнироваться в самый верхний слой, приводя к исчезновению слоя пористой матрицы. В то же время, если вязкость превышает указанную верхнюю границу, то слой пористой матрицы и гемостатический слой могут быть отделены друг от друга, и может не сформироваться связующий слой.

Фенол- или многоатомный фенол-содержащие фрагменты могут быть введены в цепочку биосовместимого полимера методами химического синтеза, электрохимического синтеза или ферментативного синтеза, с использованием соединения, содержащего фенольный, катехиновый или галлольный фрагмент. В одном варианте осуществления, биосовместимый полимер растворяют в дистиллированной воде при нагревании, и реагенты, включая фенол- или многоатомное фенол-содержащее соединение, добавляют в полученный раствор, и смесь перемешивают при pH от 4 до 6.

Например, раствор для формирования гемостатического слоя, включающий полимер, содержащий введенные в него катехиновые фрагменты, готовят химически по описанной далее методике. Сначала раствор 1-гидрокси-2,5-пирролидиндиона (NHS) добавляют в раствор полимера, получая смешанный раствор полимер/NHS, и добавляют раствор 1-этил-3-(-3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (EDC) в смешанный раствор полимер/NHS, получая смешанный раствор полимер/NHS/EDC. После этого добавляют раствор допамина, и он реагирует со смешанным раствором полимер/NHS/EDC, давая раствор для формирования гемостатического слоя, включающий полимер, содержащий введенные в него катехиновые фрагменты.

Согласно способу по настоящему изобретению, реакция между фенол- или многоатомным фенол-содержащим соединением и биосовместимым полимером проходит в водной фазе. Во время этой реакции многоатомный фенол, такой как катехин, окисляется до хиноноподобных соединений по реакции с кислородом в воде. Совместное присутствие катехина и хинона в гемостатическом слое приводит к дополнительному улучшению адгезивных свойств и гемостатических свойств.

Конкретнее, соединение, содержащее фенольный фрагмент, введенный в цепь биосовместимого полимера, может представлять собой, например, тирамин, L-тирозин или флоретиновую кислоту. Конкретнее, соединение, содержащее катехиновый или галлольный фрагмент, введенный в цепь биосовместимого полимера, может представлять собой, например, пирокатехин, L-допа, допамин, норэпинефрин, кофеиновую кислоту, галловую кислоту, галлоламин или 2-аминоэтан пирогаллол.

На стадии (c) раствор для формирования гемостатического слоя вводят в контакт с поверхностью пористой матрицы. Для этого, например, раствор для формирования гемостатического слоя помещают в форму из ПЭТ, пористую матрицу помещают поверх этого раствора, и раствор для формирования гемостатического слоя импрегнируется в пористую матрицу при охлаждении. В результате импрегнирования вводится связующий слой между слоем пористой матрицы и гемостатическим слоем. Во время импрегнирования контролируют толщину связующего слоя, чтобы она находилась в диапазоне от 1 до 1500 мкм, предпочтительно от 100 до 1200 мкм, более предпочтительно от 200 до 1000 мкм. В этом диапазоне толщины достигаются высокие адсорбционные и запечатывающие характеристики слоя пористой матрицы.

На стадии (d) раствор для формирования гемостатического слоя подвергают лиофилизации (сублимационной сушке) с образованием твердого гемостатического слоя на поверхности пористой матрицы. Связующий слой также может быть полностью сформирован на поверхности раздела между пористой матрицей и гемостатическим слоем.

Согласно способу по настоящему изобретению, аппликационный гемостатический материал, имеющий многослойную структуру, состоящую из гемостатического слоя, связующего слоя и слоя пористой матрицы, может быть получен простым способом посредством импрегнирования.

Аппликационный гемостатический материал, полученный способом по настоящему изобретению, безопасен для людей и имеет функции гемостаза, in vivo адгезии, а также адсорбции и запечатывания крови. Таким образом, данный аппликационный гемостатический материал может быть использован для существенного улучшения работы существующих полимерных гемостатических агентов. Кроме того, аппликационный гемостатический материал эффективно останавливает кровотечение и может использоваться в различных областях, в которых требуется предотвратить повреждение органов, желчеистечение и обеспечить послеоперационную адгезию. Кроме того, аппликационный гемостатический материал по настоящему изобретению удобен в использовании, потому что он не прилипает к хирургическим инструментам при их использовании, и его качество не изменяется при транспортировке, поскольку его компоненты не содержат гидролизуемых групп.

Настоящее изобретение будет более подробно описано на приведенных далее примерах. Квалифицированному специалисту в данной области будет понятно, что эти примеры приведены исключительно для иллюстрации, и объем настоящего изобретения не ограничивается только ими.

Примеры

Препаративный пример 1: Синтез желатин-катехина

300 мл трижды дистиллированной воды помещали в реактор и добавляли туда 3 г желатина, который был предварительно разделен на небольшие порции. Полученную смесь растворяли при надлежащем перемешивании при нагревании в течение по меньшей мере 3 часов, получая раствор желатина. Полное растворение желатина подтверждали визуальным наблюдением.

Раствор 1,12 г 1-гидрокси-2,5-пирролидиндиона (“NHS”) в 15 мл трижды дистиллированной воды добавляли в перемешиваемый раствор желатина, получая раствор желатин-NHS. Раствор 1,87 г 1-этил-3-(-3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (“EDC”) в 15 мл трижды дистиллированной воды добавляли в раствор желатин-NHS, получая раствор желатин-NHS-EDC. Раствор 1,23 г допамина в 15 мл трижды дистиллированной воды добавляли в раствор желатин-NHS-EDC, получая раствор желатин-NHS-EDC-допамина. Реакцию проводили при комнатной температуре в течение по меньшей мере 5 часов. После завершения реакции, реакционный раствор подвергали диализу с использованием диализной мембраны (Номинальное отсечение по молекулярной массе (MWCO): 12000-14000, SpectraPor). Полученный продукт подвергали лиофилизации и хранили.

2 мг полученной желатин-катехиновой гемостатической губки растворяли в 1 мл деионизованной воды. Степень связывания катехина подтверждали с помощью спектрофотометра, работающего в УФ-видимой области. В результате степень связывания катехина на молекулу желатина была определена равной 3,3%.

Препаративный пример 2: Синтез гиалуроновой кислоты-катехина

300 мл трижды дистиллированной воды помещали в реактор и добавляли 3 г гиалуроновой кислоты, которая была предварительно разделена на небольшие порции. Полученную смесь растворяли при надлежащем перемешивании, получая раствор гиалуроновой кислоты. Полное растворение гиалуроновой кислоты подтверждали визуальным наблюдением.

Раствор 2,27 г NHS в 15 мл трижды дистиллированной воды добавляли в перемешиваемый раствор гиалуроновой кислоты, получая раствор гиалуроновой кислоты-NHS. Раствор 3,79 г EDC в 15 мл трижды дистиллированной воды добавляли в раствор гиалуроновой кислоты-NHS, получая раствор гиалуроновой кислоты-NHS-EDC. Раствор 3,00 г допамина в 15 мл трижды дистиллированной воды добавляли в раствор гиалуроновой кислоты-NHS-EDC, получая раствор гиалуроновой кислоты-NHS-EDC-допамина. Реакцию проводили при комнатной температуре в течение по меньшей мере 5 часов. После завершения реакции, реакционный раствор подвергали диализу с использованием диализной мембраны (MWCO: 12000-14000, SpectraPor). Полученный продукт подвергали лиофилизации и хранили.

2 мг полученной гиалуроновая кислота-катехиновой гемостатической губки растворяли в 1 мл деионизованной воды. Степень связывания катехина подтверждали с помощью спектрофотометра, работающего в УФ-видимой области. В результате, степень связывания катехина на молекулу гиалуроновой кислоты была определена равной 4,3%.

Препаративный пример 3: Синтез хитозан-катехина

300 мл трижды дистиллированной воды помещали в реактор и добавляли 3 г хитозана, который был предварительно разделен на небольшие порции. В полученную смесь добавляли 3 мл 5M раствора соляной кислоты. Полученную смесь растворяли при надлежащем перемешивании и добавляли 8 мл 0,5M раствора гидроксида натрия. Полученную смесь растворяли при надлежащем перемешивании, получая раствор хитозана. Полное растворение хитозана подтверждали визуальным наблюдением.

Раствор 2,07 г HCA в 10 мл воды тройной очистки добавляли в перемешиваемый раствор хитозана, получая раствор хитозан-HCA. Раствор 1,77 г EDC в 200 мл этанола добавляли в раствор хитозан-HCA. Реакцию проводили при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 часа. После завершения реакции, реакционный раствор подвергали диализу с использованием диализной мембраны (MWCO: 12000-14000, SpectraPor). Полученный продукт подвергали лиофилизации и хранили.

2 мг полученной хитозан-катехиновой гемостатической губки растворяли в 1 мл деионизованной воды. Степень связывания катехина подтверждали с помощью спектрофотометра, работающего в УФ-видимой области. В результате, степень связывания катехина на молекулу хитозана была определена равной 8,9%.

Препаративный пример 4: Производство гемостатической многослойной губки, имеющей структуру желатиновый слой/связующий слой/хитозан-катехиновый слой

В данном примере гемостатическую многослойную губку в качестве аппликационного гемостатического материала получали, используя желатин в качестве пористой матрицы и хитозан-катехин, синтезированный в Препаративном примере 3, в качестве гемостатического слоя.

Гемостатический слой гемостатической многослойной губки формировали по следующей методике. Сначала 1 г лиофилизованного хитозан-катехина, синтезированного в Препаративном примере 3, растворяли в 100 мл трижды дистиллированной воды при перемешивании, получая раствор для формирования гемостатического слоя. Вязкость данного раствора была определена равной 74,3 сП. После того как этот раствор помещали в форму, желатин (губкообразный адсорбирующий полимер) в качестве пористой матрицы помещали на этот раствор таким образом, чтобы раствор для формирования гемостатического слоя нужным образом импрегнировался в желатин, после чего проводили лиофильную сушку.

Полученная в результате гемостатическая многослойная губка состояла из слоя пористой матрицы, включающего желатин (нижний), связующий слой (средний) и гемостатический слой, включающий хитозан, содержащий введенные в него катехиновые фрагменты (верхний).

Препаративный пример 5: Производство гемостатической многослойной губки, имеющей структуру желатиновый слой/связующий слой/хитозан-катехиновый слой

Гемостатическую многослойную губку изготавливали так же как описано в Препаративном примере 4, за исключением того, что 0,5 г хитозан-катехина растворяли в 100 мл трижды дистиллированной воды, получая раствор для формирования гемостатического слоя. Вязкость полученного раствора для формирования гемостатического слоя была определена равной 25,7 сП.

Препаративный пример 6: Производство гемостатической многослойной губки, имеющей структуру желатиновый слой/связующий слой/желатин-катехиновый слой

Гемостатическую многослойную губку изготавливали так же как описано в Препаративном примере 4, за исключением того, что 1 г желатин-катехина растворяли в 100 мл трижды дистиллированной воды, получая раствор для формирования гемостатического слоя. Вязкость полученного раствора для формирования гемостатического слоя была определена равной 14,6 сП.

Препаративный пример 7: Производство гемостатической многослойной губки, имеющей структуру желатиновый слой/связующий слой/гиалуроновая кислота-катехиновый слой

Гемостатическую многослойную губку изготавливали так же как описано в Препаративном примере 4, за исключением того, что 1 г гиалуроновой кислоты-катехина растворяли в 100 мл трижды дистиллированной воды, получая раствор для формирования гемостатического слоя. Вязкость полученного раствора для формирования гемостатического слоя была определена равной 13,3 сП.

Препаративный пример 8: Производство гемостатической многослойной губки, имеющей структуру желатиновый слой/связующий слой/хитозан-катехиновый слой, методом нанесения покрытия

1,5 г лиофилизованного хитозан-катехина, синтезированного в Препаративном примере 3, растворяли в 100 мл трижды дистиллированной воды при перемешивании, получая раствор для формирования гемостатического слоя. Вязкость полученного раствора для формирования гемостатического слоя была определена равной 745 сП. Полученный хитозан-катехиновый раствор равномерно наносили на желатиновый слой и затем проводили лиофилизацию, получая гемостатическую многослойную губку.

Сравнительный Препаративный пример 1: Производство гемостатических многослойных губок, имеющих структуру желатиновый слой/связующий слой/хитозан-катехиновый слой

Хитозан-катехиновые растворы, имеющие значения вязкости в диапазоне от 10 до 2500 сП, согласно измерению на ротационном вискозиметре при 4°C, готовили в качестве раствора для формирования гемостатического слоя. Полученные растворы для формирования гемостатического слоя использовали для получения гемостатических многослойных губок, имеющих многослойную структуру. В этой многослойной структуре связующий слой был хорошо оформлен, и слои не отделялись друг от друга. В отличие от этого, когда использовался хитозан-катехиновый раствор, имеющий вязкость вне указанных выше пределов, было трудно получить многослойную губку со стабильной структурой.

На Фиг. 3 изображены структуры гемостатической многослойной губки, полученной импргенированием хитозан-катехинового раствора с низкой вязкостью в желатиновый слой, и гемостатической многослойной губки, полученной импргенированием хитозан-катехинового раствора с высокой вязкостью в желатиновый слой. На Фиг. 3, когда хитозан-катехиновый раствор с вязкостью < 10 сП импргенировался в желатиновый слой, избыточно большое количество хитозан-катехинового раствора адсорбировалось в желатиновый слой, не позволяя получить многослойную структуру. При этом, как показано в части B на Фиг. 3, когда использовался хитозан-катехиновый раствор с вязкостью > 2500 сП, связующий слой не формировался, и в результате не достигалось достаточной силы связывания, что приводит к отделению желатинового слоя от хитозан-катехинового слоя. Вязкость раствора, использованного для получения губки, показанной в части A на Фиг. 3, составляла 8,3 сП. Вязкость раствора, использованного для получения губки, показанной в части B на Фиг. 3, составляла 2717 сП.

Экспериментальный пример 1: Изучение многослойной губки

В данном экспериментальном примере, поперечный разрез многослойной губки, полученной в Препаративном примере 4, наблюдали с использованием сканирующего электронного микроскопа при увеличении 40× и 200×.

На Фиг. 4 показаны изображения поперечного разреза многослойной губки, полученные методом сканирующей электронной микроскопии. На Фиг. 4 губка имеет трехслойную структуру, состоящую из гемостатического слоя (верхний), связующего слоя (средний) и слоя пористой матрицы (нижний).

Толщина связующих слоев в многослойных губках, полученных в Препаративных примерах 4, 5 и 8, составляла 390±40 мкм, 900±90 мкм и 310±100 мкм, соответственно.

Экспериментальный пример 2: Измерение прочности губок на разрыв

В данном экспериментальном примере измеряли прочности на разрыв для желатиновой губки, хитозановой губки и многослойной губки, полученной в Препаративном примере 4. Сначала каждую из губок резали на образцы, имеющие ширину 0,6 см и длину 0,5 см. Затем оба конца образца зажимали в универсальной машине для тестирования. Образцы растягивали со скоростью 5,0 мм/мин. Регистрировали максимальную силу (N), при которой образцы разрывались. Все эксперименты проводили в четырех независимых повторах.

В Таблице 1 приведены результаты анализа прочностных характеристик губок. Среди полученных в тестах значений, модули упругости (наклон кривой зависимости деформации от напряжения) желатиновой губки и хитозановой губки составляли 0,85 и 1,02, соответственно. В отличие от них, модуль упругости у многослойной губки составлял 1,71, что в 2,01 раза больше, чем у желатиновой губки, и в 1,68 раза больше, чем у хитозановой губки.

Таблица 1

Прочностные характеристики Желатиновая губка Хитозановая губка Многослойная губка Максимальное усилие (N) 3,98 1,51 3,88 Удлинение (%) 4,17 1,68 2,05 Прочность на разрыв (Н/мм²) 0,13 0,05 0,13 Модуль упругости (Н/мм²) 0,85 1,02 1,71

Экспериментальный пример 3: Сравнение запечатывающих свойств губок

В данном экспериментальном примере сравнивали запечатывающие свойства желатиновой губки, хитозановой губки и многослойной губки, полученной в Препаративном примере 4. Сначала капали раствор красного красителя на желатиновую губку, хитозановую губку и многослойную губку. Наблюдали за верхней и нижней поверхностью каждой губки.

На Фиг. 5 показаны фотографии с результатами анализа запечатывающих свойств гемостатических губок. На Фиг. 5 раствор красного красителя наблюдали только на нижней поверхности желатиновой губки и многослойной губки, и это говорит о том, что данные губки обладают запечатывающими свойствами. В отличие от них, раствор красного красителя проникал с нижней поверхности на верхнюю поверхность хитозановой губки, указывая на то, что хитозановая губка не обладает запечатывающими свойствами.

Экспериментальный пример 4: Сравнение силы адгезии к тканям кишечника свиньи.

В данном экспериментальном примере сравнивали силу адгезии желатиновой губки, хитозановой губки и многослойной губки, полученной в Препаративном примере 4, к тканям. Сначала каждую губку резали на кусочки размером 1,0×1,0 см и готовили прямоугольные кусочки ткани кишечника. Капали кровь животного на ткань кишечника, а затем губку (размер 1,0×1,0 см) присоединяли к соответствующему образцу ткани. Затем оба конца полученного образца зажимали в универсальной машине для тестирования. Регистрировали прочность на срез при растяжении (N), когда губка отделялась от ткани кишечника. Силу адгезии (кПа) вычисляли из значения прочности на срез при растяжении (N). Все эксперименты проводили в трех независимых повторах.

В Таблице 2 приведены значения силы адгезии губок к покрытым кровью тканям кишечника свиньи. Сила адгезии к тканям росла в следующем порядке: желатиновая губка < хитозановая губка < многослойная губка. Каждый результат эксперимента представлен в виде среднего значения ± стандартное отклонение.

Таблица 2

Губка Сила адгезии (кПа) Желатиновая губка 5,23 ± 0,46 Хитозановая губка 11,80 ± 1,30 Многослойная губка 16,93 ± 9,25

Экспериментальный пример 5: Запечатывающие и адгезивные свойства на тканях кишечника свиньи

В данном экспериментальном примере исследовали запечатывающие и адгезивные свойства желатиновой губки, хитозановой губки и многослойной губки, полученной в Препаративном примере 4. Использовали прибор для испытания прочности на продавливание для анализа запечатывающих и адгезивных свойств губок. Все эксперименты проводили в трех независимых повторах.

Делали отверстие в ткани кишечника свиньи с помощью пробойника диаметром 0,8 см; желатиновую губку, хитозановую губку и двухслойную губку разрезали на кусочки размером 2,0×2,0 см и помещали на отверстие диаметром 8 мм. Ткань кишечника, на которой была расположена губка, размещали на диафрагме прибора для испытания прочности на продавливание, закачивали воздух в прибор и регистрировали давление, при котором губка отрывалась от ткани кишечника.

В Таблице 3 показаны результаты анализа запечатывающих и адгезивных свойств. Желатиновая губка легко отрывалась от ткани, поскольку у неё сила адгезии к ткани была близка к 0 гПа. Поскольку хитозановая губка не обладает запечатывающей способностью, закачиваемый в прибор воздух проходил через поры губки, что делало невозможным измерение давления. В отличие от них, поскольку многослойная губка обладает и запечатывающей способностью, и адгезией к ткани, для неё можно измерить прочность запечатывания-адгезии. Прочность запечатывания-адгезии у многослойной губки к ткани кишечника свиньи была определена равной в среднем 37,8 гПа.

Таблица 3

Губка Давление (гПа) Среднее Стандартное отклонение Хитозановая губка ~ 0 - - ~ 0 ~ 0 Желатиновая губка ~ 0 - - ~ 0 ~ 0 Многослойная губка 35,5 37,8 2,8 37,8 41,3

Экспериментальный пример 6: Сравнение удобства использования

В данном экспериментальном примере для желатиновой губки, хитозановой губки и многослойной губки, полученной в Препаративном примере 4, при использовании в качестве гемостатических агентов оценивали – прилипают ли они к хирургическим инструментам, и обладают ли они адгезией к живым тканям, принимая во внимание водное окружение in vivo при хирургических операциях.

Каждую губку резали на кусочки размером 1,0×1,0 см, хирургические щипцы обрабатывали физиологическим раствором, и готовили прямоугольные кусочки ткани кишечника. После того как губку (размер 1,0×1,0 см) присоединяли к ткани шипцами, проверяли – отделяется ли губка от шипцов. После того как губку присоединяли к ткани кишечника аналогично описанному выше, проверяли – отделяется ли губка от ткани.

В Таблице 4 указано отделялась ли каждая губка от щипцов, обработанных физраствором, или от ткани кишечника после контакта с щипцами или тканью. Желатиновая губка имела слабую адгезию к инструментам и тканям, а хитозановая губка имела высокую адгезию к инструментам и ткани. В отличие от них, поверхность многослойной губки в контакте с инструментами показала слабую адгезию, а при контакте с тканью поверхность многослойной губки показала хорошую адгезию к ткани. Можно сделать вывод, что многослойная губка превосходит другие губки по удобству в использовании.

Таблица 4

Губка Адгезия к инструментам Адгезия к ткани Желатиновая губка Плохая Плохая Хитозановая губка Хорошая Хорошая Многослойная губка Плохая Хорошая

Экспериментальный пример 7: Эффективность достижения гемостаза в модели кровотечения в крысиной печени

В данном экспериментальном примере гемостатическую многослойную губку, полученную в Препаративном примере 4, исследовали в модели кровотечения в крысиной печени для оценки ее гемостатических свойств.

В качестве экспериментальных животных использовали самцов крыс Sprague Dawley 9-недельного возраста. Животных делили на две группы: контрольную группу, которая не подвергалась никаким воздействиям после вызывания кровотечения, и экспериментальную группу, в которой использовали желатиновую губку или многослойную губку после вызывания кровотечения.

После полной анестезии каждой крысы стерилизовали место вмешательства. После разрезания живота открывали печень и опрыскивали ее стерильным физраствором для удаления посторонних частиц. Центр открытой печени ранили скальпелем, вызывая кровотечение.

В контрольной группе не проводилось никакой дальнейшей обработки кровотечения, вызванного травмой. В экспериментальной группе на место кровотечения помещали желатиновую губку или многослойную губку.

Через 3 минуты после вызывания кровотечения невооруженным глазом оценивали – достигался ли гемостаз. Полученные результаты приведены в Таблице 5. Гемостаз не наблюдался у всех животных в контрольной группе и в экспериментальной группе с желатиновой губкой, даже после 3 минут кровотечения. То есть, коэффициент достижения гемостаза за 3 минуты кровотечения составил 0%. Напротив, гемостаз наблюдался у всех животных в экспериментальной группе с многослойной губкой. То есть, коэффициент достижения гемостаза за 3 минуты кровотечения составил 100%. Эти результаты показывают, что многослойная губка эффективно останавливает кровотечение в месте повреждения у порезанной печени крыс.

Таблица 5

Группа Достигнут ли гемостаз
за 3 минуты Коэффициент достижения гемостаза (%) Контрольная группа × 0 × × Желатиновая губка × 0 × × Многослойная губка ○ 100 ○ ○

Экспериментальный пример 8: Гемостатические свойства в модели кровотечения из крысиной сонной артерии

В данном экспериментальном примере многослойную губку, полученную в Препаративном примере 4, исследовали в модели кровотечения из крысиной сонной артерии для оценки ее гемостатических свойств. Все эксперименты проводили в трех независимых повторах.

В качестве экспериментальных животных использовали самцов крыс Sprague Dawley 9-недельного возраста. Животных делили на две группы: контрольную группу, в которой использовали марлю после вызывания кровотечения, и экспериментальную группу, в которой использовали многослойную губку после вызывания кровотечения.

После полной анестезии каждой крысы стерилизовали место вмешательства. Среднюю часть между челюстью и грудью крысы иссекали примерно 3 см в длину и вызывали кровотечение из сонной артерии с помощью иглы 31G.

У каждого животного в контрольной группе место кровотечения покрывали марлей для компрессионного гемостаза. У каждого животного в экспериментальной группе место кровотечения покрывали многослойной губкой и марлей, сложенными вместе, для компрессионного гемостаза. Через 2 минуты осторожно удаляли марлю или многослойную губку, сложенную с марлей, так чтобы не повредить сгустки крови в месте гемостаза, и проверяли невооруженным взглядом – достигался ли гемостаз.

Через 2 минуты оценивали невооруженным взглядом – достигался ли гемостаз. Полученные результаты показаны в Таблице 6. Гемостаз не наблюдался через 2 минуты после начала кровотечения у всех животных в контрольной группе с использованием марли для компрессионного гемостаза. В отличие от этого, гемостаз наблюдался через 2 минуты после начала кровотечения у всех животных в экспериментальной группе с использованием многослойной губки. То есть, коэффициент достижения гемостаза за 2 минуты после начала кровотечения составил 100%. Эти результаты показывают, что многослойная губка эффективно останавливает кровотечение в месте кровотечения из сонной артерии у крыс

Таблица 6

Группа Вес (г) Достигнут ли гемостаз за 2 минуты Коэффициент достижения гемостаза (%) Контроль 307 × 0 313 × 315 × Многослойная губка 316 ○ 100 312 ○ 315 ○

Экспериментальный пример 9: Оценка цитотоксичности и внутрикожных реакций для многослойной губки

В данном экспериментальном примере исследовали цитотоксичность и внутрикожные реакции для многослойной губки, полученной в Препаративном примере 4.

Цитотоксичность тестировали непрямым методом. Сначала 2,0% агар и 2xMEM смешивали в соотношении 1:1. Полученной смесью покрывали полученные из мышей клетки L929 и помещали сверху многослойную губку, порезанную на кусочки размером 1,0×1,0 см. Клетки выращивали в инкубаторе при 5% CO₂ и 37±1 °C в насыщенной водяными парами атмосфере. После 48 часов инкубирования наблюдали морфологию клеток через прямой микроскоп. Добавляли примерно 2 мл раствора нейтрального красного и инкубировали в инкубаторе 15-30 мин. После удаления нейтрального красного клетки промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Оценивали – наблюдалось ли обесцвечивание клеток.

Внутрикожную реакцию оценивали следующим образом. Сначала отбирали 3 здоровых новозеландских белых кролика весом 2,0 кг или больше, и сбривали шерсть на спине каждого кролика. Внутрикожно инъецировали животным 0,2 мл экстракта каждой губки. Оценивали проявление нежелательных реакций, таких как эритема или эдема, в месте инъекции.

В Таблице 7 показаны результаты тестов цитотоксичности и внутрикожной реакции. Тест цитотоксичности показал, что слегка деформированные или деградировавшие клетки наблюдаются прямо под желатиновой губкой и многослойной губкой, и небольшая деформация и обесцвечивание клеток наблюдается прямо под хитозановой губкой. По этим результатам можно определить, что цитотоксичность всех губок несущественная. Тест внутрикожной реакции показал, что экстракты из всех губок не вызвали нежелательных реакций, таких как эритема или эдема, при внутрикожной инъекции. Поэтому все губки можно считать материалами, не вызывающими внутрикожных реакций.

Таблица 7

Губка Цитотоксичность Внутрикожная реакция Желатиновая губка Приемлемая Приемлемая Хитозановая губка Приемлемая Приемлемая Многослойная губка Приемлемая Приемлемая

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к аппликационному гемостатическому материалу и к способу производства указанного материала. Аппликационный гемостатический материал, содержащий: слой пористой матрицы, содержащий биосовместимый полимер; гемостатический слой, нанесенный на слой пористой матрицы и содержащий полимер, в который введены фрагменты, содержащие бензольное кольцо, содержащее одну или больше гидроксильных групп; и связующий слой, расположенный между слоем пористой матрицы и гемостатическим слоем, предотвращающий отделение слоя пористой матрицы от гемостатического слоя, причем указанный связующий слой сформирован с использованием материала, который является смешивающимся со слоем пористой матрицы и гемостатическим слоем, причем указанный материал связующего слоя представляет собой смесь или сополимер основного составного компонента слоя пористой матрицы и основного составного компонента гемостатического слоя. Способ производства аппликационного гемостатического материала, включающий (a) растворение полимера, содержащего введенные в него фенол- или многоатомный фенол-содержащие фрагменты, в воде с получением раствора для формирования гемостатического слоя, (b) обеспечение пористой матрицы, образованной из биосовместимого полимера, (c) введение раствора для формирования гемостатического слоя в контакт с поверхностью пористой матрицы так, чтобы раствор для формирования гемостатического слоя импрегнировался в поры пористой матрицы, и (d) высушивание раствора для формирования гемостатического слоя с одновременным образованием гемостатического слоя на поверхности пористой матрицы и связующего слоя на границе между пористой матрицей и гемостатическим слоем, причем раствор для формирования гемостатического слоя имеет вязкость от 10 до 2500 сП, при измерении на ротационном вискозиметре при 4°C. Вышеуказанная группа изобретений обеспечивает получение материала, безопасного для людей, имеющего функции гемостаза, in vivo адгезии, адсорбции и запечатывания крови, при этом материал эффективно останавливает кровотечение и может использоваться в различных областях, в которых требуется предотвратить повреждение органов, желчеистечение и обеспечить послеоперационную адгезию, а также удобен в использовании, так как не прилипает к хирургическим инструментам. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 5 ил., 7 табл., 18 пр.

1. Аппликационный гемостатический материал, содержащий: слой пористой матрицы, содержащий биосовместимый полимер; гемостатический слой, нанесенный на слой пористой матрицы и содержащий полимер, в который введены фрагменты, содержащие бензольное кольцо, содержащее одну или больше гидроксильных групп; и связующий слой, расположенный между слоем пористой матрицы и гемостатическим слоем, предотвращающий отделение слоя пористой матрицы от гемостатического слоя, причем указанный связующий слой сформирован с использованием материала, который является смешивающимся со слоем пористой матрицы и гемостатическим слоем, причем указанный материал связующего слоя представляет собой смесь или сополимер основного составного компонента слоя пористой матрицы и основного составного компонента гемостатического слоя.

2. Аппликационный гемостатический материал по п. 1, в котором биосовместимый полимер представляет собой природный или синтетический биоразлагаемый полимер.

3. Аппликационный гемостатический материал по п. 1, в котором слой пористой матрицы представляет собой желатиновую или коллагеновую прокладку.

4. Аппликационный гемостатический материал по п. 1, в котором полимер гемостатического слоя содержит введенные в него фенол- или многоатомный фенол-содержащие фрагменты.

5. Аппликационный гемостатический материал по п. 4, в котором указанный полимер представляет собой биосовместимый полимер.

6. Аппликационный гемостатический материал по п. 4, в котором каждый из фенол- или многоатомный фенол-содержащих фрагментов представлен фрагментом “фенол-L-” или “многоатомный фенол-L-”, где L представляет собой простую связь, C₁-C₁₀ алифатическую углеводородную цепь, необязательно содержащую -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)O- или -C(O)NH-, или C₃-C₁₀ алициклическую углеводородную цепь, необязательно содержащую -O-, -S-, -NH-, -C(O)-, -C(O)O-, -OC(O)O- или -C(O)NH-.

7. Аппликационный гемостатический материал по п. 1, в котором гемостатический слой содержит и бензольные кольца, содержащие -OH группы, и бензольные кольца, содержащие =O группы.

8. Аппликационный гемостатический материал по п. 4, в котором связующий слой включает смешанный участок из биосовместимого полимера и полимера, содержащего введенные в него фенол- или многоатомный фенол-содержащие фрагменты.

9. Способ производства аппликационного гемостатического материала, включающий (a) растворение полимера, содержащего введенные в него фенол- или многоатомный фенол-содержащие фрагменты, в воде с получением раствора для формирования гемостатического слоя, (b) обеспечение пористой матрицы, образованной из биосовместимого полимера, (c) введение раствора для формирования гемостатического слоя в контакт с поверхностью пористой матрицы так, чтобы раствор для формирования гемостатического слоя импрегнировался в поры пористой матрицы, и (d) высушивание раствора для формирования гемостатического слоя с одновременным образованием гемостатического слоя на поверхности пористой матрицы и связующего слоя на границе между пористой матрицей и гемостатическим слоем, причем раствор для формирования гемостатического слоя имеет вязкость от 10 до 2500 сП, при измерении на ротационном вискозиметре при 4°C.

10. Способ по п. 9, в котором связующий слой имеет толщину от 1 до 1500 мкм.