СРЕДСТВО ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПАРАНЕОПЛАСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ И ХИМИОТЕРАПИИ, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2012 года по МПК A61K31/95 A61P35/00 A61P39/00 

Изобретение относится к медицине, конкретно к (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекану формулы (I):

обладающему противоопухолевой активностью, а также мембраностабилизирующим эффектом и цитопротекторным действием в условиях цитостатической противоопухолевой химиотерапии и паранеопластических изменений в тканях.

Указанные свойства позволяют использовать соединение в медицине для купирования цитотоксических эффектов в тканях при токсическом гепатите, противоопухолевой химиотерапии и на фоне паранеопластических процессов, вызванных злокачественным ростом.

Алкилированные фенолы, образующие в окисляющей среде стабильные феноксильные радикалы, являются высокоэффективными антиоксидантами. Благодаря низкой токсичности они широко применяются в полимерных материалах, в том числе контактирующих с человеком (пищевая упаковка, детские игрушки, медицинские инструменты и т.д.). Однако в медицинской практике данные соединения представлены весьма ограниченным кругом лекарственных препаратов. Препарат дибунол (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол) применяется для лечения рака и папилломатоза мочевого пузыря, циститов, ожогов, трофических и лучевых язв [1. М.Д.Машковский. Лекарственные средства, в двух томах, изд. «Торсинг», Харьков, 1998, т.2, с.55]. Препарат пробукол [4,4'-(изопропилидендитио)-бис-(2,6-ди-трет-бутил)фенол] назначается как гиполипидемическое средство при гиперхолестеринемии с риском развития ишемической болезни сердца [2. Лекарственные препараты, разрешенные к применению в СССР. Под ред. М.А.Клюева, Э.А.Бабаяна. М., Медицина, 1979, с.61-65].

Интерес к разработке таких агентов в последнее время значительно возрос в связи необходимостью их включения в комплексную химиотерапию опухолей для повышения противоопухолевой резистентности организма и снижения побочных эффектов цитостатической химиотерапии. Ассортимент подобных препаратов-корректоров химиотерапевтических средств в настоящее время ограничен.

Структурным аналогом заявляемого соединения является ионол (действующее вещество препарата дибунол) формулы (II).

Ионол обладает антиоксидантной, преимущественно антирадикальной, активностью, предотвращая нарушения клеточных мембран, вызванные развитием окислительного стресса, возникающего при различных патологических процессах. В экспериментальных исследованиях показано, что ионол уменьшает эффект многих токсинов и предотвращает развитие ишемических повреждений органов. Внутрибрюшинное введение ионола крысам на фоне интоксикации CCl₄ существенно понижает удельную площадь некрозов гепатоцитов. Внутрижелудочное введение масляного раствора дибунола сокращает сроки заживления язвенных поражений [3. Н.К.Зенков, Н.В.Кандалинцева, В.З.Ланкин и др. Фенольные биоантиоксиданты. Новосибирск: СО РАМН, 2003. - С.248]. Основным недостатком данного вещества является развитие побочных эффектов при хроническом применении, связанных с влиянием токсичных продуктов метаболизма. Ионол вызывает повреждения в ткани легких, инициируя воспалительный процесс, который приводит к развитию опухолей. Токсический эффект ионола проявляется в отношении печени, что выражается в морфологических нарушениях гепатоцитов в виде дезинтеграции и вакуолизации цитоплазмы, аутолиза митохондрий, жировой инфильтрации, снижения содержания гликогена и т.д. Данные изменения сходны с действием канцерогенов [4. Pastor et al. Antioxidant enzymes and fatty acid status in erytrocytes of Down syndrome patients. Clin. Chem. - 1998. Vol 44. P.924-929]. Следует отметить, что ионол относится к умеренно токсичным соединениям: ЛД₅₀ для мышей составляет 2000, для крыс 1600-3200 мг/кг (III класс токсичности). В отличие от ионола, заявленный агент (I), является малотоксичным: ЛД₅₀ - свыше 5000 мг/кг для животных тех же видов (IV класс токсичности). По антиоксидантной активности в модельных системах (окисление стирола и лярда) заявленное соединение превосходит ионол, a in vivo на модели длительной неполной ишемии головного мозга снижает накопление продуктов перекисного окисления в мозге крыс [15. Плотников М.Б., Просенко А.Е., Смольякова В.И., Иванов И.С., Чернышева Г.А., Кандалинцева Н.В. Синтез и антиоксидантная активность 3,5-диметил-4-гидроксибензилтиододекана // Хим.-фарм. журн., 2010, №3 (44), с.65-67].

Соединением, близким по мембраностабилизирующим свойствам к заявляемому, является препарат α-токоферол формулы (III).

Действие данного липофильного препарата направлено на стабилизацию клеточных мембран при повреждении их токсичными радикальными продуктами. Защитный эффект токоферола показан на моделях ишемии печени, почек и мозга [5. Kaiden et al. Reduced tocopherol content of В cells from patients with cronic lymphocytic leukemia. Blood. 1984. Vol.63. P.213-215]. Как гепатопротектор препарат (III) применяется при острых и хронических токсических гепатитах, в том числе алкогольных и лекарственных, сопровождающихся клеточным цитолизом, а также при воспалительных и дистрофических заболеваниях печени другой этиологии [6. Голиков А.П., Полумисков В.Ю., Давыдов Б.В. и др. Перекисное окисление липидов и основные факторы его активации у больных инфарктом миокарда // Кардиология. - 1989. №7. С.53-59]. Анализ экспериментальных и клинических данных в отношении применения данного препарата в лечении опухолевых заболеваний не дает однозначных рекомендаций о его использовании в терапии опухолевых процессов [3. Н.К.Зенков, Н.В.Кандалинцева, В.З.Ланкин и др. Фенольные биоантиоксиданты. Новосибирск: СО РАМН, 2003. - С.248]. По этой причине токоферола ацетат не нашел широкого применения как корректор при комплексной противоопухолевой терапии.

Ранее было показано, что заявленный фенол (I) превосходит α-токоферол и троллокс по антиокислительной активности, увеличивая выживаемость клеток штаммов E.coli при их обработке пероксидом водорода, а также не проявляет генотоксичности и мутагенной активности в тесте Эймса [13. Кемелева Е.А., Васюнина Е.А., Синицина О.И., Хомченко А.С., Гросс М.А., Кандалинцева Н.В., Просенко А.Е., Невинский Г.А. Новые перспективные антиоксиданты на основе 2,6-диметилфенола // Биоорган, химия, 2008, №4 (34), с.558-569]. Соединение (I) известно также как средство для лечения больных с сердечно-сосудистыми и другими заболеваниями для уменьшения повышенной вязкости крови, спонтанной агрегации эритроцитов, снижения агрегационной способности тромбоцитов и внутрисосудистого тромбообразования [14. Плотников М.Б., Смольякова В.И., Иванов И.С., Чернышева Г.А., Просенко А.Е., Гросс М.А., Бойко М.А. Средство, обладающее антиагрегантной, уменьшающей повышенную вязкость крови и антитромбогенной активностью // Пат. РФ №2368376 (2009)]. Однако применение данного агента в качестве мембраностабилизирующего и цитопротекторного средства при опухолевых заболеваниях и цитотоксической химиотерапии в литературе не описано. Не исследованы также противоопухолевые свойства этого соединения.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является разработка на основе доступного 2,6-диметилфенола малотоксичного фенольного агента, с противоопухолевыми свойствами и цитопротекторным действием в различных тканях при паранеопластических синдромах, цитостатической противоопухолевой химиотерапии и токсическом гепатите.

Поставленная задача достигается химическим соединением - (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододеканом формулы (I), полученным из 2,6-диметилфенола и додекантиола способом, описанным в работе [12. Просенко А.Е., Дюбченко О.И., Терах Е.И., Марков А.Ф., Горох Е.А., Бойко М.А. Синтез и исследование антиокислительных свойств алкилзамещенных гидроксибензилдодецилсульфидов // Нефтехимия, 2006, №4 (46), с.310-315] и обладающим выраженной противоопухолевой, цитопротекторной и мембраностабилизирующей активностью, в том числе на фоне введения в организм цитостатических препаратов и гепатотропного яда CCl₄.

Исследование биологической активности соединения (I) включало в себя определение его антицитолитического и мембраностабилизирующего эффектов при токсическом гепатите, а также противоопухолевого, антиметастатического и цитопротекторного действия на фоне перевиваемых опухолей, в том числе в сочетании с противоопухолевыми химиотерапевтическими препаратами с целью снижения их цитотоксического эффекта в организме. При исследовании антицитолитического и мембраностабилизирующего действия в качестве препарата сравнения брали токоферола ацетат. В качестве эталона противоопухолевой и антиметастатической активности использовали стандартную схему полихимиотерапии АСОР (циклофосфан, доксорубицин, винкристин и преднизолон) [7. Гершанович М.Л., Филов В.А., Акимов М.А., Акимов А.А. Введение в фармакотерапию злокачественных опухолей - СПб.: Сотис, 1999. С.105].

Полученные данные обрабатывались статистически с помощью стандартного пакета программ «STATISTICA».

Предварительно методом Кербера [8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У.Хабриева - М.: Медицина, 2005. 832 с.] определялась острая токсичность соединения (I) на белых беспородных мышах массой 22-25 г при однократном внутрижелудочном способе введения. Показано, что соединения (I) относится к IV классу токсичности, ЛД₅₀ свыше 5000 мг/кг.

Антицитолитические и мембраностабилизиующие свойства агента определяли на мышах линии С57В1 массой 25 г, у которых вызывали токсический гепатит путем внутрижелудочного введения 10% раствора CCl₄ в растительном масле (в объеме 0,1 мл). Раствор соединения (I) вводили внутрижелудочно в дозе 80 мг/кг массы тела. Группе сравнения аналогичным способом вводили масляный раствор токоферола (80 мг/кг). Контролем являлись животные с введением только CCl₄. Установлено, что введение масляного раствора соединения (I) мышам достоверно снижает концентрацию маркеров цитолиза - С-реактивного белка (СРБ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) - в крови мышей соответственно в 2 и 2,9 раз относительно контроля. Эффективность мембраностабилизирующего действия соединения (I) выше, чем у токоферола (в 1,2-1,8 раз). Выявлено, что соединение (I) достоверно уменьшает в печени концентрацию вторичного продукта перекисного окисления липидов - малонового диальдегида (МДА) (в 1,7 раз относительно контроля). Токоферол в данных условиях не оказывает достоверного мембраностабилизирующего эффекта.

Противоопухолевые свойства соединения (I) определяли in vitro и in vivo. В опытах in vitro изучали цитотоксическое действие агента в различных лекарственных формах (масляный раствор, водная взвесь, водный раствор с диметилсульфоксидом) на клеточные культуры нормальных мышиных фибробластов и саркомы V40. Установлено, что соединение (I) в виде масляного раствора проявляет наименее выраженное цитотоксическое действие на нормальные и опухолевые клетки. Концентрации, близкие к среднеэффективным, составляют: для масляного раствора - около 100 мМ; для водной взвеси - 0,01 мМ; для водного раствора с ДМСО - 0,001 мМ.

Противоопухолевое действие соединения (I) in vivo исследовали на животных с солидными перевиваемыми опухолями - карциномой легких Льюис (мыши самки линии C57BL/6 массой 18-23 г) и карциномой Эрлиха (беспородные мыши самцы массой 20-25 г). Эталоном противоопухолевого эффекта являлась цитостатическая полихимиотерапия, применяемая по стандартной схеме АСОР (однократное парентеральное введение циклофосфана, доксорубицина, винкристина и преднизолона в дозах 1/5 от ЛД₅₀). Агент (I) вводился внутрижелудочно на 11 день после перевивки опухоли в виде раствора в подсолнечном масле по 0,2 мл на 10 г массы тела в дозе 100 мг/кг (мышам с карциномой Льюис и карциномой Эрлиха) и в дозе 50 мг/кг (мышам с карциномой Эрлиха). Введение агента продолжалось в течение 7 дней. Полихимиотерапия АСОР проводилась однократно на десятый день после перевивки опухоли. Противоопухолевый эффект оценивали по индексу торможения роста опухоли (отношение разности средних размеров опухолей в контрольной и опытной группах к ее размерам в контроле), который определяли в динамике в период введения агента согласно методическим рекомендациям [8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У.Хабриева - М.: Медицина, 2005. 832 с.]. Установлено, что при данном режиме введения противоопухолевый эффект соединения (I) не уступает эффекту полихимиотерапии АСОР (таблицы 2, 3).

Антиметастатические свойства соединения (I) изучали на мышах самках линии C57BL/6 с перевиваемой карциномой легких Льюис. Агент (I) вводили животным в подсолнечном масле в дозе 100 мг/кг в течение 7 дней, начиная с 11 дня после перевивки опухоли. В качестве группы сравнения использовали животных с полихимиотерапией АСОР. Методом морфометрического анализа срезов обеих долей легких [9. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. М.: Медицина, 1990. 384 с.] определяли объемную плотность метастазов (относительное количество метастатических очагов, Vv, %) и поверхностную плотность метастазов (относительная площадь метастатических очагов, Sv, %). Интенсивность процесса метастазирования оценивали по частоте метастазирования (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе) и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ) [8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У.Хабриева - М.: Медицина, 2005. 832 с.]. Установлено, что агент (I) оказывает антиметастатическое действие, хотя и уступает полихимиотерапии АСОР по величине ИИМ (64% против 81% соответственно) (таблица 4).

Изучение возможности применения соединения (I) как корректора неспецифического цитотоксического полиорганного эффекта противоопухолевой полихимиотерапии (схема АСОР) проводили на мышах с перевитыми опухолями - карциномой легких Льюис и карциномой Эрлиха. Предварительно определяли влияние агента на противоопухолевый эффект полихимиотерапии. Комплекс химиотерапевтических препаратов по схеме АСОР вводили однократно парентерально на 10 день после перевивки. Агент (I) вводился этим же группам мышей через сутки после полихимиотерапии внутрижелудочно в виде раствора в дозе 100 мг/кг в подсолнечном масле по 0,2 мл на 10 г массы тела (дополнительной группе с карциномой Эрлиха в дозе 50 мг/кг). Введение агента продолжалось в течение 7 дней после АСОР. Установлено, что масляный раствор соединения (I) не стимулирует рост опухоли в постцитостатическом периоде. Введение агента в дозе 100 мг/кг повышает противоопухолевый эффект полихимиотерапии (на 10-12% в модели карциномы Льюис, на 30% в модели карциномы Эрлиха) (таблицы 5, 6). Таким образом, показано, что соединения (I) может применяться на фоне цитостатической полихимиотерапии.

В этих же экспериментах исследовалась способность соединения (I) снижать побочное цитотоксическое действие полихимиотерапии в тканях животных опухоленосителей. Установлено, что в результате 7- дневного введения соединения (I) в масляном растворе в дозе 100 мг/кг после полихимиотерапии у животных с карциномой Льюис наблюдалось снижение тяжести некробиотических поражений печени, почек, миокарда, уменьшение нарушений кровообращения во внутренних органах. На общее положительное действие изучаемого агента указывает также гиперплазия белой пульпы селезенки у мышей данной группы, свидетельствующая о повышении иммунной активности. Кроме того, увеличение количества очагов внемедулярного кроветворения и инфильтрация красной пульпы селезенки клетками гранулоцитарного ряда указывает на стимуляцию процессов кроветворения.

После введения соединения (I) в виде масляного раствора в дозе 50 мг/кг на фоне ПХТ у животных с карциномой Эрлиха отмечается частичное купирование признаков токсического поражения печени: снижение степени дистрофического поражения гепатоцитов, уменьшение количества некротизированных клеток и нейтрофильной инфильтрации синусоидов, увеличение выраженности макрофагальной реакции. Аналогичное введение агента (I) в дозе 100 мг/кг в сочетании с ПХТ приводит к существенному купированию признаков токсического поражения печени. Уменьшается не только степень дистрофического поражения гепатоцитов, но и его площадь. Таким образом, установлено, что агент (I), вводимый на фоне полихимиотерапии АСОР с целью коррекции ее токсического действия, проявляет органопротективные свойства, снижая размеры зон с некротическими и дистрофическими поражениями и степень этих поражений.

Таким образом, алкилированный фенол - (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан формулы (I) можно рассматривать как средство с мембраностабилизирующим, цитопротекторным и противоопухолевым свойствами, в том числе способностью купировать цитотоксические повреждения в органах, возникающие в результате побочного действия химиопрепаратов.

К отличительным признакам соединения следует отнести:

1. Высокий антицитолитический и мембраностабилизирующий эффект.

2. Выраженную противоопухолевую активность.

3. Коррекцию паранеопластических нарушений в тканях.

4. Цитопротекторные свойства при применении на фоне цитостатической полихимиотерапии.

5. Не снижает противоопухолевую эффективность цитостатической химиотерапии.

6. Не уменьшает антиметастатическое действие цитостатической химиотерапии.

Ранее у заявленного соединения - (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана - была выявлена антиоксидантная, антиагрегантная и антитромбогенная активность [13. Кемелева Е.А., Васюнина Е.А., Синицина О.И., Хомченко А.С., Гросс М.А., Кандалинцева Н.В., Просенко А.Е., Невинский Г.А. Новые перспективные антиоксиданты на основе 2,6-диметилфенола // Биоорган, химия, 2008, №4 (34), с.558-569; 14. Плотников М.Б., Смольякова В.И., Иванов И.С., Чернышева Г.А., Просенко А.Е., Гросс М.А., Бойко М.А. Средство, обладающее антиагрегантной, уменьшающей повышенную вязкость крови и антитромбогенной активностью // Пат. РФ №2368376 (2009); 15. Плотников М.Б., Просенко А.Е., Смольякова В.И., Иванов И.С., Чернышева Г.А., Кандалинцева Н.В. Синтез и антиоксидантная активность 3,5-диметил-4-гидроксибензилтиододекана // Хим.-фарм. журн., 2010, №3 (44), с.65-67]. Противоопухолевые и цитопротекторные свойства не изучались и не обнаружены в патентной и научно-медицинской литературе. (3,5-Диметил-4-гидрокси)бензилтиододекан может быть использован в медицинской практике в качестве противоопухолевого, мембраностабилизирующего и цитопротекторного средства для коррекции цитотоксических эффектов химиотерапии и паранеопластических нарушений.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям патентоспособности изобретения, а именно «новизне», «изобретательскому уровню» и «промышленной применимости».

Сущность изобретения иллюстрируется примерами и рисунками.

Фиг.1. Печень мыши с карциномой Эрлиха после однократного введения комплекса цитостатиков: мелкоочаговый некроз гепатоцитов, ацидофильные клетки с пикнотичными ядрами. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400.

Фиг.2. Печень мыши с карциномой Эрлиха после введения соединения (I) в дозе 50 мг/кг на фоне ПХТ; дистрофия гепатоцитов центролобулярных зон. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 200.

Фиг.3. Печень мыши с карциномой Эрлиха после введения соединения (I) в дозе 100 мг/кг на фоне ПХТ: гепатоциты без признаков дистрофии, в просвете синусоидов фибрин, нейтрофилы, макрофаги. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. 400.

Пример 1. Получение соединения (I) из 2,6-диметилфенола и додекантиола через промежуточный синтез N,N-диметил-(3,5-диметил-4-гидрокси)бензиламина согласно схеме [12].

15,9 г (0,13 моль) 2,6-диметилфенола, 29,5 (0,195 моль) диметиламина, 10,8 (0,143 моль) формальдегида и 25 мл метанола нагревали в атмосфере азота и кипятили 4 ч., затем охлаждали, отгоняли растворитель, остаток кристаллизовали из толуола. Получали 19,2 г (83%) N,N-диметил-(3,5-диметил-4-гидрокси)бензиламина, т.пл. 113°С. Спектр ЯМР ¹H (500, 13 МГц, CDCl₃), δ, м.д.: 2.16 с (6Н, ArMe), 2.17 с (6Н, NMe), 3.23 с (6Н, ArCH ₂), 4.80-5.60 уш. (1Н, ОН), 6.80 с (2Н, Н_аром.). Найдено, %: С 73.93; Н 9.85; N 7.65. C₁₁H₁₇NO. Вычислено, %: С 73.70; Н 9.56; N 7.81.

8,0 г (44,6 ммоль) N,N-диметил-(3,5-диметил-4-гидрокси)бензиламина, 8,2 г (40,6 ммоль) додекантиола и 33 мл о-ксилола нагревали в атмосфере азота и кипятили 16 ч., затем охлаждали, обрабатывали соляной кислотой, промывали водой, сушили Na₂SO₄, отгоняли растворитель. Остаток перегоняли под вакуумом, получали 10,9 г (80%) (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана (I), т.кип. 197-199°С (1 мм рт.ст.), т.пл. 56-57°С (из этанола). Спектр ЯМР ¹H (500,13 МГц, CDCl₃), δ, м.д.: 0.86 т (3Н, S(CH₂)₁₁ Me), 1.24 с (18Н, (CH ₂)₉Me), 1.54 м (2Н, SCH₂CH ₂), 2.21 с (6Н, ArMe), 2.40 т (2Н, SCH₂), 3.58 с (6Н, ArCH ₂), 4.54 с (1Н, ОН), 6.89 с (2Н, Н_аром.). Найдено, %: С 75.03; Н 10.92; S 9.22. C₂₁H₃₆OS. Вычислено, %: С 74.94; Н 10.78; S 9.53.

Пример 2. Изучение мембраностабилизирующего действия соединения (I) на модели токсического гепатита.

Мембраностабилизирующие свойства агента определяли по антицитолитическому эффекту на мышах линии С57В1 массой 25 г, у которых вызывали токсический гепатит путем внутрижелудочного введения 10% раствора CCl₄ в растительном масле (в объеме 0,1 мл). Масляный раствор соединения (I) вводили внутрижелудочно в дозе 40 мг/кг массы тела (в объеме 0,1 мл) дважды: за 5 ч до и через 1 ч после введения CCl₄. Суммарная доза агента составила 80 мг/кг. Группе сравнения аналогичным способом вводили масляный раствор токоферола (суммарная доза 80 мг/кг). Контролем являлись животные с введение только CCl₄. Через сутки после последнего введения препаратов животных умерщвляли и определяли в сыворотке крови активность маркеров цитолиза - аланинаминотрансферазы (АЛТ) и С-реактивного белка (СРБ), используя стандартные наборы реактивов «Biocon». В гомогенатах печени определяли концентрацию малонового диальдегида (МДА) общепринятым методом [10. Камышников B.C. Справочник по клинико-химической лабораторной диагностике, Минск: Беларусь, 2000, Т.2, с.207].

Результаты представлены в таблице 1. Установлено, что введение масляного раствора соединения (I) мышам достоверно снижает концентрацию маркеров цитолиза СРБ и АЛТ в крови мышей соответственно в 2 и 2,9 раз относительно контроля. Это свидетельствует о том, что в условиях индуцированного гепатита соединение (I) оказывает протекторное действие на клетки, прежде всего гепатоциты, которые подвергаются цитолизу под действием ССl₄. Эффективность мембраностабилизирующего действия агента (I) выше, чем у токоферола (в 1,2-1,8 раз). Выявлено, что соединение (I) достоверно уменьшает в печени концентрацию вторичного продукта перекисного окисления липидов - МДА (в 1,7 раз относительно контроля). Токоферол в данных условиях не оказывает достоверного мембраностабилизирующего эффекта.

Таблица 1 Изменение содержания С-реактивного белка и аланинаминотрансферазы в сыворотке крови и концентрации малонового диальдегида в печени мышей с CCl₄-индуцированным гепатитом Группа СРБ, мг/мл крови АЛТ, Ед/л крови МДА, нМ/10 мг белка печени Контроль 20,00±0,15 14613±1656 4,50±0,35 Соединение (I) 10,00±2,10* 5052±743* 2,7±0,33* Токоферол 12,00±1,80* 9164±1202* 3,2±0,36 *р<0,05 достоверность относительно контроля

Таким образом, показано, что внутрижелудочное введение соединения (I) в масляном растворе в дозе 80 мг/кг оказывает мембраностабилизирующее и антицитолитическое действие, которое превосходит аналогичные эффекты токоферола.

Пример 3. Изучение выраженности цитотоксического действия препаратов соединения (I) на клеточных культурах in vitro.

В опытах in vitro в качестве клеточных культур были взяты фибробласты мышей линии СВА и опухолевые клетки саркомы V40.2 - клона, возникшего из спонтанно трансформированных фибробластов мышей in vitro [11. Лавровский В.А., Ефремов Я.Р., Пивоварова Е.Н. и др. // Цитология, 2002, т.44, №7, с.702-711]. Для культивирования клеток использовали среду Игла MEM и DMEM (ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Института полиомиелита и вирусных инфекций им. М.П.Чумакова», г.Москва), содержащую глютамин с добавлением эмбриональной бычьей сыворотки Fetal Bovine Serum (HYClone, Perbio). Из порошка соединения (I) готовили препараты в виде масляного раствора (на оливковом масле), водно-твиновой взвеси и раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО), которые добавляли в ростовую среду Игла MEM и DMEM до конечных концентраций 1000-0,001 мМ. Полученными препаратами обрабатывали культивируемые клетки. Через 24 и 48 ч после обработки подсчитывали отношение количества погибших клеток к их общему количеству в процентах.

Установлено, что концентрации, близкие к среднеэффективным, составляют: для масляного раствора - около 100 мМ; для водной взвеси - 0,01 мМ; для водного раствора с ДМСО - 0,001 мМ (таблица 2).

Таблица 2. Зависимость цитотоксического эффекта соединения (I) от концентрации в ростовой среде в культурах нормальных фибробластов и саркомы V40.2 Препа-
рат Концентрация соединения (I), мМ Гибель фибробластов, % Гибель опухолевых клеток, % 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч Масля-
ная эмульсия 100,0 0 100 0 100 1,0 0 0 0 0 0,1 0 0 0 0 Взвесь в ростовой среде 0,01 40 70 40 70 0,001 20 30 20 30 Раствор с ДМСО 0,001 20 40 20 40 0,0001 0 0 0 0

Таким образом, соединение (I) в виде масляного раствора проявляет наименее выраженное цитотоксическое действие на нормальные и опухолевые клетки.

Пример 4. Изучение противоопухолевого действия соединения (I) на мышах с перевиваемой карциномой легких Льюис.

Противоопухолевое действие соединения (I) исследовали на мышах самках линии C57BL/6 массой 18-23 г, которым перевивали внутримышечно клеточную суспензию карциномы легких Льюис в объеме 5×10⁶ опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора. Через 10 дней после перевивки опытной группе мышей ежедневно в течение 7 дней вводили внутрижелудочно раствор соединения (I) в подсолнечном масле в дозе 100 мг/кг (по 0,2 мл на 10 г массы тела). Эталоном эффекта являлась группа животных, которым проводилась цитостатическая полихимиотерапия по стандартной схеме АСОР: однократное парентеральное введение циклофосфана (50 мг/кг), доксорубицина (4 мг/кг), винкристина (0,1 мг/кг) и преднизолона (5 мг/кг). Контролем являлись животные с опухолью. Контроль и группа с полихимиотерапией АСОР получали в течение 7 дней подсолнечное масло. Противоопухолевый эффект определяли по величине индекса торможения роста опухоли (ТРО) - разности средних размеров опухолей в контрольной и опытной группах, отнесенной к среднему размеру опухолей в контроле [8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У.Хабриева - М.: Медицина, 2005. 832 с.]. В конце опыта ТРО рассчитывали по массе опухоли, которую определяли как разницу между массой лапы с опухолью и здоровой коллатеральной конечностью.

Результаты опыта приведены в таблице 3. Установлено, что средние размеры опухолевых узлов у мышей с введением соединения (I), так же как и в группе сравнения, были достоверно меньше, чем в контроле. При этом показатели в опытной и референсной группах не имели статистически значимых различий между собой. Величина ТРО в группе с введением соединения (I) составила в среднем 33% против 26% в группе сравнения. В конце опыта индекс ТРО в группах с введением агента, рассчитанный по массе опухолевых узлов, был не ниже, чем в группе сравнения (таблица 3).

Таблица 3. Значения индекса торможения роста карциномы легких Льюис (ТРО) у мышей в период введения агента (I) Группа ТРО, % (по размеру опухоли) ТРО, % (по массе опухоли) Фон 2 сут 4 сут 5 сут 7 сут 8 сут ПХТ АСОР 0 12 35** 27* 30** 5 Соединение (I), 100 мг/кг 0 32 40**** 28* 33** 21* *Р<0,05 различия с контролем достоверны

Таким образом, установлено, что при данном режиме введения противоопухолевый эффект соединения (I) не уступает эффекту полихимиотерапии АСОР.

Пример 5. Изучение противоопухолевого действия соединения (I) на мышах с перевиваемой карциномой Эрлиха.

Противоопухолевое действие соединения (I) исследовали на беспородных мышах самцах массой 20-25 г, которым перевивали внутримышечно клеточную суспензию карциномы Эрлиха в объеме 5×10⁶ опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора. Через 10 дней после перевивки двум опытным группам вводили внутрижелудочно масляный раствор соединения (I) в дозах соответственно 100 и 50 мг/кг (по 0,2 мл на 10 г массы тела). Группе сравнения проводили однократно цитостатическую полихимиотерапию по стандартной схеме АСОР. Контролем являлись животные с опухолью. Введение раствора соединения (I) продолжали 7 дней. Контроль и группа с полихимиотерапией АСОР получали в те же сроки эквивалентное количество подсолнечного масла. Величину противоопухолевого эффекта определяли по индексу торможения роста опухоли (ТРО).

Установлено, что у мышей с карциномой Эрлиха средний индекс ТРО под действием соединения (I) составил 16-18%, тогда как в группе ПХТ АСОР его величина составила 11%. В конце опыта индекс ТРО в группах с введением агента, рассчитанный по массе опухолевых узлов, был не ниже, чем в группе сравнения (таблица 4). Различия в показателях между опытной и референсной группой были статистически недостоверными.

Таблица 4. Значения индекса торможения роста карциномы Эрлиха (ТРО) у мышей в период введения агента (I) Группа ТРО, % (по размеру опухоли) ТРО, % (по массе опухоли) Фон 2 сут 4 сут 7 сут 8 сут ПХТ АСОР 0 19 11 3 0 Соединение (I), 100 мг/кг 0 6 24* 17 4 Соединение (I), 50 мг/кг 0 17 18 19 6 *Р<0,05 различия с контролем достоверны

Таким образом, на данной модели показано, что при данном режиме введения противоопухолевый эффект соединения (I) не уступает эффекту полихимиотерапии АСОР.

Пример 6. Исследование антиметастатического эффекта.

Антиметастатические свойства соединения (I) изучали на мышах самках линии C57BL/6 массой 18-23 г с солидной карциномой легких Льюис. Клеточную суспензию карциномы легких Льюис перевивали внутримышечно в объеме 5×10⁶ опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора. Через 10 дней после перевивки опытной группе мышей ежедневно в течение 7 дней вводили внутрижелудочно раствор соединения (I) в подсолнечном масле в дозе 100 мг/кг (по 0,2 мл на 10 г массы тела). В качестве группы сравнения использовали животных с полихимиотерапией АСОР (однократное парентеральное ведение циклофосфана, доксорубицина, винкристина и преднизолона на десятый день после перевивки опухоли). В конце опыта животных умерщвляли, извлекали легкие и после стандартной гистологической обработки исследовали методом световой микроскопии. Антиметастатический эффект определяли путем морфометрического анализа срезов обеих долей легких. Объемную плотность (Vv, %) метастазов подсчитывали по методу Автандилова [9. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. М.: Медицина, 1990. 384 с.] с использованием окулярной сетки на 289 точек. Поверхностную плотность метастазов (Sv, %) определяли путем подсчета площади метастатических очагов с помощью программы «Видео-Тест». Интенсивность процесса метастазирования оценивали по частоте метастазирования (ЧМ) (отношение числа животных с метастазами к общему количеству животных в группе) и индексу ингибирования метастазирования (ИИМ) [8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У.Хабриева - М.: Медицина, 2005. 832 с.]:

,

где А_к - частота метастазирования в контрольной группе, А - частота метастазирования в опытной группе, В_к - плотность метастазов у животных контрольной группы,

В - плотность метастазов у животных опытной группы.

Результаты представлены в таблице 5.

Установлено, что введение химиотерапевтических препаратов АСОР достоверно тормозит диссеминацию опухоли, тогда как агент (I) проявляет лишь тенденцию к уменьшению метастатических поражений ввиду значительных колебаний показателей объемной и поверхностной плотности метастазов в данной группе (таблица 5).

Таблица 5. Показатели метастазирования карциномы легких Льюис в легких мышей Группа Vv, % Sv, % ЧМ, % ИИМ, % Контроль 0,80±0,33 1,77±0,63 100 0 ПХТ АСОР 0,15±0,10* 0,33±0,15* 100 81 Соединение (I), 100 мг/кг 0,32±0,17 0,63±0,26 100 64 * Р<0,05 по сравнению с I группой (различия с контролем достоверны), Vv - объемная плотность метастазирования; Sv - поверхностная плотность метастазирования; ЧМ - частота метастазирования; ИИМ - индекс ингибирования метастазирования

Сравнение величин ИИМ в группах с введением соединения (I) (64%) и с полихимиотерапией АСОР (81%) свидетельствует о том, что агент (I) не усиливает диссеминации опухоли, но уступает референсной группе по величине антиметастатического эффекта.

Пример 7. Изучение влияния соединения (I) на противоопухолевый эффект цитостатической полихимиотерапии мышей с перевиваемой карциномой легких Льюис.

Изучение влияния агента соединения (I) на эффективность противоопухолевой полихимиотерапии проводили на мышах самках линии C57BL/6 массой 18-23 г. Всем животным перевивали внутримышечно клеточную суспензию карциномы легких Льюис в объеме 5×10⁶ опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора. На 10 день после перевивки двум группам животным вводили однократно парентерально комплекс химиотерапевтических препаратов по схеме АСОР. Одной из этих групп через сутки после полихимиотерапии вводили внутрижелудочно соединение (I) в виде раствора в подсолнечном масле по 0,2 мл на 10 г массы тела в дозе 100 мг/кг, вторая группа с ПХТ АСОР являлась референсной. Контролем являлись животные с опухолью. Введение раствора соединения (I) опытным мышам продолжали 7 дней. Контроль и группа с полихимиотерапией АСОР получали в те же сроки эквивалентное количество подсолнечного масла. Величину противоопухолевого эффекта определяли по индексу торможения роста опухоли (ТРО), который в период введения агента рассчитывали по размерам опухоли, а в конце опыта - по массе опухоли. Установлено, что масляный раствор соединения (I), вводимый в дозе 100 мг/кг после полихимиотерапии, не стимулирует развитие опухоли: величины ТРО в опытной и референсной группах не имели достоверных различий между собой (таблица 6).

Таблица 6. Индекс торможения роста карциномы легких Льюис (ТРО) в период введения соединения (I) на фоне полихимиотерапии АСОР Группа ТРО, % (по размеру опухоли) ТРО, % (по массе опухоли) Фон 2 сут 4 сут 5 сут 7 сут 8 сут ПХТ АСОР 0 12 35** 27* 30** 5 ПХТ АСОР + соединения (I), 100 мг/кг 0 30* 42**** 37*** 31** 17* *Р<0,05 различия с контролем достоверны

Таким образом, показано, что соединения (I) может применяться на фоне цитостатической полихимиотерапии карциномы легких Льюис.

Пример 8. Изучение противоопухолевых свойств соединения (I) на фоне цитостатической полихимиотерапии мышей с перевиваемой карциномой Эрлиха.

Влияние агента соединения (I) на противоопухолевый эффект полихимиотерапии изучали на беспородных мышах самцах массой 20-25 г. Всем животным перевивали внутримышечно клеточную суспензию карциномы Эрлиха в объеме 5×10⁶ опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора. На 10 день после перевивки всем группам животных, кроме контроля, вводили однократно парентерально комплекс химиотерапевтических препаратов по схеме АСОР. Через сутки двум опытным группам вводили внутрижелудочно масляный раствор соединения (I) в дозах соответственно 100 и 50 мг/кг (по 0,2 мл на 10 г массы тела). Контролем являлись животные с опухолью, группой сравнения - животные с ПХТ АСОР. Введение раствора соединения (I) опытным мышам продолжали 7 дней. Контроль и группа сравнения получали в те же сроки эквивалентное количество подсолнечного масла. Величину противоопухолевого эффекта определяли по индексу торможения роста опухоли (ТРО), который в период введения агента рассчитывали по размерам опухоли, а в конце опыта - по массе опухоли.

Установлено, что в модели карциномы Эрлиха масляный раствор соединения (I) в дозе 100 мг/кг не оказывает пролиферативного действия на клетки опухоли, а, напротив, проявляет тенденцию к повышению противоопухолевого эффекта полихимиотерапии (в среднем на 30%). Уменьшение дозы агента до 50 мг/кг не оказывает статистически значимого влияния на противоопухолевую эффективность ПХТАСОР (таблица 7).

Таблица 7 Индекс торможения роста карциномы Эрлиха (ТРО) в период введения соединения (I) на фоне цитостатической полихимиотерапии АСОР Группа ТРО, % (по размеру опухоли) ТРО, % (по массе опухоли) Фон 2 сут 4 сут 7 сут 8 сут ПХТ АСОР 0 19 11 3 0 ПХТ АСОР + соединение (1), 100 мг/кг 0 13 36**# 38* 15 ПХТ АСОР + соединения (I), 50 мг/кг 0 22 21 23 1 *Р<0,05 различия с контролем достоверны #Р<0,05 различия с группой ПХТ АСОР достоверны

Таким образом, показано, что соединения (I) может применяться на фоне цитостатической полихимиотерапии карциномы Эрлиха.

Пример 9. Изучение органопротективных свойства соединения (I) в условиях цитостатической полихимиотерапии мышей с перевиваемой карциномой легких Льюис.

Органопротекторные свойства соединения (I) изучали на мышах самках линии C57BL/6 массой 23-25 г с солидной карциномой легких Льюис. Клеточную суспензию карциномы легких Льюис перевивали внутримышечно в объеме 5×10⁶ опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора. На 10 день после перевивки двум группам животным вводили однократно парентерально комплекс химиотерапевтических препаратов по схеме АСОР (однократное парентеральное ведение циклофосфана, доксорубицина, винкристина и преднизолона на десятый день после перевивки опухоли). Одной из этих групп через сутки после полихимиотерапии вводили внутрижелудочно соединение (I) в виде раствора в подсолнечном масле по 0,2 мл на 10 г массы тела в дозе 100 мг/кг, вторая группа с ПХТ АСОР являлась референсной. Контролем являлись животные с опухолью. Введение раствора соединения (I) опытным мышам продолжали 7 дней. Контроль и группа с полихимиотерапией АСОР получали в те же сроки эквивалентное количество подсолнечного масла. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали печень, почки, сердце, селезенку и после стандартной гистологической обработки исследовали методом световой микроскопии.

В результате морфологического исследования тканей животных с карциномой Льюис после введения комплекса химиотерапевтических препаратов (группа ПХТ) отмечается нарушение кровообращения во внутренних органах (венозное полнокровие, фибрин в сосудах), а также развитие токсических поражений печени (некрозы, баллонная дистрофия), почек (расширение мезангиального матрикса, гидропическая дистрофия эпителиоцитов, отек интерстициальной ткани) и миокарда (контрактурные изменения). В группе животных с введением соединения (I) в дозе 100 мг/кг в сочетании с полихимиотерапией выраженность отмеченных патологических изменений в тканях снижается, они носят обратимый характер. На общее положительное действие изучаемого агента у мышей данной группы указывает также гиперплазия белой пульпы селезенки, которая свидетельствует о повышении иммунной активности. Кроме того, увеличение количества очагов внемедулярного кроветворения и инфильтрация красной пульпы селезенки клетками гранулоцитарного ряда свидетельствуют о стимуляции процессов кроветворения.

Таким образом, у соединения (I) выявлено органопротекторное действие в условиях цитостатической полихимиотерапии мышей с карциномой легких Льюис.

Пример 10. Изучение органопротективных свойства соединения (I) в условиях цитостатической полихимиотерапии мышей с перевиваемой карциномой Эрлиха.

Гепатопротекторное действие соединения (I) изучали на беспородных мышах самцах массой 20-25 г. Всем животным перевивали внутримышечно клеточную суспензию карциномы Эрлиха в объеме 5×10⁶ опухолевых клеток в 0,1 мл физиологического раствора. На 10 день после перевивки всем группам животным, кроме контроля, вводили однократно парентерально комплекс химиотерапевтических препаратов по схеме АСОР. Через сутки двум опытным группам вводили внутрижелудочно масляный раствор соединения (I) в дозах, соответственно, 100 и 50 мг/кг (по 0,2 мл на 10 г массы тела). Контролем являлись животные с опухолью, группой сравнения - животные с ПХТ АСОР. Введение раствора соединения (I) опытным мышам продолжали 7 дней. Контроль и группа сравнения получали в те же сроки эквивалентное количество подсолнечного масла. В конце опыта животных умерщвляли, извлекали печень и после стандартной гистологической обработки исследовали методом световой микроскопии.

В результате морфологического исследования ткани печени установлено, что однократное введение комплекса цитостатиков животным с карциномой Эрлиха приводит к развитию токсического поражения печени, проявляющегося некродистрофическими изменениями гепатоцитов центролобулярных зон.

После введения агента (I) в дозе 50 мг/кг на фоне ПХТ у животных отмечается частичное купирование признаков токсического поражения печени: снижается степень дистрофического поражения гепатоцитов, уменьшается количество некротизированных клеток и нейтрофильная инфильтрация синусоидов, увеличивается выраженность макрофагальной реакции. Введение соединения (I) в дозе 100 мг/кг в сочетании с ПХТ приводит к существенному купированию признаков токсического поражения печени. Уменьшается не только степень дистрофического поражения гепатоцитов, но и его площадь. Некротические поражения гепатоцитов выявляются преимущественно в перипортальной зоне в виде диффузных мелкоочаговых некрозов, инфильтрированных гистиоцитами.

Таким образом, у соединения (I) выявлено гепатопротекторное действие в условиях цитостатической полихимиотерапии мышей с карциномой Эрлиха.

Таким образом, предлагаемое изобретение в сравнении с прототипом обладает следующими преимуществами, а именно:

- высоким мембраностабилизирующим и антицитолитическим эффектом;

- выраженной противоопухолевой активностью;

- снижением цитотоксических эффектов в тканях, вызванных паранеопластическими процессами;

- цитопротекторными свойствами при применении на фоне цитостатической полихимиотерапии.

- Не снижает противоопухолевую эффективность цитостатической химиотерапии;

- Не уменьшает антиметастатическое действие цитостатической химиотерапии.

Источники информации

1. М.Д.Машковский. Лекарственные средства, в двух томах, изд. «Торсинг», Харьков, 1998, т.2, с.55.

2. Лекарственные препараты, разрешенные к применению в СССР. Под ред. М.А.Клюева, Э.А.Бабаяна. М.: Медицина, 1979, с.61-65.

3. Н.К.Зенков, Н.В.Кандалинцева, В.З.Ланкин и др., Фенольные биоантиоксиданты. Новосибирск: СО РАМН, 2003. - С.248.

4. Pastor et al. Antioxidant enzymes and fatty acid status in erytrocytes of Down syndrome patients. Clin. Chem. - 1998. Vol 44. P.924-929.

5. Kaiden et al. Reduced tocopherol content of В cells from patients with cronic lymphocytic leukemia. Blood. 1984. Vol.63. P.213-215.

6. Голиков А.П., Полумисков В.Ю., Давыдов Б.В. и др. Перекисное окисление липидов и основные факторы его активации у больных инфарктом миокарда // Кардиология. - 1989. №7. С.53-59.

7. Гершанович М.Л., Филов В.А., Акимов М.А., Акимов А.А. Введение в фармакотерапию злокачественных опухолей - СПб.: Сотис, 1999. С.105.

8. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Р.У.Хабриева - М.: Медицина, 2005. 832 с.

9. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. М.: Медицина, 1990. 384 с.

10. Камышников B.C. Справочник по клинико-химической лабораторной диагностике, Минск: Беларусь, 2000, Т.2, с.207.

11. Лавровский В.А., Ефремов Я.Р., Пивоварова Е.Н. и др. // Цитология, 2002, т.44, №7, с.702-711.

12. Просенко А.Е., Дюбченко О.И., Терах Е.И., Марков А.Ф., Горох Е.А., Бойко М.А. Синтез и исследование антиокислительных свойств алкилзамещенных гидроксибензилдодецилсульфидов // Нефтехимия, 2006, №4 (46), с.310-315.

13. Кемелева Е.А., Васюнина Е.А., Синицина О.И., Хомченко А.С., Гросс М.А., Кандалинцева Н.В., Просенко А.Е., Невинский Г.А. Новые перспективные антиоксиданты на основе 2,6-диметилфенола // Биоорган. химия, 2008, №4 (34), с.558-569.

14. Плотников М.Б., Смольякова В.И., Иванов И.С., Чернышева Г.А., Просенко А.Е., Гросс М.А., Бойко М.А. Средство, обладающее антиагрегантной, уменьшающей повышенную вязкость крови и антитромбогенной активностью // Пат. РФ №2368376 (2009).

15. Плотников М.Б., Просенко А.Е., Смольякова В.И., Иванов И.С., Чернышева Г.А., Кандалинцева Н.В. Синтез и антиоксидантная активность 3,5-диметил-4-гидроксибензилтиододекана // Хим.-фарм. журн., 2010, №3 (44), с.65-67.

Изобретение относится к медицине, конкретно к (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекану формулы I.

Соединение обладает противоопухолевым, мембраностабилизирующим, цитопротекторным действием и может использоваться для купирования цитотоксических эффектов в тканях при токсическом гепатите, противоопухолевой химиотерапии и на фоне паранеопластических процессов, вызванных злокачественным ростом. 10 пр., 7 табл., 3 ил.

Применение серосодержащего фенола (3,5-диметил-4-гидрокси)бензилтиододекана формулы (I)

в качестве средства для коррекции цитотоксических эффектов паранеопластических процессов и химиотерапии, обладающее противоопухолевой активностью.