ПРИМЕНЕНИЕ ГЕМОГЛОБИНА ПОЛИМЕРИЗОВАННОГО ДЛЯ МОБИЛИЗАЦИИ КРОВИ ИЗ ДЕПО ПРИ КРОВОПОТЕРЯХ Российский патент 2024 года по МПК A61M5/00 A61K38/42 A61P7/00 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в трансфузиологии как средство, обеспечивающее мобилизацию крови из депо при острых кровопотерях в неотложных и чрезвычайных ситуациях, полевых условиях, медицине катастроф при хирургических операциях, при острой гипоксии. Изобретение также относится к ветеринарии и может быть использовано для лечения домашних животных при пироплазмозе, травмах, хирургических вмешательствах, сопровождающихся кровопотерей и гипоксией.

Известен препарат «Геленпол» /RU 2132687, А61К 35/18, 10.07.1999/, представляющий собой смесь тетрамера гемоглобина и олигомеров с различной длиной цепи. Олигомеры получены путем сшивания тетрамеров гемоглобина глутаровым альдегидом и модифицированы глутаминовой кислотой.

Известен препарат фирмы Biopure на основе гемоглобина, полученного, в том числе, из эритроцитов крови крупного рогатого скота / патенты US 5084558, C07K 14/805, опубл. 28.01.1992 и US 6506725, C07K 14/805, 14.01.2003.

Известен препарат по патенту RU 2203087, A61K 38/42, опубл. 20.08.2000 полученный из донорской крови.

Известен препарат с функцией переноса кислорода [Патент РФ №2340354, C07K 14/805, опубл. 10.12.2008].

Известен агент защиты клеток крови и восстановления кроветворной системы и фармакологическая комбинация для лечения онкологических больных [Патент №2328304, A61K 38/42, опубл. 10.07.2008].

Известен полимеризованный гемоглобин с функцией переноса кислорода [Патент РФ №2340354, A61K 38/42, опубл. 10.12.2008 и Патент РФ №2361608, A61K 38/42, опубл. 20.07.2009]. Указанный полимеризованный глутаровым альдегидом гемоглобин, получают из крови животных, представляет собой лиофилизат и содержит не менее 90% полимеризованного гемоглобина с молекулярной массой в диапазоне 192000-320000 Да, а содержание метгемоглобина составляет не более 5%. Для всех вышеуказанных препаратов не показана функция повышения чувствительности опухолевых клеток к воздействию химиотерапии.

Указанные препараты представлены полимеризованным гемоглобином. Известно, что полимеризованный гемоглобин представляет смесь тетрамера гемоглобина и олигомеров с различной длиной цепи и является переносчиком кислорода. Однако до сих пор они не рассматривались как индукторы восстановления естественных компенсаторных механизмов организма в дополнение к эффекту заместительного действия - переноса кислорода, которым обладает полимеризованный гемоглобин. В частности, как экзогенного индуктора эндогенной продукции важнейшего низкомолекулярного медиатора - оксида углерода (СО), модулирующего сосудистый тонус и выброс крови из депо при массивных кровопотерях.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является расширение арсенала средств, обладающих одновременно кислородтранспортными и мобилизующими элементы крови из депо свойствами при низких концентрациях и дозах введения полимеризованного гемоглобина.

Для достижения технического результата в настоящем изобретении предлагается применение гемоглобина полимеризованного в качестве средства, обладающего кислородтранспортными свойствами и свойствами по мобилизации клеток крови из органов депонирующих кровь, что позволяет увеличить шансы на выживаемость пострадавшего в первые часы после массивной кровопотери за счет восстановления гемодинамических и гематологических показателей.

Гемоглобин полимеризованный представляет собой лиофилизат для приготовления раствора для инфузий. Содержание полимеризованного гемоглобина с молекулярной массой в диапазоне 192000-320000 Да составляет не менее 90%, а концентрация метгемоглобина в его составе составляет не более 5%. При этом гемоглобин полимеризован глутаровым альдегидом.

Предлагается также способ применения гемоглобина полимеризованного, при котором его вводят пациентам от 1 до 12 г в сутки от 1 до 4 раз в сутки.

Заявленное изобретение иллюстрируется следующими фигурами, на которых показано изменение гематологических показателей крови после введения гемоглобина полимеризованного при острой кровопотере у свиней in vivo:

фиг. 1 - изменение кол-ва эритроцитов;

фиг. 2 - среднее содержание гемоглобина;

фиг. 3 - степень насыщения эритроцитов гемоглобином.

Сущность изобретения поясняется примерами конкретного выполнения, в которых:

препарат составляет собой модифицированный полимеризованный глутаровым альдегидом гемоглобин, полученный из крови животных, в виде лиофилизата и содержит не менее 90% полимеризованного гемоглобина с молекулярной массой в диапазоне 192000-320000 Да, а содержание метгемоглобина в кровезаменителе составляет не более 5%.

В результате проведенных нами экспериментальных исследований обнаружено неизвестное до сих пор свойство гемоглобина полимеризованного (лиофилизата для приготовления раствора для инфузий) стимулировать процессы мобилизации крови из депо при острых кровопотерях, что позволяет в первые часы восстановить гемодинамические и гематологические показатели организма.

Наличие у гемоглобина полимеризованного дополнительных свойств по восстановлению гемодинамических и гематологических показателей крови делает его очень важным и доступным препаратом при острой и массивной кровопотере, оперативно мобилизуя собственные ресурсы организма.

Свойство гемоглобина полимеризованного усиливать процессы мобилизации крови из депо при геморрагическом шоке является для специалиста фактом неочевидным и не вытекает из уровня техники в данной области, не обнаружено в патентной и научно-медицинской литературе.

Вышеуказанное свойство гемоглобина полимеризованного может быть использовано в практическом здравоохранении и ветеринарии для повышения качества лечения. Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям патентоспособности изобретения, а именно «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Обнаруженное в ходе исследования на крупных лабораторных животных значительное влияние введения гемоглобина полимеризованного на гемодинамику крови и кровенаполнение и вазодилатацию микрососудов позволяет рассматривать его как экзогенный индуктор и субстрат для эндогенной продукции важнейшего низкомолекулярного медиатора - СО при активации гемоксигеназ и других ферментных систем организма.

В качестве вероятного механизма можно рассматривать индукцию выброса из депо, в частности селезенки, зрелых эритроцитов и других элементов депонированной крови. Эти данные позволяют рассматривать кровезаменитель на основе гемоглобина полимеризованного как перспективный индуктор активации естественных компенсаторных механизмов организма в дополнение к эффекту заместительного действия -переноса кислорода, которым обладает полимеризованный гемоглобин.

Новым в предлагаемом изобретении является то, что в качестве средства для мобилизации крови из депо при острых кровопотерях может применяться гемоглобин полимеризованный (лиофилизат для приготовления раствора для инфузий), состоящий из полимеризованного гемоглобина с молекулярной массой в диапазоне 192000-320000 Да не менее 90%, и метгемоглобина с содержанием не более 5%.

Статистическая обработка результатов исследований была проведена с применением параметрических и непараметрических методов. Различия между группами считались статистически значимыми при Р≤0,05.

Пример 1. Гемоглобин полимеризованный с функцией переноса кислорода как средство для мобилизации крови из депо при кровопотерях оценивался на модели геморрагического шока на 30 крысах-самцах CD (Sprague-Dawley) с уровнем кровопотери 40% от объема циркулирующей крови (ОЦК). Объем всей циркулирующей крови рассчитывался из соотношения 6 мл крови на 100 г массы тела крыс. Масса тела крыс перед операцией составляла 362-376 г.

Эксперимент проведен на крысах CD, которые были разделены на 3 группы по 10 животных: группа №1 Кровопотеря + физиологический раствор, группа №2 Кровопотеря + 1% раствор гемоглобина полимеризованного, группа №3 Кровопотеря + 4% раствор гемоглобина полимеризованного. Исследованные на крысах 1% и 4% растворы гемоглобина полимеризованного соответствовали 3,15 и 12,60 г гемоглобина в пересчете на взрослого человека.

До эксперимента животным имплантировали катетеры в сонную артерию, бедренную артерию и бедренную вену. Через 24-28 часов после операции крыс подключали к установке «Hemodynamics». Регистрацию артериального давления, частоту сердечных сокращений осуществляли через бедренную артерию. Первоначально записывали фоновые параметры гемодинамики. Затем животные были подвергнуты процедуре забора крови 40% от общего объема циркулирующей крови. Процедура забора крови осуществлялась единовременно. Через 20 минут после забора крови животным вводили физиологический раствор, 1%-ный раствор гемоглобина полимеризованного или 4%-ный раствор гемоглобина полимеризованного в физиологическом растворе (в зависимости от групповой принадлежности). Введение веществ проводили через бедренную вену в течение 5 минут. Регистрацию артериального давления и частоту сердечных сокращений проводили до момента забора крови, во время забора крови и после введения раствора гемоглобина полимеризованного в течение 120 минут. Образцы крови (объем одной пробы 250 мкл) для анализа на приборе RapidPoint 405 (Siemens) забирали из бедренной артерии и бедренной вены до момента начала моделирования геморрагического шока, после окончания кровезамещения через 5, 15, 30, 60, 90, 120 минут и на следующие сутки после моделирования геморрагического шока.

Анализ образцов крови осуществлялся на приборе RapidPoint 405 (Siemens), определяемые параметры приведены ниже:

рн

РСО₂ (mmHg) - парциальное давление СО₂

РО₂ (mmHg) - парциальное давление О₂

НСО3 -act (mmol/L)

НСО3 -std (mmol/L)

ВЕ(В) (mmol/L) сдвиг оснований

BE(ecf) (mmol/L)

ctCO₂ (mmol/L) содержание CO₂ в крови

Hct (%) - гематокрит

tHb (g/L) - общий гемоглобин

sO₂ (%) - насыщение Hb кислородом

FO₂Hb (%) - процент содержания оксигенированного гемоглобина

FCOHb (%) - содержание карбоксигемоглобина

FMetHb (%) - содержание метгемоглобина

FHHb (%) - содержание дезоксигемоглобина

BO₂ (mL/dL)

p_5O (mmHg)

ctO₂ (mL/dL) содержание кислорода в крови

Na (mmol/L)

K (mmol/L)

Са (mmol/L)

Са (7,4) (mmol/L)

Cl (mmol/L)

AnGap (mmol/L) анионный интервал

Результаты проведенного исследования показали, что компенсация кровопотери 1% и 4% растворами гемоглобина полимеризованного приводила к изменениям в развитии гемодинамической реакции, наблюдаемой при геморрагическом шоке в группе контрольных животных. У крыс с введением 1% или 4% гемоглобина полимеризованного не развивалось резкое повышение частоты сердечных сокращений (ЧСС) после окончания кровезамещения. У животных, которым вводился 4% раствор гемоглобина полимеризованного, также не наблюдалось снижение значений среднего артериального давления (САД) в течение 60 минут после кровезамещения.

Как показано в таблице 1 и 2, взятие крови в объеме 40% от общего объема циркулирующей крови приводило к снижению гематокрита и содержания общего гемоглобина по сравнению с начальными значениями, которые наблюдались в ходе эксперимента у животных всех групп (Таблица 1).

Через 120 минут после введения животным препаратов было выявлено, что у крыс получавших 4% раствор гемоглобина полимеризованного, гематокрит и общий гемоглобин был выше в артериальной крови относительно контроля и в венозной по сравнению с группой с введением 1% раствора (Таблица 1, 2).

Насыщение гемоглобина кислородом и содержание оксигенированного гемоглобина после кровезабора/кровезамещения снижалось в венозной крови по сравнению с собственными начальными значениями во всех группах животных, однако такой закономерности в артериальной крови выявлено не было (Таблица 3, 4). Для животных получавших 4% раствор гемоглобина полимеризованного было показано более высокое насыщение гемоглобина артериальной крови по сравнению с контролем и группой с введением 1% раствора через 30 минут после проведения кровезамещения. В группе с введением 4% раствора гемоглобина полимеризованного также наблюдалось более высокое содержание кислорода в артериальной крови на 120-й минуте (Таблица 5). В группе животных, у которых кровезамещение осуществлялось 4% раствором гемоглобина полимеризованного отмечено увеличение содержания карбоксигемоглобина (FCOHb) в артериальной крови через 5 минут после введения вещества по сравнению с контролем и группой с введением 1% раствора. Увеличение содержания карбоксигемоглобина в венозной крови было выявлено у крыс, которым вводился 4% раствор через 5 минут по сравнению с контролем и через 5, 30 минут с группой получавшей 1% раствор (Таблица 6). У животных, которым вводился 1% раствор, было выявлено увеличение содержания FCOHb на 120-й минуте по сравнению с контролем и группой получавшей 4% раствор гемоглобина полимеризованного (Таблица 6). Увеличение содержания метгемоглобина в артериальной и венозной крови было выявлено в группе животных, которым вводился 4% раствор гемоглобина полимеризованного, через 5, 30, 90 минут после его введения по сравнению с контролем и другой экспериментальной группой (Таблица 7). Содержание восстановленной формы гемоглобина - дезоксигемоглобина не изменялось в артериальной крови у животных всех групп после проведения кровезабора/кровезамещения относительно собственных начальных значений, но увеличивалось по сравнению с начальными значениями в венозной крови (Таблица 8). У животных, получавших 4% раствор гемоглобина полимеризованного, было выявлено снижение содержания дезоксигемоглобина через 30 минут после кровезамещения по сравнению с контролем и группой, получавшей 1% раствор.

Таким образом, исследование гемодинамических свойств и газотранспортной функции 1% и 4% растворов гемоглобина полимеризованного показало, что введение 4% раствора компенсировало развитие изменений САД и ЧСС, которые возникали у животных контрольной группы в первые часы эксперимента. Также введение 4% раствора гемоглобина полимеризованного приводило к улучшениям таких параметров газотранспортной функции крови, как общий гемоглобин, насыщенность гемоглобина кислородом, содержание кислорода в артериальной крови. Эффекты 1% раствора были менее выраженными, чем 4%.

Пример 2. Гемоглобин полимеризованный с функцией переноса кислорода как средство для мобилизации крови из депо при кровопотерях оценивался в модельных экспериментах на свиньях с уровнем кровопотери 30% от объема циркулирующей крови (ОЦК).

Эксперимент проведен на 5 свиньях с массой тела 45-50 кг.

1. Подготовительный этап эксперимента

За сутки до эксперимента животным лишали корма. В день операции перед транспортировкой из вивария в экспериментальную операционную для индукции анестезии, а также в ходе наркоза внутримышечно вводили 5 мг/кг Zoletil^®100. Животное фиксировали на операционном столе в положении «на спине» с разведенными в стороны конечностями, выполняли трахеостомию.

Продольным разрезом длиной 5-7 см над грудиной выполняли доступ к кольцам трахеи. Выкраивали П-образный лоскут, основанием обращенный вниз и вводили интубационную трубку №8; 9. В течение всего эксперимента проводили искусственную вентиляцию легких аппаратом Minor Vet ТН-1А (Китай) в режиме перемежающейся вентиляции с положительным давлением (IPPV), частотой 12-15 вдохов в минуту с ингаляцией 100% кислорода. На вводном наркозе использовали 5 об.%, а для поддержания анестезии - 2-4 об.% изофлурана. В носоглотку устанавливали датчик измерения температуры тела.

В правой паховой области выполняли разрез длиной 10 см, последовательно выделяли бедренную артерию (БА) и бедренную вену (БВ) на протяжении 2-3 см. В правую БА устанавливали интродьюсер 5Fr для инвазивного мониторинга артериального давления (АД) и для проведения ангиографии. Также через интродьюсер из правой БА делали забор артериальной крови для анализа ее газового состава (рН, PCO₂, PO₂, BEecf, НСО₃, TCO₂, sO₂, Lac) на аппарате VetScan i-STAT 1 (Abaxis) в трех контрольных точках:

- перед началом основного этапа эксперимента;

- через 1 час после снятия компрессии с поврежденной артерии;

- через 3 часа после снятия компрессии с поврежденной артерии.

Из левой БВ до начала основного эксперимента (первая контрольная точка) забирали венозную кровь для клинического анализа крови, аналогичным образом венозную кровь забирали перед выведением животного из эксперимента (вторая контрольная точка).

2. Основной этап эксперимента За основу методики проведения эксперимента взята действующая общепризнанная методика В. Kheirabadi [J. Trauma. - 2011. - Vol. 71 (Suppl. 1). - P. S139-S146], которая была незначительно модифицирована и состоит из следующих основных этапов:

- выделение БА;

- боковая артериотомия БА (выкусывателем сосудистой стенки) диаметром 6,0 мм;

- время свободного кровотечения 45 с;

- прямое давление на рану после применения местного гемостатического средства (МТС) в течение 3 мин;

- использование второго пакета МТС при неэффективности первого;

- наблюдение за животным в течение 180 минут с контролем гемодинамики и внутривенной инфузией кристаллоидов;

- осуществление механической провокации (сгибание/разгибание поврежденной конечности животного 5 раз) с целью оценки прочности гемостаза;

- проведение ангиографии, для оценки проходимости поврежденного сосуда.

В левой паховой области выполняли разрез длиной 10 см, выделяли БА на протяжении 5 см. На сосуды с помощью спрея наносили 10% р-р лидокаина для устранения спазма БА. Измеряли диаметр БА и после атравматичного проксимального и дистального пережатия артерии сосудистыми зажимами с помощью выкусывателя сосудистой стенки выполняли артериотомию (диаметром 6,0 мм).

После этого с БА снимались сосудистые зажимы и после 45 сек свободного кровотечения (кровь собиралась салфетками и электроотсосом, взвешивалась) применяли МТС согласно инструкции, к нему с последующей компрессией в течение 3 минут.

Тампонирование раны во всех случаях осуществляли прицельно к зоне повреждения артерии. Поверх раны для сведения ее краев накладывали клипсу iTClamp^®50. При возобновлении кровотечения рану перетампонировали вторым пакетом МГС.

Если уровень среднего артериального давления (АДср) составлял величину ниже 55 мм рт.ст., то через 5 минут после применения МГС начинали струйную инфузию теплого (37,0-3 8,0°С) плазмозамещающего раствора Рингера со скоростью, достаточной для поддержания АДср на уровне не ниже 55 мм рт.ст. При достижении целевого показателя инфузию приостанавливали. В течение трех часов вели наблюдение за подтеканием крови из раны (аспирировали и взвешивали) и мониторировали основные витальные функции. Таким образом, производили оценку объема вторичной кровопотери.

Спустя 3 часа после применения МГС через интродьюсер, установленный в правой БА, под рентгеноскопией (с использованием «С-дуги»), диагностический катетер заводили через бифуркацию аорты в левую подвздошную артерию и выполняли ангиографию для оценки состояния поврежденной БА.

Далее выполняли тест на определение устойчивости гемостаза с помощью 5-ти кратного разгибания и сгибания поврежденной конечности. Фиксировали следующие показатели: выживаемости животных, динамики красной крови, гемодинамики.

В ходе эксперимента осуществляли кровопотерю в объеме 30% от ОЦК выше описанным методом. На фоне кровопотери проводили внутривенную инфузию гемоглобина полимеризованного из расчета 4 г в 500 мл физиологического раствора на животное. Гемоглобин полимеризованный вводился внутривенно капельно (20 мл за 10 минут). Кровь для анализа брали в следующие временные точки: 1) до введения (фон перед кровопотерей); 2) после кровопотери; 3) через 1 час после введения гемоглобина полимеризованного; 4) через 2 часа после введения гемоглобина полимеризованного; 5) через 3 часа после введения гемоглобина полимеризованного; 6) через 4 часа после введения гемоглобина полимеризованного.

В ходе исследования установлено, что животные приобретали ярко-розовую окраску кожи через 30 минут после введения гемоглобина полимеризованного. Спустя 1 час окраска кожных покровов становилась нормальной.

Результаты проведенного исследования показали, что компенсация кровопотери внутривенной инфузией гемоглобина полимеризованного из расчета 4 г в 500 мл физиологического раствора на животное приводила к изменениям в развитии гемодинамической реакции, наблюдаемой при геморрагическом шоке до его введения. Введение раствора гемоглобина полимеризованного из расчета 4 г в 500 мл физиологического раствора на животное обеспечивало улучшение таких параметров газотранспортной функции крови, как изменение количества эритроцитов (Фиг. 1), среднее содержание (Фиг. 2) и степень их насыщения гемоглобином (Фиг. 3).

Полученные результаты по двум экспериментам на крысах и свиньях свидетельствуют о том, что гемоглобин полимеризованный обеспечивает не только функцию переноса кислорода тканям, подвергающимся гипоксии при кровопотере, но и обладает свойствами оперативной мобилизации крови из депо, которые позволяют восстановить гемодинамические и гематологические показатели первые часы после геморрагического шока. Об этом говорят данные динамики гемодинамических и гематологических показателей, а также газов крови после массивной кровопотери и инфузий гемоглобина полимеризованного. Уровень эритроцитов, гемоглобина и его насыщенность кислородом нормализовался и даже был выше контроля (физиологический раствор) через два часа после введения гемоглобина полимеризованного. Показатель гематокрита, уровень которого резко снизился после кровопотери, также нормализовался и даже был выше контроля через два часа после введения гемоглобина полимеризованного. Вероятно, гемоглобин полимеризованный обеспечивает индукцию выброса из депо зрелых эритроцитов и других клеток крови. Эти данные позволяют рассматривать гемоглобин полимеризованный как перспективный индуктор и субстрат для восстановления естественных компенсаторных механизмов организма в дополнение к эффекту заместительного действия - переноса кислорода, которым обладает полимеризованный гемоглобин крупного рогатого скота.

Свойство гемоглобина полимеризованного по мобилизации собственной крови из депо при массивной кровопотере и гипоксии позволяет использовать минимальные дозы, быстро в течение нескольких часов достигается нормализация показателей крови.

Изобретение относится к области медицины, а именно к трансфузиологии, и может быть использовано для мобилизации крови из депо при острых кровопотерях. Предложено применение гемоглобина полимеризованного в виде раствора для инфузий, приготовленного из лиофилизата, где гемоглобин полимеризованный представляет собой полимеризованный глутаровым альдегидом гемоглобин, полученный из крупного рогатого скота, с молекулярной массой в диапазоне 192000-320000 Да, где лиофилизат содержит не менее 90% полимеризованного гемоглобина, в качестве средства, обладающего свойствами по мобилизации клеток крови из органов, депонирующих кровь, при острых кровопотерях. Гемоглобин полимеризованный вводят пациентам в дозе от 1 до 12,6 г в сутки. Использование изобретения позволяет восстановить гемодинамические и гематологические показатели в первые часы после геморрагического шока при низких дозах введения полимеризованного гемоглобина за счет его свойств по мобилизации клеток крови из органов, депонирующих кровь. 1 з.п. ф-лы, 8 табл., 3 ил., 2 пр.

1. Применение гемоглобина полимеризованного в виде раствора для инфузий, приготовленного из лиофилизата, где гемоглобин полимеризованный представляет собой полимеризованный глутаровым альдегидом гемоглобин, полученный из крупного рогатого скота, с молекулярной массой в диапазоне 192000-320000 Да, где лиофилизат содержит не менее 90% полимеризованного гемоглобина, в качестве средства, обладающего свойствами по мобилизации клеток крови из органов, депонирующих кровь, при острых кровопотерях.

2. Применение по п.1, отличающееся тем, что гемоглобин полимеризованный вводят пациентам в дозе от 1 до 12,6 г в сутки.