СПОСОБ ОТБОРА ШТАММОВ RH. TRIFOLII, СПОСОБНЫХ К ЭФФЕКТИВНОМУ СИМБИОЗУ НА КИСЛЫХ ПОЧВАХ С ПОВЫШЕННЫМ СОДЕРЖАНИЕМ ИОНОВ АЛЮМИНИЯ Российский патент 2003 года по МПК C12N1/20 A01C21/00 C12Q1/02 C12Q1/02 C12R1/41 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к приемам возделывания клевера лугового.

При возделывании клевера лугового на землях с повышенной кислотностью (рН менее 5,0), которые в Нечерноземной зоне занимают огромные посевные площади, отмечается низкая активность бобово-ризобиального комплекса, что приводит к почти полному прекращению симбиотической азотфиксации, обусловленной отсутствием в почве высокоэффективных устойчивых к высокому содержанию в почве ионов водорода и алюминия штаммов Rh. trifolii. Имеющиеся в коллекции НИИСХ микробиологии штаммы клубеньковых бактерий клевера лугового не вполне отвечают требованиям применения их на кислых почвах. Отсюда возникает острая необходимость в разработке ускоренных методов отбора кислотоустойчивых штаммов клубеньковых бактерий, способных к эффективному симбиозу в сильнокислой среде.

Существующий способ отбора клубеньковых бактерий на эффективность симбиоза представляет собой продолжительный, трудоемкий и дорогостоящий процесс, включающий проведение микровегетационных и вегетационных опытов по методике ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (1). В основном этим методом проводится отбор штаммов клубеньковых бактерий, предназначенных для нейтральных и слабокислых почв. Особые сложности в исследованиях по оценке симбиотической способности возникают при моделировании экспериментов, требующих экстремальных условий для выращивания растений, в частности высокой кислотности почвы, обусловленной повышенным содержанием ионов водорода и алюминия.

В литературе имеются сведения о методе выращивания бобовых культур в модельных опытах в условиях сильно кислой среды (2). Для сохранения стабильной реакции питательного раствора в данном эксперименте применяли промывные фосфатные буферные системы.

Объектом исследования служили взрослые растения клевера ползучего (6-месячные), выращенные в полевых условиях, которые затем пересаживали в сосуды с перлитом. Инокуляцию же этих растений эффективными штаммами проводили через 11-17 дней после пересадки, т.е. подготовительный период занимал около 7 месяцев. Этот метод выращивания растений имеет ряд недостатков: во-первых, он очень громоздок (включает несколько этапов) и продолжителен по времени; во-вторых, ежедневная смена питательного раствора нарушает естественный процесс адаптации растений к экстремальным условиям произрастания, препятствует нормальному инфицированию корней клубеньковыми бактериями и формированию необходимого количества клубеньков, и, кроме того, применяемая промывная буферная система требует огромного количества дорогостоящих химреактивов.

Цель изобретения - разработка способа отбора эффективных кислотоустойчивых штаммов клубеньковых бактерий для клевера лугового, выращиваемого на кислых почвах (рН<4,5).

В предлагаемом способе поставленная цель достигается тем, что в применяемые питательные среды для создания экстремальных условий (т.е. повышенной кислотности) вносили Al³⁺, на которых затем культивировали Rh. trifolii в чистой культуре (на агаровой среде) и в симбиозе с растениями клевера лугового (на водной среде).

Способ состоит из двух этапов и осуществляется следующим образом: на первом этапе проводили предварительный отбор кислотоустойчивых штаммов клубеньковых бактерий в селективной среде. В бобовый агар после его стерилизации вносили хлористый алюминий (АlСl₃) в различных концентрациях. Оценку штаммов на кислотоустойчивость осуществляли через трое суток после посева по пятибалльной шкале, где контролем служил посев клубеньковых бактерий клевера на бобовом агаре без Аl³⁺ (таблица 1).

Из таблицы 1 видно, что большее число штаммов (более 70%) способно сохранять жизнеспособность в сильно кислой среде (рН 4,5). Концентрация ионов Al³⁺ в 100 мг/л оказалась губительна для всех изучаемых штаммов клубеньковых бактерий. Результаты эксперимента показали, что отбор кислотоустойчивых штаммов Rh. trifolii целесообразно проводить на бобовой питательной среде с добавлением 75 мг/л Аl³⁺.

Второй этап заключался в поиске оптимального способа выращивания растений для определения эффективности симбиоза в экстремальных условиях, который удовлетворял бы требованиям краткосрочности (не более 35 дней) и стабильности поддержания условий отбора.

Отбор штаммов на эффективность симбиоза с клевером луговым проводили в микровегетационном опыте по методике ВНИИСХ микробиологии (1) в нашей модификации. Растения выращивали в пробирках емкостью 50 мл, наполненных вермикулитом. В питательную безазотистую среду Красильникова-Кореняко вносили ионы Аl³⁺ в форме АlСl₃ в концентрации 50 мг/л раствора, рН которого составил 4,5. Посев осуществляли проростками с одновременной инокуляцией штаммом КС-4, показавшим высокую кислотоустойчивость на первом этапе отбора, и шт. КС-9 с низким уровнем жизнеспособности в кислой среде. Опытные растения помещали в камеру искусственного климата с рекомендуемым для клевера лугового режимом выращивания. За контроль принимали растения, выращенные на нейтральной питательной среде без инокуляции. Эффективность симбиоза определяли через 30-35 дней по накоплению биомассы (таблица 2).

Результаты таблицы 2 показывают, что оценку кислотоустойчивых штаммов на способность к активному симбиозу в сильно кислой среде целесообразно проводить при выращивании растений на водной питательной среде с внесением 50 мг/л ионов Аl³⁺ в форме АlСl₃ (режим 1), так как рН такого раствора остается неизменным в течение всего опыта, и при этом отмечается существенное увеличение сухой биомассы - в 3 раза по сравнению с режимами 3 и 4 и в 1,7 раза по сравнению с контролем, т.е. при этих условиях обеспечивается проявление эффективности штаммов (по методике ВНИИСХ микробиологии штаммы, обеспечившие растениям прибавку абсолютно-сухой биомассы более 70% по сравнению с контролем, считаются эффективными).

Таким образом, предлагаемый метод позволяет провести предварительный отбор кислотоустойчивых штаммов уже в чистой культуре (на 3-4 сутки после посева), а оценка их на эффективность симбиоза в краткосрочном модельном опыте при экстремальных условиях выращивания растений (50 мг/л Аl³⁺, рН 4,5) в целом упрощает схему отбора, при этом сокращаются сроки отбора эффективных кислотоустойчивых штаммов клубеньковых бактерий, снижаются затраты на проведение экспериментов. Производственное применение таких штаммов расширяет возможность возделывания клевера лугового на кислых почвах, занимающих огромные площади, без дополнительных затрат на их известкование и внесение азотных удобрений.

Источники информации
1. Методические рекомендации по получению новых штаммов клубеньковых бактерий и оценке их эффективности. Л., 1979, с. 16-18.

2. Gary R Cline and Anthony F. Silvernail. 1997. Effects of Soil Acidity on the Growth of Sericea Lespedeza. J. Plant Nutr. 20 (12), 1657-1666.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, а именно к способу отбора штаммов Rhizobium trifolii, способных к эффективному симбиозу на кислых почвах с повышенным содержанием ионов алюминия при возделывании клевера лугового. Способ состоит из двух этапов. На первом этапе отбирают кислотоустойчивые штаммы бактерий Rhizobium trifolii, которые культивируют в течение 3 суток на селективной бобовой питательной среде, содержащей ионы Al³⁺, внесенного после стерилизации среды в форме AlCl₃ в количестве 75 мг/л (до достижения рН среды 4,5). Затем оценивают и отбирают эффективные кислотоустойчивые штаммы. На втором этапе проводят выращивание отобранных штаммов на безазотистой питательной среде Красильникова-Кореняко, содержащей ионы Al³⁺, внесенного в форме AlCl₃ в количестве 50 мг/л (до достижения рН среды 4,5), путем посева проростков клевера с одновременной инокуляцией их данными штаммами. Далее растения клевера выращивают в условиях искусственного климата с рекомендуемым режимом, а через 30-35 дней после посева (на ранних этапах онтогенеза клевера) отбирают штаммы, способные к эффективному симбиозу на кислых почвах по накоплению биомассы. Способ позволяет сократить сроки и упростить схему отбора кислотоустойчивых штаммов клубеньковых бактерий, расширить возможность возделывания клевера лугового на кислых почвах без дополнительных затрат на их известкование и внесение азотных удобрений. 2 табл.

Способ отбора штаммов азотфиксирующих бактерий, способных к эффективному симбиозу на кислых почвах с повышенным содержанием ионов алюминия, включающий оценку жизнеспособности штаммов, инокулированных на бобовые растения, выращивание их на безазотистой питательной среде с повышенной кислотностью, отличающийся тем, что культивируют штаммы бактерий Rhizobium trifolii в течение 3 суток на селективной бобовой питательной среде, содержащей ионы Al³⁺, внесенного после стерилизации среды в форме АlСl₃ в количестве 75 мг/л (до достижения рН среды 4,5), затем оценивают и отбирают эффективные кислотоустойчивые штаммы, далее проводят выращивание отобранных штаммов на безазотистой питательной среде Красильникова-Кореняко, содержащей ионы Al³⁺, внесенного в форме АlСl₃ в количестве 50 мг/л (до достижения рН среды 4,5), путем посева проростков клевера с одновременной инокуляцией их данными штаммами, после чего растения клевера выращивают в условиях искусственного климата с рекомендуемым режимом, а через 30-35 дней после посева (на ранних этапах онтогенеза клевера) отбирают штаммы, способные к эффективному симбиозу на кислых почвах по накоплению биомассы.