Способ определения 2-амино-4,6-динитрофенола в биологическом материале Российский патент 2025 года по МПК G01N33/48 G01N33/50 

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения 2-амино-4,6-динитрофенола в биологическом материале, и может быть использовано в практике химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и клинических лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения алкилдинитрофенолов в биологическом материале, который заключается в том что биологический объект обрабатывают при перемешивании трижды по 30 минут порциями ацетона. объём каждой из которых численно в два раза превышает массу биологического объекта, полученные ацетоновые излечение объединяют, испаряют до сухого остатка в токе воздуха при комнатной температуре, остаток растворяют в гексане, полученный раствор трижды экстрагируют щелочным раствором (универсальный буфер с рН 11,98, разбавленный водой в четыре раза) при соотношении объёмов органической и водной фаз 1:1, щелочные экстракты отделяют, объединяют, подкисляют 24%-ным раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, экстрагируют порциями диэтилового эфира трижды при соотношении водной и органической фаз 1,5-2:1 по объёму, эфирные извлечения объединяют, эфир испаряют, сухой остаток растворяют в ацетоне, часть этого раствора наносят на линию старта хроматографической пластины типа Силуфол UV-254, хроматографируют в системе растворителей хлороформ-гексан в соотношении 7:4 по объёму, анализируемое вещество идентифицируют по величине Rf, извлекают из сорбента диметилформамидом и определяют спектрофотометрическим методом по интенсивности светопоглощения элюата, используя уравнение калибровочного графика (А. с. 1786426 SU. G01N31/00 (2006.01); G01N30/90 (2006.01). Способ определения алкилдинитрофенолов в биологическом материале / Шорманов В.К., Нестерова А.В. (SU). – № 4884097/04; заявл. 19.11.1990; опубл. 07.01.1993, Бюл. № 1. – 11 с.).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью.

Известен способ определения 4-нитрофенолов в биологическом материале, состоящий в том, что биологическую ткань измельчают, трижды по полчаса настаивают с порциями уксусного ангидрида, масса каждой из которых численно в два раза превышает массу биоматериала, извлечения отделяют от твёрдых частиц биоматериала, объединяют, испаряют до половины объема, разбавляют водой в объемном соотношении 1:3, экстрагируют диэтиловым эфиром, насыщенным водой, экстрагент испаряют, полученный остаток растворяют в хлороформе, экстрагируют водно-щелочным раствором при pH 9,0-9,5, экстракт отделяют, подкисляют до pH 2-3, повторно экстрагируют диэтиловым эфиром, насыщенным водой, полученный экстракт отделяют, экстрагент испаряют до сухого остатка, который затем растворяют в хлороформе и подвергают хроматографическому определению методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в колонке, заполненной силикагелем "Силасорб 600" с размером частиц 5 мкм, с использованием в качестве подвижной фазы системы растворителей, состоящей из гексана и пропанола-2, взятых в объемном соотношении 20:1 (Пат. 2121681 RU. G01N 33/50 (2006.01). Способ определения 4-нитрофенолов в биологическом материале / Шорманов В.К.; заявитель и патентообладатель: Шорманов В.К. (RU). – № 94021200/14; заявл. 07.06.1994; опубл. 10.11.98, Бюл. № 31. – 7 с.).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью.

Наиболее близким является способ определения 2-амино-4,6- динитрофенола в биологическом материале, заключающийся в том, что биологический объект измельчают, двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является смесь ацетон-ацетонитрил в отношении 1:1 по объёму, при условии, что масса каждой порции изолирующего агента в 2 раза превышает массу биологического объекта, полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха комнатной температуры, остаток растворяют в ацетоне, ацетоновый раствор наносят на пластину «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А с УФ-индикатором, хроматографируют, используя двухкомпонентную подвижную фазу ацетон-хлороформ в отношении 7:3 по объёму, анализируемое вещество извлекают из хроматограммы диметилформамидом и проводят определение физико-химическим методом, которым является спектрофотометрия, по интенсивности светопоглощения элюата, измеряемой в области 489 нм. (Погосян, Н.Г. Исследование сохраняемости 2-амино-4,6-динитрофенола в биологическом материале при хранении в различных температурных режимах // Химия и химическая технология в XXI веке: материалы XXII научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Томск, 17-20 мая 2021 г.). – Томск: ФГАОУ ВО НИ ТПУ, 2021. – Т. 1. – С. 323-324.).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью определения.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения 2-амино-4,6-динитрофенола в образце тканей или органов.

Технический результат достигается тем, что биологический объект измельчают, двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является смесь ацетон-ацетонитрил в отношении 6:4 по объему, при условии, что масса каждой порции изолирующего агента в 2 раза превышает массу биологического объекта, полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха комнатной температуры, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха комнатной температуры до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей ацетон-диэтиловый эфир в отношении 6:4 по объему, хроматографируют в полупрепаративной колонке с силикагелем «Меrck» 40/63 мкм, используя двухкомпонентную подвижную фазу ацетон-диэтиловый эфир в отношении 6:4 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, анализируемое вещество, содержащееся в остатке, переводят в О-ацетильное производное, для чего остаток обрабатывают уксусном ангидридом в условиях кипячения при 139°C в течение 25 минут, после чего уксусный ангидрид удаляют в токе азота до сухого остатка, остаток растворяют в этилацетате и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, в капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил) диметилполисилоксан, при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1,0 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70^оС, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70^оС до 200^оС со скоростью 40^оС в минуту, затем с 200^оС до 290^оС со скоростью 12,5^оС в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250^оС, температура квадруполя 150^оС, температура интерфейса детектора 290^оС, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-амино-4,6-динитрофенола, исходя из площади хроматографического пика его О-ацетильного производного.

Способ осуществляется следующим образом: биологический объект, содержащий 2-амино-4,6-динитрофенол, измельчают, двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является смесь ацетон-ацетонитрил в отношении 6:4 по объему, при условии, что масса каждой порции изолирующего агента в 2 раза превышает массу биологического объекта полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединенного извлечения испаряют в токе воздуха комнатной температуры, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха комнатной температуры до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей ацетон-диэтиловый эфир в отношении 6:4 по объему, хроматографируют в полупрепаративной колонке с силикагелем «Меrck» 40/63 мкм, используя двухкомпонентную подвижную фазу ацетон-диэтиловый эфир в отношении 6:4 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, анализируемое вещество, содержащееся в остатке, переводят в О-ацетильное производное, для чего остаток обрабатывают уксусном ангидридом в условиях кипячения при 139°C в течение 25 минут, после чего уксусный ангидрид удаляют в токе азота до сухого остатка, остаток растворяют в этилацетате и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, в капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил) диметилполисилоксан, при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1,0 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70^оС, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70^оС до 200^оС со скоростью 40^оС в минуту, затем с 200^оС до 290^оС со скоростью 12,5^оС в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250^оС, температура квадруполя 150^оС, температура интерфейса детектора 290^оС, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-амино-4,6-динитрофенола, исходя из площади хроматографического пика его О-ацетильного производного.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Определение 2-амино-4,6-динитрофенола в ткани печени

К 10 г измельчённой до размеров частиц 0,2-0,5 мм ткани печени прибавляют 10 мг 2-амино-4,6-динитрофенола, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22^оС. По истечении указанного времени биологический объект двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является смесь ацетон-ацетонитрил в отношении 6:4 по объему, при условии, что масса каждой порции изолирующего агента в 2 раза превышает массу биологического объекта. При этом биологический объект заливают 20 г смеси ацетон-ацетонитрил в отношении 6:4 по объему и выдерживают 30 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют от твёрдых частиц биоматериала, операцию настаивания повторяют в указанных условиях.

Полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединённого извлечения испаряют в токе воздуха комнатной температуры, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают порциями ацетона по 15 мл каждая при энергичном перемешивании, извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха комнатной температуры до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 4 мл смеси растворителей ацетон-диэтиловый эфир в отношении 6:4 по объему. Полученный раствор вносят в хроматографическую полупрепаративную колонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля «Меrck» 40/63 мкм. Хроматографируют, элюируя двухкомпонентной подвижной фазой ацетон-диэтиловый эфир в отношении 6:4 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая.

Фракции элюата с 9 по 36 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22^оС, анализируемое вещество, содержащееся в остатке, переводят в О-ацетильное производное, для чего остаток обрабатывают 5 мл уксусного ангидрида, образующийся раствор количественно переносят в коническую колбу вместимостью 25 мл и кипятят с прямым холодильником при 139°C в течение 25 минут, после чего уксусный ангидрид удаляют из реакционного раствора в токе азота до сухого остатка, остаток растворяют в 10 мл этилацетата (раствор А). 0,5 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят этилацетатом до метки (раствор Б) и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия.

В процессе определения 4 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя хромато-масс-спектрометр Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил) метилполисилоксан, при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм.

Начальная температура термостата колонки составляет 70^оС, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70^оС до 200^оС со скоростью 40^оС в минуту, затем с 200^оС до 290^оС со скоростью 12,5^оС в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250^оС, температура квадруполя 150^оС, температура интерфейса детектора 290^оС, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-амино-4,6-динитрофенола по площади хроматографического пика его О-ацетильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,9 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-600 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 8,07 мин соответствует О-ацетильному производному 2-амино-4,6-динитрофенола. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 50, 62, 90, 119, 131, 177, 193, 223. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 223, интенсивность которой принимается за 100 %.

2-амино-4,6-динитрофенол идентифицируют по сочетанию времени удерживания соответствующего О-ацетильного производного в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

Количество 2-амино-4,6-динитрофенола вычисляют, исходя из площади хроматографического пика, соответствующего его О-ацетильному производному и полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, а затем пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесённую в биологический материал.

Построение градуировочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,8, 1,6, 2,4, 5,0 мл 0,125% раствора и 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 6,0, 8,0 и 10,0 мл 1,25% раствора 2-амино-4,6-динитрофенола в этилацетате и доводят объём содержимого каждой колбы до метки этилацетатом. 0,1 мл каждого из растворов вносят в выпарительную чашку и испаряют в токе воздуха при комнатной температуре до сухого остатка.

Остаток обрабатывают 5 мл уксусного ангидрида, образующийся раствор количественно переносят в коническую колбу вместимостью 25 мл и кипятят с прямым холодильником при 139°C в течение 25 минут, после чего уксусный ангидрид удаляют из реакционного раствора в токе азота до сухого остатка, остаток растворяют в 10 мл этилацетата.

4 мкл каждого из полученных растворов вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя хромато-масс-спектрометр Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил) метилполисилоксан, при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм.

Начальная температура термостата колонки составляет 70^оС, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70^оС до 200^оС со скоростью 40^оС в минуту, затем с 200^оС до 290^оС со скоростью 12,5^оС в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250^оС, температура квадруполя 150^оС, температура интерфейса детектора 290^оС, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-амино-4,6-динитрофенола по площади хроматографического пика его О-ацетильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,9 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-400 m/z.

По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 8,0⋅10^-10 – 1,0⋅10^-7 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение градуировочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S = 1113552⋅C - 25939,

где S – площадь хроматографического пика; C – концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.

Результаты количественного определения 2-амино-4,6-динитрофенола в ткани печени представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение 2-амино-4,6-динитрофенола в ткани лёгких

К 10 г измельчённой до размеров частиц 0,2-0,5 мм ткани лёгких прибавляют 10 мг 2-амино-4,6-динитрофенола, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22^оС. По истечении указанного времени биологический объект двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является смесь ацетон-ацетонитрил в отношении 6:4 по объему, при условии, что масса каждой порции изолирующего агента в 2 раза превышает массу биологического объекта. При этом биологический объект заливают 20 г смеси ацетон-ацетонитрил в отношении 6:4 по объему и выдерживают 30 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют от твёрдых частиц биоматериала, операцию настаивания повторяют в указанных условиях.

Полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединённого извлечения испаряют в токе воздуха комнатной температуры, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают порциями ацетона по 15 мл каждая при энергичном перемешивании, извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха комнатной температуры до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 4 мл смеси растворителей ацетон-диэтиловый эфир в отношении 6:4 по объему. Полученный раствор вносят в хроматографическую полупрепаративную колонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля «Меrck» 40/63 мкм. Хроматографируют, элюируя двухкомпонентной подвижной фазой ацетон-диэтиловый эфир в отношении 6:4 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая.

Фракции элюата с 9 по 36 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22^оС, анализируемое вещество, содержащееся в остатке, переводят в О-ацетильное производное, для чего остаток обрабатывают 5 мл уксусного ангидрида, образующийся раствор количественно переносят в коническую колбу вместимостью 25 мл и кипятят с прямым холодильником при 139°C в течение 25 минут, после чего уксусный ангидрид удаляют из реакционного раствора в токе азота до сухого остатка, остаток растворяют в 10 мл этилацетата (раствор А). 0,5 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят этилацетатом до метки (раствор Б) и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия.

В процессе определения 4 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя хромато-масс-спектрометр Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил) метилполисилоксан, при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм.

Начальная температура термостата колонки составляет 70^оС, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70^оС до 200^оС со скоростью 40^оС в минуту, затем с 200^оС до 290^оС со скоростью 12,5^оС в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250^оС, температура квадруполя 150^оС, температура интерфейса детектора 290^оС, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-амино-4,6-динитрофенола по площади хроматографического пика его О-ацетильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,9 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-600 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 8,07 мин соответствует О-ацетильному производному 2-амино-4,6-динитрофенола. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 50, 62, 90, 119, 131, 177, 193, 223. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 223, интенсивность которой принимается за 100 %.

2-амино-4,6-динитрофенол идентифицируют по сочетанию времени удерживания соответствующего О-ацетильного производного в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

Количество 2-амино-4,6-динитрофенола вычисляют, исходя из площади хроматографического пика, соответствующего его О-ацетильному производному и полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, а затем пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесённую в биологический материал.

Построение градуировочного графика и его уравнение приводятся выше в примере 1.

Результаты количественного определения 2-амино-4,6-динитрофенола в ткани лёгких представлены в таблице 2.

Пример 3

Определение 2-амино-4,6-динитрофенола в ткани почек

К 10 г измельчённой до размеров частиц 0,2-0,5 мм ткани почек прибавляют 10 мг 2-амино-4,6-динитрофенола, тщательно перемешивают биологический объект с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22^оС. По истечении указанного времени биологический объект двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента, которым является смесь ацетон-ацетонитрил в отношении 6:4 по объему, при условии, что масса каждой порции изолирующего агента в 2 раза превышает массу биологического объекта. При этом биологический объект заливают 20 г смеси ацетон-ацетонитрил в отношении 6:4 по объему и выдерживают 30 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют от твёрдых частиц биоматериала, операцию настаивания повторяют в указанных условиях.

Полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединённого извлечения испаряют в токе воздуха комнатной температуры, остаток неоднократно (трижды по 3 минуты) обрабатывают порциями ацетона по 15 мл каждая при энергичном перемешивании, извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха комнатной температуры до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 4 мл смеси растворителей ацетон-диэтиловый эфир в отношении 6:4 по объему. Полученный раствор вносят в хроматографическую полупрепаративную колонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля «Меrck» 40/63 мкм. Хроматографируют, элюируя двухкомпонентной подвижной фазой ацетон-диэтиловый эфир в отношении 6:4 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая.

Фракции элюата с 9 по 36 включительно, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22^оС, анализируемое вещество, содержащееся в остатке, переводят в О-ацетильное производное, для чего остаток обрабатывают 5 мл уксусного ангидрида, образующийся раствор количественно переносят в коническую колбу вместимостью 25 мл и кипятят с прямым холодильником при 139°C в течение 25 минут, после чего уксусный ангидрид удаляют из реакционного раствора в токе азота до сухого остатка, остаток растворяют в 10 мл этилацетата (раствор А). 0,5 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, доводят этилацетатом до метки (раствор Б) и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия.

В процессе определения 4 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя хромато-масс-спектрометр Shimadzu GCMS-QP2010 Ultra.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-фенил) метилполисилоксан, при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм.

Начальная температура термостата колонки составляет 70^оС, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70^оС до 200^оС со скоростью 40^оС в минуту, затем с 200^оС до 290^оС со скоростью 12,5^оС в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250^оС, температура квадруполя 150^оС, температура интерфейса детектора 290^оС, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-амино-4,6-динитрофенола по площади хроматографического пика его О-ацетильного производного.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Режим с делением потока 1:2. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 2,9 минуты. Диапазон сканирования составляет 40-600 m/z.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 8,07 мин соответствует О-ацетильному производному 2-амино-4,6-динитрофенола. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 50, 62, 90, 119, 131, 177, 193, 223. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 223, интенсивность которой принимается за 100 %.

2-амино-4,6-динитрофенол идентифицируют по сочетанию времени удерживания соответствующего О-ацетильного производного в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

Количество 2-амино-4,6-динитрофенола вычисляют, исходя из площади хроматографического пика, соответствующего его О-ацетильному производному и полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, а затем пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесённую в биологический материал.

Построение градуировочного графика и его уравнение приводятся выше в примере 1.

Результаты количественного определения 2-амино-4,6-динитрофенола в ткани почек представлены в таблице 3.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 3 раза повышает чувствительность определения в биологическом материале и в 667 раз в хроматографируемой пробе. Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 4.

Таблица 4

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов

(на примере исследования ткани печени)

Показатели Предлагаемый способ Известный способ Чувствительность (открываемый минимум)
а) в 100 г биоматериала
б) в детектируемой пробе 1,2⋅10^-5 г
6,0⋅10^-10 г 3,6⋅10^-5 г
4,0⋅10^-7 г Интервал линейности градуировочного графика (г в детектируемой пробе) 8,0⋅10^-10 – 1,0⋅10^-7 г 1,0⋅10^-6 – 1,8⋅10^-5 г

Изобретение относится к области биохимии. Описан способ определения 2-амино-4,6-динитрофенола в образце органа или ткани, заключающийся в том, что образец измельчают, двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента при условии, что масса каждой порции изолирующего агента в 2 раза превышает массу образца. Полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединённого извлечения испаряют в токе воздуха комнатной температуры, остаток растворяют, хроматографируют, используя двухкомпонентную подвижную фазу, и проводят определение физико-химическим методом. Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения 2-амино-4,6-динитрофенола в образце тканей или органов. 4 табл., 3 пр.

Способ определения 2-амино-4,6-динитрофенола в образце органа или ткани, заключающийся в том, что образец измельчают, двукратно по 30 минут обрабатывают порциями органического изолирующего агента при условии, что масса каждой порции изолирующего агента в 2 раза превышает массу образца, полученные органические извлечения объединяют, растворитель из объединённого излечения испаряют в токе воздуха комнатной температуры, остаток растворяют, хроматографируют, используя двухкомпонентную подвижную фазу, и проводят определение физико-химическим методом, отличающийся тем, что в качестве органического изолирующего агента используется смесь ацетон-ацетонитрил в отношении 6:4 по объему, после испарения растворителя из объединённого извлечения остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, упаривают в токе воздуха комнатной температуры до полного удаления растворителя, перед хроматографированием остаток растворяют в смеси растворителей ацетон-диэтиловый эфир в отношении 6:4 по объему, хроматографируют в полупрепаративной колонке с силикагелем 40/63 мкм, используя двухкомпонентную подвижную фазу ацетон-диэтиловый эфир в отношении 6:4 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют, анализируемое вещество, содержащееся в остатке, переводят в О-ацетильное производное, для чего остаток обрабатывают уксусным ангидридом в условиях кипячения при 139°C в течение 25 минут, после чего уксусный ангидрид удаляют в токе азота до сухого остатка, остаток растворяют в этилацетате и проводят определение физико-химическим методом, которым является хромато-масс-спектрометрия, в капиллярной колонке HP-5MS длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, представляющей собой (5%-ный фенил) диметилполисилоксан, при толщине плёнки неподвижной фазы 0,25 мкм, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1,0 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 70°С, данная температура выдерживается в течение 2 минут, в дальнейшем температура повышается от 70°С до 200°С со скоростью 40°С в минуту, затем с 200°С до 290°С со скоростью 12,5°С в минуту, конечная температура колонки выдерживается в течение 2 минут, температура инжектора составляет 250°С, температура квадруполя 150°С, температура интерфейса детектора 290°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-амино-4,6-динитрофенола исходя из площади хроматографического пика его О-ацетильного производного.