Способ получения комплексной синбиотической композиции Российский патент 2023 года по МПК A61K35/744 A61K31/70 C12N1/20 C12R1/23 

Область техники к которой относится изобретение

Изобретение относится к области ветеринарии, касается разработки синбиотической композиции комбинированной с фруктанами для улучшения, восстановления и/или реабилитации кишечного микробиома, а также профилактики иммунного ответа новорождённого поголовья сельскохозяйственных животных и птицы до и/или после возникновения желудочно-кишечных болезней.

Уровень техники

Подавляющее большинство видов бактерий, составляющих микробиом организма животного, живут в пищеварительной системе. Микробиота состоит из 10-100 триллионов микробных клеток, находящихся в каждом организме, в основном кишечных бактерий. Только в коже и пищеварительной системе обитает около 2000 различных видов бактерий. Соответственно, здоровый кишечник так важен для общего благополучия организма животного из-за той роли, которую бактерии играют в укреплении сильной иммунной системы и поддержании физиологического здоровья.

Полезные кишечные бактерии отвечают за выработку витаминов, вытесняя вредные микробы, создавая ферменты, уничтожающие вредные бактерии, и стимулируя секрецию IgA и регуляторных Т-клеток, поддерживающих иммунную функцию.

Рацион кормления сельскохозяйственных животных играет большую роль в обеспечении здоровья кишечника и поддержании пробиотической составляющей микробиома. В свою очередь, здоровье кишечника может влиять на то, как организм животного усваивает питательные вещества из установленного хозяйством рациона.

Применение в терапии и профилактики антибактериальных средств, влечёт за собой выпуск некачественной продукции, которая, содержит опасные антибиотики, гормоны и пестициды, которые убивают полезные бактерии в организме человека, что может способствовать увеличению частоты таких заболеваний, как инфекции желудочно-кишечного тракта, дифтерия, запоры, синдром раздраженного кишечника.

Пробиотические добавки являются важной составляющей рациона кормления сельскохозяйственных животных и птицы для улучшения физиологической адаптации новорождённого молодняка. Что еще более важно, роль любого лекарственного или иммунотерапевтического вмешательства должна заключаться в том, чтобы уравновесить потерю оптимальной функции кишечника. Многие из современных подходов в ветеринарии несовершенны для улучшения здоровья желудочно-кишечного тракта и даже вредны для микробиома кишечника.

Включение полезных бактерий в состав питательной композиции, которые оказывают значимый пробиотический эффект, усиливают иммунобиологический ответ сельскохозяйственных животных и птицы, особенно в период новорожденности к факторам окружающей среды, способствуют формированию благоприятных условий в желудочно-кишечном тракте и улучшению пищеварения.

Известен состав кормовой добавки – фитоферментная кормовая добавка для телят [патент РФ № RU 2692609 C1], включающий смесь из трех видов лекарственных растений - подорожника большого, горца птичьего и ромашки аптечной, глюкозы и фруктозы, микроэлементов селена и цинка в органической форме, аскорбиновой кислоты, сычужного фермента - пепсина говяжьего.

Недостатки следующие.

1. Во-первых, указанные выше добавки стимулируют пищеварение и иммунную систему, однако не содержат пробиотиков - индигенных и транзиторных бактерий, способствующих профилактике возникновения дисбактериозов и диареи у молодняка крупного рогатого скота.

2. Во-вторых, предложенная фитоферментная кормовая добавка не предназначены для длительного профилактического использования.

3. В-третьих, указанные формулой изобретения растительные компоненты труднодоступны для сбора, поскольку не имеют широкого распространения в большей части территории России и трудоёмки.

Известен, комплексный бактериальный препарат Энтрацид П, который используется для профилактики и лечения желудочно-кишечных болезней животных [патент РФ № RU 2091075 C1], содержащий Lactobacillus acidophilus и Enterococcus faecium в сухой измельчённой до порошкообразного состояния форме.

Недостатки следующие.

1. Во-первых, указанный препарат не имеет в своём составе стабилизирующих добавок, что характеризуется низким сроком хранения.

2. Во-вторых, в следствии отсутствия стимулирующих добавок указанный препарат имеет недостаточную метаболическую активность.

Наиболее близким по технической сущности (прототипом), является препарат для лечения и профилактики дисбактериальных состояний кишечника у птиц [патент РФ № RU 2410105 C1], включающий пребиотик инулин, в качестве питательной среды используют молочную сыворотку, а в качестве пробиотической составляющей включают закваску живых микроорганизмов Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium, которая в свою очередь была приготовлена на основе обезжиренного молока. Препарат имеет форму заквашенной смеси.

Недостатки следующие.

1. Во-первых, эффективность указанного препарата не доказана на сельскохозяйственных животных.

2. Во-вторых, отсутствие штаммов микроорганизмов, не даёт ясность в доказательной базе благоприятного воздействия на показатели продуктивности и состояния кишечника птиц с применением препарата.

3. В-третьих, указанный препарат имеет форму заквашенной смеси, что характеризуется низким сроком хранения.

Раскрытие изобретения

Задачей предполагаемого изобретения является разработка комплексной синбиотической композиции и способа её получения, которая служит для профилактики дисбиотических нарушений (состояний) посредством использования биосовместимых составляющих, преимущественно безвредных и экологически безопасных.

 Технический результат изобретения заключается в ингибировании роста нежелательных бактерий и патогенов и/или коррекции физиологических нарушений, вызванных применением антибиотиков и как следствие повышение физиологического и иммунобиологического статуса сельскохозяйственных животных и птицы, за счет применения комплексной синбиотической композиции с включением фруктанов: Инулина и ФОС, а также трансферрина – Лактоферрина.

Технический результат достигается с помощью комплексной синбиотической композиции «Фруктафлор» включающей инулин микроорганизмы Lactobacillus acidophilus, Enterococcus faecium, причём дополнительно содержит депонированные паспортизированные микроорганизмы Lactobacillus acidophilus В-2585 13 и Enterococcus faecium В-2579 К-50 с концентрацией микроорганизмов 10⁸-10¹² КОЕ/г, лактоферрин, ФОС в сухом виде и защитную сахарозо-желатиновую среду в следующем соотношении мас./%:

Lactobacillus acidophilus (В-2585) 13 0,65г/14,2% Enterococcus faecium (В-2579) К-50 0,65г/14,2% лактоферрин 0,2г/4,3% инулин 0,5г/10,9% ФОС 0,3г/6,5% защитная сахарозо-желатиновая среда 2,3г/50%

Технический результат достигается с помощью способа получения комплексной синбиотической композиции «Фруктафлор» по п.1 включающего посев депонированных паспортизированных пробиотических культуры Lactobacillus acidophilus В-2585 13 и Enterococcus faecium В-2579 К-50 на питательную среду - мясо-пептонный бульон при стерильных условиях для увеличения количества микроорганизмов, с последующей инкубацией в отдельных пробирках по 3 мл в каждой на протяжении 12 часов, после чего производят засев на чашки Петри в каждой по 5 мл питательной среды М 17 и MRS с целью культивирования, и инкубируют в термостате на протяжении 36 часов, по истечении заданного времени чашки Петри достают из термостата и наблюдают интенсивный рост микроорганизмов, в условиях ламинарного шкафа стерильным шпателем снимают выросшую культуру и помещают ее в колбы, которые содержат 150 мл питательной среды - мясо-пептонного бульона, после чего отправляют на лиофилизацию, по итогам которой на 1 г сухого вещества 2 млрд микроорганизмов одного вида, а в качестве питательной основы для культур микроорганизмов используют сухие вещества: фруктаны – Инулин и ФОС, а также белок из семейства трансферринов – Лактоферрин, смешивают в стерильные флаконы ФБУ20 (стекло) 20 кубов с учётом правил асептики, загружают питательную основу в виде мелкодисперсного порошка и консорциум депонированных пробиотических культур Lactobacillus acidophilus В-2585 13 и Enterococcus faecium В-2579 К-50 в ресуспендированных фосфатным буфером с титром клеток 10⁸-10¹² КОЕ/г, дополнительно включают компоненты защитной сахарозо-желатиновой среды в соотношении 1:1 содержащей 10% сахарозы и 2% желатина, далее проводят предварительное замораживание композиции в морозильных камерах, температура которых от - 40 до - 60 °С не более 24 часов, материал прошедший заморозку переносят в сушильный шкаф, где досушивают предварительно замороженный объект при температуре 20 °С, в процессе удаляют связанную воду до содержания массовой доли не более 1,3%, по завершению процесса досушивания объекта насос отключают, и через фильтр в камеру подают стерильный сухой азот, достают готовые флаконы, заполняют их сухим воздухом и закрывают резиновыми пробками с алюминиевыми колпачками

Композиция в качестве бактерий-пробиотиков содержит штамм Lactobacillus acidophilus 13, ВКПМ: (В-2585) (1977 год) и штамм Enterococcus faecium К-50, ВКПМ: В-2579 (1984 год) депонированные во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов НИИ им. Кручатова.

Инулин (фруктаны) представляет собой встречающееся в природе растворимое волокно, состоящее из смеси олигомеров различной степени полимеризации. Инулины в основном состоят из звеньев фруктозы и обычно имеют концевую глюкозу. Растительные инулины обычно содержат от 2 до 140 единиц фруктозы. Инулин можно получить из различных источников, включая топинамбур, георгин, лук, чеснок и клубни цикория [Новое слово в лечении воспалительных заболеваний кишечника // JSAP/Российское издание. 2011. №1 − С. 42-43].

Фруктоолигосахариды (фруктаны) встречаются во многих видах растений, включая георгины, цикорий, лук, чеснок, лук-шалот, пшеничную рожь, артишоки и томаты. Фруктоолигосахариды также могут быть получены ферментативным путем с помощью химических методов. Особенно хорошо известно, что фруктоолигосахариды используются для стимуляции роста видов Bifidobacterium [Новое слово в лечении воспалительных заболеваний кишечника // JSAP/Российское издание. 2011. №1− С. 42-43].

Лактоферрин представляет собой белок, который секретируется в молоке, моче, слизи и слюне и подавляется белковыми клетками в месте поражения многочисленными патогенами. Основная функция лактоферрина заключается в связывании железа, который действует как высокоэффективное противомикробное средство. Железо является важным фактором роста практически для каждой клетки и микроорганизма, а свободное железо способствует росту патогенных микроорганизмов в кишечнике (бактерий, грибков и вирусов), позволяя проникать в остальные части организма через стенки кишечника. Лактоферрин вырабатывается нейтрофилами для поглощения свободного железа, которое в противном случае было бы доступно бактериям, вирусам и грибам для роста. В отличие от синтетических антибиотиков, устойчивость к которым у бактерий может развиться в результате мутации, лактоферрин оказывает бактериостатическое действие до тех пор, пока бактериям требуется железо для роста [ Смирнова Н. С. Клинико-фармакологический анализ ветеринарного фармацевтического рынка иммномодулирующих препаратов и перспективы его развития МНИЖ. 2014. №3-4 (22).− С. 131-133.]

Чертежи и иные материалы

ФИГ. 1 Результаты антагонистической активности исследуемых препаратов.

ФИГ. 2 Паспорт штамма Enterococcus faecium (В-2579) К-50, выдаваемого из коллекции.

ФИГ. 3 Паспорт штамма Lactobacillus acidophilus (В-2585) 13, выдаваемого из коллекции.

Осуществление изобретения

Способ получения комплексной синбиотической композиции «Фруктафлор» включает депонированные паспортизированные пробиотические культуры Lactobacillus acidophilus (В-2585) 13 и Enterococcus faecium (В-2579) К-50, которые, в условиях стерильной зоны высевают на питательную среду (мясо-пептонный бульон) для увеличения количества микроорганизмов в отдельных пробирках по 3 мл в каждой и инкубируют на протяжении 12 часов, после чего производят засев на чашки Петри (в каждой по 5 мл питательной среды М 17 и MRS) с целью культивирования, и инкубируют в термостате на протяжении 36 часов, по истечении заданного времени чашки Петри достают из термостата и наблюдают интенсивный рост микроорганизмов, в условиях ламинарного шкафа стерильным шпателем снимают выросшую культуру и помещают ее в колбы, которые содержали 150 мл питательной среды (мясо-пептонного бульона), после чего отправляют на лиофилизацию, по итогам которой на 1 г сухого вещества 2 млрд микроорганизмов одного вида, а в качестве питательной основы для культур микроорганизмов используют сухие вещества: фруктаны – Инулин и ФОС, а также белок из семейства трансферринов – Лактоферрин, смешивают в стерильные флаконы ФБУ20 (стекло) 20 кубов с учётом правил асептики, загружают питательную основу в виде мелкодисперсного порошка и консорциум депонированных пробиотических культур Lactobacillus acidophilus (В-2585) 13 и Enterococcus faecium (В-2579) К-50 в ресуспендированных фосфатным буфером с титром клеток 10⁸-10¹² КОЕ/г, дополнительно включают компоненты защитной сахарозо-желатиновой среды в соотношении 1:1 содержащей 10% сахарозы и 2% желатина, далее проводят предварительное замораживание композиции в морозильных камерах, температура которых от - 40 до - 60 °С не более 24 часов, материал прошедший заморозку переносят в сушильный шкаф, где досушивают предварительно замороженный объект при температуре 20 °С, в процессе удаляют связанную воду до содержания массовой доли не более 1,3%, по завершению процесса досушивания объекта насос отключают, и через фильтр в камеру подают стерильный сухой азот, достают готовые флаконы, заполняют их сухим воздухом и закрывают резиновыми пробками с алюминиевыми колпачками.

Пример 1. Получение комплексной синбиотической композиции «Фруктафлор» осуществляли путем приготовления питательной основы для культур микроорганизмов, для этого использовали сухие вещества: пребиотик – инулин и ФОС, лактоферрин и смешивали в соответствии с п.1 формулы изобретения, смешивали. В стерильные флаконы ФБУ20 20 мл загружали питательную основу в виде мелкодисперсного порошка и консорциум депонированнных пробиотических культур Lactobacillus acidophilus (В-2585) 13 и Enterococcus faecium (В-2579) К-50 ресуспендированных фосфатным буфером с титром клеток 10⁸-10¹² КОЕ/г, дополнительно включали компоненты защитной сахарозо-желатиновой среды, которая содержала 10% сахарозы и 2% желатина(среда М.М. Файбича). Соотношение композиции и среды высушивания 1:1. Полученную смесь размещали в низкотемературных шкафах под воздействием температуры +4°С в течении 2 часов. Далее предварительно замораживали методом сверхмедленного охлаждения (менее 1°С/мин) при температуре – 50 °С. Материал прошедший процедуру замораживания переносили в сушильный шкаф, где досушивали при температуре 30°С/ч. По завершению лиофилизации объекта насос отключали, и через фильтр в камеру подавали стерильный сухой азот. Доставали готовые флаконы, заполняли их сухим воздухом и закрывали резиновыми пробками с алюминиевыми колпачками. Массовая доля влаги составляла 1,02%.

По результатам проведенной оценки качества комплексной синбиотической композиции «Фруктафлор» было установлено, что концентрация микроорганизмов составила Lactobacillus acidophilus (В-2585) 13 – 10⁵ КОЕ/г и Enterococcus faecium (В-2579) К-50 – 10⁴ КОЕ/г. В связи с этим было принято решение снизить температуру заморозки при сверхмедленном охлаждении для того что бы увеличить жизнеспособность пробиотических микроорганизмов.

Пример 2. Получение комплексной синбиотической композиции «Фруктафлор» осуществляли согласно примеру 1, отличающаяся тем, что полученную смесь размещали в низкотемпературных шкафах при температуре +4°С в течении 2 часов. После чего продукт замораживали методом сверхмедленного охлаждения (менее 1°С/мин) при температуре – 40°С. Материал прошедший процедуру замораживания переносили в сушильный шкаф, где досушивали при температуре 30°С/ч. По завершению лиофилизации объекта насос отключали, и через фильтр в камеру подавали стерильный сухой азот. Доставали готовые флаконы, заполняли их сухим воздухом и закрывали резиновыми пробками с алюминиевыми колпачками. Массовая доля влаги составляла 1,08%.

По результатам оценки концентрации микроорганизмов, было определено, что Lactobacillus acidophilus (В-2585) 13 – 10⁷ КОЕ/г и Enterococcus faecium (В-2579) К-50 – 10⁶ КОЕ/г. Таким образом, установлено, что снижение параметров температуры обеспечивает увеличение концентрации микроорганизмов. Так же было предложено, сократить интенсивный нагрев, снизить скорость нагрева до 20°С/ч, что в свою очередь повысит сохранность клеток.

Пример 3. Получение синбиотической композиции «Фруктафлор» осуществляли согласно примеру 1, отличающееся тем, что полученную смесь размещали в низкотемпературных шкафах при температуре +4°С в течениие 2 часов. Далее замораживали методом сверхмедленного охлаждения (менее 1°С/мин) в низкотемпературном холодильнике при температуре – 40°C. Предварительно замороженное средство перегружали в сушильную камеру интенсивного нагрева, где высушива со скоростью 20°С/ч. По завершению лиофилизации объекта насос отключали, и через фильтр в камеру подавали стерильный сухой азот. Доставали готовые флаконы, заполняли их сухим воздухом и закрывали резиновыми пробками с алюминиевыми колпачками. Массовая доля влаги составляла 1,19%.

Таким образом, предложенный метод лиофильной сушки по примеру 3 создает оптимальные условия для роста и сохранения жизнеспособности пробиотических бактериальных клеток входящих в состав синбиотической композиции «Фруктафлор».

Пример 4. Проведение первичного исследования опытного образца «Фруктафлор» и его прототипов заключалась в подготовке исследуемого материала – комплексной синбиотической композиции, комплексного бактериального препарата Энтрацид П [патент РФ № RU 2091075 C1] и препарата для лечения и профилактики дисбактериальных состояний кишечника у птиц [патент РФ № RU 2410105 C1] по отношению к суспензиям тест-культур Escherichia coli K-12 J53 и Staphylococcus aureus ATTCC 6538P с их последующем внесением в расплавленный агар. Затем с использованием стандартных штампов, состоящих из трубок-пробойников, проделывали лунки в агаре с тест-культурами и вносили исследуемые образцы препаратов. Инкубировали на протяжении 24 часов в термостате. Учитывали зоны задержки роста и диаметр зон с помощью штангенциркуля.

В результате проведенной оценки антагонистических свойств (таблица 1) было выявлено, что комплексный бактериальный препарат Энтрацид П проявляет среднюю антогонистическую активность в отношении к Escherichia coli K-12 J53 – зона задержки роста составила 19,0 мм. В отношении и Staphylococcus aureus ATTCC 6538P исследуемый консорциум проявляет менее выраженную среднюю антагонистическую активность и зона задержки роста составила 16,0 мм.

Препарат для лечения и профилактики дисбактериальных состояний кишечника у птиц оказывает среднюю антагонистическую активность в отношении всех используемых тест-культур. Зона задержки роста данного препарата к Escherichia coli K-12 J53 была равна 18,0 мм, а в отношении Staphylococcus ATTCC 6538P – 15,0 мм.

Наиболее значимые результаты были получены в опыте с применением комплексной синбиотической композиции «Фруктафлор», где зона задержки роста к Escherichia coli K-12 J53 составила 27,0 мм, что подтверждает высокую антагонистическую активность. В отношении Staphylococcus aureus ATTCC 6538P зона задержки роста составила 21,0 мм, что свидетельствует о менее выраженной антагонистической активности по отношению к данной тест-культуре, в сравнении с Escherichia coli K-12 J53.

Представленное изобретение по сопоставлению с прототипом и другими известными техническими решениями имеет следующее преимущественное право:

- Ингредиенты, применяемые в данном образце, выпускаются в промышленных условиях, что становится преимуществом в доступности и превалированием в ценовой категории;

- Обеспечивает стабилизацию нормофлоры желудочно-кишечного тракта и повышение иммунобиологических показателей животного;

- Сохраняет биологические свойства наиболее длительный срок;

- Обладает избирательной активностью микроорганизмов, тем самым повышая колонизационный потенциал нормофлоры желудочно-кишечного тракта.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения комплексной синбиотической композиции, включающий посев культуры штамма Lactobacillus acidophilus 13 ВКПМ В-2585 и штамма Enterococcus faecium К-50 ВКПМ В-2579 в отдельные пробирки на мясопептонный бульон, через 12 ч производят засев на чашки Петри на питательные среды М 17 и MRS, инкубируют 36 ч, затем снимают выросшую культуру, помещают в колбы с мясопептонным бульоном и лиофилизируют. В качестве питательной основы для культур микроорганизмов используют сухие вещества: инулин, фруктоолигосахарид, лактоферрин в стерильных флаконах ФБУ20 (стекло) 20 мл, смешивают Lactobacillus acidophilus 13 ВКПМ В-2585 и Enterococcus faecium К-50 ВКПМ В-2579, ресуспендированные фосфатным буфером с титром клеток 10⁸-10¹² КОЕ/г, включают компоненты защитной сахарозо-желатиновой среды, затем предварительно замораживают при температуре от - 40 до - 60 °С не более 24 ч, в сушильном шкафу досушивают при 20 °С; готовые флаконы заполняют сухим воздухом, закрывают резиновыми пробками с алюминиевыми колпачками. Изобретение обеспечивает ингибирование роста нежелательных бактерий и патогенов желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственного животного. 3 ил., 4 пр.

Способ получения комплексной синбиотической композиции, включающий посев культуры штамма Lactobacillus acidophilus 13 ВКПМ В-2585 и штамма Enterococcus faecium К-50 ВКПМ В-2579 на питательную среду - мясопептонный бульон при стерильных условиях с последующей инкубацией в отдельных пробирках по 3 мл в каждой на протяжении 12 ч, после чего производят засев на чашки Петри в каждой по 5 мл питательной среды М 17 и MRS, и инкубируют в термостате на протяжении 36 ч, по истечении заданного времени чашки Петри достают из термостата и наблюдают интенсивный рост микроорганизмов, в условиях ламинарного шкафа стерильным шпателем снимают выросшую культуру и помещают ее в колбы, которые содержат 150 мл питательной среды - мясопептонного бульона, после чего отправляют на лиофилизацию, по итогам которой на 1 г сухого вещества 2 млрд микроорганизмов одного вида, а в качестве питательной основы для культур микроорганизмов используют сухие вещества: фруктаны – инулин и фруктоолигосахарид, а также белок из семейства трансферринов – лактоферрин, смешивают в стерильные флаконы ФБУ20 (стекло) 20 мл с учётом правил асептики, загружают питательную основу в виде мелкодисперсного порошка и смешивают Lactobacillus acidophilus 13 ВКПМ В-2585 и Enterococcus faecium К-50 ВКПМ В-2579, ресуспендированные фосфатным буфером с титром клеток 10⁸-10¹² КОЕ/г, дополнительно включают компоненты защитной сахарозо-желатиновой среды, в соотношении 1:1 содержащей 10% сахарозы и 2% желатина, далее проводят предварительное замораживание композиции в морозильных камерах, температура которых от - 40 до - 60 °С не более 24 ч, материал прошедший заморозку переносят в сушильный шкаф, где досушивают предварительно замороженный объект при температуре 20 °С, в процессе удаляют связанную воду до содержания массовой доли не более 1,3%, по завершении процесса досушивания объекта насос отключают, и через фильтр в камеру подают стерильный сухой азот, достают готовые флаконы, заполняют их сухим воздухом и закрывают резиновыми пробками с алюминиевыми колпачками.