СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАДИОХИМИЧЕСКОГО СОЕДИНЕНИЯ НА ОСНОВЕ МЕЧЕННЫХ ИОДОМ-123 РЕКОМБИНАНТНЫХ АДРЕСНЫХ МОЛЕКУЛ БЕЛКОВОЙ ПРИРОДЫ С АНКИРИНОВЫМИ ПОВТОРАМИ ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ РАКА С ГИПЕРЭКСПРЕССИЕЙ HER2/NEU Российский патент 2024 года по МПК A61K51/08 A61K101/02 C07B59/00 

Изобретение относится к ядерной медицине, онкологии, фармацевтической химии и фармакологии, в частности к радиофармацевтическим лекарственным препаратам на основе рекомбинантных молекул белковой природы с анкириновыми повторами (DARPin) для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu.

Известен способ получения радиохимического соединения на основе рекомбинантных адресных молекул белковой природы с анкириновыми повторами DARPin(HE)₃-Eс1, меченных иодом-123, для радионуклидной диагностики онкологических заболеваний [Боденко В. В. Разработка метода введения метки иода-123 в молекулу DARPin(HE)3 -Eс1 прямым способом / В. В. Боденко; науч. рук. М. В. Белоусов // Химия и химическая технология в XXI веке: материалы XXII Международной научно-практической конференции студентов и молодых ученых имени выдающихся химиков Л. П. Кулёва и Н. М. Кижнера, посвященной 125-летию со дня основания Томского политехнического университета, Томск, 17-20 мая 2021 г.: в 2 т. - Томск: Изд-во ТПУ, 2021. - Т. 1. - С. 344-345], который заключается в следующем: к 100 мкг DARPin(HE)₃-Eс1 добавляют 200 мкл раствора иода-123 с активностью 100 МБк, предварительно нейтрализованным 20 мкл 0,1 M HCl. Затем добавляют 50 мкл раствора хлорамина-Т концентрацией 2 мг/мл в фосфатно-солевом буфере (PBS). Инкубируют при комнатной температуре в течение 120 с. Далее добавляют 50 мкл раствора метабисульфита натрия концентрацией 4 мг/мл в PBS и проводят очистку, используя колонки NAP-5. Радиохимический выход составил более 79% при радиохимической чистоте около 100%.

Недостатком этого способа является использование рекомбинантных адресных молекул белковой природы с анкириновыми повторами для радиоиодирования, имеющих низкое сродство к рецептору HER2/neu.

Известен способ получения радиохимического соединения на основе рекомбинантных адресных молекул белковой природы с анкириновыми повторами DARPins G3, меченных иодом-123, для визуализации экспрессии HER2/neu при раке [Development of the designed ankyrin repeat protein (DARPin)G3 for HER2 molecular imaging / Robert Goldstein, Jane Sosabowski, Maria Livanos, Julius Leyton, Kim Vigor, Gaurav Bhavsar, Gabriela Nagy-Davidescu, Mohammed Rashid, Enrique Miranda, Jenny Yeung, Berend Tolner, Andreas Pluckthun, Stephen Mather, Tim Meyer, Kerry Chester // Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging (2015) 42:288-301], в котором для иодирования используют коммерчески готовый реагент «Pierce™ iodination tubes» (Thermo Scientific, Runcorn, UK). В стеклянную пробирку с реактивом Pierce™ добавляют DARPins G3 5-60 мкг в PBS и инкубируют 10 мин при комнатной температуре с 10 МБк ¹²⁵I или 15-20 МБк¹²³I. Реакцию иодирования останавливают добавлением раствора натрия метабисульфита до финальной концентрации 1 мкM. Радиоиодированные DARPins очищают с помощью NAP-5 колонок. Радиохимический выход до очистки составлял 60-70%, после очистки - более 95%.

Недостатками этого способа являются использование коммерчески малодоступного реагента для иодирования, длительный по времени процесс окисления, что может приводить к нежелательному окислению адресных белков, снижению их аффинности, невысокие выходы.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание способа получения радиохимического соединения на основе меченных иодом-123 рекомбинантных адресных молекул белковой природы с анкириновыми повторами для визуализации рака с гиперэкспрессией HER2/neu.

Способ получения радиохимического соединения на основе меченных иодом-123 рекомбинантных адресных молекул белковой природы с анкириновыми повторами для визуализации рака с гиперэкспрессией HER2/neu, также как в прототипе, включает использование белка DARPin G3 и инкубирование при комнатной температуре.

Согласно изобретению во флакон, содержащий 500-4000 мкг белка DARPin G3, добавляют 2-20 мкг натрия иодида, раствор ¹²³I с активностью 280-1200 МБк, раствором 0,1 М хлористоводородной кислоты доводят рН до 5,5-7,5, инкубируют 3-7 минут. Затем добавляют 40-120 мкг хлорамина-Т, перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 60-240 с. Далее добавляют 80-240 мкг натрия метабисульфита и очищают, используя гель-фильтрационную колонку с сефадексом G25. К очищенному раствору добавляют стерильный 0,9 % раствор натрия хлорида и фильтруют через стерилизующий фильтр.

Эффективность предложенного способа достигается за счет прямого радиоиодирования остатков аминокислоты тирозина в структуре белка DARPin G3 в присутствии натрия иодида, что обеспечивает радиохимический выход получения ¹²³I-DARPin G3 свыше 95 %. Достигаемый высокий выход снижает потери белка и активности.

На фиг. 1 представлена радиотонкослойная хроматограмма, демонстрирующая радиохимический выход ¹²³I-DARPin G3 свыше 95% до очистки; пик зеленого цвета - ¹²³I-DARPin G3, пик красного цвета - ¹²³I в ионной форме.

На фиг. 2 представлена радиотонкослойная хроматограмма, демонстрирующая радиохимическую чистоту ¹²³I-DARPin G3 100% после очистки; пик зеленого цвета - ¹²³I-DARPin G3, пик ¹²³I в ионной форме отсутствует.

На фиг. 3 представлены результаты определения специфичности связывания ¹²³I-DARPin G3 in vitro. Концентрация была 2 нМ. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n=3).

На фиг. 4 показаны результаты определения аффинности и константы диссоциации (K_D) ¹²³I-DARPin G3 с помощью HER2+ клеток SKOV-3 in vitro.

На фиг. 5 показано накопление ¹²³I-DARPin G3 в опухолях SKOV-3 (HER2+) и Ramos (HER2-) у мышей Nu/j, 4 часа после инъекции, 3 мкг белка/на мышь. Данные представлены как среднее значение %введенная доза/г ± стандартное отклонение для четырех мышей.

В таблице 1 представлены условия и результаты получения радиохимического соединения на основе на основе меченных иодом-123 рекомбинантных адресных молекул белковой природы с анкириновыми повторами DARPins G3.

Для осуществления способа использовали белок DARPin G3, содержащий аминокислотную последовательность гистидил-глутамат (HE)₃ на N-конце белка, полученный известным способом в несколько стадий с использованием Escherichia coli и последующей очисткой [Vorobyeva A. Comparison of tumor-targeting properties of directly and indirectly radioiodinated designed ankyrin repeat protein (DARPin) G3 variants for molecular imaging of HER2 // International journal of oncology. - 2019. - Vol. 54, №. 4. - P. 1209-1220].

Во флакон, содержащий 3400 мкг белка DARPin G3, добавили 16 мкг натрия иодида в водном растворе 2 мг/мл, раствор ¹²³I с активностью 600 МБк. Затем раствором 0,1 М хлористоводородной кислоты довели рН до 6,5 и инкубировали 5 минут. Затем добавили 100 мкг раствора хлорамина-Т концентрацией 2 мг/мл в PBS, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 120 с. Далее добавили 200 мкг раствора натрия метабисульфита концентрацией 4 мг/мл в PBS и очистили с помощью гель-фильтрационной колонки с сефадексом G25. Далее к очищенному раствору ¹²³I-DARPin G3 добавили стерильный 0,9 % раствор натрия хлорида до общего объема 10 мл. После перемешивания полученный раствор пропустили через стерилизующий фильтр с помощью шприца в стерильный флакон.

Эффективность способа получения ¹²³I-DARPin G3 оценивали по величине радиохимического выхода, который определяли методом тонкослойной радиохроматографии с использованием полоски из стекловолокна со слоем силикагеля iTLC (Aglient Technologies, Inc. Folsom, США) и системы ацетон-вода 4:1 в качестве подвижной фазы. Распределение радиоактивности по полоске iTLC измеряли с помощью сканера miniGITA Single (Elysia Raytest, Германия).

На линию старта полоски iTLC-бумаги (Agilent, США) наносили 2 мкл полученного соединения. Полоску с нанесенной пробой сушили на воздухе, помещали в камеру с подвижной фазой ацетон-вода 4:1 и хроматографировали восходящим методом. Когда фронт подвижной фазы прошел около 90 % длины полоски бумаги от линии старта, ее вынимали из камеры, сушили на воздухе и распределение активности ¹²³I на радиохроматограмме регистрировали радиометрическим методом.

¹²³I-DARPin G3 остался на линии старта (R_f = 0,0-0,4), а примеси, свободные ¹²³I-ионы и другие формы окисления йода продвинулись с фронтом растворителя (R_f = 0,8-1,0).

Радиохимический выход (РХВ) полученного ¹²³I-DARPin G3 составил 98,0 % (фиг. 1, 2).

Другие примеры получения ¹²³I-DARPin G3 представлены в таблице 1. Из приведённых в таблице экспериментальных данных следует, что во всех приведённых примерах достигается заявленный технический результат.

Эффективность способа получения ¹²³I-DARPin G3 для радионуклидной диагностики рака с гиперэкспрессией HER2/neu подтверждается исследованиями in vitro и in vivo с использованием клеточных культур с экспрессией HER2/neu.

Оценку специфичности связывания ¹²³I-DARPin G3 с рецептором HER2/neu, проводили на линиях опухолевых клеток человека с разным уровнем экспрессии HER2/neu: SK-BR-3 (клетки рака молочной железы), SKOV-3 (клетки рака яичника человека), PC-3 (клетки рака предстательной железы) по методике, описанной [ Orlova, A. Slow internalization of anti-HER2 synthetic affibody monomer ¹¹¹In-DOTA-ZHER2:342-pep2: implications for development of labeled tracers. Cancer biotherapy & radiopharmaceuticals 2008, 23, (4), 435-42. http://DOI:10.1089/cbr.2008.0464]. Эксперимент проводили с блокированием рецепторов немеченым белком DARPin G3. Изучение специфичности ¹²³I-DARPin G3 показало, что связывание происходит на высоком уровне и пропорционально уровню экспрессии HER2/neu в клетках, при этом при блокировании рецепторов избытком немеченого белка наблюдается статистически значимое уменьшение связывания в клетках (фиг. 3).

Определение аффинности связывания с рецепторами HER2/neu ¹²³I-DARPin G3 осуществляли методом насыщения [Velikyan I., Sundberg A.L., Lindhe O., Höglund A.U., Eriksson O., Werner E., Carlsson J., Tolmachev V. Preparation and evaluation of (68)Ga-DOTA-hEGF for visualization of EGFR expression in malignant tumors. J Nucl Med. 2005 Nov;46(11):1881-8. PMID: 16269603] в интервале от 0,2 до 40 нМ. Установлено, что ¹²³I-DARPin, полученный по заявляемому способу, связывается с рецепторами HER2/neu на поверхности клеток SKOV-3 с константой диссоциации в наномолярном значении 3,2±0,5 нмоль (фиг. 4).

Для подтверждения таргетных свойств ¹²³I-DARPin G3 in vivo использовали иммунодефицитных мышей Nu/j, с привитыми человеческими опухолями SKOV-3 с высокой экспрессией HER2/neu Ramos с ¹²³I-DARPin G3 отрицательной экспрессией HER2/neu. Самкам мышей подкожно вводили 10 млн клеток SKOV-3 или Ramos в 100 мкл культуральной среды.

Результаты исследования ¹²³I-DARPin G3 in vivo в ксенографтах SKOV-3 и Ramos показаны на фиг. 5. Поглощение в опухолях SKOV-3 было значимо выше, чем в опухолях Ramos, p <0,005. Это подтверждает, что ¹²³I-DARPin G3 функционально пригоден для диагностики опухолей с экспрессией HER2/neu.

Таким образом, предложенный способ получения радиохимического соединения на основе меченных иодом-123 рекомбинантных адресных молекул белковой природы с анкириновыми повторами позволяет расшить арсенал технических средств получения радиохимических соединений на основе адресных молекул белковой природы с анкириновыми повторами для визуализации рака с гиперэкспрессией HER2/neu, поскольку специфически и с высокой аффинностью связывается с опухолевыми клетками с экспрессией HER2/neu (константа диссоциации 3,2±0,5 нмоль) и может отличать опухоли с экспрессией целевых рецепторов от опухолей без экспрессии. Предложенный способ получения ¹²³I-DARPin G3 проводится в течение короткого промежутка времени, обеспечивает высокий выход - свыше 95%.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАДИОХИМИЧЕСКОГО СОЕДИНЕНИЯ НА ОСНОВЕ МЕЧЕННЫХ ИОДОМ-123 РЕКОМБИНАНТНЫХ АДРЕСНЫХ МОЛЕКУЛ БЕЛКОВОЙ ПРИРОДЫ С АНКИРИНОВЫМИ ПОВТОРАМИ ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ РАКА С ГИПЕРЭКСПРЕССИЕЙ HER2/NEU
Таблица 1 № Количество белка
DARPin G3,
мкг Содержание
натрия иодида,
мкг Активность ¹²³I,
МБк Время,
в течение которого
ведут
инкубирование,
t, мин рН,
при
котором
ведут
инкубиро-
вание Содержание
хлора-
мина Т,
мкг Время,
в течение
которого
ведут
инкубиро-
вание
с хлорами-ном-Т,
с Содержание
натрия метаби-сульфита,
мкг Радиохимический
выход,
% 1 500 2 600 5 6,5 100 120 200 96,0 2 3400 16 600 5 6,5 100 120 200 98,0 3 4000 19 600 5 6,5 100 120 200 98,7 4 3400 2 600 5 6,5 100 120 200 95,1 5 3400 20 600 5 6,5 100 120 200 98,4 6 3400 16 280 5 6,5 100 120 200 98,2 7 3400 16 1200 5 6,5 100 120 200 98,9 8 3400 16 600 3 6,5 100 120 200 98,0 9 3400 16 600 7 6,5 100 120 200 98,9 10 3400 16 600 5 6,5 100 120 200 98,2 11 3400 16 600 5 5,5 100 120 200 97,8 12 3400 16 600 5 7,5 100 120 200 96,4 13 3400 16 600 5 7,5 100 240 200 95,4 14 3400 16 600 5 6,5 40 60 80 95,5 15 3400 16 600 5 6,5 120 60 240 97,5

Изобретение относится к ядерной медицине, онкологии, фармацевтической химии и фармакологии, в частности к способу получения радиохимического соединения на основе меченных иодом-123 рекомбинантных молекул белковой природы с анкириновыми повторами (DARPin) для радионуклидной диагностики злокачественных образований с гиперэкспрессией HER2/neu. Согласно способу во флакон, содержащий 500-4000 мкг белка DARPin G3, добавляют 2-20 мкг натрия иодида, раствор ¹²³I с активностью 280-1200 МБк, затем раствором 0,1 М хлористоводородной кислоты доводят рН до 5,5-7,5 и инкубируют 3-7 минут. После этого добавляют 40-120 мкг хлорамина-Т, перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 60-240 с. Далее добавляют 80-240 мкг натрия метабисульфита и очищают, используя гель-фильтрационную колонку с сефадексом G25. К очищенному раствору добавляют стерильный 0,9% раствор натрия хлорида и фильтруют через стерилизующий фильтр. Технический результат: обеспечивается радиохимический выход более 95%. 5 ил., 1 табл.

Способ получения радиохимического соединения на основе меченных иодом-123 рекомбинантных адресных молекул белковой природы с анкириновыми повторами для визуализации рака с гиперэкспрессией HER2/neu, включающий использование белка DARPin G3, инкубирование при комнатной температуре, отличающийся тем, что во флакон, содержащий 500-4000 мкг белка DARPin G3, добавляют 2-20 мкг натрия иодида, раствор ¹²³I с активностью 280-1200 МБк и раствором 0,1 М хлористоводородной кислоты доводят рН до 5,5-7,5, инкубируют 3-7 минут, затем добавляют 40-120 мкг хлорамина-Т, перемешивают и инкубируют в течение 60-240 с, далее добавляют 80-240 мкг натрия метабисульфита и очищают, используя гель-фильтрационную колонку с сефадексом G25, затем к очищенному раствору добавляют стерильный 0,9% раствор натрия хлорида и фильтруют через стерилизующий фильтр.