Новое производное 9-аминоакридона, обладающее противоопухолевой и антиметастатической активностью Российский патент 2023 года по МПК C07D219/10 A61K31/435 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицины и химико-фармацевтической промышленности, может быть применено в качестве противоопухолевого лекарственного средства и относится к 9-аминия-3,3-диметил-3,4-дигидроакридин-1(2Н)-она 2-гидрокси-бутандиовата, формулы соединения 1.

Уровень техники

Одним из основных методов лечения онкологических заболеваний является лекарственная химиотерапия.

В настоящее время для противоопухолевой химии применяют около ста лекарственных средств из различных химических классов, разделенных на определенные группы по механизму действия:

- алкилирующие;

- антиметаболиты;

- антибиотики;

- агонисты и антагонисты гормонов;

- вещества растительного происхождения;

- таргетные (молекулярно-нацеленные; блокирование активации рецепторов) (Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов, распоряжение Правительства РФ от 23 ноября 2020 г. №3073-р на 2021 год).

Значительная часть применяемых противоопухолевых препаратов в большинстве своем токсичны, развитие раковых клеток подавляют частично.

В связи с этим актуальным является создание противоопухолевых лекарственных средств малотоксичных, эффективно действующих на орган-мишень, ингибирующих метастазирование.

Среди применяемых лекарственных препаратов для противоопухолевой химиотерапии отсутствуют препараты из химического класса аминоакридонов. В доступных публикациях соединение 1 не описано.

Целью изобретения является синтез нового соединения 9-аминия-3,3-диметил-3,4-дигидроакридин-1(2Н)-она 2-гидрокси-бутандиовата (соединение 1), проявляющего противоопухолевую, антиметастатическую активность и создание на его основе лекарственного средства с противоопухолевой и антиметастатической активностью.

Технический результат достигается тем, что предложен метод синтеза соединения 1, и проведены исследования его токсичности и фармакологической активности.

Пример 1. Синтез 9-аминия-3,3-диметил-3,4-дигидроакридин-1(2Н)-она 2-гидрокси-бутандиовата (соединение 1).

В гомогенизатор загружают 9,35 г (0,25 гм) * 9-амино-3,3-диметил-3,4-дигидроакридин-1(2Н)-она и 3,35 г (0,25 гм) 2-гидрокси-бутандиовой кислоты. Массу тщательно гомогенизируют в течение 10-15 минут, затем загружают 70 мл этилового спирта, гомогенизируют реагенты, нагревают массу при перемешивании до кипения, выдерживают 10-15 минут, фильтруют на роторном испарителе, отгоняют этиловый спирт при 30 мм рт. ст., остаток перекристаллизовывают из этилового спирта, сушат до постоянной массы. Получают 10,93 г белого с кремоватым оттенком кристаллического порошка с Тпл.=193-195°С.

Найдено, %: С 60,91; Н 5,94; N 7,46 C₁₉H₂₂N₂O₆

Вычислено, %: С 60,95; Н 5,92; N 7,48; О 25,65

ИК-спектр, v см^-1: 3160, 3080 (NH), 1620,1630 (С=С), 1560 (СОО^-);

ТСХ на сорбенте Silikagel Merck F254, элюент вода:бутанол:ацетон (3:1:1), в зоне основной адсорбции одно пятно.

Примечание:* - 9-амино-3,3-диметил-3,4-дигидроакридин-1(2Н)-она получен методом, описанным в Патенте РФ №2567388.

Исследования фармакологической активности соединения 1 - 9-аминия-3,3-диметил-3,4-дигидроакридин-1(2Н)-она 2-гидрокси-бутандиовата представлены в следующих примерах.

Пример 2. Острая токсичность 9-аминия-3,3-диметил-3,4-дигидроакридин-1(2Н)-она 2-гидрокси-бутандиовата (соединение 1) и прототипа - циклофосфамида.

Острая токсичность соединения 1 изучена в опытах на белых беспородных мышах (60 особей обоего пола весом 19-22 г, полученных из питомника филиала «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России) при внутрибрюшинном введении соединения 1 в виде раствора в 0,9% изотоническом растворе хлорида натрия в объеме 0,8-1,0 мл в возрастающих концентрациях. В случае превышения общего объема вводимого вещества 1,0 мл осуществляли кратное введение через каждые 30 мин.

Показатель ЛД₅₀ рассчитывали методом Личфилда-Уилкоксона (Е.В. Арзамасцев, И.В. Березовская, О.В. Верстакова [и др.] Методические рекомендации по изучению общетоксического действия лекарственных средств / Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - С. 25-35; Гуськова Т.А. Токсикология лекарственных средств. - М.: Издательский дом "Русский врач". - 2003. - С. 20-24). Результаты исследования соединения общей формулы (1), а также прототипа циклофосфамида, представлены в табл. 1.

Из приведенных в таблице 1 данных видно, что заявляемое соединения 1 более, чем в полтора раза менее токсично, нежели прототип циклофосфамид при внутрибрюшинном введении. При этом, соединение 1 относится к классу 3 (умеренно токсичные вещества) классификации токсичности химических веществ в соответствии с ГОСТом 12.1.007 - 76 (Березовская И.В. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения // Хим.-фарм. журнал. - 2003. - Т. 37, №3. - С. 32-34).

Пример 3. Противоопухолевая активность соединения 1 на модели сингенной опухоли - меланомы В16 у мышей C₅₇B1/6

Противоопухолевая активность соединения 1 изучена в опытах на 30 мышах самцах линии C₅₇B1/6, полученных из питомника SPF-лабораторных животных - филиала ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (г. Пущино) при внутрибрюшинном введении заявляемого соединения 1 и циклофосфамида (прототип) в дозе, составляющей 1% от показателя ЛД₅₀ при данном пути введения, объемом 0,8-1,0 мл в 0,9% изотоническом растворе хлорида натрия, через 72 часа после перевивки опухоли в течение 7 суток.

Противоопухолевую активность изучали на сингенной опухолевой системе - меланоме В16 - из банка опухолевых штаммов ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Опухоль воспроизводили трехступенчатой перевивкой клеток опухолевого штамма (Трещалина Е.М., Жукова О.С, Герасимова Г.К. [и др.] Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств / Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - С. 640-654).

Противоопухолевое действие оценивали в соответствии с международными рекомендациями по изучению специфической активности противоопухолевых препаратов (Geran R.I., Greenberg N.H., MacDonald М.М., Schumacher A.M., Abbott B.J. Protocols for screening chemical agents and natural products against tumor and other biological systems // Cancer Chemother. Rep. - 1972. - Vol.3. - P. 1-103).

Результаты исследования противоопухолевого действия соединения 1 на модели сингенной опухоли - меланомы В16 - представлены в табл.2. Из представленных в табл. 2 данных видно, что внутрибрюшинное введение соединения 1 в дозе 1,6 мг/кг в сутки в течение 7 суток сопровождается статистически значимыми различиями в объеме опухоли между контрольной группой и группой животных, получавших прототип в эквитоксической дозе, на 14-х и 22-х сутках наблюдения. В эти же временные интервалы статистической значимостью отличался и индекс торможения роста опухоли. У 40% животных в группе мышей, получавших соединение 1, регистрировали ремиссию опухолевого процесса, чего не было в группе животных, получавших прототип.

Таким образом, в отличие от прототипа, соединение 1 отличается большей силой противоопухолевого действия в отношении первичного опухолевого узла, формирующегося в месте трансплантации опухолевых клеток в организм мышей.

Пример 4. Противоопухолевая и антиметастатическая активность соединения 1 на животной модели с использованием ксенографта человеческой опухоли - аденокарциномы молочной железы

Противоопухолевую и антиметастатическую активность соединения 1 изучили в опытах на 6-8 недельных 15 мышах-самках линии атомических мышей BALB/c nu/nu, полученных из питомника SPF-лабораторных животных - филиала ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (г. Пущино) при внутрибрюшинном введении соединения 1 и циклофосфамида (прототип) в дозе, составляющей 1% от показателя ЛД₅₀ при данном пути введения, объемом 0,8-1,0 мл в 0,9% изотоническом растворе натрия хлорида, через 72 часа после перевивки опухоли в течение 7 суток.

Противоопухолевую и антиметастатическую активность изучали на опухолевой системе - ксенографте аденокарциномы молочной железы - из банка опухолевых штаммов ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Опухоль воспроизводили трехступенчатой перевивкой клеток опухолевого штамма подкожно животным в область левого бедра (Трещалина Е.М., Жукова О.С, Герасимова Г.К. [и др.] Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств / Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - С. 640-654).

Фармакологическое действие оценивали в соответствии с международными рекомендациями по изучению специфической активности противоопухолевых препаратов (Geran R.I., Greenberg N.H., MacDonald М.М., Schumacher A.M., Abbott B.J. Protocols for screening chemical agents and natural products against tumor and other biological systems // Cancer Chemother. Rep. - 1972. - Vol.3. - P. 1-103).

Результаты исследования противоопухолевого и антиметастатического действия соединения 1 на модели аденокарциномы молочной железы представлены в табл. 3 и 4. Из представленных в табл. 3 и 4 данных хорошо видно, что внутрибрюшинное введение соединения 1 в дозе 1,6 мг/кг в сутки в течение 7 суток сопровождается статистически значимыми различиями в объеме опухоли между контрольной группой и группой животных, получавших прототип в эквитоксической дозе, на 14-х и 22-х сутках наблюдения. Кроме того, были зафиксированы статистически значимые различия как в количестве, так и объеме метастатического поражения головного мозга животных при сравнении с мышами контрольной группой и группы животных, получавших прототип в эквитоксической дозе, на 31-е сутки формирования опухоли.

Таким образом, в отличие от прототипа, соединение 1 отличается большей противоопухолевой и антиметастатической активностью в отношении ксенографта аденокарциномы молочной железы, перевитого в организм атимичных линейных мышей.

Пример 5. Влияние соединения 1 на тканевое содержание рецептора эпидермального фактора роста в первичном опухолевом узле на модели ксенографтной опухоли - аденокарциномы молочной железы

Влияние соединения 1 на тканевое содержание рецептора эпидермального фактора роста в первичном опухолевом узле изучено в опытах на 6-8 недельных 15 мышах-самках линии атимических мышей BALB/c nu/nu, полученных из питомника SPF-лабораторных животных - филиала ФГБУН Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (г. Пущино) при внутрибрюшинном введении соединения 1 и циклофосфамида (прототип) в дозе, составляющей 1% от показателя ЛД₅₀ при данном пути введения, объемом 0,8-1,0 мл в 0,9% изотоническом растворе натрия хлорида, через 72 часа после перевивки опухоли в течение 7 суток.

Тканевую концентрацию рецептора эпидермального фактора роста в первичном опухолевом узле изучали на опухолевой системе - ксенографте аденокарциномы молочной железы из банка опухолевых штаммов ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Опухоль воспроизводили трехступенчатой перевивкой клеток опухолевого штамма (Трещалина Е.М., Жукова О.С, Герасимова Г.К. [и др.] Методические рекомендации по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств / Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - С. 640-654).

Тканевую концентрацию драйвера опухолевой прогрессии при раке молочной железы -рецептора эпидермального фактора роста оценивали методом количественного иммуноферментного анализа типа «сэндвич» в гомогенате первичного опухолевого узла на 31 стуки после перевивки опухоли (Кишкун А.А. Руководство по лабораторным методам диагностики. - М.: ГЭОТАР-Медицина, 2014. - С.534-612) с использованием исследовательского набора антител EGFR (full length) ELISA kit производства Invitrogen (США).

Результаты исследования тканевой концентрации рецептора эпидермального фактора роста в первичном опухолевом узле на фоне курсового внутрибрюшинного введения соединения 1 на модели ксенографтной аденокарциномы молочной железы представлены в табл.5. Из представленных в табл.5 данных видно, что внутрибрюшинное введение соединения 1 в дозе 1,6 мг/кг сопровождается статистически значимым снижением концентрации онкогена в опухоли при сравнении с животными контрольной группой и группой животных, получавших прототип в эквитоксической дозе, на 31-х сутках наблюдения.

Таким образом, в отличие от прототипа, соединения 1 обладает способностью подавлять тканевую экспрессию драйвера опухолевой прогрессии при раке молочной железы - рецептора эпидермального фактора роста.

Исследования проведены в соответствии с этическими требованиями к работе с экспериментальными животными («Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ МЗ СССР №755 от 12.08.1987 г.), Федеральный закон «О защите животных от жестокого обращения» от 01.01.1997 г., Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.04.2016 г. №199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики», ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами» (введен в действие 01.07.2016 г.) и одобрены Биоэтической комиссией.

По сравнению с известным решением применение соединения 1 позволяет снизить острую токсичность, увеличить силу противоопухолевого эффекта при формировании сингенной модели опухоли у мышей, а также повысить противоопухолевую и антиметастатическую активность при аденокарциноме молочной железы за счет подавления тканевой экспрессии рецептора эпидермального фактора роста.

Настоящее изобретение относится к новому биологически активному соединению 9-аминия-3,3-диметил-3,4-дигидроакридин-1(2Н)-она 2-гидрокси-бутандиовата и его применению в качестве лекарственного средства, обладающего противоопухолевой и антиметастатической активностью в отношении меланомы и аденокарциномы молочной железы. 2 н.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр.

1. 9-аминия-3,3-диметил-3,4-дигидроакридин-1(2Н)-она 2-гидрокси-бутандиоват формулы

.

2. Применение соединения по п.1 в качестве лекарственного средства, обладающего противоопухолевой и антиметастатической активностью в отношении меланомы и аденокарциномы молочной железы.