МОЛЕКУЛЫ РНК, ВКЛЮЧАЮЩИЕ НЕКАНОНИЧЕСКИЕ ПАРЫ ОСНОВАНИЙ Российский патент 2024 года по МПК C12N15/113 C12N15/82 A01N63/60 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к новым структурам двухцепочечной РНК (дцРНК) и их применению в сайленсинге генов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

РНК-сайленсинг - эволюционно консервативный механизм сайленсинга генов у эукариот, запускаемый двухцепочечной РНК (дцРНК), которая может находиться в форме, называемой шпилечной РНК (шРНК). В основном пути РНК-сайленсинга дцРНК процессируется белками Dicer с образованием коротких дуплексов малой РНК размером 20-25 нуклеотидов (нт), одна цепь которых связывается с белками Argonaute (AGO) с формированием РНК-индуцируемого комплекса сайленсинга (RISC). В этом комплексе сайленсинга малая РНК используется в качестве гида для поиска и связывания комплементарной одноцепочечной РНК, после чего белок AGO расщепляет РНК, что приводит к ее деградации.

У растений существует множество путей сайленсинга РНК, включающих пути микроРНК (мкРНК), транс-действующей малой интерферирующей РНК (tasiРНК), ассоциированной с повторами миРНК (rasiРНК) и экзогенной (вирусной и трансгенной) миРНК (экзомиРНК). мкРНК представляют собой малые РНК размером 20-24 нуклеотидов, процессируемые в ядре Dicer-подобным белком 1 (DCL1) из коротких РНК-предшественников со структурой стебель-петля, которые транскрибируются РНК-полимеразой II с генов MIR. tasiРНК представляют собой фрагменты миРНК размером преимущественно 21 нт, получаемые в результате DCL4 процессинга длинной дцРНК, синтезируемой РНК-зависимой РНК-полимеразой 6 (RDR6) из мкРНК-расщепленного фрагмента РНК генов TAS. 24-нуклеотидные rasiРНК процессируются DCL3, а дцРНК предшественник синтезируется при комбинированном действии растительной ДНК-зависимой РНК-полимеразы IV (PolIV) и RDR2 из повторяющейся ДНК в геноме. Путь экзомиРНК перекрывается с путями tasiРНК и rasiРНК, причем в процессинге экзомиРНК участвует и DCL4, и DCL3. В дополнение к DCL1, DCL3 и DCL4 модельное растение Arabidopsis thaliana и другие высшие растения кодируют DCL2 или его эквивалент, которые создают миРНК длиной 22 нуклеотида, в том числе экзозиРНК длиной 22 нуклеотида, и играют важную роль в системном и транзитивном подавлении генов у растений. Все эти малые РНК у растений подвергаются метилированию по 2'-гидроксильной группе 3'-концевого нуклеотида посредством HUA Enhancer 1 (HEN1), при этом считается, что такое 3'-концевое 2'-O-метилирование стабилизирует малые РНК в растительных клетках. мкРНК, tasiРНК и экзомиРНК функционально подобны малым РНК в клетках животных, которые участвуют в посттранскрипционном сайленсинге генов или в сиквенс-специфической деградации РНК у животных. Однако rasiРНК являются уникальными для растений и функционируют, направляя de novo метилирование цитозина в когнатной ДНК, механизм транскрипционного сайленсинга гена, известный как РНК-направленное метилирование ДНК (RdDM).

РНК-сайленсинг, индуцированный дцРНК, широко используется для снижения активности генов в различных эукариотических системах, и был разработан ряд технологий сайленсинга генов. Разные организмы часто поддаются различным подходам к сайленсингу генов. Например, длинная дцРНК (длиной не менее 100 пар оснований) в меньшей степени подходит для индукции РНК-сайленсинга в клетках млекопитающих из-за дцРНК-индуцированных ответов интерферона, поэтому в клетках млекопитающих обычно используют более короткие дцРНК (менее 30 пар оснований), тогда как в растениях шпилечная РНК (шРНК) с длинным дцРНК стеблем очень эффективна. У растений разные пути РНК-сайленсинга привели к созданию различных технологий сайленсинга генов, таких как технологии на основе искусственной мкРНК, искусственной tasiРНК и вирус-индуцированного сайленсинга генов. Однако до сих пор успешное применение сайленсинга РНК в растениях достигалось в первую очередь за счет использования длинных шРНК трансгенов. Конструкция шРНК трансгена обычно состоит из инвертированного повтора, состоящего из полностью комплементарных смысловых и антисмысловых последовательностей последовательности гена-мишени (которые при транскрипции образуют дцРНК стебель шРНК), разделенных спейсерной последовательностью (формирующей петлю шРНК), которые встраивают между промотором и терминатором транскрипции для экспрессии в растительных клетках. Спейсерная последовательность нужна для стабилизации ДНК с инвертированными повторами в бактериях в процессе получения конструкции. Стебель дцРНК получаемого шРНК транскрипта процессируется белками DCL с образованием миРНК, которые вызывают сайленсинг гена-мишени. Трансгены шРНК широко применяются для нокдауна экспрессии генов, модификации метаболических путей и повышения устойчивости растений к болезням и вредителям для улучшения сельскохозяйственных культур, причем в настоящее время имеются сообщения о многочисленных успешных применениях этой технологии для улучшения сельскохозяйственных культур (Guo et al., 2016; Kim et al., 2019).

Впрочем, недавние исследования указывают, что шРНК трансгены подвергаются самоиндуцированной репрессии транскрипции, что нарушает стабильность и эффективность сайленсинга генов-мишеней. Хотя все трансгены потенциально подвержены транскрипционному молчанию, зависимому от положения или числа копий, шРНК трансгены уникальны, поскольку они формируют миРНК, которые могут направлять метилирование ДНК в своей собственной последовательности по пути RdDM, и это может вызывать транскрипционный аутосайленсинг.

Несмотря на то, что индуцированный дцРНК сайленсинг генов оказался ценным инструментом для изменения фенотипа организма, существует потребность в альтернативных, предпочтительно улучшенных, молекулах дцРНК, которые можно применять для РНКи.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы изобретения разработали новые генетические конструкции для получения молекул РНК, которые включают одну или больше областей двухцепочечной РНК, которые включают несколько неканонически спаренных нуклеотидов и/или неспаренных нуклеотидов, включая формы, которые содержат две или больше петлевых последовательностей, называемых в настоящем документе дцРНК с концевой петлей (кпРНК). Эти молекулы РНК обладают одной или более следующими особенностями: их легко синтезировать, они накапливаются в клетках в более высоких уровнях при транскрипции генетических конструкций, кодирующих их, они легче образуют структуру дцРНК и вызывают эффективный сайленсинг РНК молекул-мишеней в эукариотических клетках, и они могут образовывать кольцевые молекулы РНК при процессинге в клетках растений. Молекулы РНК также эффективны при нанесении на поверхность растения или при поедании животными, например насекомыми.

В первом аспекте настоящего изобретения предложена химерная молекула рибонуклеиновой кислоты (РНК), включающая область двухцепочечной РНК (дцРНК), включающую первую смысловую рибонуклеотидную последовательность длиной по меньшей мере 20 последовательных нуклеотидов и первую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность длиной по меньшей мере 20 последовательных нуклеотидов, причем первая смысловая рибонуклеотидная последовательность и первые антисмысловые рибонуклеотидные последовательности способны к гибридизации друг с другом с формированием области дцРНК, где:

i) первая смысловая рибонуклеотидная последовательность состоит из ковалентно связанных, в порядке 5'→3', первого 5' рибонуклеотида, первой последовательности РНК и первого 3' рибонуклеотида,

ii) первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность состоит из ковалентно связанных, в порядке от 5' к 3', второго 5'-рибонуклеотида, второй последовательности РНК и второго 3'-рибонуклеотида,

iii) первый 5'-рибонуклеотид спаривается со вторым 3'-рибонуклеотидом с образованием концевой пары оснований области дцРНК,

iv) второй 5'-рибонуклеотид спаривается с первым 3'-рибонуклеотидом с образованием концевой пары оснований области дцРНК,

v) от приблизительно 5% до приблизительно 40% рибонуклеотидов первой смысловой рибонуклеотидной последовательности и первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности, в общей сложности, либо спарены с образованием неканонических пар оснований, либо не спарены,

vi) область дцРНК не содержит 20 последовательных канонических пар оснований,

vii) молекула РНК способна к процессингу в эукариотической клетке или in vitro, причем первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность расщепляется с получением коротких молекул антисмысловой РНК (асРНК) длиной 20-24 рибонуклеотидов,

viii) молекула РНК или по меньшей мере некоторые молекулы асРНК, или и те, и другие, способны к снижению экспрессии или активности молекулы РНК-мишени в эукариотической клетке, и

ix) молекула РНК может быть получена ферментативно при транскрипции in vitro и/или в клетке.

В предпочтительном варианте осуществления первого аспекта первая смысловая рибонуклеотидная последовательность ковалентно связана с первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательностью посредством первой соединительной рибонуклеотидной последовательности, включающей последовательность петли длиной по меньшей мере 4 нуклеотида или от 4 до 1000 рибонуклеотидов, или от 4 до 200 рибонуклеотидов, или от 4 до 50 рибонуклеотидов, или по меньшей мере 10 нуклеотидов, или от 10 до 1000 рибонуклеотидов, или от 10 до 200 рибонуклеотидами, или от 10 до 50 рибонуклеотидов, причем первая соединительная рибонуклеотидная последовательность ковалентно связана либо с первым 3' рибонуклеотидом и вторым 5' рибонуклеотидом, либо со вторым 3' рибонуклеотидом и первым 5' рибонуклеотидом, таким образом, что последовательности содержатся в одной непрерывной цепи РНК. В другом варианте осуществления первая соединительная рибонуклеотидная последовательность ковалентно связана либо со вторым 3' рибонуклеотидом и первым 5' рибонуклеотидом, либо, предпочтительно, с первым 3' рибонуклеотидом и вторым 5' рибонуклеотидом, таким образом, что последовательности содержатся в одной непрерывной цепи РНК.

В самой простой форме такая молекула РНК называется шпилечной РНК (шРНК). В более предпочтительном варианте осуществления от приблизительно 5% до приблизительно 40% рибонуклеотидов первой смысловой рибонуклеотидной последовательности и первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности дцРНК, в общей сложности, спарены с образованием неканонических пар оснований, предпочтительно пар оснований G:U. То есть все рибонуклеотиды первой смысловой рибонуклеотидной последовательности спарены с рибонуклеотидами первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности либо с образованием канонических пар оснований, либо неканонических пар оснований, при этом область дцРНК включает 20 последовательных пар оснований, включая некоторые неканонические пары оснований. Таким образом, область дцРНК не включает 20 последовательных канонических пар оснований. В более предпочтительном варианте осуществления шРНК согласно изобретению первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность полностью комплементарна области РНК-мишени. В этом варианте осуществления первая смысловая рибонуклеотидная последовательность отличается по последовательности от области РНК-мишени заменой C нуклеотидов в области РНК-мишени U-нуклеотидами в шРНК. Такие молекулы представлены в Примерах 6-11 шпилечными РНК, включающими пары оснований G:U. В предпочтительных вариантах осуществления длина первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности составляет от 20 до приблизительно 1000 нуклеотидов или от 20 до приблизительно 500 нуклеотидов, или является другой длиной, как описано в настоящем документе. Более предпочтительно, шРНК продуцируется или вводится в клетку растения или клетку гриба. В таких вариантах осуществления РНК-мишень может быть транскриптом эндогенного гена в клетке или растительного патогена, или вредителя, такого как насекомое-вредитель.

В более предпочтительном варианте осуществления молекула РНК включает вторую смысловую рибонуклеотидную последовательность, и первая смысловую рибонуклеотидную последовательность и первая антисмысловую рибонуклеотидную последовательность соединены первой соединительной рибонуклеотидной последовательностью, содержащей последовательность петли длиной по меньшей мере 4 нуклеотида, причем первая соединительная рибонуклеотидная последовательность ковалентно связана с первым 3'-рибонуклеотидом и вторым 5'-рибонуклеотидом, и молекула РНК дополнительно включает вторую соединительную рибонуклеотидную последовательность, которая включает последовательность петли длиной по меньшей мере 4 нуклеотида и которая ковалентно связана со вторым 3'-рибонуклеотидом и второй смысловой рибонуклеотидной последовательностью, с формированием структуры кпРНК. В альтернативном предпочтительном варианте осуществления молекула РНК включает вторую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, и первая смысловая рибонуклеотидная последовательность и первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность соединены первой соединительной рибонуклеотидной последовательностью, включающей последовательность петли длиной по меньшей мере 4 нуклеотида, причем первая соединительная рибонуклеотидная последовательность ковалентно связана со вторым 3'-рибонуклеотидом и первым 5'-рибонуклеотидом, и молекула РНК дополнительно включает вторую соединительную рибонуклеотидную последовательность, которая включает последовательность петли длиной по меньшей мере 4 нуклеотида и которая ковалентно связана со вторым 3' рибонуклеотидом и второй антисмысловой рибонуклеотидной последовательностью, с формированием структуры кпРНК.

В другом предпочтительном варианте осуществления молекула РНК включает вторую смысловую рибонуклеотидную последовательность и вторую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, где вторая смысловая рибонуклеотидная последовательность и вторые антисмысловые рибонуклеотидные последовательности способны к гибридизации друг с другом, формируя вторую область дцРНК, и первая смысловая рибонуклеотидная последовательность и первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность соединены первой соединительной рибонуклеотидной последовательностью, включающей последовательность петли длиной по меньшей мере 4 нуклеотида, причем первая соединительная рибонуклеотидная последовательность ковалентно связана с первым 3' рибонуклеотидом и вторым 5' рибонуклеотидом, и молекула РНК дополнительно, или необязательно, включает вторую соединительную рибонуклеотидную последовательность, включающую последовательность петли длиной по меньшей мере 4 нуклеотида и ковалентно связанную со вторым 3' рибонуклеотидом и второй смысловой рибонуклеотидной последовательностью, или которая ковалентно связывает вторую смысловую рибонуклеотидную последовательность и вторую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, формируя структуру кпРНК. В другом предпочтительном варианте осуществления молекула РНК включает вторую смысловую рибонуклеотидную последовательность и вторую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, и первая смысловая рибонуклеотидная последовательность и первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность соединены первой соединительной рибонуклеотидной последовательностью, включающей последовательность петли длиной по меньшей мере 4 нуклеотида, причем первая соединительная рибонуклеотидная последовательность ковалентно связана со вторым 3' рибонуклеотидом и первым 5' рибонуклеотидом, и молекула РНК дополнительно, или необязательно, включает вторую соединительную рибонуклеотидную последовательность, включающую последовательность петли длиной по меньшей мере 4 нуклеотида и ковалентно связанную с первым 3' рибонуклеотидом и второй антисмысловой рибонуклеотидной последовательностью, или которая ковалентно связывает вторую смысловую рибонуклеотидную последовательность и вторую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, формируя структуру кпРНК. В более предпочтительных вариантах осуществления вторая смысловая рибонуклеотидная последовательность и вторая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность, в случае своего присутствия в молекуле РНК, включают по меньшей мере 20 последовательных нуклеотидов. В таких вариантах осуществления первая и вторая смысловые рибонуклеотидные последовательности могут быть ковалентно связаны промежуточной рибонуклеотидной последовательностью, которая не имеет родственную последовательность с молекулой РНК-мишени или имеет родственную последовательность с молекулой РНК-мишени, или первая и вторая смысловые рибонуклеотидные последовательности ковалентно связаны без промежуточной рибонуклеотидной последовательности. Первая и вторая смысловые рибонуклеотидные последовательности могут формировать одну непрерывную смысловую рибонуклеотидную область, обладающую по меньшей мере 50% идентичностью последовательности с молекулой РНК-мишени. В других вариантах осуществления первая и вторая антисмысловые рибонуклеотидные последовательности могут быть ковалентно связаны промежуточной рибонуклеотидной последовательностью, которая не имеет родственной последовательности с комплементом молекулы РНК-мишени, или имеет родственную последовательность с комплементом молекулы РНК, или первая и вторая антисмысловые рибонуклеотидные последовательности ковалентно связаны без промежуточной рибонуклеотидной последовательности. Первая и вторая антисмысловые смысловые рибонуклеотидные последовательности могут формировать одну непрерывную антисмысловую рибонуклеотидную область, обладающую по меньшей мере 50% идентичностью последовательности с комплементом молекулы РНК-мишени. В таких вариантах осуществления молекула РНК включает вторую смысловую рибонуклеотидную последовательность и вторую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, которые гибридизуются путем спаривания оснований, предпочтительно 5% и 40% рибонуклеотидов второй смысловой рибонуклеотидной последовательности и второй антисмысловой рибонуклеотидной последовательности, в общей сложности, либо спариваются с образованием неканонической пары оснований или не спариваются, предпочтительно спариваются с образованием пар оснований G:U, где вторая область дцРНК не включает 20 последовательных канонических пар оснований, и где молекула РНК способна процессироваться в эукариотической клетке или in vitro, причем вторая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность расщепляется с получением молекул коротких антисмысловых РНК (асРНК) длиной 20-24 рибонуклеотида.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления, рассматривающем молекулу РНК в целом и каждую область дцРНК в молекуле РНК, от 5% до 40% рибонуклеотидов каждой смысловой рибонуклеотидной последовательности и ее соответствующей антисмысловой рибонуклеотидной последовательности, которые гибридизуются путем спаривания оснований, в общей сложности, либо спариваются с образованием неканонической пары оснований, либо не спариваются, причем молекула РНК в целом не содержит 20 последовательных канонических пар оснований ни в одной из ее областей дцРНК, и молекула РНК способна процессироваться в эукариотической клетке или in vitro, при этом каждая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность расщепляется с образованием коротких молекул антисмысловой РНК (асРНК) длиной 20-24 рибонуклеотида.

В предпочтительных вариантах осуществления каждая соединительная рибонуклеотидная последовательность независимо имеет длину от 4 до приблизительно 2000 нуклеотидов, предпочтительно от 4 до приблизительно 1200 нуклеотидов, более предпочтительно от 4 до приблизительно 200 нуклеотидов и наиболее предпочтительно от 4 до приблизительно 50 нуклеотидов. В варианте осуществления молекула РНК дополнительно включает 5'-лидерную последовательность и/или 3'-трейлерную последовательность.

Во втором аспекте настоящего изобретения предложена химерная молекула рибонуклеиновой кислоты (РНК), включающая область двухцепочечной РНК (дцРНК), включающую смысловую рибонуклеотидную последовательность и антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, которые способны гибридизоваться друг с другом с образованием области дцРНК, где:

i) смысловая рибонуклеотидная последовательность состоит из ковалентно связанных, в порядке от 5' к 3', первого 5'-рибонуклеотида, первой последовательности РНК и первого 3'-рибонуклеотида,

ii) антисмысловая рибонуклеотидная последовательность состоит из ковалентно связанных, в порядке от 5' к 3', второго 5'-рибонуклеотида, второй последовательности РНК и второго 3'-рибонуклеотида,

iii) первый 5'-рибонуклеотид спаривается со вторым 3'-рибонуклеотидом с образованием концевой пары оснований области дцРНК,

iv) второй 5'-рибонуклеотид спаривается с первым 3'-рибонуклеотидом с образованием концевой пары оснований области дцРНК,

v) от приблизительно 5% до приблизительно 40% рибонуклеотидов смысловой рибонуклеотидной последовательности и антисмысловой рибонуклеотидной последовательности, в общей сложности, либо спарены с образованием неканонических пар оснований, либо не спарены,

vi) область дцРНК не содержит 20 последовательных канонических пар оснований,

vii) молекула РНК способна к процессингу в эукариотической клетке или in vitro, при этом антисмысловая рибонуклеотидная последовательность расщепляется с получением коротких молекул антисмысловой РНК (асРНК) длиной 20-24 рибонуклеотидов,

viii) молекула РНК или по меньшей мере некоторые молекулы асРНК, или и те, и другие, способны к снижению экспрессии или активности молекулы РНК-мишени в эукариотической клетке, и

ix) молекула РНК может быть получена ферментативно при транскрипции in vitro и/или в клетке.

Как известно специалисту, каждый из вариантов осуществления, относящихся к первому аспекту, за исключением случаев, когда длина смысловой рибонуклеотидной последовательности и антисмысловой рибонуклеотидной последовательности составляет меньше 20 последовательных нуклеотидов, относится ко второму аспекту.

В третьем аспекте настоящего изобретения предложена молекула рибонуклеиновой кислоты (РНК), включающая первый РНК-компонент, второй РНК-компонент, который ковалентно связан с первым РНК-компонентом и, необязательно, одно или более, или все из: (i) соединительной рибонуклеотидной последовательности, которая ковалентно связывает первый и второй РНК-компоненты, (ii) 5'-лидерной последовательности и (iii) 3'-трейлерной последовательности,

где первый РНК-компонент состоит, в порядке от 5' к 3', из первого 5'-рибонуклеотида, первой последовательности РНК и первого 3'-рибонуклеотида, где первые 5' и 3' рибонуклеотиды спариваются друг с другом в молекуле РНК, где первая последовательность РНК включает первую смысловую рибонуклеотидную последовательность по меньшей мере из 20 последовательных рибонуклеотидов, первую последовательность петли по меньшей мере из 4 рибонуклеотидов и первую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность по меньшей мере из 20 последовательных рибонуклеотидов, где первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность гибридизуется с первой смысловой рибонуклеотидной последовательностью в молекуле РНК, где первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность способна гибридизоваться с первой областью молекулы РНК-мишени,

где второй РНК-компонент ковалентно связан через соединительную рибонуклеотидную последовательность, если таковая присутствует, или напрямую, если соединительная рибонуклеотидная последовательность не присутствует, с первым 5'-рибонуклеотидом или первым 3'-рибонуклеотидом,

где второй РНК-компонент состоит, в порядке от 5' к 3', из второго 5'-рибонуклеотида, второй последовательности РНК и второго 3'-рибонуклеотида, где вторые 5' и 3' рибонуклеотиды спариваются друг с другом в молекуле РНК, где вторая последовательность РНК включает вторую смысловую рибонуклеотидную последовательность, вторую последовательность петли по меньшей мере из 4 рибонуклеотидов и вторую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, где вторая смысловая рибонуклеотидная последовательность гибридизуется со второй антисмысловой рибонуклеотидной последовательностью в молекуле РНК,

где 5'-лидерная последовательность, если таковая присутствует, состоит из рибонуклеотидной последовательности, которая ковалентно связана с первым 5'-рибонуклеотидом, если второй РНК-компонент связан с первым 3'-рибонуклеотидом, или со вторым 5'-рибонуклеотидом, если второй РНК-компонент связан с первым 5'-рибонуклеотидом, и

где 3'-трейлерная последовательность, если таковая присутствует, состоит из рибонуклеотидной последовательности, которая ковалентно связана со вторым 3'-рибонуклеотидом, если второй РНК-компонент связан с первым 3'-рибонуклеотидом, или с первым 3'-рибонуклеотидом, если второй РНК-компонент связан с первым 5'-рибонуклеотидом.

В четвертом аспекте настоящего изобретения предложена молекула РНК, включающая первый РНК-компонент, второй РНК-компонент, который ковалентно связан с первым РНК-компонентом, и, необязательно, один или более, или все из: (i) соединительной рибонуклеотидной последовательности, которая ковалентно связывает первый и второй РНК-компоненты, (ii) 5'-лидерной последовательности и (iii) 3'-трейлерной последовательности,

где первый РНК-компонент состоит, в порядке от 5' к 3', из первого 5'-рибонуклеотида, первой последовательности РНК и первого 3'-рибонуклеотида, где первые 5' и 3' рибонуклеотиды спариваются, где первая последовательность РНК включает первую смысловую рибонуклеотидную последовательность, первую последовательность петли по меньшей мере из 4 рибонуклеотидов и первую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, где первая смысловая рибонуклеотидная последовательность и первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность состоят по меньшей мере из 20 последовательных рибонуклеотидов, при этом по меньшей мере 20 последовательных рибонуклеотидов первой смысловой рибонуклеотидной последовательности полностью спариваются по меньшей мере с 20 последовательными рибонуклеотидами первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности, где по меньшей мере 20 последовательных рибонуклеотидов первой смысловой рибонуклеотидной последовательности или по меньшей мере 20 последовательных рибонуклеотидов первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности идентичны по последовательности первой области молекулы РНК-мишени или ее комплементу, соответственно, или обоим,

где второй РНК-компонент ковалентно связан, через соединительную рибонуклеотидную последовательность, если таковая присутствует, с первым 5'-рибонуклеотидом или первым 3'-рибонуклеотидом,

где второй РНК-компонент состоит, в порядке от 5' к 3', из второго 5'-рибонуклеотида, второй последовательности РНК и второго 3'-рибонуклеотида, где вторые 5' и 3' рибонуклеотиды спариваются, где вторая последовательность РНК включает вторую смысловую рибонуклеотидную последовательность, вторую последовательность петли по меньшей мере из 4 рибонуклеотидов и вторую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, где вторая смысловая рибонуклеотидная последовательность спаривается со второй антисмысловой рибонуклеотидной последовательностью,

где 5'-лидерная последовательность, если таковая присутствует, состоит из последовательности рибонуклеотидов, которая ковалентно связана с первым 5'-рибонуклеотидом, если второй РНК-компонент связан с первым 3'-рибонуклеотидом, или со вторым 5'-рибонуклеотидом, если второй РНК-компонент связан с первым 5'-рибонуклеотидом, и

где 3'-трейлерная последовательность, если таковая присутствует, состоит из последовательности рибонуклеотидов, которая ковалентно связана со вторым 3'-рибонуклеотидом, если второй РНК-компонент связан с первым 3'-рибонуклеотидом, или с первым 3'-рибонуклеотидом, если второй РНК-компонент связан с первым 5'-рибонуклеотидом.

В предпочтительных вариантах осуществления представленных выше аспектов молекула РНК согласно изобретению является химерной молекулой РНК.

В пятом аспекте настоящего изобретения предложена химерная молекула РНК, включающая первый РНК-компонент и второй РНК-компонент, который ковалентно связан с первым РНК-компонентом,

где первый РНК-компонент включает первую область двухцепочечной РНК (дцРНК), включающую первую смысловую рибонуклеотидную последовательность и первую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, которые способны к гибридизации друг с другом с образованием первой области дцРНК, и первую промежуточную рибонуклеотидную последовательность по меньшей мере из 4 нуклеотидов, которая ковалентно связывает первую смысловую рибонуклеотидную последовательность и первую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность,

где второй РНК-компонент включает вторую смысловую рибонуклеотидную последовательность, вторую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность и вторую промежуточную рибонуклеотидную последовательность по меньшей мере из 4 рибонуклеотидов, которая ковалентно связывает вторую смысловую рибонуклеотидную последовательность и вторую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, где вторая смысловая рибонуклеотидная последовательность гибридизуется со второй антисмысловой рибонуклеотидной последовательностью в молекуле РНК,

где в первом РНК-компоненте:

i) первая смысловая рибонуклеотидная последовательность состоит по меньшей мере из 20 последовательных рибонуклеотидов, ковалентно связанных, в порядке от 5' к 3', первого 5'-рибонуклеотида, первой последовательности РНК и первого 3'-рибонуклеотида,

ii) первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность состоит по меньшей мере из 20 последовательных рибонуклеотидов, ковалентно связанных, в порядке от 5' к 3', второго 5'-рибонуклеотида, второй последовательности РНК и второго 3'-рибонуклеотида,

iii) первый 5'-рибонуклеотид спаривается со вторым 3'-рибонуклеотидом,

iv) второй 5'-рибонуклеотид спаривается с первым 3'-рибонуклеотидом,

v) от 5% до 40% рибонуклеотидов первой смысловой рибонуклеотидной последовательности и первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности, в общей сложности, либо спариваются с образованием неканонических пар оснований, либо не спариваются, и

vi) первая область дцРНК не содержит 20 последовательных канонических пар оснований,

где химерная молекула РНК способна к процессингу в эукариотической клетке или in vitro, при этом первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность расщепляется с получением короткой молекулы антисмысловой РНК (асРНК) длиной 20-24 рибонуклеотидов, и где:

(a) химерная молекула РНК или по меньшей мере некоторые молекулы асРНК, или и те, и другие, способны к снижению экспресссии или активности молекулы РНК-мишени в эукариотической клетке, или

(b) первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность включает последовательность по меньшей мере из 20 последовательных рибонуклеотидов, которая по меньшей мере на 50% идентична по последовательности, предпочтительно по меньшей мере 90% или на 100% идентична по последовательности области комплемента молекулы РНК-мишени, или

(c) и (a), и (b).

В варианте осуществления, где молекула РНК имеет первый РНК-компонент, первый 5'-рибонуклеотид и первый 3'-рибонуклеотид первого РНК-компонента образуют пару оснований друг с другом. Такая пара оснований определена в настоящем документе как концевая пара оснований области дцРНК, образованная при самогибридизации первого РНК-компонента. В варианте осуществления, где первая смысловая рибонуклеотидная последовательность ковалентно связана с первым 5'-рибонуклеотидом без каких-либо промежуточных нуклеотидов, и первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность ковалентно связана с первым 3'-рибонуклеотидом без каких-либо промежуточных нуклеотидов, первый 5'-рибонуклеотид непосредственно связан с одной из смысловой последовательности и антисмысловой последовательности, и первый 3'-рибонуклеотид непосредственно связан с другой смысловой последовательностью и антисмысловой последовательностью.

В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 20 последовательных рибонуклеотидов первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности способны спариваться с нуклеотидами первой области молекулы РНК-мишени. В этом контексте спаривание оснований может быть каноническим или неканоническим, например, по меньшей мере, с некоторыми парами оснований G:U. Независимо для каждой пары оснований G:U, G может присутствовать в первой области молекулы РНК-мишени или предпочтительно в первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности. В альтернативе не все из по меньшей мере 20 последовательных рибонуклеотидов первой пары оснований антисмысловой рибонуклеотидной последовательности спарены с нуклеотидами первой области молекулы РНК-мишени. Например, 1, 2, 3, 4 или 5 из по меньшей мере 20 последовательных рибонуклеотидов первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности не спарены с первой областью молекулы РНК-мишени. В варианте осуществления первая смысловая рибонуклеотидная последовательность ковалентно связана с первым 5'-рибонуклеотидом без каких-либо промежуточных нуклеотидов, и/или первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность ковалентно связана с первым 3'-рибонуклеотидом без каких-либо промежуточных нуклеотидов.

В варианте осуществления представленных выше аспектов молекула РНК включает одну или больше соединительных рибонуклеотидных последовательностей, где соединительная рибонуклеотидная последовательность является родственной по последовательности с молекулой РНК, или идентична, по меньшей мере частично, области молекулы РНК-мишени или ее комплементу. В предпочтительном варианте осуществления соединительная рибонуклеотидная последовательность вместе со смысловыми последовательностями в первом и втором РНК-компонентах являются частью одной непрерывной смысловой последовательности, или вместе с антисмысловыми последовательностями в первом и втором РНК-компонентах являются частью одной непрерывной антисмысловой последовательности. В варианте осуществления молекула РНК включает соединительную рибонуклеотидную последовательность, где соединительная рибонуклеотидная последовательность содержит меньше 20 рибонуклеотидов. В варианте осуществления соединительная рибонуклеотидная последовательность гибридизуется с молекулой РНК-мишени. В варианте осуществления соединительная рибонуклеотидная последовательность идентична части комплемента молекулы РНК-мишени. В варианте осуществления соединительная рибонуклеотидная последовательность содержит от 1 до 10 рибонуклеотидов.

В вариантах осуществления предствленных выше аспектов молекула РНК включает одно или более, или все из: (i) соединительной рибонуклеотидной последовательности, ковалентно связывающей первый и второй РНК-компоненты, (ii) 5'-удлиняющей последовательности и (iii), 3'-удлиняющей последовательности, где 5'-удлиняющая последовательность, если таковая присутствует, состоит из последовательности рибонуклеотидов, которая ковалентно связана с первым РНК-компонентом или со вторым РНК-компонентом, и где 3'-удлиняющая последовательность, если таковая присутствует, состоит из последовательности рибонуклеотидов, которая ковалентно связана со вторым РНК-компонентом или с первым РНК-компонентом, соответственно. В варианте осуществления первый РНК-компонент и второй РНК-компонент ковалентно связаны через соединительную рибонуклеотидную последовательность. В альтернативном варианте осуществления первый РНК-компонент и второй РНК-компонент непосредственно связаны без присутствия какой-либо соединительной рибонуклеотидной последовательности.

В вариантах осуществления первого - четвертого аспектов молекула РНК включает две или более смысловых рибонуклеотидных последовательностей, каждая из которых является идентичной по последовательности области молекулы РНК-мишени, и молекула РНК включает одну или более антисмысловых рибонуклеотидных последовательностей, спаренных со смысловыми рибонуклеотидными последовательностями, где тот или больше антисмысловых последовательностей дополнительны, предпочтительно полностью дополнительны в области целевой молекулы. В варианте осуществления две или более смысловых рибонуклеотидных последовательностей идентичны по последовательности различным областям одной молекулы РНК-мишени, которые могут быть или могут не быть смежными в молекуле РНК-мишени. В варианте осуществления две или более смысловых рибонуклеотидных последовательностей идентичны по последовательности области других молекул РНК-мишеней. В варианте осуществления две или более смысловых рибонуклеотидных последовательностей не содержат никаких промежуточных последовательностей петель, т.е. они являются непрерывными относительно молекулы РНК-мишени.

В предпочтительных вариантах осуществления первого - пятого аспектов молекула РНК включает две или более антисмысловых рибонуклеотидных последовательностей, при этом смысловые рибонуклеотидные последовательности спарены с ними, и такие антисмысловые последовательности комплементарны, предпочтительно полностью комплементарны, области молекулы РНК-мишени. Области молекулы РНК-мишени, к которой они комплементарны, могут быть или могут не быть смежными в молекуле РНК-мишени. В варианте осуществления две или более антисмысловых рибонуклеотидных последовательностей комплементарны разным областям одной молекулы РНК-мишени. В варианте осуществления вторая из двух или более антисмысловых рибонуклеотидных последовательностей комплементарна области другой молекулы РНК-мишени, отличающейся от первой из двух или более антисмысловых рибонуклеотидных последовательностей. В предпочтительном варианте осуществления две или более антисмысловых рибонуклеотидных последовательностей не содержат никаких промежуточных последовательностей петель, т.е. они являются непрерывными относительно комплемента молекулы РНК-мишени. В предпочтительном варианте осуществления одна или обе из двух или более антисмысловых рибонуклеотидных последовательностей и смысловых рибонуклеотидных последовательностей спариваются по всей их полной длине с образованием канонических пар оснований или некоторого числа канонических и некоторого числа неканонических пар оснований, предпочтительно пар оснований G:U.

В предпочтительном варианте осуществления первого - пятого аспектов молекула РНК является одиночной цепью рибонуклеотидов. В своей самой простой форме молекула РНК включает структуру шпилечной РНК (шРНК), имеющую 5'-конец, смысловую рибонуклеотидную последовательность, которая имеет длину по меньшей мере 21 нуклеотид, антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, которая полностью спарена со смысловой рибонуклеотидной последовательностью на протяжении по меньшей мере 21 последовательного нуклеотида, промежуточную последовательностью петли и 3'-конец. Молекула РНК может включать 5'-лидерную последовательность и/или 3'-трейлерную последовательность. В другой форме молекула РНК включает одиночную цепь рибонуклеотидов, имеющую 5'-конец, по меньшей мере одну смысловую рибонуклеотидную последовательность, которая имеет длину по меньшей мере 21 нуклеотид, антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, которая полностью спарена с каждой смысловой рибонуклеотидной последовательностью на протяжении по меньшей мере 21 последовательного нуклеотида, по меньшей мере две последовательности петель и 3'-конец. В порядке от 5' к 3' может быть расположена смысловая рибонуклеотидная последовательность, а затем антисмысловая рибонуклеотидная последовательность, или наоборот. В варианте осуществления рибонуклеотид на 5'-конце и рибонуклеотид на 3'-конце являются смежными, каждый образует пару оснований и не связан ковалентно напрямую, см., например, Фигуру 1.

В другом варианте осуществления первого - пятого аспектов молекула РНК включает первую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с первой областью РНК-мишени, вторая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность гибридизуется со второй областью РНК-мишени, причем вторая область РНК-мишени отличается от первой области РНК-мишени, и молекула РНК включает только одну смысловую рибонуклеотидную последовательность, которая обладает по меньшей мере 50% идентичностью последовательности с РНК-мишенью, где две антисмысловых последовательности не являются смежными в молекуле РНК. В варианте осуществления первая и вторая области РНК-мишени являются смежными в РНК-мишени. В альтернативе они не являются смежными.

В другом варианте осуществления первого - пятого аспектов молекула РНК включает первую смысловую рибонуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична первой области РНК-мишени, вторую смысловую рибонуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 60% идентична второй области РНК-мишени, при этом вторая область РНК-мишени отличается от первой области РНК-мишени, и молекула РНК включает только одну антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с РНК-мишенью, где две смысловых последовательностей не являются смежными в молекуле РНК. В варианте осуществления первая и вторая области РНК-мишени являются смежными в молекуле РНК-мишени. В альтернативе они не являются смежными. В предпочтительных вариантах осуществления первая и вторая смысловые рибонуклеотидные последовательности независимо являются по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичными соответствующей области РНК-мишени, т.е. первая смысловая последовательность может быть по меньшей мере на 70% идентична своей области-мишени, а вторая последовательность - по меньшей мере на 80% идентична своей последовательности-мишени, и т.д.

В предпочтительном варианте осуществления первого - четвертого аспектов молекула РНК является одиночной цепью рибонуклеотидов, имеющей 5'-конец, по меньшей мере одну смысловую рибонуклеотидную последовательность, которая имеет длину по меньшей мере 21 нуклеотид, антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, которая полностью спарена с каждой смысловой рибонуклеотидной последовательностью на протяжении по меньшей мере 21 последовательного нуклеотида, по меньшей мере две последовательности петель и 3'-конец. В более предпочтительном варианте осуществления спаривание оснований в молекуле РНК происходит в двухцепочечной области, которая имеет длину по меньшей мере 21 последотельное основание и включает некоторые неканонические пары оснований, наиболее предпочтительно некоторые пары оснований G:U, при этом двухцепочечная область включает по меньшей мере одну смысловую рибонуклеотидную последовательность, которая имеет длину по меньшей мере 21 нуклеотид.

В предпочтительных вариантах осуществления третьего и четвертого аспектов второй РНК-компонент отличается тем, что:

i) вторая смысловая рибонуклеотидная последовательность состоит по меньшей мере из ковалентно связанных 20 последовательных рибонуклеотидов, в порядке 5'→3', второго 5'-рибонуклеотида, третьей последовательности РНК и третьего 3'-рибонуклеотида,

ii) вторая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность состоит по меньшей мере из ковалентно связанных 20 последовательных рибонуклеотидов, в порядке 5'→3', третьего 5'-рибонуклеотида, четвертой последовательности РНК и второго 3'-рибонуклеотида,

iii) второй 5'-рибонуклеотид спаривается со вторым 3'-рибонуклеотидом,

iv) третий 3'-рибонуклеотид спаривается с третьим 5'-рибонуклеотидом,

где химерная молекула РНК способна к процессингу в эукариотической клетке или in vitro, при этом вторая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность расщепляется с получением короткой молекулы антисмысловой РНК (асРНК) длиной 20-24 рибонуклеотида. Наиболее предпочтительно молекулы асРНК, полученные из второй антисмысловой последовательности, способны снижать экспрессию РНК-мишени, без или в комбинации с молекулами асРНК, полученными из первой антисмысловой последовательности первого РНК-компонента.

В предпочтительном варианте осуществления пятого аспекта второй РНК-компонент отличается тем, что:

i) вторая смысловая рибонуклеотидная последовательность состоит по меньшей мере из ковалентно связанных 20 последовательных рибонуклеотидов, в порядке от 5' к 3', третьего 5'-рибонуклеотида, третьей последовательности РНК и третьего 3'-рибонуклеотида,

ii) вторая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность состоит по меньшей мере из ковалентно связанных 20 последовательных рибонуклеотидов, в порядке от 5' к 3', четвертого 5'-рибонуклеотида, четвертой последовательности РНК и четвертого 3' рибонуклеотида,

iii) третий 5'-рибонуклеотид спаривается с четвертым 3'-рибонуклеотидом,

iv) третий 3'-рибонуклеотид спаривается с третьим 5'-рибонуклеотидом,

где химерная молекула РНК способна к процессингу в эукариотической клетке или in vitro, при этом вторая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность расщепляется с получением короткой молекулы антисмысловой РНК (асРНК) длиной 20-24 рибонуклеотида.

В каждом из представленных выше предпочтительных вариантов осуществления более предпочтительно, что от 5% до 40% рибонуклеотидов первой смысловой рибонуклеотидной последовательности и первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности, и/или второй смысловой рибонуклеотидной последовательности и второй антисмысловой рибонуклеотидной последовательности, и/или каждой смысловой рибонуклеотидной последовательности и ее соответствующей антисмысловой рибонуклеотидной последовательности, которые гибридизуются, в общей сложности, либо спарены с образованием неканонической пары оснований или не спарены, и/или область дцРНК, сформированная между комплементарной смысловой и антисмысловой последовательностями, не включает 20 последовательных канонических пар оснований. Более предпочтительно приблизительно 12%, приблизительно 15%, приблизительно 18%, приблизительно 21%, приблизительно 24%, приблизительно 27%, приблизительно 30%, от 10% до 30% или от 15% до 30%, или еще более предпочтительно от 16% до 25% рибонуклеотидов в смысловой рибонуклеотидной последовательности и ее соответствующей антисмысловой рибонуклеотидной последовательности, предпочтительно для каждой области дцРНК в молекуле РНК, в общей сложности, либо спарены с образованием неканонической пары оснований, либо не спарены. Еще более предпочтительно приблизительно 12%, приблизительно 15%, приблизительно 18%, приблизительно 21%, приблизительно 24%, приблизительно 27%, приблизительно 30%, от 10% до 30% или от 15% до 30%, или еще более предпочтительно от 16% до 25% рибонуклеотидов области(ей) дцРНК в молекуле РНК, в общей сложности, спарены с образованием неканонических пар оснований, и все другие рибонуклеотиды области(ей) дцРНК в молекуле РНК спарены с образованием канонических пар оснований. В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или 100% неканонических пар оснований в первой или второй области дцРНК или всех областях дцРНК, в общей сложности, являются парами оснований G:U. Наиболее предпочтительно, в этих вариантах осуществления:

(a) химерная молекула РНК и/или по меньшей мере некоторые молекулы асРНК способны снижать экспрессию или активность молекулы РНК-мишени в эукариотической клетке, или

(b) первая и вторая антисмысловые рибонуклеотидные последовательности, предпочтительно каждая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность, включает последовательность по меньшей мере из 20 последовательных рибонуклеотидов, которая по меньшей мере на 50% идентична по последовательности области комплемента молекулы РНК-мишени, предпочтительно по меньшей мере на 60% идентична, более предпочтительно по меньшей мере на 70% идентична, еще более предпочтительно по меньшей мере на 80% идентична, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 90% идентична или на 100% идентична области комплемента молекулы РНК-мишени, или

и (a), и (b).

В варианте осуществления первого - пятого аспектов молекула РНК включает 5'-лидерную последовательность или 5'-удлиняющую последовательность. В варианте осуществления молекула РНК включает 3'-трейлерную последовательность или 3'-удлиняющую последовательность. В предпочтительном варианте осуществления молекула РНК включает и 5'-лидерную/удлиняющую последовательность, и 3'-трейлерную/удлиняющую последовательность.

В варианте осуществления первого - пятого аспектов каждый рибонуклеотид молекулы РНК ковалентно связан с двумя другими нуклеотидами, т.е. это - ковалентно замкнутый цикл. Также молекула РНК может быть представлена в форме гантели (Фигура 1), но при этом имеет пропуск или ник в одной части двухцепочечной структуры.

В варианте осуществления первого - пятого аспектов по меньшей мере одна или все последовательности петель молекулы РНК имеют длину больше 20 нуклеотидов. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одна из петель молекулы РНК имеет длину от 4 до 1200 рибонуклеотидов или от 4 до 1000 рибонуклеотидов. В более предпочтительном варианте осуществления все петли имеет длину от 4 до 1000 рибонуклеотидов. В более предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одна из петель молекулы РНК имеет длину от 4 до 200 рибонуклеотидов. В еще более предпочтительном варианте осуществления все петли имеет длину от 4 до 200 рибонуклеотидов. В еще более предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одна из петель молекулы РНК имеет длину от 4 до 50 рибонуклеотидов. В самом предпочтительном варианте осуществления все петли имеет длину от 4 до 50 рибонуклеотидов. В вариантах осуществления минимальная длина петли состаляет 20 нуклеотидов, 30 нуклеотидов, 40 нуклеотидов или 50 нуклеотидов. В варианте осуществления эукариотическая клетка является клеткой позвоночного животного или клеткой растения, и каждая петля молекулы РНК независимо имеет длину от 20 до 50 рибонуклеотидов или от 20 до 40 рибонуклеотидов, или от 20 до 30 рибонуклеотидов.

В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере одна последовательность петли в молекуле РНК включает одну или более связывающих последовательностей, которые комплементарны молекуле РНК, которая является эндогенной для эукариотической клетки, такой как, например, миРНК или другая регуляторная РНК в эукариотической клетке. Как можно будет легко понять, такой признак может быть комбинирован с любыми признаками длины петли, неканоническим спариванием оснований и любыми другими признаками, описанными выше для молекулы РНК. В одном из вариантов осуществления по меньшей мере одна последовательность петли включает множество связывающих последовательностей для миРНК и/или связывающие последовательности для множества миРНК. В одном варианте осуществления по меньшей мере одна последовательность петли в молекуле РНК содержит открытую рамку считывания, которая кодирует полипептид или функциональный полинуклеотид. Открытая рамка считывания предпочтительно функционально связана с последовательностью инициации трансляции, посредством чего открытая рамка считывания может транслироваться в интересующей эукариотической клетке. Например, последовательность инициации трансляции включает участок внутренней посадки рибосомы (IRES) или содержится в нем. IRES предпочтительно являетя эукариотическим IRES. Транслируемый полипептид предпочтительно имеет длину 50-400 аминокислотных остатков или 50-300, или 50-250, или 50-150 аминокислотных остатков. Такие молекулы РНК, в случае их продукции в растительной клетке, способны процессироваться с образованием кольцевых молекул РНК, содержащих большую часть или всю последовательность петли и которые способны транслироваться с обеспечением высоких уровней полипептида.

В вариантах осуществления первого - пятого аспектов молекула РНК не имеет ни одного или имеет одно или два, или больше выпетливаний в двухцепочечной области. В этом контексте выпетливание является нуклеотидом или двумя или более смежными нуклеотидами в смысловой или антисмысловой рибонуклеотидной последовательности, которые не спарены в области дцРНК и которые не имеют несовпадающего нуклеотида в соответствующем положении в комплементарной последовательности в области дцРНК. Область дцРНК молекулы РНК может включать последовательность больше 2 или 3 нуклеотидов в смысловой или антисмысловой последовательности или в обеих, которая образует выпетливание из области дцРНК при формировании структуры дцРНК. Последовательность, которая образует выпетливание, может сама формировать некоторое внутреннее спаривание оснований, например, она сама может образовывать структуру стебель-петли.

В вариантах осуществления первого - пятого аспектов молекула РНК не имеет ни одного или имеет одно или два, или больше выпетливаний в двухцепочечной области. В этом контексте выпетливание является нуклеотидом или двумя или более смежными нуклеотидами в смысловой или антисмысловой рибонуклеотидной последовательности, которые не спарены в области дцРНК и не имеют несовпадающего нуклеотида в соответствующем положении в комплементарной последовательности в области дцРНК. Область дцРНК молекулы РНК может включать последовательность больше чем из 2 или 3 нуклеотидов в смысловой или антисмысловой последовательности, или в обеих, которая образует выпетливание из области дцРНК при формировании структуры дцРНК. Последовательность, образующая выпетливание, может сама формировать некоторое внутреннее спаривание оснований, например, она сама может образовывать структуру стебель-петли.

В варианте осуществления молекула РНК имеет три, четыре или больше петель. В предпочтительном варианте осуществления молекула РНК имеет только две петли. В варианте осуществления первая двухцепочечная область или первая и вторая области дцРНК, или каждая область дцРНК, молекулы РНК включают один или два, или больше нуклеотидов, которые не спарены в двухцепочечной области, или, независимо, до 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% или 10% нуклеотидов в двухцепочечной области, которые не спарены.

В предпочтительных вариантах осуществления первого - пятого аспектов молекула РНК-мишени или молекула РНК согласно изобретению, или обе, находятся в эукариотической клетке. Например, эукариотическая клетка может быть клеткой растения, клеткой животного или клеткой гриба. В варианте осуществления эукариотическая клетка является клеткой гриба, такой как, например, клетка грибкового патогена одного или более видов растений, например, вида Fusarium, вида Verticillium или гриба, который вызывает мучнистую росу. В одном из вариантов осуществления эукариотическая клетка представляет собой клетку членистоногого, такую как, например, клетку насекомого. Предпочтительным насекомым является сокососущее насекомое, такое как тля. Например, насекомое может быть насекомым из отряда Чешуекрылых, Жесткокрылых или Двукрылых. В варианте осуществления молекула РНК согласно изобретению продуцируется в клетке, такой как, например, бактериальная клетка или другая микробная клетка, которая отличается от клетки, включающей РНК-мишень. В предпочтительном варианте осуществления микробная клетка представляет собой клетку, в которой молекула РНК продуцируется путем транскрипции с генетической конструкции, кодирующей молекулу РНК, при этом молекула РНК по существу или, предпочтительно, преимущественно не процессируется в микробной клетке путем расщепления в пределах одной или более последовательностей петель, одной или более областей дцРНК или того и другого. Например, микробная клетка представляет собой дрожжевую клетку или другую грибковую клетку, в которой отсутствует фермент Dicer. Наиболее предпочтительной клеткой для продукции молекулы РНК является клетка Saccharomyces cerevisiae. Микробная клетка может быть живой или может быть убита в результате какой-либо обработки, такой как термическая обработка, или может находиться в форме высушенного порошка. Аналогичным образом, в варианте осуществления молекула РНК согласно изобретению продуцируется в эукариотической клетке, которая не включает РНК-мишень, когда продуцируется молекула РНК согласно изобретению, но эукариотическая клетка, включающая молекулу РНК согласно изобретению и/или ее процессированные продукты РНК, может стать хозяином РНК-мишени, например, если РНК-мишень является вирусной РНК или другой введенной РНК. Такие клетки могут быть профилактически защищены против вирусной или другой введенной РНК.

В предпочтительных вариантах осуществления первого - пятого аспектов молекула РНК может быть получена ферментативно при транскрипции in vitro и/или в клетке. В варианте осуществления молекула РНК настоящего изобретения экспрессируется в клетке, т.е. продуцируется в клетке при транскрипции с одной или более нуклеиновых кислот, кодирующих молекулу РНК. Одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих молекулу РНК, предпочтительно являются молекулой ДНК, которая может присутствовать в векторе в клетке или может быть интегрирована в геном клетки или ядерный геном клетки, или в пластидную ДНК клетки. Одна или более нуклеиновых кислот, кодирующих молекулу РНК, также могут быть молекулой РНК, такой как вирусный вектор.

Таким образом, в другом аспекте настоящего изобретения предложена клетка, включающая молекулу РНК, описанную в настоящем документе. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложена молекула РНК, описанная в настоящем документе, которая экспресировалась в клетке и которая была выделена и/или очищена из клетки. В настоящем изобретении, таким образом, предложен препарат выделенных молекул РНК согласно одному или более из первого - пятого аспектов и любому из вариантов осуществления, описанных в данном контексте, подходящий для введения в клетку, включающую РНК-мишень или потенциально включающую РНК-мишень.

В варианте осуществления одна или более РНК-мишеней кодируют белок. В альтернативе одна или более РНК-мишеней не кодируют белок, такой как рРНК, тРНК, мякРНК или миРНК.

В вариантах осуществления первого - пятого аспектов приблизительно 12%, приблизительно 15%, приблизительно 18%, приблизительно 21%, приблизительно 24% или от приблизительно 15% до приблизительно 30%, или предпочтительно от приблизительно 16% до приблизительно 25% рибонуклеотидов смысловой рибонуклеотидной последовательности и ее соответствующей антисмысловой рибонуклеотидной последовательности, в общей сложности, которые образуют область дцРНК, спарены с образованием неканонической пары оснований или не спарены. В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 97% или 100% неканонических пар оснований в области дцРНК или во всех областях дцРНК в молекуле РНК являются парами оснований G:U. Нуклеотид G в каждой паре оснований G:U может быть независимо в смысловой рибонуклеотидной последовательности или предпочтительно в антисмысловой рибонуклеотидной последовательности. В отношении нуклеотидов G в парах оснований G:U области дцРНК, предпочтительно по меньшей мере 50% находятся в антисмысловой рибонуклеотидной последовательности, более предпочтительно по меньшей мере 60% или 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% или 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% из них находятся в антисмысловой рибонуклеотидной последовательности в области дцРНК. Данный признак может относиться к одной или более, или ко всем областям дцРНК в молекуле РНК. В варианте осуществления меньше 25%, меньше 20%, меньше 15%, меньше 10%, предпочтительно меньше 5%, более предпочтительно меньше 1% или наиболее предпочтительно ни один из рибонуклеотидов в области дцРНК или во всех областях дцРНК в молекуле РНК, в общей сложности, не спарены. В предпочтительном варианте осуществления все из четырех - все из шести рибонуклеотидов в области дцРНК или во всех областях дцРНК образуют неканоническую пару оснований или не спарены в молекуле РНК. В предпочтительном варианте осуществления область дцРНК или все области дцРНК не включают 10 или 9, или предпочтительно 8 последовательных канонических пар оснований. В альтернативном варианте осуществления область дцРНК включает по меньшей мере 8 последовательных канонических пар оснований, например 8-12 или 8-14, или 8-10 последовательных канонических пар оснований. В предпочтительном варианте осуществления все рибонуклеотиды в области дцРНК или во всех областях дцРНК в молекуле РНК спарены с канонической парой оснований или неканонической парой оснований. В варианте осуществления один или более рибонуклеотидов смысловой рибонуклеотидной последовательности и/или один или более рибонуклеотидов антисмысловой рибонуклеотидной последовательности не спарены. В варианте осуществления один или более рибонуклеотидов каждой смысловой рибонуклеотидной последовательности и один или более рибонуклеотидов каждой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности не спарены в молекуле РНК согласно изобретению.

В варианте осуществления одна или больше, или все антисмысловые рибонуклеотидные последовательности молекулы РНК меньше чем на 100% идентична или на приблизительно от 80% до 99,9% идентична, или на приблизительно от 90% до 98% идентична, или на приблизительно от 95% до 98% идентична, предпочтительно на 98-99,9% идентична по последовательности комплементу области молекулы РНК-мишени или двум таким областям, которые могут быть или могут не быть смежными в молекуле РНК-мишени. В предпочтительном варианте осуществления одна или более антисмысловых последовательностей РНК на 100% идентичны по последовательности области комплемента молекулы РНК-мишени, например, области, включающей 21, 23, 25, 27, 30 или 32 последовательных нуклеотида. В варианте осуществления смысловая или антисмысловая рибонуклеотидная последовательность, предпочтительно обе, имеют длину по меньшей мере 40, по меньшей мере 50, по меньшей мере приблизительно 100, по меньшей мере приблизительно 200, по меньшей мере приблизительно 300, по меньшей мере приблизительно 400, по меньшей мере приблизительно 500, по меньшей мере приблизительно 600, по меньшей мере приблизительно 700, по меньшей мере приблизительно 800, по меньшей мере приблизительно 900, по меньшей мере приблизительно 1000 или от приблизительно 100 до приблизительно 1000 последовательных нуклеотидов. Длина по меньшей мере 100 нуклеотидов предпочтительна при использовании молекулы РНК в клетках растений или клетках грибов или в случае клеток беспозвоночных животных. Длина смысловой и антисмысловой рибонуклеотидной последовательности в дцРНК 50 нуклеотидов или меньше, например 31-50 нуклеотидов, предпочтительна при использовании молекулы РНК в клетках позвоночных животных. Однако молекулы РНК, содержащие больше 50 пар оснований в области дцРНК, например, до 100 или даже 200 пар оснований, могут применяться в клетках позвоночных животных при условии, что области дцРНК содержат 10-30% нуклеотидов, спаренных с образованием пар оснований G:U в области дцРНК. В варианте осуществления количество рибонуклеотидов в смысловой рибонуклеотидной последовательности составляет от приблизительно 90% до приблизительно 110%, предпочтительно от 95% до 105%, более предпочтительно от 98% до 102%, еще более предпочтительно от 99% до 101% от количества рибонуклеотидов в соответствующей антисмысловой рибонуклеотидной последовательности, с которой она гибридизуется. В наиболее предпочтительном варианте осуществления количество рибонуклеотидов в смысловой рибонуклеотидной последовательности совпадает с количеством рибонуклеотидов в соответствующей антисмысловой рибонуклеотидной последовательности. Эти признаки могут быть применены к каждой области дцРНК в молекуле РНК.

В вариантах осуществления первого - пятого аспектов первый 3'-рибонуклеотид и второй 5'-рибонуклеотид в молекуле РНК ковалентно соединены последовательностью петли, состоящей по меньшей мере из 4 рибонуклеотидов или от 4 до 1000 рибонуклеотидов или предпочтительно от 4 до 200 рибонуклеотидов, более предпочтительно от 4 до 50 рибонуклеотидов. В варианте осуществления молекула РНК дополнительно включает 5'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную с первым 5'-рибонуклеотидом, или 3'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную со вторым 3'-рибонуклеотидом, или обе. В варианте осуществления химерная молекула РНК дополнительно включает 5'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную со вторым 5'-рибонуклеотидом, или 3'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную с первым 3'-рибонуклеотидом, или обе. В этом варианте осуществления молекула РНК включает две отдельных цепи РНК, которые гибридизуются с образованием молекулы РНК, хотя она может быть синтезирована при транскрипции с молекулы нуклеиновой кислоты в виде одного транскрипта РНК и затем процессирована с включением двух цепей РНК.

Полная длина молекулы РНК согласно изобретению, продуцируемая в виде одной цепи РНК, после сплайсинга каких-либо интронов, но перед каким-либо процессингом молекулы РНК ферментами Dicer или другими РНКазами, как правило, имеют длину от 50 до 2000 рибонуклеотидов, предпочтительно от 60 или 70 до 2000 рибонуклеотидов, более предпочтительно от 80 или 90 до 2000 рибонуклеотидов, еще более предпочтительно от 100 или 110 до 2000 рибонуклеотидов. В предпочтительных вариантах осуществления минимальная длина молекулы РНК составляет 120, 130, 140, 150, 160, 180 или 200 нуклеотидов, а максимальная длина составляет 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1500 или 2000 рибонуклеотидов. Рассматривается каждая комбинация таких указанных минимальных и максимальных длин. Продукция молекул РНК такой длины с готовностью достигается при транскрипции in vitro или в клетках, таких как бактериальные или другие микробные клетки, предпочтительно клетки S. cerevisiae, или в эукариотической клетке, в которой молекулу РНК-мишени необходимо даунрегулировать.

В варианте осуществления первого - пятого аспектов химерная молекула РНК включает две или более области дцРНК, которые имеют одинаковую последовательность или предпочтительно отличаются.

В предпочтительных вариантах осуществления первого - пятого аспектов молекула РНК экспрессируется в эукариотической клетке, т.е. продуцируется в клетке в результате транскрипции. В этих вариантах осуществления большая часть молекул дцРНК образуется при процессинге молекулы РНК, которая имеет длину 22 и/или 20 рибонуклеотидов, по сравнению с процессингом аналогичной молекулы РНК, имеющей соответствующую область дцРНК, которая полностью спарена с каноническими парами оснований. Таким образом, молекулы РНК таких вариантов осуществления с большей ленкостью процессируются с получением коротких антисмысловых РНК длиной 22 и/или 20 рибонуклеотидов, чем аналогичная молекула РНК, область дцРНК которой полностью спарена с каноническими парами оснований, в качестве части от общего количества асРНК длиной 20-24 нуклеотидов, полученных из молекулы РНК. Иными словами, меньшая доля молекул дцРНК образуется в результате процессинга молекулы РНК, которая имеет длину 23 и/или 21 рибонуклеотид, по сравнению с процессингом аналогичной молекулы РНК, которая имеет соответствующую область дцРНК, которая полностью спарена с образованием канонических пар оснований. То есть молекулы РНК согласно этим вариантам осуществления не так легко процессируются с получением коротких антисмысловых РНК из 23 и/или 21 рибонуклеотидов, чем аналогичная молекула РНК, область дцРНК в которой полностью спарена с образованием канонических пар оснований, в пропорции от общего числа асРНК размером 20-24 нуклеотида, полученных из молекулы РНК. Предпочтительно по меньшей мере 50% транскриптов РНК, образующихся в клетке в результате транскрипции с генетической конструкции, не процессируются рибонуклеазой Dicer. В одном из вариантов осуществления, когда молекула РНК экспрессируется в эукариотической клетке, то есть образуется в результате транскрипции в клетке, большая часть коротких антисмысловых молекул РНК, которые образуются в результате процессинга молекулы РНК, содержат больше одного фосфата, ковалентно присоединенного к 5'-концу, по сравнению с процессингом аналогичной молекулы РНК, которая имеет соответствующую область дцРНК, которая полностью спарена с образованием канонических пар оснований. То есть большая часть коротких антисмысловых молекул РНК имеет измененный заряд, что можно наблюдать как изменение подвижности молекул в экспериментах с использованием гель-электрофореза.

В варианте осуществления молекула РНК изобретения включает комбинацию двух или более отличительных признаков молекулы РНК, описанной в настоящем документе.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК, описанную в настоящем документе, предпочтительно химерную молекулу РНК, описанную в настоящем документе. В варианте осуществления полинуклеотид является конструкцией ДНК, которая может быть интегрирована в более крупную молекулу ДНК, такую как хромосома. В варианте осуществления полинуклеотид функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию молекулы РНК в клетке-хозяине. Клетка-хозяин может быть бактериальной клеткой, такой как E. coli, клетка гриба, такая как дрожжевая клетка, наример S. cerevisiae, или эукариотическая клетка, такая как клетка растения или клетка животного. В варианте осуществления промотор является гетерологичным по отношению к полинуклеотиду. Полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК, может быть химерным или рекомбинантным полинуклеотидом, или выделенным и/или экзогенным полинуклеотидом. В варианте осуществления промотор может функционировать in vitro, например, промотор бактериофага, такой как промотор РНК-полимеразы T7 или промотор РНК-полимеразы SP6. В варианте осуществления промотор является промотором РНК-полимеразы III, таким как промотор U6 или промотор H1. В варианте осуществления промотор является промотором РНК-полимеразы II, который может быть конститутивным промотором, тканеспецифическим промотором, регулируемым развитием промотором или индуцируемым промотором. В варианте осуществления полинуклеотид кодирует молекулу РНК-предшественника, включающую интрон по меньшей мере в одной последовательности петли, который может быть вырезан во время или после транскрипции полинуклеотида в клетке-хозяине. В варианте осуществления настоящего изобретения предложен вектор, включающий полинуклеотид, описанный в настоящем документе. В варианте осуществления вектор является вирусным вектором. В варианте осуществления вектор является плазмидным вектором, таким как бинарный вектор, подходящий для применения с Agrobacterium tumefaciens.

В одном из вариантов осуществления полинуклеотид представляет собой химерную ДНК, которая включает, в указанном порядке, промотор, способный инициировать транскрипцию молекулы РНК в клетке-хозяине, функционально связанный с последовательностью ДНК, которая кодирует молекулу РНК, предпочтительно шРНК, и область терминации транскрипции и/или полиаденилирования. В предпочтительном варианте осуществления молекула РНК содержит структуру шпилечной РНК, которая включает смысловую рибонуклеотидную последовательность, последовательность петли и антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, более предпочтительно, где смысловая и антисмысловая рибонуклеотидные последовательности спариваются с образованием области дцРНК, в которой от приблизительно 5% до приблизительно 40% рибонуклеотидов спарены с образованием неканонических пар оснований, предпочтительно пар оснований G:U. В предпочтительных вариантах осуществления клетка-хозяин является клеткой растения или клеткой гриба.

В варианте осуществления, где полинуклеотид или вектор согласно изобретению находятся в эукариотической клетке-хозяине, предпочтительно в клетке растения или клетке гриба, промоторная область полинуклеотида или вектора, функционально связанного с областью, кодирующей молекулу РНК согласно изобретению, имеет более низкий уровень метилирования по сравнению с промотором соответствующего полинуклеотида или вектора, кодирующего молекулу РНК, имеющую соответствующую область дцРНК, которая полностью спарена с каноническими парами оснований. В варианте осуществления более низкий уровень метилирования составляет меньше 50%, меньше 40%, меньше 30% или меньше 20% по сравнению с промотором соответствующего полинуклеотида или вектора. В варианте осуществления клетка-хозяин включает по меньшей мере две копии полинуклеотида или вектора, кодирующего молекулу РНК согласно изобретению. В этом варианте осуществления:

i) уровень снижения экспрессии и/или активности молекулы РНК-мишени в эукариотической клетке является по меньшей мере таким же по сравнению с соответствующей эукариотической клеткой, содержащей одну копию полинуклеотида или вектора, и/или

ii) уровень снижения экспрессии и/или активности молекулы РНК-мишени в эукариотической клетке является более низким когда по сравнению с соответствующей клеткой, включающей молекулу РНК, имеющую соответствующую область дцРНК, которая полностью спарена с каноническими парами оснований.

В другом аспекте настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, включающая молекулу РНК, описанную в настоящем документе, малые молекулы РНК (длиной 20-24 нт), получаемые при процессинге химерной молекулы РНК, полинуклеотид, описанный в настоящем документе, или вектор, включающий их. В варианте осуществления клетка-хозяин является нечеловеческой клеткой, такой как клетка бактерии, клетка гриба, например, дрожжевая клетка, такая как клетка S. cerevisiae, клетка растения или клетка не относящегося к человеку животного, предпочтительно клетка растения. В варианте осуществления клетка является нечеловеческой клеткой или клеткой человека в клеточной культуре. В варианте осуществления клетка является эукариотической клеткой, такой как клетка, отличающаяся от клетки животного. В варианте осуществления клетка является микробной клеткой, такой как прокариотическая клетка. В варианте осуществления клетка-хозяин является живой. В альтернативном варианте осуществления клетка-хозяин является мертвой и/или неспособна к воспроизводству. Клетка-хозяин может быть клеткой, в которой молекула РНК была получена в результате транскрипции и/или процессинга, или клетка может быть клеткой, отличающейся от клетки, в которой молекула РНК была получена в результате транскрипции и/или процессинга, такой как клетка, включающая молекулу РНК-мишени.

В варианте осуществления, клетка-хозяин предпочтительно является клеткой растения или клеткой гриба, включающей химерную молекулу РНК и/или малые молекулы РНК, полученные в результате процессинга химерной молекулы РНК, где химерная молекула РНК включает, в порядке 5'→3', первую смысловую рибонуклеотидную последовательность, первую соединительную рибонуклеотидную последовательность, которая включает последовательность петли, и первую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность.

В другом варианте осуществления клетка-хозяин является эукариотической клеткой и включает по меньшей мере две копии полинуклеотида, кодирующего химерную молекулу РНК согласно любому из пунктов 1-39, и где

i) уровень снижения экспрессии или активности молекулы РНК-мишени в эукариотической клетке является приблизительно таким же или больше чем уровень снижения экспрессии или активности молекулы РНК-мишени, если клетка содержала одну копию полинуклеотида, и/или

ii) уровень снижения экспрессии или активности молекулы РНК-мишени в эукариотической клетке является более низким по сравнению с соответствующей клеткой, включающей молекулу РНК, имеющую соответствующую область дцРНК, которая полностью спарена с образованием канонических пар оснований.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен не относящийся к человеку организм, предпочтительно животное или растение, включающий молекулу РНК согласно изобретению, предпочтительно химерную молекулу РНК, описанную в настоящем документе, или малые молекулы РНК (длиной 20-24 нт), полученные в результате процессинга химерной молекулы РНК, или полинуклеотид или вектор согласно изобретению, включающий их, или клетка-хозяин, включающая их. В варианте осуществления не относящийся к человеку организм, предпочтительно растение или гриб, является трансгенным, поскольку он включает полинуклеотид согласно изобретению. В варианте осуществления полинуклеотид стабильно интегрирован в геном не относящегося к человеку организма. Изобретение также включает части животного и растения и продукты, полученные из них, включая молекулу РНК и/или малые молекулы РНК (длиной 20-24 нт), полученные в результате процессинга химерной молекулы РНК, и/или полинуклеотид или вектор изобретения, например, семена, растительные культуры, собранные продукты и продукты, полученные из них после сбора урожая.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения молекулы РНК согласно изобретению, включающий экспрессию полинуклеотида согласно изобретению в клетке-хозяине или бесклеточной системе экспрессии. Предпочтительно полинуклеотид представляет собой химерную молекулу ДНК, кодирующую молекулу РНК. В этом варианте осуществления способ может дополнительно включать, по меньшей мере, частичную очистку молекулы РНК, или нет.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ получения клетки или не относящегося к человеку организма, предпочтительно клетки растения, растения или гриба, включающий введение полинуклеотида или вектора, или молекулы РНК согласно изобретению в клетку, предпочтительно клетку животного, клетку растения или гриба, предпочтительно так, чтобы полинуклеотид или вектор или его часть, кодирующая молекулу РНК, были стабильно интегрированы в геном клетки. В варианте осуществления клетка представляет собой клетку животного, например клетку человека, которая может быть клеткой животного в культуре. В варианте осуществления не относящийся к человеку организм создан из клетки или дочерней клетки, например, путем регенерации трансгенного растения и, необязательно, получения от него потомства. В варианте осуществления не относящийся к человеку организм создан путем введения клетки или одной или более дочерних клеток в не относящийся к человеку организм. Альтернативно стабильной интеграции полинуклеотида или вектора в геном клетки, полинуклеотид или вектор могут быть введены в клетку без интеграции полинуклеотида или вектора в геном, например, для транзиентной продукции молекулы РНК в клетке или организме. В одном из вариантов осуществления не относящийся к человеку организм, например животное или растение, является устойчивым к вредителю или патогену, например паразиту или патогену животного, вредителю или патогену растения, предпочтительно насекомому-вредителю или грибковому патогену. В одном варианте осуществления способ включает стадию тестирования одного или более не относящихся к человеку организмов, предпочтительно растений, включающих полинуклеотид, вектор или молекулу РНК согласно изобретению, на устойчивость к вредителю или патогену. Не относящиеся к человеку организмы, например тестируемые растения, могут быть потомством не относящегося к человеку организма, предпочтительно растения, в которое полинуклеотид, был впервые введен вектор или молекула РНК согласно изобретению, и, следовательно, способ может включать стадию получения такого потомства. Способ может дополнительно включать этап идентификации и/или отбора не относящегося к человеку организма, например животного или растения, устойчивого к вредителям или патогенам. Например, множество относящихся к человеку организмов, например животных или растений, каждое из которых включает полинуклеотид, вектор или молекулу РНК согласно изобретению, могут быть протестированы для определения того, какое из них является устойчивым к вредителю или патогену, а также потомство, полученное от идентифицированного не относящегося к человеку организма, животного или растения.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен экстракт клетки-хозяина или организма или их части согласно изобретения, где экстракт включает молекулу РНК согласно изобретению, малые молекулы РНК (длиной 20-24 нт), полученные в результате процессинга химерной молекулы РНК, или и то, и другое, и/или полинуклеотид или вектор согласно изобретению. В варианте осуществления настоящего изобретения предложена композиция, включающая одну или более молекул РНК согласно изобретению, малые молекулы РНК (длиной 20-24 нт), полученные в результате процессинга химерной молекулы РНК, или и то, и другое, полинуклеотид согласно изобретению, вектор согласно изобретению, клетка-хозяин согласно изобретению или экстракт, полученный способом согласно изобретению, и один или более подходящих носителей. В варианте осуществления композиция является фармацевтической композицией, такой как композиция, подходящая для введения человеку или другому животному. Фармацевтическая композиция может подходить для профилактики или лечения заболевания или для наружного применения, такого как косметическое применение. В варианте осуществления композиция подходит для нанесения на растение, предпочтительно растение или популяцию растений в полевых условиях, например, в виде аэрозоля, или на насекомое или популяцию насекомых. В варианте осуществления композиция подходит для нанесения на сельскохозяйственную культуру, например, путем распыления на культурные растения в полевых условиях.

В варианте осуществления экстракт или композиция, включающие молекулу РНК согласно изобретению или малые молекулы РНК (длиной 20-24 нт), полученные в результате процессинга химерной молекулы РНК, или и то, и другое, дополнительно включают по меньшей мере одно соединение, которое повышает стабильность молекулы РНК или полинуклеотида и/или вектора, при этом по меньшей мере одно соединение облегчает захват молекулы РНК, полинуклеотида или вектора клеткой, такой как, например, клетка организма. В варианте осуществления соединение является агентом, способствующим трансфекции, например, липидсодержащим соединением.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ снижения или даунрегуляции уровня и/или активности молекулы РНК-мишени в клетке или организме, включающий введение в клетку или организм, например в его часть, одной или более молекул РНК согласно изобретению и/или малых молекул РНК (длиной 20-24 нуклеотида), полученных в результате процессинга химерной молекулы РНК, полинуклеотида согласно изобретению, вектора согласно изобретению или композиции согласно изобретению. В этом контексте доставка может осуществляться посредством поедания, контакта, воздействия, трансформации или иного введения молекулы РНК или малых молекул РНК, или их смеси, или полинуклеотида или вектора согласно изобретению в клетку или организм. Введение может быть улучшено при использовании средства, которое увеличивает захват молекул РНК, полинуклеотидов или векторов согласно изобретению, например при помощи средств, способствующих трансфекции, ДНК- или РНК-связывающих полипептидов, или может быть выполнено без включения таких средств, например, проводят посев семени, которое является трансгенным по полинуклеотиду или вектору согласно изобретению, и позволяют семени вырасти в трансгенное растение, экспрессирующее молекулы РНК согласно изобретению. В варианте осуществления молекула РНК-мишени кодирует белок. В варианте осуществления способ снижает уровень и/или активность больше чем одной молекулы РНК-мишени, причем молекулы РНК-мишени являются различными, например, снижается уровень и/или активность двух или более РНК-мишеней, родственных по последовательности, например, из семейства генов. Таким образом, в варианте осуществления, химерную молекулу РНК и/или малые молекулы РНК, полученные в результате процессинга химерной молекулы РНК, подвергают контакту с клеткой или организмом, предпочтительно клеткой растения, растением, грибом или насекомым, путем наружного нанесения на клетку или организм, или включают в корм для организма.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ контроля не относящегося к человеку организма, например, вредителя или патогена животных, или вредителя или патогена растений, включающий доставку в не относящийся к человеку организм одной и/или более молекул РНК согласно изобретению или малых молекул РНК (длиной 20-24 нт), полученных в результате процессинга химерной молекулы РНК, или полинуклеотида или вектора согласно изобретению, клетки-хозяина согласно изобретению, экстракта, полученного способом согласно изобретению, или композиции согласно изобретению, где молекула РНК и/или малые молекулы РНК оказывают токсическое воздействие на не относящийся к человеку организм. В варианте осуществления не относящийся к человеку организм является членистоногим, таким как, например, насекомое, или растением таким как, например, сорняк. В варианте осуществления не относящийся к человеку организм является растением, при этом насекомое поедает такое растение или его часть, посредством чего осуществляется контроль насекомого. Контроль может включать снижение выживаемости вредителя или патогена, или снижение приспособленности или воспроизводства вредителя или патогена, или и то, и другое. Контроль может включать снижение выживаемости и/или воспроизводства потомства вредителя или патогена, в который впервые были введены молекулы РНК.

Другой аспект изобретения относится к способу снижения ущерба, причиненного вредителями или патогенами не относящемуся к человеку организму, например животному или растению, включающий доставку вредителю или патогену или контакт вредителя или патогена с одной или более молекулами РНК согласно настоящему изобретению и/или малыми молекулами РНК (длиной 20-24 нт), полученными в результате процессинга химерной молекулы РНК, полинуклеотидом или вектором согласно изобретению, клеткой-хозяином согласно изобретению, экстрактом, полученным способом согласно изобретению, или композицией согласно изобретению. В одном из вариантов осуществления способ включает посев семени, которое является трансгенным по полинуклеотиду согласно изобретению, в результате чего полученные растения экспрессируют трансген с продукцией молекул РНК согласно изобретению, снижая, таким образом, ущерб, причиняемый вредителями или патогенами. Таким образом, изобретение предоставляет фермеру средство борьбы с вредителями или патогенами животных или растений. Изобретение распространяется на клетки и организмы, например животные или растения, или их части, которые включают молекулу РНК, полинуклеотид или вектор согласно изобретению, которые были введены в клетку или организм, а также на вредителя или патогена, которые включают молекулу РНК и/или малые молекулы РНК (длиной 20-24 нт), полученные в результате процессинга химерной молекулы РНК, или полинуклеотида или вектора по настоящему изобретению. Вредитель или патоген может быть живым или мертвым. Настоящее изобретение также относится к клеткам или организмам потомства, включающим молекулу РНК и/или малые молекулы РНК.

В варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ предупреждения или лечения заболевания у субъекта, включающий введение субъекту одной или более молекул РНК согласно изобретению и/или малых молекул РНК (длиной 20-24 нт), полученных путем процессинга химерной молекулы РНК, полинуклеотида или вектора согласно изобретению, клетки-хозяина согласно изобретению, экстракта, полученного способом согласно изобретению, или композиции согласно изобретению, где молекула РНК и/или малые молекулы РНК оказывают благоприятный эффект по меньшей мере в отношении одного симптома заболевания. В варианте осуществления молекула РНК или малые молекулы РНК, полинуклеотид, вектор или композицию применяют местно, перорально или путем инъекции. В варианте осуществления субъект является позвоночным животным. В варианте осуществления позвоночное животное является млекопитающим, таким как человек, сельскохозяйственное животное, такое как рогатый скот или овцы, или птицы, такие как куры и другая домашняя птица.

В другом аспекте настоящего изобретения предложена молекула РНК согласно изобретению, полинуклеотид или вектор согласно изобретению, клетка-хозяин согласно изобретению, экстракт, полученный способом согласно изобретению, или композиция согласно изобретению для применения в профилактике или при лечении заболевания у субъекта, где молекула РНК и/или малые молекулы РНК оказывают благоприятный эффект в отношении по меньшей мере одного симптома заболевания. В варианте осуществления настоящего изобретения предложено применение молекулы РНК согласно изобретению или малых молекул РНК, полученных из нее, полинуклеотида или вектора согласно изобретению, клетки-хозяина согласно изобретению, экстракта, полученного способом согласно изобретению, или композиции согласно изобретению для производства лекарственного средства для предупреждения или лечения заболевания у субъекта, где молекула РНК и/или малые молекулы РНК, полученные из нее, оказывают благоприятный эффект в отношении по меньшей мере одного симптома заболевания.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен набор, включающий одну или более молекул РНК согласно изобретению или малых молекул РНК, полученных из нее, полинуклеотид или вектор согласно изобретению, клетку-хозяина согласно изобретению, экстракт, полученный способом согласно изобретению, или композицию согласно изобретению. Набор может дополнительно включать инструкции по применению набора.

Несмотря на более широкое применение в трансгенных системах экспрессии, как обсуждается в настоящем документе, также существуют применения технологии дцРНК, которые основаны на необходимости крупномасштабного производства молекул дцРНК, такие как опрыскивание сельскохозяйственных культур для борьбы с болезнями и/или вредителями. Авторы настоящего изобретения идентифицировали S. cerevisiae в качестве подходящего организма для применения в процессах крупномасштабного производства, поскольку экспрессируемые в них молекулы дцРНК не расщепляются. Таким образом, в дополнительном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения молекул дцРНК, включающий:

а) культивирование S. cerevisiae, экспрессирующих один или более полинуклеотидов, кодирующих одну или более молекул дцРНК, и

б) сбор S. cerevisiae, продуцирующих молекулы дцРНК, или молекул дцРНК из S. cerevisiae,

где S. cerevisiae культивируют в объеме не меньше 1 литра.

ДцРНК может иметь любую структуру, такую как мшРНК, мкРНК или дцРНК согласно изобретению.

В одном из вариантов осуществления S. cerevisiae культивируют в объеме по меньшей мере 10 литров, по меньшей мере 100 литров, по меньшей мере 1000 литров, по меньшей мере 10000 литров или по меньшей мере 100000 литров.

В одном из вариантов осуществления способ дает по меньшей мере 0,1, по меньшей мере 0,5 или по меньшей мере 1 г/л молекулы РНК согласно изобретению.

S. cerevisiae, полученные с применением этого способа, или молекулы дцРНК, выделенные из них (в очищенном или частично очищенном (например, в виде экстракта) состоянии), могут применяться в способах, описанных в настоящем документе, таких как, без ограничения этим, способ снижения или даунрегуляции уровня и/или активности молекулы РНК-мишени в клетке или организме, способ снижения ущерба, причиняемого вредителями или патогенами не относящемуся к человеку организму, способ контроля не относящегося к человеку организма или способ предупреждения или лечения заболевания у субъекта.

Любой вариант осуществления в настоящем документе должен применяться с соответствующими изменениями к любому другому варианту осуществления, если специально не указано иное.

Настоящее изобретение не должно быть ограничено в объеме определенными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе, которые предназначены лишь в целях иллюстрации. Функционально эквивалентные продукты, композиции и способы в явной форме включены в рамки изобретения, как описано в настоящем документе.

По всему тексту настоящего описания, если прямо не указано иное или иное не следует из контекста, ссылка на один этап, композицию, группу этапов или группу композиций должна охватывать один и множество (т.е. один или больше) таких этапов, композиций, групп этапов или групп композиций.

Далее изобретение описано посредством следующих неограничивающих Примеров и со ссылкой на сопровождающие фигуры.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СОПРОВОЖДАЮЩИХ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1. Схематические конструкции двух молекул кпРНК. (A) Эта молекула кпРНК включает смысловую последовательность, которую можно рассматривать как две смежные смысловые последовательности, ковалентно связанные без промежуточной спейсерной последовательности и обладающие идентичностью с РНК-мишенью, антисмысловую последовательность, которая комплементарна смысловой последовательности и которая разделена на две области - 5'-область и 3'-область, и две петли, которые отделяют смысловую от антисмысловой последовательности. (B) Эта молекула кпРНК содержит антисмысловую последовательность, которую можно рассматривать как две смежные антисмысловые последовательности, ковалентно связанные без промежуточной спейсерной последовательности и обладающие идентичностью с комплементом РНК-мишени, смысловую последовательность, которая комплементарна антисмысловой последовательности и которая разделена на две области, и две петли, которые отделяют смысловую от антисмысловой последовательности. Молекула РНК, полученная путем транскрипции, например, путем транскрипции in vitro с промотора, такого как промотор T7 или Sp6, отжигается на себя при спаривании оснований между комплементарной смысловой и антисмысловой последовательностями с образованием двухцепочечной области с петлей на каждом конце и имеет "ник" в антисмысловой или смысловой последовательности. Дополнительные последовательности могут быть связаны с 5'- и/или 3'-концами как 5'- или 3'-удлинители.

Фигура 2. кпРНК более эффективна при формировании дцРНК, чем отжиг смысловой/антисмысловой шпилечной РНК. Показаны схематические представления трех форм двухцепочечных молекул РНК: A, обычнная дцРНК, образованная при отжиге двух отдельных цепей; B, шпилечная РНК, имеющая 5'- и 3'-удлинитель; и C, молекула кпРНК. На нижней панели показан фотоснимок после гель-электрофореза РНК транскриптов трех типов молекул РНК, направленно воздействующих на ген GUS или на ген GFP.

Фигура 3. Нозерн-блот гибридизация обработанных (A и B) и необработанных дистальных (C и D) тканей показывает, что кпРНК более стабильна, чем дцРНК, и распространяется в ткани табачного листа. В дистальных тканях (C и D, верхняя панель) сигнал дцРНК не был обнаружен, в отличие от мощных сигналов кпРНК.

Фигура 4. Обработка кпРНК вызывала даунрегуляцию GUS как в обработанной области (1), так и в необработанной области выше (3).

Фигура 5. кпРНК вызывает сайленсинг гена FAD2.1 в листьях N. benthamiana.

Фигура 6. Нозерн-блот гибридизация подтверждает сильную даунрегуляцию мРНК FAD2.1 при обработке ledFAD2.1 через 6 и 24 часа.

Фигура 7. Выравнивание нуклеотидных последовательностей области гена-мишени GUS (SEQ ID NO:14) и смысловой последовательности конструкции hpGUS[G:U] (нуклеотиды 9-208 из SEQ ID NO:11). 52 цитидин-нуклеотида (C) заменены тимидин-нуклеотидами (T). Консервативные нуклеотиды отмечены звездочкой, замененные C не отмечены звездочкой.

Фигура 8. Выравнивание нуклеотидных последовательностей области гена-мишени GUS (SEQ ID NO:14) и смысловой последовательности конструкции hpGUS[1:4] (нуклеотиды 9-208 из SEQ ID NO:12). Каждый 4-й нуклеотид в hpGUS[1:4] был заменен в сравнении с соответствующей смысловой последовательностью дикого типа, в результате для каждого 4-го нуклеотида, C был изменен на G, G был изменен на C, A был изменен на T, и T был изменен на A. Консервативные нуклеотиды отмечены звездочкой, замененные G и C не отмечены звездочкой, замененные A и Т отмечены двоеточием.

Фигура 9. Выравнивание нуклеотидных последовательностей области гена-мишени GUS (SEQ ID NO:14) и смысловой последовательности конструкции hpGUS[2:10] (нуклеотиды 9-208 из SEQ ID NO:13). Каждый 9-й и 10-й нуклеотиды в каждом блоке из 10 нуклеотидов в hpGUS[2:10] заменены в сравнении с соответствующей смысловой последовательностью дикого типа, в результате для каждого 9-го и 10-го нуклеотида, C был изменен на G, G был изменен на C, A был изменен на T, и T был изменен на A. Консервативные нуклеотиды отмечены звездочкой, замененные G и C не отмечены звездочкой, замененные A и Т отмечены двоеточием.

Фигура 10. Схематическая диаграмма, на которой показаны структуры генетических конструкций, кодирующих модифицированные шпилечные РНК, направленно воздействующие на мРНК GUS.

Фигура 11. Схематическая диаграмма вектора pWBPPGH, используемого для трансформации растений табака, обеспечивающая ген-мишень GUS. T-ДНК идет от правого бордера (RB) до левого бордера (LB) вектора. Ген селективного маркера на T-ДНК является геном 35S-HPT-tm1', кодирующим устойчивость к гигромицину.

Фигура 12. Активность GUS в растениях, трансформированных конструкциями, кодирующими модифицированные шпилечные РНК для снижения экспрессии ген-мишени GUS. Без hp: контрольные растения PPGH11 и PPGH24 без конструкций hpGUS. Количество растений, демонстрирующих меньше чем 10% активность GUS по сравнению с соответствующими контрольными растениями PPGH11 или PPGH24, и процент таких растений относительно числа протестированных растений приведены в скобках.

Фигура 13. (A) Средняя активность GUS всех трансгенных растений: 59 растений hpGUS[wt], 74 - hpGUS[G:U], 33 - hpGUS[1:4] и 41 - hpGUS[2:10]. (B) Средняя активность GUS всех растений после сайленсинга (32 - hpGUS[wt], 71 - hpGUS[G:U], 33 - hpGUS[1:4] и 28 - hpGUS[2:10].

Фигура 14. Активность GUS потомства трансгенных растений, содержащих hpGUS[wt], hpGUS[G:U] или hpGUS[1:4].

Фигура 15. Авторадиограмма Саузерн-блоттинга ДНК из 16 растений, трансформированных конструкцией hpGUS[G:U]. ДНК расщепляли HindIII перед гель-электрофорезом и метили зондом OCS-T. Дорожка 1: маркеры мол.веса (HindIII-расщепленная ДНК лямбда); Дорожки 2 и 3 - ДНК родительских растений PPGH11 и PPGH24; Дорожки 4-19: ДНК из 16 различных трансгенных растений.

Фигура 16. Ауторадиограмма эксперимента Нозерн-блот гибридизации с целью обнаружения смысловых (верхняя панель) и антисмысловых (более низкая группа) кРНК, полученных из шпилечных РНК, экспрессируемых в трансгенном табаке. Дорожки 1 и 2 содержали РНК, полученную из родительских растений PPGH11 и PPGH24, не содержащих конструкции hpGUS. Дорожки 3-11 содержали РНК из растений hpGUS[wt], и дорожки 12-20 содержали РНК из растений hpGUS[G:U].

Фигура 17. Авторадиограмма Нозерн-блот гибридизации с целью обнаружения антисмысловых кРНК из трансгенных растений. Дорожки 1-10 из растений hpGUS[wt], дорожки 11-19 из растений hpGUS[G:U]. Антисмысловые кРНК имеют подвижность, соответствующую длине 20-24 нуклеотида. Блот повторно метили антисмысловыми к РНК U6 в качестве контроля нанесения на дорожку.

Фигура 18. Авторадиограмма повторной Нозерн-блот гибридизации с целью обнаружения антисмысловых кРНК из трансгенных растений

Фигура 19. Анализ метилирования ДНК области соединения 35S промотора и смысловой области GUS в конструкциях hpGUS в трансгенных растениях. Фрагменты соединения амплифицировали с помощью ПЦР с (+) или без (-) предварительной обработки растительной ДНК ферментом McrBC.

Фигура 20. Анализ метилирования ДНК области 35S промотора в конструкциях hpGUS в трансгенных растениях. Фрагменты 35S амплифицировали с помощью ПЦР с (+) или без (-)предварительной обработки растительной ДНК ферментом McrBC.

Фигура 21. Распределение по размеру и представленность процессированной РНК. (A) конструкции EIN2. (B) конструкции GUS.

Фигура 22. Выравнивание смысловой последовательности (верхняя последовательность, нуклеотиды 17-216 из SEQ ID NO:22) конструкции hpEIN2[G:U] и нуклеотидной последовательности (нижняя последовательность, SEQ ID NO:27) области кДНК, соответствующей гену-мишени EIN2 A. thaliana. Смысловая последовательность была получена путем замены 43 цитидин-нуклеотидов (C) в последовательности дикого типа тимидин-нуклеотидами (T). Консервативные нуклеотиды отмечены звездочкой, замененные C не отмечены звездочкой.

Фигура 23. Выравнивание смысловой последовательности (верхняя последовательность, нуклеотиды 13-212 из SEQ ID NO:24) конструкции hpCHS[G:U] с нуклеотидной последовательностью области кДНК, соответствующей гену-мишени CHS A. thaliana (SEQ ID NO:28, нижняя последовательность). Смысловая последовательность была получена путем замены 65 цитидин-нуклеотидов (C) в последовательности дикого типа тимидин-нуклеотидами (T). Консервативные нуклеотиды отмечены звездочкой, замененные C не отмечены звездочкой.

Фигура 24. Выравнивание антисмысловой последовательности (верхняя последовательность, нуклеотиды 8-207 из SEQ ID NO:25) конструкции hpEIN2[G:U/U:G] и нуклеотидной последовательности (нижняя последовательность, SEQ ID NO:29) области комплемента гена-мишени EIN2 A. thaliana. Антисмысловая последовательность была получена путем замены 49 цитидин-нуклеотидов (C) в последовательности дикого типа тимидин-нуклеотидами (T). Консервативные нуклеотиды отмечены звездочкой, замененные C не отмечены звездочкой.

Фигура 25. Выравнивание антисмысловой последовательности (верхняя последовательность, нуклеотиды 13-212 из SEQ ID NO:26) конструкции hpCHS[G:U/U:G] и нуклеотидной последовательности (нижняя последовательность, SEQ ID NO:30) области комплемента гена-мишени CHS A. thaliana. Антисмысловая последовательность была получена путем замены 49 цитидин-нуклеотидов (C) в последовательности дикого типа тимидин-нуклеотидами (T). Консервативные нуклеотиды отмечены звездочкой, замененные C не отмечены звездочкой.

Фигура 26. Схематические диаграммы конструкций шРНК с этилен-нечувствительным 2 (EIN2) и халконсинтазой (CHS). 35S: 35S промотор CaMV; области EIN2 и CHS показаны в виде последовательности дикого типа (wt) или G:U-модифицированной последовательности (G:U). Стрелки указывают ориентацию фрагментов ДНК - стрелки, направленные справа налево, указывают антисмысловые последовательности. Также показаны сайты рестрикции.

Фигура 27. Длина гипокотиля рассады трансгенных растений A. thaliana в анализе EIN2, содержащих hpEIN2[wt] или hpEIN2[G:U]

Фигура 28. кОТ-ПЦР для мРНК CHS в трансгенных A. thaliana, трансгенных по конструкции hpCHS[wt] или hpCHS[G:U], нормализованные по уровням РНК актина-2. Col-0 - A. thaliana дикого типа (нетрансгенный).

Фигура 29. Авторадиограмма Нозерн-блот гибридизации РНК из растений, трансформированных hpEIN2[wt] или hpEIN2[G:U]. На верхней панели показана длина гипокотиля для линий. Авторадиограмма показывает Нозерн-блот, меченный смысловым зондом EIN2 для обнаружения антисмысловых кРНК. Тот же блот повторно метили РНК зондом U6 в качестве контроля нанесения (РНК U6).

Фигура 30. Анализ метилирования ДНК 35S промотора и 35S-смысловых EIN2 последовательностей в геномной ДНК трансгенных растений A. thaliana.

Фигура 31. Уровни метилирования ДНК в промоторе и 5'-области конструкций шпилечной РНК.

Фигура 32. 35S промотор в последних метилированных линиях популяции hpEIN2[wt] все еще показывает значительное метилирование.

Фигура 33. 35S промотор в линиях G:U hpEIN2 показывает лишь слабое метилирование (<10%).

Фигура 34. Сайленсинг гена под действием кпРНК и шРНК с G:U в клетках CHO и Vero через 72 часа.

Фигура 35. Гантельные плазмиды, протестированные в клетках Hela через 48 часов.

Фигура 36. Примеры возможных модификаций молекул дцРНК.

Фигура 37. Пониженная продуктивность тли после кормления искусственным кормом с добавкой кпРНК для снижения экспрессии генов MpC002 или MpRack-1 у зеленой персиковой тли. Верхняя панель (A): среднее число нимф на количество взрослых тлей после десятидневного периода с 100 мкл 50 нг/мкл кпРНК. Нижняя панель (B): процент тлей, выживших в течение пятидневного курса после питания на 100 мкл, содержащих 200 нг/мкл кпРНК MpC002, MpRack-1 или контрольной ledGFP.

Фигура 38. Нозерн-блот гибридизация с целью обнаружения ledGUS и hpGUS РНК при использовании полноразмерного смыслового транскрипта GUS в качестве зонда. Знак "+" внизу обозначает высокую экспрессию GUS; "-" обозначает низкую экспрессию/отсутствие экспрессии GUS, т.е. сильный сайленсинг GUS.

Фигура 39. Нозерн-блот гибридизация с целью обнаружения длинной hpEIN2 и ledEIN2 РНК (верхняя панель) и миРНК, полученных с двух конструкций (нижняя панель).

Фигура 40. Схематическое изображение структур "стебель-петля" транскриптов, экспрессируемых с конструкций GUS шРНК. Транскрипты имеют комплементарные смысловые и антисмысловые последовательности, которые спариваются с образованием стеблей дцРНК, специфичных к последовательности GUS, с указанными длинами стеблей в парах оснований (пн) и числом нуклеотидов (нт) в петлях. Транскрипты, кодируемые конструкциями GFP шРНК, которые образуют GFP-специфичный стебель дцРНК с полностью каноническим спариванием оснований (GFPhp[WT] или дцРНК стебель, имеющий приблизительно 25% пар оснований в виде пар оснований G:U (GFPhp[G:U] с петлей, полученной с области кодирующей последовательности GUS. Последовательности петли для всех транскриптов GFPhp содержали две последовательности, которые были комплементарны miR165/miR166 и, таким образом, обеспечивали сайты связывания для этих мкРНК.

Фигура 41. Анализ методом Нозерн-блот гибридизации, показывающий, что трансгены, кодирующие шРНК, дают различные фрагменты последовательности петли при экспрессии в растительных клетках. (A) Экспрессия гена-мишени GUS (GUS) и длинного шРНК трансгена GUShp1100 с последовательностью спейсера/петли длиной 1100 нт. Конструкцию, кодирующую супрессор РНК-сайленсинга вируса мозаики огурца 2b (CMV2b), включали для улучшения экспрессии трансгена. (B) Нозерн-блот анализ, показывающий РНК после экспрессии двух коротких шРНК трансгенов GUShp93-1 и GUShp93-2 в стабильно трансформированных растениях A. thaliana. Образцы РНК обрабатывали (+) или не обрабатывали (-) РНКазой I. Оба РНК блота гибридизовали со специфичными к петле антисмысловыми РНК-зондами.

Фигура 42. Петля GUShp1100 накапливалась на высоких уровнях в клетках N. benthamiana и была устойчива к расщеплению РНКазой R.

Фигура 43. Трансгенные S. cerevisiae, экспрессирующие конструкцию GUShp1100, демонстрировали молекулу РНК одного типа, соответствующую полноразмерному транскрипту шпилечной РНК. На нижней панели показана Нозерн-блот гибридизация образцов РНК из трансгенных S. cerevisiae.

Фигура 44. Транскрипт GUShp1100, экспрессируемый в S. cerevisiae, остается полноразмерным и не образует кольцевую РНК петлю. Первые четыре дорожки соответствуют in vitro транскриптам полноразмерного или дцРНК стебля GUShp1100 с включением суммарной РНК, выделенной из листьев N. benthamiana дикого типа.

Фигура 45. Петли шРНК могут использоваться в качестве эффективного сиквенс-специфического репрессора молекул мкРНК. (A) Конструкция GFPhp[G:U] индуцировала фенотипы сильной супрессии miR165/166 в трансгенных растениях Arabidopsis. (B) Нозерн-блот гибридизация с целью определения представленности GFPhp транскрипта в РНК из трансгенных растений Arabidopsis. (C) ОТ-кПЦР анализ кольцевой РНК петли GFPhp.

ОПИСАНИЕ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO:1 - Рибонуклеотидная последовательность кпРНК GFP.

SEQ ID NO:2 - Рибонуклеотидная последовательность кпРНК GUS.

SEQ ID NO:3 - Рибонуклеотидная последовательность кпРНК FAD2.1 N. benthamiana.

SEQ ID NO:4 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая кпРНК GFP.

SEQ ID NO:5 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая кпРНК GUS.

SEQ ID NO:6 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая кпРНК FAD2.1 N. benthamiana.

SEQ ID NO:7 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая GFP.

SEQ ID NO:8 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая GUS.

SEQ ID NO:9 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая FAD2.1 N. benthamiana.

SEQ ID NO:10 - Нуклеотидная последовательность, используемая для получения смысловой области GUS для конструкций, кодирующих молекулы шпилечных РНК, направленно взаимодействующие с мРНК GUS.

SEQ ID NO:11 - Нуклеотидная последовательность, используемая для получения смысловой области GUS для конструкции, кодирующей молекулу шпилечной РНК hpGUS[G:U].

SEQ ID NO:12 - Нуклеотидная последовательность, используемая для получения смысловой области GUS для конструкций, кодирующих молекулу шпилечной РНК hpGUS[1:4].

SEQ ID NO:13 - Нуклеотидная последовательность, используемая для получения смысловой области GUS для конструкций, кодирующих молекулу шпилечной РНК hpGUS[2:10].

SEQ ID NO:14 - Нуклеотидная последовательность нуклеотидов 781-1020 кодирующей белок области гена GUS.

SEQ ID NO:15 - Рибонуклеотидная последовательность шпилечной структуры (включая ее петлю) РНК hpGUS[wt].

SEQ ID NO:16 - Рибонуклеотид шпилечной структуры (включая ее петлю) РНК hpGUS[G:U].

SEQ ID NO:17 - Рибонуклеотид шпилечной структуры (включая ее петлю) РНК hpGUS[1:4].

SEQ ID NO:18 - Рибонуклеотид шпилечной структуры (включая ее петлю) РНК hpGUS[2:10].

SEQ ID NO:19 - Нуклеотидная последовательность кДНК, соответствующей гену EIN2 A. thaliana, рег. номер NM_120406.

SEQ ID NO:20 - Нуклеотидная последовательность кДНК, соответствующей гену CHS A. thaliana, рег. номер NM_121396, 1703 нт.

SEQ ID NO:21 - Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, включающего 200 нт смысловую последовательность из кДНК, соответствующей гену EIN2 A. thaliana, фланкированную сайтами рестрикции.

SEQ ID NO:22 - Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, включающего 200 нт смысловую последовательность EIN2, как в SEQ ID NO:21, за исключением того, что 43 C были заменены Т, используемая при конструировании hpEIN2[G:U].

SEQ ID NO:23 - Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, включающего 200 нт смысловую последовательность из кДНК, соответствующей гену CHS A. thaliana, фланкированную сайтами рестрикции.

SEQ ID NO:24 - Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, включающего 200 нт смысловую последовательность CHS, как в SEQ ID NO:23, за исключением того, что 65 C были заменены Т, используемая при конструировании hpCHS[G:U].

SEQ ID NO:25 - Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, включающего 200 нт антисмысловую последовательность EIN2, в которой 50 C были заменены Т, используемая при конструировании hpEIN2[G:U/U:G].

SEQ ID NO:26 - Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, включающего 200 нт антисмысловую последовательность CHS, в которой 49 C были заменены Т, используемая при конструировании hpCHS[G:U/U:G].

SEQ ID NO:27 - Нуклеотидная последовательность нуклеотидов 601-900 из кДНК, соответствующей гену EIN2 из A. thaliana (рег. номер NM_120406).

SEQ ID NO:28 - Нуклеотидная последовательность нуклеотидов 813-1112 из кДНК, соответствующей гену CHS от A. thaliana (рег. номер NM_121396).

SEQ ID NO:29 - Нуклеотидная последовательность комплемента нуклеотидов 652-891 из кДНК, соответствующей гену EIN2 из A. thaliana (рег. номер NM_120406).

SEQ ID NO:30 - Нуклеотидная последовательность комплемента нуклеотидов 804-1103 из кДНК, соответствующей гену CHS из A. thaliana.

SEQ ID NO:31 - Кодирующая белок FANCM I область кДНК Arabidopsis thaliana, рег. номер NM_001333162. Нуклеотиды 675-1174 из области-мишени (500 нуклеотидов).

SEQ ID NO:32 - Кодирующая белок FANCM I область кДНК Brassica napus. Нуклеотиды 896-1395 из области-мишени (500 пн).

SEQ ID NO:33 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая hpFANCM-At[wt], направленно взаимодействующую с кодирующей белок FANCM I областью A. thaliana. Смысловая последовательность FANCM, нуклеотиды 38-537; последовательность петли, нуклеотиды 538-1306; антисмысловая последовательность FANCM, нуклеотиды 1307-1806.

SEQ ID NO:34 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая hpFANCM-At[G:U], направленно взаимодействующую с кодирующей белок FANCM I областью A. thaliana. Смысловая последовательность FANCM, нуклеотиды 38-537; последовательность петли, нуклеотиды 538-1306; антисмысловая последовательность FANCM, нуклеотиды 1307-1806.

SEQ ID NO:35 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая hpFANCM-Bn[wt], направленно взаимодействующую с кодирующей белок FANCM I областью B. napus. Смысловая последовательность FANCM, нуклеотиды 34-533; последовательность петли, нуклеотиды 534-1300; антисмысловая последовательность FANCM, нуклеотиды 1301-1800.

SEQ ID NO:36 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая hpFANCM-Bn[G:U], направленно взаимодействующую с кодирующей белок FANCM I областью B. napus. Смысловая последовательность FANCM, нуклеотиды 34-533; последовательность петли, нуклеотиды 534-1300; антисмысловая последовательность FANCM, нуклеотиды 1301-1800.

SEQ ID NO:37 - Нуклеотидная последовательность кодирующей белок области кДНК, соответствующей гену DDM1 B. napus; рег. номер XR_001278527.

SEQ ID NO:38 - Нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующей hpDDM1-Bn[wt], направленно взаимодействующую с кодирующей белок областью DDM1 B. napus.

SEQ ID NO:39 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая hpDDM1-Bn[G:U], направленно взаимодействующую с кодирующей белок областью DDM1 B. napus. Смысловая последовательность DDM1, нуклеотиды 35-536; последовательность петли, нуклеотиды 537-1304; антисмысловая последовательность DDM1, нуклеотиды 1305-1805.

SEQ ID NO:40 - кДНК EGFP.

SEQ ID NO:41 - Нуклеотидная последовательность кодирующей области hpEGFP[wt], с порядком антисмысловая/петля/смысловая относительно промотора.

SEQ ID NO:42 - Нуклеотидная последовательность кодирующей области hpEGFP[G:U], которая содержит 157 замен C на T в смысловой последовательности EGFP.

SEQ ID NO:43 - Нуклеотидная последовательность кодирующей области ledEGFP[wt], которая не содержит замен C на T в смысловой последовательности EGFP.

SEQ ID NO:44 - Нуклеотидная последовательность кодирующей области ledEGFP[G:U], которая содержит 162 замены C на T в смысловой последовательности EGFP.

SEQ ID NO:45 - Нуклеотидная последовательность, используемая для получения смысловой области GUS для конструкции, кодирующей молекулу шпилечной РНК hpGUS[G:U] без фланкирующих сайтов рестрикции.

SEQ ID NO:46 - Нуклеотидная последовательность, используемая для получения смысловой области GUS для конструкций, кодирующих молекулу шпилечной РНК hpGUS[1:4] без фланкирующих сайтов рестрикции.

SEQ ID NO:47 - Нуклеотидная последовательность, используемая для получения смысловой области GUS для конструкций, кодирующих молекулу шпилечной РНК hpGUS[2:10] без фланкирующих сайтов рестрикции.

SEQ ID NO:48 - Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, включающего 200 нт смысловую последовательность EIN2, как в SEQ ID NO:21, за исключением того, что 43 C были заменены Т, используемая при конструировании hpEIN2[G:U] без фланкирующих последовательностей.

SEQ ID NO:49 - Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, включающего 200 нт смысловую последовательность CHS, как в SEQ ID NO:23, за исключением того, что 65 C были заменены Т, используемая при конструировании hpCHS[G:U] без фланкирующих последовательностей.

SEQ ID NO:50 - Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, включающего 200 нт антисмысловую последовательность EIN2 с заменой 50 C на Т, используемая при конструировании hpEIN2[G:U/U:G] без фланкирующих последовательностей

SEQ ID NO:51 - Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, включающего 200 нт антисмысловую последовательность CHS с заменой 49 C на Т, используемая при конструировании hpCHS[G:U/U:G] без фланкирующих последовательностей.

SEQ ID NO:52 - Олигонуклеотидный праймер, используемый для амплификации 200 пн смысловой последовательности GUS (GUS-WT-F)

SEQ ID NO:53 - Олигонуклеотидный праймер, используемый для амплификации 200 пн смысловой последовательности GUS (GUS-WT-R)

SEQ ID NO:54 - Олигонуклеотидный праймер (прямой), используемый для получения фрагмента hpGUS[G:U] с заменой всех C на T (GUS-GU-F)

SEQ ID NO:55 - Олигонуклеотидный праймер (обратный), используемый для получения фрагмента hpGUS[G:U] с заменой всех C на T (GUS-GU-R)

SEQ ID NO:56 - Олигонуклеотидный праймер (прямой), используемый для получения фрагмента hpGUS[1:4] с заменой каждого 4-го нуклеотида (GUS-4M-F)

SEQ ID NO:57 - Олигонуклеотидный праймер (обратный), используемый для получения фрагмента hpGUS[1:4] с заменой каждого 4-го нуклеотида (GUS-4M-R)

SEQ ID NO:58 - Олигонуклеотидный праймер (прямой), используемый для получения фрагмента hpGUS[2:10] с заменой каждого 9-го и 10-го нуклеотида (GUS-10M-F)

SEQ ID NO:59 - Олигонуклеотидный праймер (обратный), используемый для получения фрагмента hpGUS[2:10] с заменой каждого 9-го и 10-го нуклеотида (GUS-10M-R)

SEQ ID NO:60 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая прямой праймер (35-F3)

SEQ ID NO:61 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая обратный праймер (GUSwt-R2)

SEQ ID NO:62 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая прямой праймер (GUSgu-R2)

SEQ ID NO:63 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая обратный праймер (GUS4m-R2)

SEQ ID NO:64 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая прямой праймер (35-F2)

SEQ ID NO:65 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая обратный праймер (35-R1)

SEQ ID NO:66 - Олигонуклеотидный праймер, используемый для амплификации 200 пн смысловой последовательности EIN2 дикого типа (EIN2wt-F)

SEQ ID NO:67 - Олигонуклеотидный праймер, используемый для амплификации 200 пн смысловой последовательности EIN2 дикого типа (EIN2wt-R)

SEQ ID NO:68 - Олигонуклеотидный праймер, используемый для амплификации 200 пн смысловой последовательности CHS дикого типа (CHSwt-F)

SEQ ID NO:69 - Олигонуклеотидный праймер, используемый для амплификации 200 пн смысловой последовательности CHS дикого типа (CHSwt-R)

SEQ ID NO:70 - Олигонуклеотидный праймер (прямой), используемый для получения фрагмента hpEIN2 [G:U] с заменой каждого C на T (EIN2gu-F)

SEQ ID NO:71 - Олигонуклеотидный праймер (обратный), используемый для получения фрагмента hpEIN2 [G:U] с заменой каждого C на T (EIN2gu-R)

SEQ ID NO:72 - Олигонуклеотидный праймер (прямой), используемый для получения фрагмента hpCHS [G:U] с заменой каждого C на T (CHSgu-F)

SEQ ID NO:73 - Олигонуклеотидный праймер (обратный), используемый для получения фрагмента hpCHS [G:U] с заменой каждого C на T (CHSgu-R)

SEQ ID NO:74 - Олигонуклеотидный праймер (прямой), используемый для получения фрагмента hpEIN2 [G:U/U:G] с заменой каждого C на T (asEIN2gu-F)

SEQ ID NO:75 - Олигонуклеотидный праймер (обратный), используемый для получения фрагмента hpEIN2 [G:U/U:G] с заменой каждого C на T (asEIN2gu-R)

SEQ ID NO:76 - Олигонуклеотидный праймер (прямой), используемый для получения фрагмента hpCHS [G:U/U:G] с заменой каждого C на T (asCHSgu-F)

SEQ ID NO:77 - Олигонуклеотидный праймер (обратный), используемый для получения фрагмента hpCHS [G:U/U:G] с заменой каждого C на T (asCHSgu-R)

SEQ ID NO:78 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая прямой праймер (CHS-200-F2)

SEQ ID NO:79 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая обратный праймер (CHS-200-R2)

SEQ ID NO:80 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая прямой праймер (Actin2-For)

SEQ ID NO:81 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая обратный праймер (Actin2-Rev)

SEQ ID NO:82 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая прямой праймер (Top-35S-F2)

SEQ ID NO:83 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая обратный праймер (Top-35S-R2)

SEQ ID NO:84 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая прямой праймер (Link-35S-F2)

SEQ ID NO:85 - Нуклеотидная последовательность, кодирующая обратный праймер (Link-EIN2-R2)

SEQ ID NO:86 - Рибонуклеотидная последовательность смыслового si22

SEQ ID NO:87 - Рибонуклеотидная последовательность антисмыслового si22

SEQ ID NO:88 - Рибонуклеотидная последовательность прямого праймера

SEQ ID NO:89 - Рибонуклеотидная последовательность обратного праймера

SEQ ID NO:90 - Рибонуклеотидная последовательность прямого праймера

SEQ ID NO:91 - Рибонуклеотидная последовательность обратного праймера

SEQ ID NO:92 - Возможные модификации молекул дцРНК

SEQ ID NO:93 - Нуклеотидная последовательность кДНК, соответствующей гену DDM1 Brassica napus (рег. номер XR_001278527).

SEQ ID NO:94 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию шпилечной РНКи (шРНК), направленно воздействующую на ген DDM1 B. napus.

SEQ ID NO:95 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию шпилечной РНКи (шРНК) с парами оснований G:U, направленно воздействующую на ген DDM1 B. napus.

SEQ ID NO:96 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген DDM1 B. napus.

SEQ ID NO:97 - Нуклеотидная последовательность кДНК, соответствующей гену FANCM A. thaliana (рег. номер NM_001333162).

SEQ ID NO:98 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию шпилечной РНКи (шРНК), направленно воздействующую на ген FANCM A. thaliana.

SEQ ID NO:99 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию шпилечной РНКи (шРНК) с парами оснований G:U, направленно воздействующую на ген FANCM A. thaliana.

SEQ ID NO:100 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген FANCM A. thaliana.

SEQ ID NO:101 - Нуклеотидная последовательность кДНК, соответствующей гену FANCM B. napus (рег. номер XM_022719486.1).

SEQ ID NO:102 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию шпилечной РНКи (шРНК), направленно воздействующую на ген FANCM B. napus.

SEQ ID NO:103 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию шпилечной РНКи (шРНК) с парами оснований G:U, направленно воздействующую на ген FANCM B. napus.

SEQ ID NO:104 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген FANCM B. napus.

SEQ ID NO:105 - Нуклеотидная последовательность кодирующей белок области кДНК, соответствующей гену TOR Nicotiana benthamiana.

SEQ ID NO:106 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген TOR N. benthamiana.

SEQ ID NO:107 - Нуклеотидная последовательность кодирующей белок области кДНК, соответствующей гену ацетолактатсинтазы (ALS) ячменя, Hordeum vulgare (рег. номер LT601589).

SEQ ID NO:108 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей кпРНК, направленно воздействующую на ген ALS ячменя (H. vulgare).

SEQ ID NO:109 - Нуклеотидная последовательность кодирующей белок области кДНК, соответствующей гену HvNCED1 ячменя Hordeum vulgare (рег. номер AK361999).

SEQ ID NO:110 - Нуклеотидная последовательность кодирующей белок области кДНК, соответствующей гену HvNCED2 ячменя Hordeum vulgare (рег. номер DQ145931).

SEQ ID NO:111 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на гены NCED1 ячменя Hordeum vulgare и пшеницы Triticum aestivum.

SEQ ID NO:112 - нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на гены NCED2 ячменя Hordeum vulgare и пшеницы Triticum aestivum.

SEQ ID NO:113 - Нуклеотидная последовательность кодирующей белок области кДНК, соответствующей гену ячменя, кодирующему ABA-OH-2 (Рег. номер DQ145933).

SEQ ID NO:114 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на гены ABA-OH-2 ячменя Hordeum vulgare и пшеницы Triticum aestivum.

SEQ ID NO:115 - Нуклеотидная последовательность кодирующей белок области кДНК, соответствующей гену A. thaliana, кодирующему EIN2 (At5g03280).

SEQ ID NO:116 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген EIN2 A. thaliana.

SEQ ID NO:117 - Нуклеотидная последовательность кодирующей белок области кДНК, соответствующей гену A. thaliana, кодирующему CHS (рег. номер NM_121396).

SEQ ID NO:118 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген CHS A. thaliana.

SEQ ID NO:119 - Нуклеотидная последовательность кодирующей белок области кДНК, соответствующей гену N-like L. angustifolius (Рег. номер XM_019604347).

SEQ ID NO:120 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген N-like L. angustifolius.

SEQ ID NO:121 - Нуклеотидная последовательность кодирующей белок области кДНК, соответствующей гену MLO Vitis pseudoreticulata (Рег. номер KR362912).

SEQ ID NO:122 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей первую конструкцию кпРНК, направленно воздействующую ген MLO Vitis.

SEQ ID NO:123 - Нуклеотидная последовательность кодирующей белок области кДНК, соответствующей гену MpC002 Myzus persicae.

SEQ ID NO:124 - Нуклеотидная последовательность кодирующей белок области кДНК, соответствующей гену MpRack-1 Myzus persicae.

SEQ ID NO:125 - Нуклеотидная последовательность химерной конструкции, кодирующей кпРНК, направленно воздействующую на ген C002 M.persicae.

SEQ ID NO:126 - Нуклеотидная последовательность химерной конструкции, кодирующей кпРНК, направленно воздействующую на ген Rack-1 M.persicae.

SEQ ID NO:127 - Нуклеотидная последовательность кДНК, соответствующей гену ABCwhite Helicoverpa armigera.

SEQ ID NO:128 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген ABC-переносчика white Helicoverpa armigera.

SEQ ID NO:129 - Нуклеотидная последовательность кДНК, соответствующей гену, подобному нейропептидам PBAN-типа Linepithema humile (XM_012368710).

SEQ ID NO:130 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген PBAN у аргентинских муравьев (рег. номер XM_012368710).

SEQ ID NO:131 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген, кодирующий каталитическую субъединицу A протонной АТФ-азы V-типа (рег. номер XM_023443547) L. cuprina.

SEQ ID NO:132 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген, кодирующий РНКазу 1/2 L. cuprina.

SEQ ID NO:133 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген, кодирующий хитинсинтазу L. cuprina.

SEQ ID NO:134 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген, кодирующий рецептор экдизона (EcR) L. cuprina.

SEQ ID NO:135 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген, кодирующий гамма-тубулин 1/1-подобный L. cuprina.

SEQ ID NO:136 - Ген-мишень TaMlo (AF384144).

SEQ ID NO:137 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген, кодирующий TaMlo.

SEQ ID NO:138 - Нуклеотидная последовательность кодирующей белок области кДНК, соответствующей гену MLO Vitis pseudoreticulata (рег. номер KR362912).

SEQ ID NO:139 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей первую конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген MLO Vitis.

SEQ ID NO:140 - Cyp51 гомолог 1 (рег. номер KK764651.1, локус RSAG8_00934).

SEQ ID NO:141 - Cyp51 гомолог 2 (рег. номер KK764892.1, локус номер RSAG8_12664).

SEQ ID NO:142 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген, кодирующий Cyp51.

SEQ ID NO:143 - CesA3 ген-мишень (рег. номер JN561774.1).

SEQ ID NO:144 - Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на ген, кодирующий CesA3.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Общие методы и определения

Если прямо не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, должны иметь то же значение, которое обычно известно специалистам в данной области (например, в области культур клеток, молекулярной генетики, сайленсинга генов, химии белков и биохимии).

Если не указано иное, методы получения рекомбинантных белков, культур клеток и иммунологические методы, используемые в настоящем изобретении, являются стандартными методиками, хорошо известными специалистам в данной области. Такие методы описаны и объяснены в литературе в таких источниках, как J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (редактор), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (редакторы), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), and F.M. Ausubel et al. (редакторы), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включая все редакции по настоящее время), Ed Harlow and David Lane (редакторы) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), и J.E. Coligan et al. (редакторы) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (включая все редакции по настоящее время).

Термин "антисмысловой регуляторный элемент" или "антисмысловая последовательность рибонуклеиновой кислоты" или "антисмысловая последовательность РНК" при использовании в настоящем документе означает последовательность РНК, которая, по меньшей мере частично, комплементарна, по меньшей мере, части молекулы РНК-мишени, с которой она гибридизуется. В некоторых вариантах осуществления антисмысловая последовательность РНК модулирует (повышает или снижает) экспрессию или количество молекулы РНК-мишени, или ее активность, например, посредством снижения трансляции молекулы РНК-мишени. В некоторых вариантах осуществления антисмысловая последовательность РНК изменяет сплайсинг пре-мРНК-мишени, что приводит к другому варианту сплайсинга. Примеры компонентов антисмысловых последовательностей включают, без ограничения, олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, аналоги олигонуклеотидов, миметики олигонуклеотидов и их химерные комбинации.

Термин "антисмысловая активность" используется в рамках настоящего описания для обозначения любой поддающейся обнаружению и/или измерению активности, связанной с гибридизацией антисмысловой последовательности РНК с ее молекулой РНК-мишени. Такое обнаружение и/или измерение может быть прямым или косвенным. В примере антисмысловую активность оценивают путем обнаружения и/или измерения количества транскрипта молекулы РНК-мишени. Антисмысловая активность может быть также обнаружена как изменение фенотипа, связанного с молекулой РНК-мишени. При использовании в настоящем документе термин "молекула РНК-мишени" относится к транскрипту гена, который подвергается модуляции антисмысловой последовательностью РНК согласно настоящему изобретению. Таким образом, "молекула РНК-мишени" может быть любой молекулой РНК, экспрессию или активность которой можно модулировать антисмысловой последовательностью РНК. Примеры молекул РНК-мишеней включают, без ограничения, РНК (в том числе, но без ограничения, пре-мРНК и мРНК или их части), транскрибируемую с ДНК, кодирующей целевой белок, рРНК, тРНК, малую ядерную РНК и миРНК, включая их формы-предшественники. РНК-мишень может быть геномной РНК патогена или вредителя, такого как вирус, или молекулой РНК, полученной из нее, такой как репликативная форма вирусного патогена, или их транскриптом. Например, молекула РНК-мишени может быть РНК из эндогенного гена (или мРНК, транскрибируемой с гена) или гена, который введен или может быть введен в эукариотическую клетку, экспрессия которой связана с конкретным фенотипом, признаком, нарушением или патологическим состоянием, или молекулой нуклеиновой кислоты из возбудителя инфекции. В примере молекула РНК-мишени находится в эукариотической клетке. В другом примере молекула РНК-мишени кодирует белок. В данном контексте антисмысловая активность может быть оценена путем обнаружения и или измерения количества белка-мишени, например, по его активности, такой как ферментная активность, или функции, отличной от ферментной, или по фенотипу, связанному с его функцией. При использовании в настоящем документе термин "белок-мишень" относится к белку, модулируемому антисмысловой последовательностью РНК согласно настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления антисмысловую активность оценивают путем обнаружения и/или измерения количества молекул РНК-мишеней и/или расщепленных молекул РНК-мишеней и/или альтернативно сплайсированных молекул РНК-мишеней.

Антисмысловая активность может быть обнаружена или измерена с помощью различных методов. Например, антисмысловая активность может быть обнаружена или оценена путем сравнения активности в конкретном образце и сравнения активности с активностью в контрольном образце.

Термин "направленное взаимодействие" используется в рамках настоящего описания для обозначения ассоциации антисмысловой последовательности РНК с конкретной молекулой РНК-мишени или конкретной областью нуклеотидов в молекуле РНК-мишени. В одном примере антисмысловая последовательность РНК согласно настоящему раскрытию обладает комплементарностью, по меньшей мере, с областью молекулы-мишени РНК. В данном контексте термин "комплементарность" относится к последовательности рибонуклеотидов, которая способна к спариванию оснований с последовательностью рибонуклеотидов на молекуле РНК-мишени посредством образования водородных связей между основаниями на рибонуклеотидах. Например, в РНК аденин (A) комплементарен урацилу (U), а гуанин (G) - цитозину (C).

В некоторых вариантах осуществления "комплементарное основание" относится к рибонуклеотиду антисмысловой последовательности РНК, который способен спариваться с рибонуклеотидом смысловой последовательности РНК в молекуле РНК согласно настоящему изобретению или в молекуле РНК-мишени. Например, если рибонуклеотид в определенном положении антисмысловой последовательности РНК способен образовывать водородную связь с рибонуклеотидом в определенном положении молекулы РНК-мишени, то положение водородной связи между последовательностью антисмысловой РНК и молекулой РНК-мишени считается комплементарным по этому рибонуклеотиду. Напротив, термин "некомплементарный" относится к паре рибонуклеотидов, которые не образуют водородные связи друг с другом или не поддерживают гибридизацию иным способом. Термин "комплементарный" также может использоваться для обозначения способности антисмысловой последовательности РНК гибридизоваться с другой нуклеиновой кислотой посредством комплементарности. В некоторых вариантах осуществления последовательность РНК и ее мишень комплементарны друг другу, если достаточное количество соответствующих положений в каждой молекуле занимают рибонуклеотиды, которые могут связываться друг с другом, обеспечивая стабильную ассоциацию между последовательностью антисмысловой РНК и последовательностью смысловой РНК в молекуле РНК согласно изобретению и/или в молекуле РНК-мишени. Специалисту в данной области известно, что включение некомплементарных нуклеотидов возможно без нарушения способности последовательности антисмысловой РНК и мишени оставаться в ассоциации. Таким образом, в настоящем документе описаны последовательности антисмысловой РНК, которые могут содержать приблизительно до 20% нуклеотидов, которые не спариваются друг с другом (то есть не являются комплементарными соответствующим нуклеотидам в мишени). Предпочтительно антисмысловые соединения содержат не больше чем приблизительно 15%, более предпочтительно не больше чем приблизительно 10%, наиболее предпочтительно не больше 5% некомплементарных нуклеотидов или не содержат их. Остальные рибонуклеотиды являются комплементарными или не нарушают иным образом гибридизацию (например, пары G:U или A:G) между последовательностью антисмысловой РНК и последовательностью смысловой РНК или молекулой РНК-мишени. Специалисту в данной области техники будет известно, что последовательности антисмысловых РНК, описанные в настоящем документе, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% (полностью) комплементарны по меньшей мере с областью молекулы РНК-мишени.

При использовании в настоящем документе "химерная молекула РНК" относится к любой молекуле РНК, которая обычно не встречается в природе. В примере молекулы химерной РНК, раскрытые в настоящем документе, были модифицированы с созданием некомплементарностей в области(ях) дцРНК. Например, химерные молекулы РНК могут быть модифицированы с превращением цитозинов в урацилы. В одном примере химерные молекулы РНК были модифицированы путем обработки бисульфитом в течение некоторого времени и в условиях, достаточных для превращения неметилированных цитозинов в урацилы.

Специалисту в данной области будет известно, что различные комбинации рибонуклеотидов могут спариваться с образованием пары оснований. В настоящем изобретении рассматриваются как канонические, так и неканонические пары оснований. В одном примере спаривание оснований может включать A:T или G:C в молекуле ДНК или U:A или G:C в молекуле РНК. В другом примере спаривание оснований может включать A:G или G:T, или U:G.

Термин "каноническое спаривание оснований" при использовании в настоящем описании означает спаривание оснований между двумя нуклеотидами, которые представляют собой A:T или G:C в случае дезоксирибонуклеотидов или A:U или G:C в случае рибонуклеотидов.

Термин "неканоническое спаривание оснований" при использовании в настоящем описании означает взаимодействие между основаниями двух нуклеотидов, которое отличается от канонического спаривания оснований в контексте двух последовательностей ДНК или РНК. Например, неканоническое спаривание оснований включает спаривание между G и U (G:U) или между A и G (A:G). Примеры неканонического спаривания оснований включают пурин-пурин или пиримидин-пиримидин. Как правило, в рамках настоящего описания неканоническое спаривание оснований представляют собой G:U. Другими примерами неканонических пар азотистых оснований, менее предпочтительных, являются A:C, G:T, G:G и A:A.

Настоящее изобретение относится к РНК-компонентам, которые "гибридизуются" на протяжении ряда рибонуклеотидов. Специалистам в данной области будет известно, что такие термины, как "гибридизуется" и "гибридизующийся" используются для описания молекул, которые отжигаются на основе комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот. Такие молекулы не должны быть на 100% комплементарными для гибридизации (то есть они не должны быть обязательно "полностью спаренными"). Например, при комплементарности последовательностей может присутствовать одно или более некомплементарных оснований. В одном примере РНК-компоненты, определенные в настоящем документе, гибридизуются в жестких условиях гибридизации. Термин "жесткие условия гибридизации" относится к параметрам, с которыми знаком специалист в данной области, включая изменение температуры гибридизации в зависимости от длины молекулы РНК. Параметры гибридизации рибонуклеотидов можно найти в источниках, в которых описаны такие методы, Sambrook, et al. (выше), и Ausubel, et al. (выше). Например, жесткие условия гибридизации, используемые в настоящем документе, могут относиться к гибридизации при 65°C в гибридизационном буфере (3,5×SSC, 0,02% фиколла, 0,02% поливинилпирролидона, 0,02% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 2,5 мМ NaH₂PO₄ (pH 7) (0,5% SDS, 2 мМ ЭДТА) с последующей одной или более промывками в 0,2×SSC, 0,01% BSA при 50°C. Более короткие РНК-компоненты, такие как последовательности РНК длиной 20-24 нуклеотида, гибридизуются в условиях более низкой жесткости. Термин "условия гибридизации низкой жесткости" относится к параметрам, с которыми знаком специалист в данной области, включая изменение температуры гибридизации в зависимости от длины молекулы РНК. Например, условия гибридизации низкой жесткости, используемые в настоящем документе, могут относиться к гибридизации при 42°C в гибридизационном буфере (3,5×SSC, 0,02% фиколла, 0,02% поливинилпирролидона, 0,02% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 2,5 мМ NaH₂PO₄ (pH 7), 0,5% SDS, 2 мМ ЭДТА) с последующей одной или более промывками в 0,2×SSC, 0,01% BSA при 30°C.

Настоящее изобретение также охватывает РНК-компоненты, которые "полностью спарены" на протяжении непрерывных рибонуклеотидов. Термин "полностью спаренный" используется в рамках настоящего описания для обозначения ряда непрерывных спариваний рибонуклеотидных оснований. Полностью спаренный ряд последовательных рибонуклеотидов не включает пропуски или неспаренные нуклеотиды. Термин "непрерывный" используется для обозначения ряда рибонуклеотидов. Рибонуклеотиды, включающие непрерывный ряд, соединяются непрерывным рядом фосфодиэфирных связей, причем каждый рибонуклеотид связан непосредственно со следующим.

Молекулы РНК настоящего изобретения включают смысловую последовательность и соответствующую антисмысловую последовательность. Родство между этими последовательностями определено в настоящем документе. Родство последовательностей и активность антисмысловой последовательности в отношении молекулы РНК-мишени также определены в настоящем документе.

Термин "ковалентно связанный" используется в рамках настоящего описания для обозначения связи между первыми и вторыми РНК-компонентами или любыми последовательностями РНК или рибонуклеотидами. Как будет известно специалисту в данной области, ковалентное соединение или связь являются химической связью, включающей распределение общих электронных пар между атомами. В примере первый и второй РНК-компоненты или смысловая последовательность РНК и антисмысловая последовательность РНК ковалентно связаны как часть одной цепи РНК, которая может складываться и гибридизоваться сама с собой посредством самокомплементарности. В этом примере компоненты ковалентно связаны на протяжении одного или более рибонуклеотидов фосфодиэфирными связями.

В рамках настоящего описания термин "гибридизация" означает спаривание комплементарных полинуклеотидов посредством спаривания комплементарных оснований. Хотя отсутствует ограничение конкретным механизмом, наиболее распространенный механизм спаривания включает образование водородных связей, которые могут образовываться по правилу Уотсона-Крика между комплементарными рибонуклеотидами.

При использовании в настоящем документе фраза "молекула РНК оказывает вредное воздействие на не относящийся к человеку организм" или подобные фразы означают, что молекула РНК-мишени молекулы РНК присутствует в не относящемся к человеку организме, и контакт клеток, экспрессирующих молекулу РНК, с молекулой РНК-мишени приводит к снижению уровней и/или активности молекулы РНК-мишени по сравнению с теми же клетками, не содержащими молекулу РНК. В варианте осуществления молекула РНК-мишени кодирует белок, важный для роста, воспроизводства или выживания. Как пример, если не относящийся к человеку организм является вредителем сельскохозяйственных культур или патогеном, или паразитом или патогеном животного, молекула РНК может оказывать вредное воздействие на питание вредителя или патогена, апоптоз клеток, дифференцировку клеток и развитие, продуктивность или потребность в половом размножении, формирование мышц, подергивание мышц, сокращение мышц, образование ювенильного гормона, регуляцию ювенильного гормона, регуляцию и транспорт ионов, поддержание потенциала клеточной мембраны, биосинтез аминокислот, деградацию аминокислот, сперматогенез, синтез феромонов, чувствительность к феромонам, образование антенн, формирование крыльев, формирование ног, формирование яиц, созревание личинок, образование пищеварительных ферментов, синтез гемолимфы, поддержание гемолимфы, передачу нервных импульсов, переход в личиночную стадию, окукливание, выход из окукливания, деление клеток, энергетический обмен, дыхание, метаболизм хитина, формирование структуры цитоскелета. В другом примере не относящийся к человеку организм представляет собой сорняк, и молекула РНК оказывает вредное воздействие на биосинтез аминокислот, фотосинтез, синтез жирных кислот, целостность клеточной мембраны, синтез пигментов или рост.

При использовании в настоящем документе фраза "молекула РНК оказывает благоприятное воздействие по меньшей мере на один симптом заболевания" или подобные фразы означают, что РНК-мишень молекулы присутствует у субъекта, и контакт клеток, экспрессирующих РНК-мишень, с молекулой РНК приводит к снижению уровня и/или активности РНК-мишени по сравнению с теми же клетками, в которых отсутствует молекула РНК. В одном варианте осуществления РНК-мишень кодирует белок, который играет роль при наличии заболевания. В одном варианте осуществления заболевание является раком или онкологическим заболеванием, инфекционным заболеванием, сердечно-сосудистым заболеванием, неврологическим заболеванием, прионным заболеванием, воспалительным заболеванием, аутоиммунным заболеванием, заболеванием легких, заболеванием почек, заболеванием печени, митохондриальным заболеванием, эндокринными заболеваниями, заболеваниями и состояниями, связанными с репродукцией, и любыми другими показаниями, которые могут реагировать на уровень экспрессируемого продукта гена в клетке или организме.

Молекулы РНК согласно настоящему изобретению и композиции, включающие их, могут вводить субъекту. Такие термины, как "субъект", "пациент" или "индивид" являются терминами, которые в некотором контексте могут использоваться попеременно в настоящем описании. В примере субъект является млекопитающим. Млекопитающее может быть домашним животным, таким как собака или кошка, или сельскохозяйственным животным, таким как лошадь или корова. В одном примере субъектом является человек. Например, субъект может быть взрослым. В другом примере субъект может быть ребенком. В другом примере субъект может быть подростком. В другом примере молекулы РНК согласно настоящему изобретению и композиции, включающих их, могут вводить насекомому. В другом примере молекулы РНК согласно настоящему изобретению и композиции, включающих их, могут вводить в растение. В другом примере молекулы РНК согласно настоящему изобретению и композиции, включающих их, могут вводить в клетке гриба или популяцию.

При использовании в настоящем документе "устойчивый" или его вариации являются относительными терминами в том смысле, что присутствие молекулы РНК повышает устойчивость, например, снижает воспроизводство вредителя или патогена или снижает уровень повреждения организма.

При использовании в настоящем документе термин "неродственный по последовательности мишени" относится к молекулам, обладающим меньше чем 50% идентичностью на протяжении полной длины промежуточной последовательности РНК. С другой стороны, термин "родственный по последовательности мишени" относится к молекулам, обладающим 50% или большей идентичностью на протяжении полной длины промежуточной последовательности РНК.

Термин "и/или", например, "X и/или Y", следует понимать как означающий "X и Y" или "X или Y", при этом он должен использоваться в рамках прямой поддержки обоих значений или одного из значений.

При использовании в настоящем документе термин приблизительно, если не указано обратное, относится к +/-20%, более предпочтительно +/-10% от указанного значения.

В тексте настоящего описания слово "включают" или его вариации, такие как "включает" или "включающий", предусматривают включение указанного элемента, целого числа или этапа или группы элементов, целых чисел или этапов, но не исключение какого-либо другого элемента, целого числа или этапа или группы элементов, целых чисел или этапов.

Неканоническое спаривание оснований

В одном варианте осуществления молекулы РНК согласно настоящему изобретению содержат смысловую рибонуклеотидную последовательность и антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, которые способны гибридизоваться друг с другом с образованием двухцепочечной области (дц)РНК с некоторым неканоническим спариванием оснований, то есть с комбинацией канонического и неканонического спаривания оснований. В одном варианте осуществления молекулы РНК согласно настоящему изобретению содержат две или более смысловых рибонуклеотидных последовательностей, каждая из которых способна гибридизоваться с областями одной (непрерывной) антисмысловой рибонуклеотидной последовательности с образованием области дцРНК с некоторым неканоническим спариванием оснований. См., например, Фигуру 1B. В одном варианте осуществления молекулы РНК согласно настоящему изобретению содержат две или более антисмысловых смысловых рибонуклеотидных последовательностей, каждая из которых способна гибридизоваться с областями одной (непрерывной) смысловой рибонуклеотидной последовательности с образованием области дцРНК с некоторым неканоническим спариванием оснований. См., например, Фигуру 1А. В одном варианте осуществления молекулы РНК согласно настоящему изобретению содержат две или более антисмысловых смысловых рибонуклеотидных последовательностей и две или более смысловых рибонуклеотидных последовательностей, где каждая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность способна гибридизоваться с антисмысловой рибонуклеотидной последовательностью с образованием двух или более областей дцРНК, одна или обе из которых включают некоторое неканоническое спаривание оснований.

В следующих вариантах осуществления полноразмерная область дцРНК (т.е. полная область дцРНК) молекулы РНК согласно изобретению рассматривают как контекст для особенности, если присутствует только одна (непрерывная) область дцРНК, или для каждой из областей дцРНК молекулы РНК, если в молекуле РНК присутствуют две или более областей дцРНК. В варианте осуществления по меньшей мере 5% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления по меньшей мере 6% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления по меньшей мере 7% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления по меньшей мере 8% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления по меньшей мере 9% или 10% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления по меньшей мере 11% или 12% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления по меньшей мере 15% или приблизительно 15% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления по меньшей мере 20% или приблизительно 20% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления по меньшей мере 25% или приблизительно 25% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления по меньшей мере 30% или приблизительно 30% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В каждом из этих вариантов осуществления предпочтительно, что максимум 40% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, более предпочтительно максимум 35% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, еще более предпочтительно максимум 30% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления, менее предпочтительном, приблизительно 35% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления, даже менее предпочтительном, приблизительно 40% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В каждом из вышеуказанных вариантов осуществления область дцРНК может включать или может не включать один или более неспаренных рибонуклеотидов в смысловой последовательности или в антисмысловой последовательности, или в обеих.

В варианте осуществления от 10% до 40% пар оснований в области дцРНК молекулы РНК согласно изобретению неканонические пары оснований. В варианте осуществления от 10% до 35% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления от 10% до 30% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления от 10% до 25% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления от 10% до 20% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления от 10% до 15% пар оснований в области дцРНК неканонические пары оснований. В варианте осуществления от 15% до 30% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления от 15% до 25% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления от 15% до 20% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления от 5% до 30% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления от 5% до 25% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления от 5% до 20% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления от 5% до 15% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления от 5% до 10% пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. В каждом из вышеуказанных вариантов осуществления область дцРНК может включать или может не включать один или более неспаренных рибонуклеотидов в смысловой последовательности или в антисмысловой последовательности, или в обеих.

В варианте осуществления область дцРНК молекулы РНК согласно изобретению включает 20 последовательных пар оснований, где по меньшей мере одна пара оснований из 20 последовательных пар оснований является неканонической парой оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 20 последовательных пар оснований, где по меньшей мере 2 пары оснований из 20 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 20 последовательных пар оснований, где по меньшей мере 3 пары оснований из 20 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 20 последовательных пар оснований, где по меньшей мере 4 пары оснований из 20 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 20 последовательных пар оснований, где по меньшей мере 5 пар оснований из 20 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 20 последовательных пар оснований, где по меньшей мере 6 пар оснований из 20 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 20 последовательных пар оснований, где по меньшей мере 7 пар оснований из 20 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 20 последовательных пар оснований, где по меньшей мере 8 пар оснований из 20 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 20 последовательных пар оснований, где по меньшей мере 9 пар оснований из 20 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В каждом из этих вариантов осуществления предпочтительно, что максимум 10 из 20 последовательных пар оснований в области дцРНК является неканоническими парами оснований, более предпочтительно максимум 9 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, еще более предпочтительно максимум 8 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, даже еще более предпочтительно максимум 7 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, и наиболее предпочтительно максимум 6 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. Предпочтительно в вышеуказанных вариантах осуществления неканонические пары оснований включают по меньшей мере одну пару оснований G:U, более предпочтительно все неканонические пары оснований являются парами оснований G:U. Предпочтительно признаки вышеуказанных вариантов осуществления относятся ко всем из 20 последовательных пар оснований, присутствующих в молекуле РНК согласно изобретению.

В варианте осуществления область дцРНК молекулы РНК изобретения включает 21 последовательную пару оснований, где по меньшей мере одна пара оснований из 21 последовательной пары оснований является неканонической парой оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 21 последовательную пару оснований, где по меньшей мере 2 пары оснований из 21 последовательной пары оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 21 последовательную пару оснований, где по меньшей мере 3 пары оснований из 21 последовательной пары оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 21 последовательную пару оснований, где по меньшей мере 4 пары оснований из 21 последовательной пары оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 21 последовательную пару оснований, где по меньшей мере 5 пар оснований из 21 последовательной пары оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 21 последовательную пару оснований, где по меньшей мере 6 пар оснований из 21 последовательной пары оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 21 последовательную пару оснований, где по меньшей мере 7 пар оснований из 21 последовательной пары оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 21 последовательную пару оснований, где по меньшей мере 8 пар оснований из 21 последовательной пары оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 21 последовательную пару оснований, где по меньшей мере 9 пар оснований из 21 последовательной пары оснований являются неканоническими парами оснований. В каждом из этих вариантов осуществления предпочтительно, что максимум 10 из 21 последовательной пары оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, более предпочтительно максимум 9 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, еще более предпочтительно максимум 8 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, даже еще более предпочтительно максимум 7 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, и наиболее предпочтительно максимум 6 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. Предпочтительно в вышеуказанных вариантах осуществления неканонические пары оснований включают по меньшей мере одну пару оснований G:U, более предпочтительно все неканонические пары оснований являются парами оснований G:U. Предпочтительно признаки вышеуказанных вариантов осуществления относятся ко всем из 21 последовательной пары оснований, присутствующих в молекуле РНК согласно изобретению.

В варианте осуществления область дцРНК молекулы РНК согласно изобретению включает 22 последовательных пары оснований, где по меньшей мере одна пара оснований из 22 последовательных пар оснований является неканонической парой оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 22 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 2 пары оснований из 22 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 22 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 3 пары оснований из 22 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 22 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 4 пары оснований из 22 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 22 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 5 пар оснований из 22 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 22 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 6 пар оснований из 22 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 22 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 7 пар оснований из 22 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 22 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 8 пар оснований из 22 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 22 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 9 пар оснований из 22 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В каждом из этих вариантов осуществления предпочтительно, что максимум 10 из 22 последовательных пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, более предпочтительно максимум 9 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, еще более предпочтительно максимум 8 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, даже еще более предпочтительно максимум 7 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, и наиболее предпочтительно максимум 6 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. Предпочтительно в вышеуказанных вариантах осуществления неканонические пары оснований включают по меньшей мере одну пару оснований G:U, более предпочтительно все неканонические пары оснований являются парами оснований G:U. Предпочтительно признаки вышеуказанных вариантов осуществления относятся ко всем из 22 последовательных пар оснований, присутствующих в молекуле РНК согласно изобретению.

В варианте осуществления область дцРНК молекулы РНК согласно изобретению включает 23 последовательных пары оснований, где по меньшей мере одна пара оснований из 23 последовательных пар оснований является неканонической парой оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 23 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 2 пары оснований из 23 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 23 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 3 пары оснований из 23 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 23 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 4 пары оснований из 23 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 23 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 5 пар оснований из 23 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 23 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 6 пар оснований из 23 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 23 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 7 пар оснований из 23 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 23 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 8 пар оснований из 23 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 23 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 9 пар оснований из 23 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В каждом из этих вариантов осуществления предпочтительно, что максимум 10 из 23 последовательных пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, более предпочтительно максимум 9 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, еще более предпочтительно максимум 8 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, даже еще более предпочтительно максимум 7 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, и наиболее предпочтительно максимум 6 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. Предпочтительно в вышеуказанных вариантах осуществления неканонические пары оснований включают по меньшей мере одну пару оснований G:U, более предпочтительно все неканонические пары оснований являются парами оснований G:U. Предпочтительно признаки вышеуказанных вариантов осуществления относятся ко всем из 23 последовательных пар оснований, присутствующих в молекуле РНК согласно изобретению.

В варианте осуществления область дцРНК молекулы РНК согласно изобретению включает 24 последовательных пары оснований, где по меньшей мере одна пара оснований из 24 последовательных пар оснований является неканонической парой оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 24 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 2 пары оснований из 24 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 24 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 3 пары оснований из 24 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 24 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 4 пары оснований из 24 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 24 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 5 пар оснований из 24 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 24 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 6 пар оснований из 24 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 24 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 7 пар оснований из 24 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 24 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 8 пар оснований из 24 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 24 последовательных пары оснований, где по меньшей мере 9 пар оснований из 24 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В каждом из этих вариантов осуществления предпочтительно, что максимум 10 из 24 последовательных пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, более предпочтительно максимум 9 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, еще более предпочтительно максимум 8 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, даже еще более предпочтительно максимум 7 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований, и наиболее предпочтительно максимум 6 из пар оснований в области дцРНК являются неканоническими парами оснований. Предпочтительно в вышеуказанных вариантах осуществления неканонические пары оснований включают по меньшей мере одну пару оснований G:U, более предпочтительно все неканонические пары оснований являются парами оснований G:U. Предпочтительно признаки вышеуказанных вариантов осуществления относятся ко всем из 24 последовательных пар оснований, присутствующих в молекуле РНК согласно изобретению.

В следующих вариантах осуществления полноразмерная область дцРНК (т.е. полная область дцРНК) молекулы РНК согласно изобретению рассматривается как контекст для признака, если присутствует только одна (непрерывная) область дцРНК, или для каждой из областей дцРНК молекулы РНК, если в молекуле РНК присутствуют две или более областей дцРНК. В варианте осуществления область дцРНК не включает 20 последовательных канонических пар оснований, т.е. каждая субобласть из 20 последовательных пар оснований включает по меньшей мере одну неканоническую пару оснований, предпочтительно по меньшей мере одну пару оснований G:U. В варианте осуществления область дцРНК не включает 19 последовательных канонических пар оснований. В варианте осуществления область дцРНК не включает 18 последовательных канонических пар оснований. В варианте осуществления область дцРНК не включает 17 последовательных канонических пар оснований. В варианте осуществления область дцРНК не включает 16 последовательных канонических пар оснований. В варианте осуществления область дцРНК не включает 15 последовательных канонических пар оснований. В варианте осуществления область дцРНК не включает 14 последовательных канонических пар оснований. В варианте осуществления область дцРНК не включает 13 последовательных канонических пар оснований. В варианте осуществления область дцРНК не включает 12 последовательных канонических пар оснований. В варианте осуществления область дцРНК не включает 11 последовательных канонических пар оснований. В варианте осуществления область дцРНК не включает 10 последовательных канонических пар оснований. В варианте осуществления область дцРНК не включает 9 последовательных канонических пар оснований. В варианте осуществления область дцРНК не включает 8 последовательных канонических пар оснований. В варианте осуществления область дцРНК не включает 7 последовательных канонических пар оснований. В вышеуказанных вариантах осуществления предпочтительно, что наиболее протяженная непрерывная субобласть канонических спаренных оснований в области дцРНК молекулы РНК или каждой области дцРНК в молекуле РНК содержит 5, 6 или 7 последовательных канонических пар оснований, т.е. в направлении более коротких указанных длин. Каждый из признаков вышеуказанных вариантов осуществления предпочтительно объединен в молекуле РНК со следующими признаками. В варианте осуществления область дцРНК включает от 10 до 19 или 20 последовательных пар оснований. В предпочтительном варианте осуществления область дцРНК включает от 12 до 19 или 20 последовательных пар оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает от 14 до 19 или 20 последовательных пар оснований. В этих вариантах осуществления область дцРНК включает 15 последовательных пар оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 16, 17, 18 или 19 последовательных пар оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 20 последовательных пар оснований. Предпочтительно в вышеуказанных вариантах осуществления последовательные пары оснований включают по меньшей мере одну неканоническую пару оснований, включающую по меньшей мере одну пару оснований G:U, более предпочтительно все неканонические пары оснований в области последовательных пар оснований являются парами оснований G:U.

В варианте осуществления область дцРНК включает субобласть из 4 канонических пар оснований между неканоническими парами оснований, т.е. по меньшей мере одна, предпочтительно одна или две (не больше 2) неканонические пары оснований примыкают к каждому концу 4 канонических пар оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 2 субобласти, по 4 канонических пары оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 3 субобласти, по 4 канонических пары оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 4 или 5 субобластей, по 4 канонических пары оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 6 или 7 субобластей, по 4 канонических пары оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 8-10 субобластей, по 4 канонических пары оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 11-15 субобластей, по 4 канонических пары оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает от 2 до 50 субобластей, по 4 канонических пары оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает от 2 до 40 субобластей, по 4 канонических пары оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает от 2 до 30 субобластей, по 4 канонических пары оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает от 2 до 20 субобластей, по 4 канонических пары оснований каждая, между неканоническими парами оснований. Предпочтительно в вышеуказанных вариантах осуществления неканонические пары оснований включают по меньшей мере одну пару оснований G:U, более предпочтительно все неканонические пары оснований, примыкающие к последовательным каноническим парам оснований в субобластях, являются парами оснований G:U. В вариациях вышеуказанных вариантов осуществления одна или обе фланкирующих неканонических пар оснований заменены неспаренным рибонуклеотидом в смысловой последовательности, антисмысловой последовательности или в обеих последовательностях, в некоторых или всех субобластях. Должно быть очевидным, что в вышеуказанных вариантах осуществления максимальное количество субобластей определяется длиной области дцРНК в молекуле РНК.

В варианте осуществления область дцРНК включает субобласть из 5 канонических пар оснований между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 2 субобласти, по 5 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 3 субобласти, по 5 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 4 или 5 субобластей, по 5 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 6 или 7 субобластей, по 5 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 8-10 субобластей, по 5 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 11-15 субобластей, по 5 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает от 2 до 50 субобластей, по 5 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает от 2 до 50 субобластей, по 5 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает от 2 до 30 субобластей, по 5 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает от 2 до 20 субобластей, по 5 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. Предпочтительно в вышеуказанных вариантах осуществления неканонические пары оснований включают по меньшей мере одну пару оснований G:U, более предпочтительно все неканонические пары оснований, примыкающие к смежным каноническим парам оснований в субобластях, являются парами оснований G:U. В вариациях вышеуказанных вариантов осуществления одна или обе фланкирующих неканонических пары оснований заменены неспаренным рибонуклеотидом в смысловой последовательности, антисмысловой последовательности или в обеих последовательностях, в некоторых или всех субобластях. Должно быть очевидным, что в вышеуказанных вариантах осуществления максимальное количество субобластей определяется длиной области дцРНК в молекуле РНК.

В варианте осуществления область дцРНК включает субобласть из 6 канонических пар оснований между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 2 субобласти, по 6 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 3 субобласти, по 6 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 4 или 5 субобластей, по 6 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 6 или 7 субобластей, по 6 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 8-10 субобластей, по 6 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 11-16 субобластей, по 6 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает от 2 до 60 субобластей, по 6 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает от 2 до 60 субобластей, по 6 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает от 2 до 30 субобластей, по 6 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает от 2 до 20 субобластей, по 6 канонических пар оснований каждая, между неканоническими парами оснований. Предпочтительно в вышеуказанных вариантах осуществления неканонические пары оснований включают по меньшей мере одну пару оснований G:U, более предпочтительно все неканонические пары оснований, примыкающие к смежным каноническим парам оснований в субобластях, являются парами оснований G:U. В вариациях вышеуказанных вариантов осуществления одна или обе фланкирующих неканонических пары оснований заменены неспаренным рибонуклеотидом в смысловой последовательности, антисмысловой последовательности или в обеих последовательностях, в некоторых или всех субобластях. Должно быть очевидным, что в вышеуказанных вариантах осуществления максимальное количество субобластей определяется длиной области дцРНК в молекуле РНК.

В варианте осуществления область дцРНК включает субобласть из 10 последовательных пар оснований, где 2-4 из пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 2 субобласти, по 10 последовательных пар оснований каждая, где 2-4 из 10 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 3 субобласти, по 10 последовательных пар оснований каждая, где 2-4 из 10 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 4 субобласти, по 10 последовательных пар оснований каждая, где 2-4 из 10 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 5 субобластей, по 10 последовательных пар оснований каждая, где 2-4 из 10 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 10 субобластей, по 10 последовательных пар оснований каждая, где 2-4 из 10 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает 4 субобласти, по 15 последовательных пар оснований каждая, где 2-6 из 15 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает от 2 до 50 субобластей, по 10 последовательных пар оснований каждая, где 2-4 из 10 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает от 2 до 40 субобластей, по 10 последовательных пар оснований каждая, где 2-4 из 10 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает от 2 до 30 субобластей, по 10 последовательных пар оснований каждая, где 2-4 из 10 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В варианте осуществления область дцРНК включает от 2 до 20 субобластей, по 10 последовательных пар оснований каждая, где 2-4 из 10 последовательных пар оснований являются неканоническими парами оснований. В одном из вариантов осуществления неканонические пары оснований в одной (непрерывной) или более, или во всех областях дцРНК молекулы РНК не граничат с неканонической парой оснований. В другом варианте осуществления неканонические пары оснований отделены по меньшей мере 2 смежными парами оснований от некомплементарной пары оснований. В другом варианте осуществления неканонические пары оснований отделены по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более смежными парами оснований от некомплементарной пары оснований. В одном из вариантов осуществления неканонические пары оснований в одной (непрерывной) или более, или во всех областях дцРНК молекулы РНК не граничат с последовательностью петли. В другом варианте осуществления неканонические пары оснований отделены по меньшей мере 2 смежными парами оснований от последовательности петли. В другом варианте осуществления неканонические пары оснований отделены по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более смежными парами оснований от последовательности петли. Предпочтительно в вышеуказанных вариантах осуществления неканонические пары оснований включают по меньшей мере одну пару оснований G:U, более предпочтительно все неканонические пары оснований в субобластях являются парами оснований G:U. В вариациях вышеуказанных вариантов осуществления одна или более из 2-4 или 2-6 неканонических пар оснований заменены неспаренным рибонуклеотидом в смысловой последовательности, антисмысловой последовательности или в обеих последовательностях, в некоторых или всех субобластях. Должно быть очевидным, что в вышеуказанных вариантах осуществления максимальное количество субобластей определяется длиной области дцРНК в молекуле РНК.

В варианте осуществления отношение канонических к неканоническим парам оснований в области дцРНК составляет от 2,5:1 до 3,5:1, например, приблизительно 3:1. В варианте осуществления отношение канонических к неканоническим парам оснований в области дцРНК составляет от 3,5:1 до 4.5:1, например, приблизительно 4:1. В варианте осуществления отношение канонических к неканоническим парам оснований в области дцРНК составляет от 4,5:1 до 5,5:1, например, приблизительно 5:1. В варианте осуществления отношение канонических к неканоническим парам оснований в области дцРНК составляет от 5,5:1 до 6,5:1, например, приблизительно 6:1. Различные области дцРНК в молекуле РНК могут иметь разные соотношения.

В вышеуказанных вариантах осуществления неканонические пары оснований в области(ях) дцРНК молекулы РНК предпочтительно все являются парами оснований G:U. В варианте осуществления по меньшей мере 99% неканонических пар оснований являются парами оснований G:U. В варианте осуществления по меньшей мере 98% неканонических пар оснований являются парами оснований G:U. В варианте осуществления по меньшей мере 97% неканонических пар оснований являются парами оснований G:U. В варианте осуществления по меньшей мере 95% неканонических пар оснований являются парами оснований G:U. В варианте осуществления по меньшей мере 90% неканонических пар оснований являются парами оснований G:U. В варианте осуществления 90-95% неканонических пар оснований являются парами оснований G:U. Например, в случае присутствия 10 неканонических пар оснований, по меньшей мере 9 (90%) являются парами оснований G:U.

В другом варианте от 3% до 50% неканонических пар оснований являются парами оснований G:U. В другом варианте от 5% до 30% неканонических пар оснований являются парами оснований G:U. В другом варианте от 10% до 30% неканонических пар оснований являются парами оснований G:U. В другом варианте от 15% до 20% неканонических пар оснований являются парами оснований G:U.

В примере представленных выше вариантов осуществления присутствует по меньшей мере 3 пары оснований G:U в одной (непрерывной) или более, или во всех областях дцРНК молекулы РНК. В другом примере присутствует по меньшей мере 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 пар оснований G:U. В другом примере присутствует по меньшей мере от 3 до 10 пар оснований G:U. В другом примере присутствует по меньшей мере от 5 до 10 пар оснований G:U.

Область дцРНК, включающая неканоническое спаренное основание(я), включает антисмысловую последовательность из 20 последовательных нуклеотидов, которая действует как антисмысловой регуляторный элемент. В варианте осуществления антисмысловой регуляторный элемент по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% или наиболее предпочтительно на 100% комплементарен молекуле РНК-мишени в эукариотической клетке. В варианте осуществления область дцРНК включает 2, 3, 4 или 5 антисмысловых регуляторных элементов, которые либо комплементарны одной и той же молекуле РНК-мишени (т.е. различным областям одной молекулы РНК-мишени), либо комплементарны разным молекулам РНК-мишеней.

В варианте осуществления один или более рибонуклеотидов смысловой рибонуклеотидной последовательности и/или один или более рибонуклеотидов антисмысловой рибонуклеотидной последовательности не спарены в области дцРНК, когда смысловая и антисмысловая последовательности гибридизуются. В этом варианте осуществления область дцРНК не включает последовательность петли, которая ковалентно соединяет смысловую и антисмысловую последовательности. Один или более рибонуклеотидов области дцРНК или субобласти могут быть не спарены. Таким образом, в этом варианте осуществления смысловая цепь области дцРНК не спаривается полностью со своей соответствующей антисмысловой цепью.

В одном варианте осуществления химерная молекула РНК не содержит неканонической пары оснований в основании петли молекулы. В другом варианте осуществления одна, две, три, четыре, пять или более, или все неканонические пары оснований фланкированы каноническими парами оснований.

В одном из вариантов осуществления химерная молекула РНК включает по меньшей мере один сайт расщепления растительной рибонуклеазы DCL-1.

В одном из вариантов осуществления молекула РНК-мишени не является молекулой вирусной РНК.

В одном варианте осуществления молекула РНК-мишени не является молекулой РНК южноафриканского вируса мозаики маниока.

В одном из вариантов осуществления молекула химерной РНК включает по меньшей мере одну пару неспаренных оснований или участок неспаренных оснований, фланкированный каноническими парами оснований, неканоническими парами оснований или канонической парой оснований и неканонической парой оснований. Например, это может быть выпетливание, как описано в настоящем документе.

В одном из вариантов осуществления молекула химерной РНК не включает двухцепочечную область, содержащую больше чем 11 канонических пар оснований.

Кроме того, в варианте осуществления и, необязательно, в комбинации с любым из признаков вышеуказанных вариантов осуществления общее количество рибонуклеотидов в смысловой последовательности(ях) и общее количество рибонуклеотидов в антисмысловой последовательности(ях) могут не быть идентичными, несмотря на то, что предпочтительно они идентичны. В варианте осуществления общее количество рибонуклеотидов в смысловой рибонуклеотидной последовательности(ях) области дцРНК составляет от 90% до 110% от общего количества рибонуклеотидов в антисмысловой рибонуклеотидной последовательности(ях). В варианте осуществления общее количество рибонуклеотидов в смысловой рибонуклеотидной последовательности(ях) составляет от 95% до 105% от общего количества рибонуклеотидов в антисмысловой рибонуклеотидной последовательности(ях). В варианте осуществления химерные молекулы РНК согласно настоящему изобретению могут включать один или более структурных элементов, таких как внутренние или концевые выпетливания или петли. Различные варианты осуществления выпетливаний и петель обсуждаются выше. В варианте осуществления области дцРНК отделены структурным элементом, таким как выпетливание или петля. В варианте осуществления, области дцРНК отделены промежуточной (спейсерной) последовательностью. Некоторые рибонуклеотиды спейсерной последовательности могут быть спарены с другими рибонуклеотидами в молекуле РНК, например, с другими рибонуклеотидами в спейсерной последовательности, или они могут быть не спарены в молекуле РНК или в некоторой части каждого. В варианте осуществления области дцРНК соединены с концевой петлей. В варианте осуществления области дцРНК фланкированы концевыми петлями.

В варианте осуществления, где область дцРНК молекулы РНК согласно изобретению содержит по меньшей мере 3 неканонических пары оснований в любой субобласти из 5 последовательных пар оснований, неканонические пары оснований не являются смежными, но отделены одной или более каноническими парами оснований, т.е. область дцРНК не содержит 3 или более последовательных неканонических пар оснований. В варианте осуществления область дцРНК не содержит 4 или более последовательных неканонических пар оснований. Например, в варианте осуществления область дцРНК включает по меньшей мере 3 неканонических пары оснований в субобласти из 10 пар оснований, где каждая неканоническая пара оснований отделена 4 каноническими парами оснований.

В варианте осуществления молекула РНК согласно изобретению включает больше одной области дцРНК. Например, молекула РНК включает 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше областей дцРНК. В этом примере одна или больше областей, или все области дцРНК могут включать представленные выше свойства, такие как неканоническое спаривание оснований и/или количество антисмысловых регуляторных элементов.

Сайленсирующая активность

Сайленсирующая активность

Молекулы РНК согласно настоящему изобретению обладают антисмысловой активностью, так как они содержат смысловую рибонуклеотидную последовательность, которая по существу комплементарна области молекулы РНК-мишени. Например, рибонуклеотидная последовательность по существу комплементарна области молекулы РНК-мишени в эукариотической клетке. В одном примере молекула РНК-мишени может находиться в клетке бактерии, клетке гриба, клетке растения, клетке насекомого или клетке животного. Такие компоненты молекул РНК, определенные в настоящем документе, могут именоваться "антисмысловым регуляторным элементом". "По существу комплементарный" означает, что смысловая рибонуклеотидная последовательность может иметь вставки, делеции и отдельные точечные мутации по сравнению с комплементом молекулы РНК-мишени в эукариотической клетке. Предпочтительно гомология между смысловой рибонуклеотидной последовательностью с антисмысловой активностью и молекулой РНК-мишени составляет по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно 100%. Например, смысловая рибонуклеотидная последовательность может включать приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19 или больше последовательных нуклеотидов, которые идентичны по последовательности первой области молекулы РНК-мишени в эукариотической клетке. В другом примере смысловая рибонуклеотидная последовательность может включать приблизительно 20 последовательных нуклеотидов, которые идентичны по последовательности первой области молекулы РНК-мишени в эукариотической клетке.

"Антисмысловая активность" используется в рамках настоящего описания для обозначения антисмыслового регуляторного элемента из молекулы РНК, определенной в настоящем документе, который модулирует (увеличивает или уменьшает) экспрессию молекулы РНК-мишени.

В различных примерах антисмысловые регуляторные элементы согласно настоящему изобретению могут включать множество мономерных субъединиц, соединенных вместе соединительными группами. Примеры включают праймеры, зонды, антисмысловые соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды с внешней направляющей последовательностью (EGS), альтернативные сплайсеры, гапмеры, миРНК и микроРНК. В таком качестве молекулы РНК согласно настоящему раскрытию могут содержать антисмысловые регуляторные элементы с одноцепочечными, двухцепочечными, кольцевыми, разветвленными или шпилечными структурами. В одном примере антисмысловая последовательность может содержать структурные элементы, такие как внутренние или концевые выпетливания или петли.

В примере молекулы РНК согласно настоящему изобретению включают химерные олигомерные компоненты, такие как химерные олигонуклеотиды. Например, молекула РНК может включать различные модифицированные нуклеотиды, антисмысловые олигонуклеотиды со смешанным скелетом или их комбинацию. В примере химерные олигомерные соединения могут включать по меньшей мере одну область, модифицированную с обеспечением повышенной устойчивости к расщеплению нуклеазами, повышенного клеточного захвата и/или повышенной аффинности связывания с молекулой РНК-мишени.

Антисмысловые регуляторные элементы могут иметь различную длину. В различных примерах настоящего изобретения предложены антисмысловые регуляторные элементы, состоящие из X-Y связанных оснований, где каждый X и Y независимо выбран из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 и 50 (при условии, что X<Y). Например, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложены антисмысловые регуляторные элементы, включающие: 8-9, 8-10, 8-11, 8-12, 8-13, 8-14, 8-15, 8-16, 8-17, 8-18, 8-19, 8-20, 8-21, 8-22, 8-23, 8-24, 8-25, 8-26, 8-27, 8-28, 8-29, 8-30, 9-10, 9-11, 9-12, 9-13, 9-14, 9-15, 9-16, 9-17, 9-18, 9-19, 9-20, 9-21, 9-22, 9-23, 9-24, 9-25, 9-26, 9-27, 9-28, 9-29, 9-30, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, 10-16, 10-17, 10-18, 10-19, 10-20, 10-21, 10-22, 10-23, 10-24, 10-25, 10-26, 10-27, 10-28, 10-29, 10-30, 11-12, 11-13, 11-14, 11-15, 11-16, 11-17, 11-18, 11-19, 11-20, 11-21, 11-22, 11-23, 11-24, 11-25, 11-26, 11-27, 11-28, 11-29, 11-30, 12-13, 12-14, 12-15, 12-16, 12-17, 12-18, 12-19, 12-20, 12-21, 12-22, 12-23, 12-24, 12-25, 12-26, 12-27, 12-28, 12-29, 12-30, 13-14, 13-15, 13-16, 13-17, 13-18, 13-19, 13-20, 13-21, 13-22, 13-23, 13-24, 13-25, 13-26, 13-27, 13-28, 13-29, 13-30, 14-15, 14-16, 14-17, 14-18, 14-19, 14-20, 14-21, 14-22, 14-23, 14-24, 14-25, 14-26, 14-27, 14-28, 14-29, 14-30, 15-16, 15-17, 15-18, 15-19, 15-20, 15-21, 15-22, 15-23, 15-24, 15-25, 15-26, 15-27, 15-28, 15-29, 15-30, 16-17, 16-18, 16-19, 16-20, 16-21, 16-22, 16-23, 16-24, 16-25, 16-26, 16-27, 16-28, 16-29, 16-30, 17-18, 17-19, 17-20, 17-21, 17-22, 17-23, 17-24, 17-25, 17-26, 17-27, 17-28, 17-29, 17-30, 18-19, 18-20, 18-21, 18-22, 18-23, 18-24, 18-25, 18-26, 18-27, 18-28, 18-29, 18-30, 19-20, 19-21, 19-22, 19-23, 19-24, 19-25, 19-26, 19-29, 19-28, 19-29, 19-30, 20-21, 20-22, 20-23, 20-24, 20-25, 20-26, 20-27, 20-28, 20-29, 20-30, 21-22, 21-23, 21-24, 21-25, 21-26, 21-27, 21-28, 21-29, 21-30, 22-23, 22-24, 22-25, 22-26, 22-27, 22-28, 22-29, 22-30, 23-24, 23-25, 23-26, 23-27, 23-28, 23-29, 23-30, 24-25, 24-26, 24-27, 24-28, 24-29, 24-30, 25-26, 25-27, 25-28, 25-29, 25-30, 26-27, 26-28, 26-29, 26-30, 27-28, 27-29, 27-30, 28-29, 28-30 или 29-30 связанных оснований.

Молекулы РНК согласно настоящему изобретению могут включать множество антисмысловых регуляторных элементов. Например, молекулы РНК могут включать по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10 антисмысловых регуляторных элементов. В примере антисмысловые регуляторные элементы являются одинаковыми. В этом примере молекула РНК может включать по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10 копий антисмыслового регулирующего элемента. В другом примере молекулы РНК согласно настоящему изобретению могут включать разные антисмысловые регуляторные элементы. Например, антисмысловые регуляторные элементы могут быть предоставлены для направленного воздействия на множество генов в метаболическом пути, таком как биосинтез липидов. В этом примере молекула РНК может включать по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10 разных антисмысловых регуляторных элементов.

Антисмысловые регуляторные элементы согласно настоящему изобретению могут модулировать (увеличивать или уменьшать) экспрессию или количество различных молекул РНК-мишеней. В примере молекула РНК-мишени является геном биосинтеза жирной кислоты. Примеры таких генов включают ген, кодирующий ацетилтрансацилазы, ацилпереносящие белки ("белок-переносчик ацила"), десатуразы, такие как стеарилдесатуразы или микросомальные D12-десатуразы, в частности гены Fad2-1, малонилтрансацилазу, -кетоацил-ACP-синтетазы, 3- кето-ACP-редуктазы, еноил-ACP-гидразы, тиоэстеразы, такие как ацил-ACP-тиоэстеразы, еноил-ACP-редуктазы. В одном примере молекулой РНК-мишени является ген FAD2 (например, который описан в Genbank под рег. номерами AF124360 (Brassica carinata), AF042841 (Brassica rapa), L26296 (Arabidopsis thaliana), A65102 (Corylus avellana)). Например, молекулой РНК-мишени может быть ген FAD2.1. В другом примере молекулой РНК-мишени может быть ген FAD2.2. В другом примере молекулой РНК-мишени могут быть гены FAD2.1 и FAD2.2. Примеры других генов, участвующих в модификации липидного состава, которые могут быть молекулой РНК-мишени, известны в уровне техники (см., например, Shure et al., 1983; Preiss et al., 1987; Gupta et al., 1988; Olive et al., 1989; Bhattacharyya et al., 1990; Dunwell, 2000; Brar et al., 1996; Kishore and Somerville, 1993; US 5,530,192 и WO 94/18337).

В другом примере молекулой РНК-мишени является ген членистоногого, такой как транскрипт гена насекомого. Примеры таких генов включают гены хитинсинтазы, такие как CHS1 и/или CHS2, или другие гены, регулирующие активность, поведение, воспроизводство, рост и/или развитие насекомого. Различные важные гены множества патогенов известны специалистам в данной области (например, гены устойчивости к нематодам приведены в WO 93/10251, WO 94/17194).

В другом примере молекула РНК-мишени ассоциирована с заболеванием. Например, молекула РНК-мишени может быть транскриптом онкогена или гена-супрессора опухоли. Примеры онкогенов включают ABL1, BCL1, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSF1R, ERBA, ERBB, EBRB2, FGR, FOS, FYN, HRAS, JUN, LCK, LYN, MYB, MYC, NRAS, RET или SRC. Примеры генов-супрессоров опухоли включают BRCA1 или BRCA2; молекулы адгезии; циклинзависимые киназы и их ингибиторы.

В другом примере молекула РНК-мишени связана с задержкой созревания плода растения. Задержка созревания плода растения может быть достигнута, например, путем снижения экспрессии генов, выбранных из группы, состоящей из полигалактуроназ, пектинэстераз, β-(1-4)глюканаз (целлюлаз), β-галактаназ (β-галактозидаз) или генов биосинтеза этилена, таких как 1-аминоциклопропан-1-карбоксилатсинтаза, гены биосинтеза каротиноидов, такие как, например, гены биосинтеза префитоена или фитоена, например фитоендесатуразы.

В другом примере молекула РНК-мишени связана с задержкой симптомов старения. Подходящие молекулы РНК-мишеней включают циннамоил-КоА:НАДФН-редуктазы или циннамоил-алкогольдегидрогеназу. Другие молекулы РНК-мишеней описаны (в WO 1995/07993).

В другом примере молекула РНК-мишени связана с модификацией содержания волокна в продуктах питания, предпочтительно в семенах. Например, молекула РНК может снижать экспрессию O-метилтрансферазы кофейной кислоты или циннамоил-алкогольдегидрогеназы.

Молекула кпРНК

В некоторых вариантах осуществления молекулы РНК согласно настоящему изобретению включают первый РНК-компонент, ковалентно связанный со вторым РНК-компонентом. В предпочтительных вариантах осуществления молекула РНК самогибридизуется или сворачивается, формируя "гантелю" или структуру кпРНК, например, см. Фигуру 1. В варианте осуществления молекула дополнительно включает одно или более из следующего:

- соединительная рибонуклеотидная последовательность, которая ковалентно связывает первый и второй РНК-компоненты;

- 5'-лидерная последовательность; и,

- 3'-трейлерная последовательность.

В варианте осуществления первый РНК-компонент состоит из, в порядке 5'→3', первого 5'-рибонуклеотида, первой последовательности РНК и первого 3'-рибонуклеотида, где первые 5' и 3' рибонуклеотиды спариваются друг с другом в молекуле РНК, где первая последовательность РНК включает первую смысловую рибонуклеотидную последовательность по меньшей мере из 20 последовательных рибонуклеотидов, первую последовательность петли по меньшей мере из 4 рибонуклеотидов и первую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность по меньшей мере из 20 последовательных рибонуклеотидов, где первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность гибридизуется с первой смысловой рибонуклеотидной последовательностью в молекуле РНК, где первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность способна к гибридизации с первой областью молекулы РНК-мишени.

В другом варианте осуществления первый РНК-компонент состоит из, в порядке 5'→3', первого 5'-рибонуклеотида, первой последовательности РНК и первого 3'-рибонуклеотида, где первые 5' и 3' рибонуклеотиды спариваются друг с другом в молекуле РНК, где первая последовательность РНК включает первую смысловую рибонуклеотидную последовательность по меньшей мере из 20 последовательных рибонуклеотидов, первую последовательность петли по меньшей мере из 4 рибонуклеотидов и первую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность по меньшей мере из 20 последовательных рибонуклеотидов, где первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность полностью спаривается с первой смысловой рибонуклеотидной последовательностью в молекуле РНК, где первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность идентична по последовательности комплементу первой области молекулы РНК-мишени. Пример такого первого РНК-компонента согласно этим двум вариантам осуществления схематично показан слева на Фигуре 1A или справа на Фигуре 1B.

В другом варианте осуществления первый РНК-компонент состоит из первого 5'-рибонуклеотида, первой последовательности РНК и первого 3'-рибонуклеотида, при этом первые 5' и 3' рибонуклеотиды спариваются друг с другом в первом РНК-компоненте, где первая последовательность РНК включает первую смысловую рибонуклеотидную последовательность, первую последовательность петли по меньшей мере из 4 рибонуклеотидов и первую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, где первая смысловая рибонуклеотидная последовательность и первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность содержат по меньшей мере 20 последовательных рибонуклеотидов, причем по меньшей мере 20 последовательных рибонуклеотидов первой смысловой рибонуклеотидной последовательности полностью спарены по меньшей мере с 20 последовательными рибонуклеотидами первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности, где по меньшей мере 20 последовательных рибонуклеотидов первой смысловой рибонуклеотидной последовательности по существу идентичны по последовательности первой области молекулы РНК-мишени.

В этих вариантах осуществления пара оснований, сформированная между первым 5'-рибонуклеотидом и первым 3'-рибонуклеотидом, считается концевой парой оснований области дцРНК, сформированной при самогибридизации первого РНК-компонента, т.е. она определяет конец области дцРНК.

В варианте осуществления первая смысловая последовательность обладает существенной идентичностью последовательности с областью РНК-мишени, где такая идентичность может быть с последовательностью длиной меньше 20 нуклеотидов. В варианте осуществления по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18 или по меньшей мере 19 последовательных рибонуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 20 последовательных рибонуклеотидов, первой смысловой рибонуклеотидной последовательности и первой области молекулы РНК-мишени идентичны по последовательности по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или 99%. В другом варианте осуществления по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 последовательных рибонуклеотидов первой смысловой рибонуклеотидной последовательности и первой области молекулы РНК-мишени идентичны на 100%. В варианте осуществления первые 3, первые 4, первые 5, первые 6 или первые 7 рибонуклеотидов от 5'-конца первой смысловой рибонуклеотидной последовательности на 100% идентичны области молекулы РНК-мишени, а остальные рибонуклеотиды по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% идентичны молекуле РНК-мишени.

В варианте осуществления по меньшей мере 20 последовательных рибонуклеотидов первой смысловой рибонуклеотидной последовательности и первой области молекулы РНК-мишени идентичны по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%. Опять же, в этом варианте осуществления первые 3, первые 4, первые 5, первые 6 или первые 7 рибонуклеотидов могут быть на 100% идентичны области молекулы РНК-мишени, а оставшиеся рибонуклеотиды по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентичны молекулы РНК-мишени. В другом варианте осуществления по меньшей мере 20 последовательных рибонуклеотидов первой смысловой рибонуклеотидной последовательности и первой области молекулы РНК-мишени идентичны на 100%.

В варианте осуществления первая антисмысловая последовательность обладает существенной идентичностью последовательности к комплементу области РНК-мишени, где такая идентичность может быть к последовательности комплемента протяженностью меньше 20 нуклеотидов. В варианте осуществления по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18 или по меньшей мере 19 последовательных рибонуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере 20 последовательных рибонуклеотидов, первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности и комплемента первой области молекулы РНК-мишени идентичны по последовательности по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или 99%. В другом варианте осуществления по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 последовательных рибонуклеотидов первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности и комплемента первой области молекулы РНК-мишени идентичны на 100%. В варианте осуществления первые 3, первые 4, первые 5, первые 6 или первые 7 рибонуклеотидов с 5'-конца первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности на 100% идентичны комплементу области молекулы РНК-мишени, а оставшиеся рибонуклеотиды по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% идентичны комплементу молекулы РНК-мишени.

В варианте осуществления по меньшей мере 20 последовательных рибонуклеотидов первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности и комплемента первой области молекулы РНК-мишени идентичны по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%. Опять же, в этом варианте осуществления первые 3, первые 4, первые 5, первые 6 или первые 7 рибонуклеотидов на 100% идентичны комплементу области молекулы РНК-мишени, а оставшиеся рибонуклеотиды по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99%, идентичны комплементу молекулы РНК-мишени. В другом варианте осуществления по меньшей мере 20 последовательных рибонуклеотидов первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности и первой области молекулы РНК-мишени идентичны на 100%.

В другом варианте осуществления второй РНК-компонент состоит из, в порядке 5'→3', второго 5'-рибонуклеотида, второй последовательности РНК и второго 3'-рибонуклеотида, где вторые 5' и 3' рибонуклеотиды образуют пару оснований, где вторая последовательность РНК включает вторую смысловую рибонуклеотидную последовательность, вторую последовательность петли по меньшей мере из 4 рибонуклеотидов и вторую антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, где вторая смысловая рибонуклеотидная последовательность спаревается со второй антисмысловой рибонуклеотидной последовательностью. В этом варианте осуществления пара оснований, образованная между вторым 5'-рибонуклеотидом и вторым 3'-рибонуклеотидом, считается концевой парой оснований области дцРНК, сформированной при самогибридизации второго РНК-компонента.

В варианте осуществления молекула РНК включает 5'-лидерную последовательность или 5'-удлиняющую последовательность, которая может возникать в результате транскрипции с промотора в генетической конструкции, с сайта начала транскрипции до начала полинуклеотида, кодирующего остальную часть молекулы РНК. Предпочтительно, чтобы такая 5'-лидерная последовательность или 5'-удлиняющая последовательность была относительно короткой по сравнению с остальной частью молекулы, и могла бы удаляться из молекулы РНК посттранскрипционно, для варианта осуществления путем обработки РНКазой. 5'-лидерная последовательность или 5'-удлиняющая последовательность может быть в основном не спаренной или может содержать одну или больше структур стебель-петля. В таком варианте осуществления 5'-лидерная последовательность может состоять из последовательности рибонуклеотидов, которая ковалентно связана с первым 5'-рибонуклеотидом, если второй РНК-компонент связан с первым 3'-рибонуклеотидом, или со вторым 5'-рибонуклеотидом, если второй РНК-компонент связан с первым 5'-рибонуклеотидом. В одном из вариантов осуществления 5'-лидерная последовательность имеет длину по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 100, по меньшей мере 200 рибонуклеотидов, предпочтительно до максимальной длины 250 рибонуклеотидов. В другом варианте осуществления 5'-лидерная последовательность имеет длину по меньшей мере 50 рибонуклеотидов. В варианте осуществления 5'-лидерная последовательность может действовать в качестве удлиняющей последовательности для амплификации молекулы РНК посредством подходящей реакции амплификации. Для варианта осуществления удлиняющая последовательность может способствовать амплификации с помощью полимеразы.

В другом варианте осуществления молекула РНК включает 3'-трейлерную последовательность или 3'-удлиняющую последовательность, которые могут возникать в результате транскрипции, продолжающейся до сигнала терминации транскрипции или полиаденилирования в конструкции, кодирующей молекулу РНК. 3'-трейлерная последовательность или 3'-удлиняющая последовательность могут включать поли(A) хвост. Предпочтительно, чтобы такая 3'-трейлерная последовательность или 3'-удлиняющая последовательность были относительно короткими по сравнению с остальной частью молекулы, и могли бы удаляться из молекулы РНК посттранскрипционно для варианта осуществления путем РНКазой. 3'-трейлерная последовательность или 3'-удлиняющая последовательность могут быть в основном неспаренными или могут содержать одну или более структур стебель-петли. В таком варианте осуществления 3'-трейлерная последовательность может состоять из последовательности рибонуклеотидов, которая ковалентно связана со вторым 3'-рибонуклеотидом, если второй РНК-компонент связан с первым 3'-рибонуклеотидом, или с первыми 3'-рибонуклеотидом, если второй РНК-компонент связан с первым 5'-рибонуклеотидом. В варианте осуществления 3'-лидерная последовательность имеет длину по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 30, по меньшей мере 100, по меньшей мере 200 рибонуклеотидов, предпочтительно до максимальной длины 250 рибонуклеотидов. В другом варианте осуществления 3'-лидерная последовательность имеет длину по меньшей мере 50 рибонуклеотидов. В варианте осуществления 3'-трейлерная последовательность может действовать в качестве удлиняющей последовательности для амплификации молекулы РНК посредством подходящей реакции амплификации. Для варианта осуществления удлиняющая последовательность может способствовать амплификации с помощью полимеразы.

В варианте осуществления все рибонуклеотиды, за исключением двух, ковалентно связаны с двумя другими нуклеотидами, т.е. молекула РНК состоит только из одной цепи РНК, которая содержит самокомплементарные области, и поэтому имеет только один 5'-концевой нуклеотид и один 3'-концевой нуклеотид. В другом варианте осуществления все рибонуклеотиды, за исключением четырех, ковалентно связаны с двумя другими нуклеотидами, т.е. молекула РНК состоит из двух цепей РНК, которые содержат комплементарные области, которые гибридизуются, и поэтому содержат только два 5'-концевых нуклеотида и два 3'-концевых нуклеотида. В другом варианте осуществления каждый рибонуклеотид ковалентно связан с двумя другими нуклеотидами, т.е. молекула РНК является кольцевой, а также имеет самокомплементарные области, и поэтому не имеет 5'-концевого нуклеотида и 3'-концевого нуклеотида.

В варианте осуществления двухцепочечная область молекулы РНК может включать одно или более выпетливаний, образующихся из-за неспаренных нуклеотидов в смысловой последовательности РНК и/или антисмысловой последовательности РНК. В варианте осуществления молекула РНК включает серию выпетливаний. Для варианта осуществления двухцепочечная область молекулы РНК может содержать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или больше выпетливаний. Каждое выпетливание может включать, независимо, один, два или больше неспаренных нуклеотидов, вплоть до 10 нуклеотидов. Более длинные последовательности могут формировать выпетливания из смысловых или антисмысловых последовательностей в области дцРНК, которые могут спариваться внутри или оставаться неспаренными. В другом варианте осуществления двухцепочечная область молекулы РНК не включает выпетливание, т.е. полностью спарена на всей протяженности области дцРНК.

В другом варианте осуществления первая смысловая рибонуклеотидная последовательность ковалентно связана с первыми 5'-рибонуклеотидом без каких-либо промежуточных нуклеотидов, или первая антисмысловая рибонуклеотидная последовательность ковалентно связана с первым 3'-рибонуклеотидом без каких-либо промежуточных нуклеотидов, или и то, и другое. В другом варианте осуществления присутствует по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере 10 промежуточных нуклеотидов. Следует понимать, что такие промежуточные нуклеотиды не являются родственными по последовательности с молекулой РНК-мишени, но могут способствовать стабилизации при спаривании смежных смысловых и антисмысловых последовательностей.

В другом варианте осуществления 20 последовательных нуклеотидов первой смысловой рибонуклеотидной последовательности ковалентно связаны с первым 5'-рибонуклеотидом без каких-либо промежуточных нуклеотидов, и 20 последовательных нуклеотидов первой антисмысловой рибонуклеотидной последовательности ковалентно связаны с первым 3'-рибонуклеотидом без каких-либо промежуточных нуклеотидов. В другом варианте осуществления присутствует по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере 10 промежуточных нуклеотидов. Промежуточные нуклеотиды могут быть спарены как часть двухцепочечной области молекулы РНК, но не являются родственными по последовательности с РНК-мишенью. Они могут способствовать обеспечению увеличенной стабильности в двухцепочечной области или удерживать два конца молекулы РНК и не оставлять неспаренными 5' и/или 3' конец.

В варианте осуществления вышеуказанные первый и второй РНК-компоненты включают соединительную рибонуклеотидную последовательность. В варианте осуществления соединительная рибонуклеотидная последовательность действует как спейсер между первой смысловой рибонуклеотидной последовательностью, которая по существу идентична по последовательности первой области молекулы РНК-мишени и другим компонентам молекулы. Например, соединительная рибонуклеотидная последовательность может действовать как спейсер между этой областью и петлей. В другом варианте осуществления молекула РНК включает множество смысловых рибонуклеотидных последовательностей, которые по существу идентичны по последовательности первой области молекулы РНК-мишени, и соединительную рибонуклеотидную последовательность, которая действует как спейсер между этими последовательностями. В варианте осуществления по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, по меньшей мере шесть, по меньшей мере семь, по меньшей мере восемь, по меньшей мере девять, по меньшей мере 10 рибонуклеотидных последовательностей, которые по существу идентичны по последовательности первой области молекулы РНК-мишени, представлены в молекуле РНК, и каждая отделена от другой(их) последовательности соединительной рибонуклеотидной последовательностью.

В варианте осуществления вышеуказанные молекулы РНК включают 5'-лидерную последовательность. В варианте осуществления 5'-лидерная последовательность состоит из последовательности рибонуклеотидов, которая ковалентно связана с первым 5'-рибонуклеотидом, если второй РНК-компонент связан с первым 3'-рибонуклеотидом, или со вторым 5'-рибонуклеотидом, если второй РНК-компонент связан с первым 5'-рибонуклеотидом. В варианте осуществления молекула РНК имеет модифицированный 5' или 3'-конец для варианта осуществления путем присоединения липидной группы, такой как холестерин, или витамина, такого как биотин, или полипептида. Такие модификации могут способствовать захвату молекулы РНК в эукариотической клетке, где РНК должна функционировать.

В варианте осуществления соединительная рибонуклеотидная последовательность имеет длину меньше 100 рибонуклеотидов. В варианте осуществления соединительная рибонуклеотидная последовательность имеет длину меньше 50 рибонуклеотидов. В варианте осуществления соединительная рибонуклеотидная последовательность имеет длину меньше 20 рибонуклеотидов. В варианте осуществления соединительная рибонуклеотидная последовательность имеет длину меньше 10 рибонуклеотидов. В варианте осуществления соединительная рибонуклеотидная последовательность имеет длину меньше 5 рибонуклеотидов. В варианте осуществления соединительная рибонуклеотидная последовательность имеет длину 1-100 рибонуклеотидов. В варианте осуществления соединительная рибонуклеотидная последовательность имеет длину 1-50 рибонуклеотидов. В варианте осуществления соединительная рибонуклеотидная последовательность имеет длину 1-20 рибонуклеотидов. В варианте осуществления соединительная рибонуклеотидная последовательность имеет длину 1-10 рибонуклеотидов. В варианте осуществления соединительная рибонуклеотидная последовательность имеет длину 1-5 рибонуклеотидов. В варианте осуществления рибонуклеотиды в соединительной рибонуклеотидной последовательности не спарены. В предпочтительном варианте осуществления все рибонуклеотиды в соединительной рибонуклеотидной последовательности спарены, или спарены все кроме 1, 2 или 3 рибонуклеотидов.

В варианте осуществления первый или второй РНК-компонент включает шпилечную структуру. В предпочтительном варианте осуществления и первый, и второй РНК-компоненты включают шпилечную структуру. В этих вариантах осуществления шпилечная структура может быть стебель-петлей. Таким образом, в варианте осуществления молекула РНК может включать первый и второй РНК-компоненты, каждый из которых включает шпилечную структуру, где шпильки ковалентно связаны линкерной последовательностью. См., например, Фигуру 1. В варианте осуществления линкерная последовательность представляет собой одну или более неспаренных рибонуклеиновых кислот. В варианте осуществления линкерная последовательность составляет от 1 до 10 неспаренных рибонуклеотидов.

В варианте осуществления молекула РНК имеет двойную шпилечную структуру, т.е. "структуру кпРНК" или "структуру гантели". В этом варианте осуществления первая шпилька является первым РНК-компонентом, а вторая шпилька является вторым РНК-компонентом. В этих вариантах осуществления ковалентно соединены либо первый 3'-рибонуклеотид и второй 5'-рибонуклеотид, либо второй 3'-рибонуклеотид и первый 5'-рибонуклеотид, но не все одновременно. В этом варианте осуществления другие 5'/3' рибонуклеотиды могут быть отделены ником (т.е. разрывом в молекуле дцРНК, в котором между 5'/3' рибонуклеотидами отсутствует фосфодиэфирная связь). Вариант осуществления такого типа конфигурации показан на Фигуре 1B. В другом варианте осуществления соответствующие 5'/3' рибонуклеотиды могут быть отделены петлей. Длиная 5'-лидерной и 3'-трейлерной последовательностей может быть одинаковой или разной. В качестве варианта осуществления 5'-лидер может быть приблизительно на 5, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500 рибонуклеотидов длиннее, чем 3'-трейлерная последовательность, или наоборот.

В вариантах осуществления, где молекула РНК имеет двойную шпилечную структуру, вторая шпилька (в дополнение к первой шпилечной структуре) включает смысловую последовательность РНК и антисмысловую последовательность РНК, которые по существу идентичны по последовательности области молекулы РНК-мишени или ее комплемента, соответственно. В варианте осуществления каждая шпилька содержит ряд рибонуклеотидов, которые по существу идентичны по последовательности области той же молекулы РНК-мишени. В варианте осуществления каждая шпилька содержит ряд рибонуклеотидов, которые по существу идентичны по последовательности различным областям той же молекулы РНК-мишени. В варианте осуществления каждая шпилька содержит ряд рибонуклеотидов, которые по существу идентичны по последовательности области разных молекул РНК-мишеней, т.е. молекула РНК может применяться для снижения экспрессии и/или активности двух молекул РНК-мишеней, которые могут не иметь родственные последовательности.

В каждой шпильке двойной шпилечной структуры молекулы РНК порядок смысловых и антисмысловых последовательностей РНК в каждой шпильке, в порядке от 5' к 3', может независимо включать сначала смысловую, затем антисмысловую, или сначала антисмысловую, затем смысловую. В предпочтительных вариантах осуществления порядок смысловых и антисмысловых последовательностей в двойной шпилечной структуре молекулы РНК является либо антисмысловая-смысловая-смысловая-антисмысловая, где две смысловых последовательности являются смежными (Фигура 1A), или смысловая-антисмысловая-антисмысловая-смысловая, где две антисмысловых последовательности являются смежными (Фигура 1B).

В варианте осуществления молекула РНК может включать, в порядке от 5' к 3', 5'-лидерную последовательность, первую петлю, смысловую последовательность РНК, вторую петлю и 3'-трейлерную последовательность, где 5' и 3'-лидерные последовательности ковалентно связаны со смысловой цепью, с формированием последовательности дцРНК. В варианте осуществления 5'-лидерная и 3'-трейлерная последовательности не связаны ковалентно друг с другом. В варианте осуществления 5'-лидерная и 3'-трейлерная последовательности отделены ником. В варианте осуществления 5'-лидерная и 3'-трейлерная последовательности лигированы друг с другом, с получением молекулы РНК с замкнутой структурой. В другом варианте осуществления 5'-лидерная и 3'-трейлерная последовательности отделены петлей.

Термин "петля" используется в рамках настоящего описания для обозначения структуры петли в молекуле РНК, раскрытой в настоящем документе, которая сформирована рядом некомплементарных рибонуклеотидов. Петли обычно следуют за рядом пар оснований между первым и вторым РНК-компонентами или соединяют смысловую последовательность РНК и антисмысловую последовательность РНК в одном из первого и второго компонентов РНК или в обоих. В варианте осуществления все рибонуклеотиды петли не комплементарны, обычно в случае более коротких петель из 4-10 рибонуклеотидов. В других вариантах осуществления некоторые рибонуклеотиды в одной или более петель комплементарны и способны спариваться в последовательности петли, при условии, что эти спаривания позволяют формироваться структуре петли. Например, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10% или по меньшей мере 15% рибонуклеотидов петли комплементарны. Варианты осуществления петель включают стебель-петли или шпильки, псевдоузлы и тетрапетли.

В варианте осуществления молекула РНК включает только две петли. В другом варианте осуществления молекула РНК включает по меньшей мере две, по меньшей мере три, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9 или по меньшей мере 10 петель, предпочтительно максимум до 10 петель. Например, молекула РНК может включать 4 петли.

В настоящем изобретении предусмотрены петли разных размеров. Например, петли могут включать 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 рибонуклеотидов. В других вариантах осуществления петли включают 15, 20, 25 или 30 нуклеотидов. В варианте осуществления один или все последовательности петель имеют длину больше 20 нуклеотидов. В других вариантах осуществления петли больше, например, включают 50, 100, 150, 200 или 300 рибонуклеотидов. В варианте осуществления петли включают 160 рибонуклеотидов. В другом варианте осуществления, менее предпочтительном, петли включают 200, 500, 700 или 1000 рибонуклеотидов при условии, что петли не препятствуют гибридизации смысловой и антисмысловой последовательностей РНК. В варианте осуществления каждая из петель содержит одинаковое количество рибонуклеотидов. Например, петли могут иметь длину от 100 до 1000 рибонуклеотидов. Например, петли могут иметь длину от 600 до 1000 рибонуклеотидов. Например, петли могут иметь длину от 4 до 1000 рибонуклеотидов. Например, петли предпочтительно имеют длину от 4 до 50 рибонуклеотидов. В другом варианте осуществления петли включают разное количество рибонуклеотидов.

В другом варианте осуществления одна или более петель включают интрон, который может быть вырезан из молекулы РНК. В варианте осуществления интрон происходит из гена растения. Примеры интронов включают интрон 3 из алкогольдегидрогеназы кукурузы 1 (Adh1) (GenBank: AF044293), интрон 4 из альфа-субъединицы бета-конглицинина сои (GenBank: AB051865); один из интронов гена rbcS-3A малой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы гороха (RBC) (GenBank: X04333). Другие варианты осуществления подходящих интронов обсуждаются в (McCullough and Schuler, 1997; Smith et al., 2000).

В различных вариантах осуществления петля может быть на конце по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10 последовательных пар оснований, которые могут быть каноническими парами оснований или могут включать одну или более неканонических пар оснований. В других вариантах осуществления, менее предпочтительных, особенно в случае клеток позвоночных животных, петля может быть на конце по меньшей мере 20, 30, 50, 100, 200, 500 или больше последовательных пар оснований.

В другом варианте осуществления молекула РНК включает две или более смысловых рибонуклеотидных последовательностей, при этом антисмысловые рибонуклеотидные последовательности, полностью спаренные с ними, каждая из которых является идентичной по последовательности области молекулы РНК-мишени. Например, молекула РНК может включать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или больше смысловых рибонуклеотидных последовательностей, и антисмысловые рибонуклеотидные последовательности, полностью спаренные с ними, где каждая из смысловых рибонуклеотидных последовательностей независимо является идентичной по последовательности области молекулы РНК-мишени. В этом варианте осуществления любая одна или более, или все последовательности могут быть отделены соединительной рибонуклеотидной последовательностью(ями). В этом варианте осуществления любая одна или более, или все последовательности могут быть отделены петлей.

В варианте осуществления две или более смысловых рибонуклеотидных последовательностей идентичны по последовательности разным областям одной и той же молекулы РНК-мишени. Например, последовательности могут быть идентичными по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6 областям одной и той же молекулы-мишени. В другом варианте осуществления две или более смысловых рибонуклеотидных последовательностей идентичны по последовательности. В варианте осуществления две или больше смысловых рибонуклеотидных последовательностей идентичны по последовательности одной и той же области одной и той же молекулы РНК-мишени. В другом варианте осуществления две или более смысловых рибонуклеотидных последовательностей идентичны по последовательности разным молекулам РНК-мишеней. В качестве варианта осуществления последовательности могут быть идентичными по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6 областям разных молекул-мишеней.

В другом варианте осуществления две или более смысловых рибонуклеотидных последовательностей не имеют промежуточных (спейсерных) последовательностей петель.

В варианте осуществления молекула РНК имеет одну цепь рибонуклеотидов, имеющую 5'-конец, по меньшей мере одну смысловую рибонуклеотидную последовательность, которая имеет длину по меньшей мере 21 нуклеотид, антисмысловую рибонуклеотидную последовательность, которая полностью спарена с каждой смысловой рибонуклеотидной последовательностью на протяжении по меньшей мере 21 последовательного нуклеотида, по меньшей мере две последовательности петель и 3'-конец. В этом варианте осуществления рибонуклеотид на 5'-конце и рибонуклеотид на 3'-конце не связаны ковалентно напрямую, а скорее непосредственно примыкают к каждому спаренному.

В другом варианте осуществления последовательные пары оснований РНК-компонентов разделены по меньшей мере одним пропуском. В варианте осуществления "пропуск" обеспечивается неспаренным рибонуклеотидом. В другом варианте осуществления "пропуск" обеспечивается нелигированной 5'-лидерной последовательностью и/или 3'-трейлерной последовательностью. В этом варианте осуществления пропуск может именоваться "нелигированным пропуском". Некомплементарные основания и нелигированный пропуск(и) могут быть расположены в разных положениях молекулы РНК. В качестве варианта осуществления нелигированный пропуск может располагаться непосредственно после антисмысловой последовательности. В другом варианте осуществления нелигированный пропуск может располагаться вблизи от петли молекулы РНК. В другом варианте осуществления нелигированный пропуск расположен примерно равноудаленно по меньшей мере между двумя петлями.

В варианте осуществления молекула РНК получена из одной цепи РНК. В варианте осуществления одна цепь не является циклически замкнутой, например, она включает нелигированный пропуск. В другом варианте осуществления молекула РНК является циклически замкнутой молекулой. Замкнутые молекулы могут быть получены при лигировании вышеуказанной молекулы РНК, включающей нелигированный пропуск, например, с помощью РНК-лигазы.

В другом варианте осуществления молекула РНК включает 5'-и/или 3'-удлиняющую последовательность. Например, молекула РНК может включать 5'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную с первым 5'-рибонуклеотидом. В другом варианте осуществления молекула РНК включает 3'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную со вторым 3'-рибонуклеотидом. В другом варианте осуществления молекула РНК включает 5'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную с первым 5'-рибонуклеотидом, и 3'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную со вторым 3'-рибонуклеотидом.

В другом варианте осуществления молекула РНК включает 5'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную со вторым 5'-рибонуклеотидом. В другом варианте осуществления молекула РНК включает 3'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную с первым 3'-рибонуклеотидом. В другом варианте осуществления молекула РНК включает 5'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную со вторым 5'-рибонуклеотидом, и 3'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную с первым 3'-рибонуклеотидом.

В другом варианте осуществления молекула РНК может включать одно или более следующего:

- 5'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную с первым 5'-рибонуклеотидом;

- 3'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную со вторым 3'-рибонуклеотидом;

- 5'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную с первым 5'-рибонуклеотидом, и 3'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную со вторым 3'-рибонуклеотидом;

- 5'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную со вторым 5'-рибонуклеотидом;

- 3'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную с первым 3'-рибонуклеотидом;

- 5'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную со вторым 5'-рибонуклеотидом, и 3'-удлиняющую последовательность, ковалентно связанную с первым 3'-рибонуклеотидом.

Нуклеиновые кислоты, кодирующие молекулы РНК

Специалист в данной области поймет из представленного выше описания, что в настоящем изобретении также предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая молекулы РНК, раскрытые в настоящем документе, и их компоненты. Например, нуклеиновая кислота, включающая последовательность, представленную в любой одной или более из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9. Нуклеиновая кислота может быть частично очищена после экспрессии в клетке-хозяине. Термин "частично очищенный" используется для обозначения молекулы РНК, которая обычно отделена от липидов, нуклеиновых кислот, других пептидов и других контаминирующих молекул, с которыми она ассоциирована в клетке-хозяине. Предпочтительно частично очищенный полинуклеотид очищен по меньшей мере на 60%, более предпочтительно по меньшей мере на 75% и более предпочтительно по меньшей мере на 90% от других компонентов, с которыми он ассоциирован.

В другом примере полинуклеотид согласно настоящему изобретению является гетерологичным полинуклеотидом. Термин "гетерологичный полинуклеотид" хорошо известен в уровне техники и относится к полинуклеотиду, который не является эндогенным по отношению к клетке или является нативным полинуклеотидом, в котором нативная последовательность была изменена, или нативным полипептидом, экспрессия которого изменена количественно в результате манипуляции с клеткой при помощи методов генной инженерии.

В другом примере полинуклеотид согласно настоящему изобретению является синтетическим полинуклеотидом. Например, полинуклеотид может быть получен с помощью методов, не требующих существования исходных последовательностей нуклеиновых кислот, таких как печать ДНК и синтез олигонуклеотидов. В другом примере полинуклеотид получен из ксенонуклеиновых кислот.

В примере полинуклеотид, раскрытый в настоящем документе, который кодирует молекулу РНК-предшественника, включающую интрон, предпочтительно в 5'-удлиняющей последовательности или по меньшей мере в одной последовательности петли, где интрон может быть удален при транскрипции полинуклеотида в клетке-хозяине или in vitro. В другом примере последовательность петли включает два, три, четыре, пять или больше интронов. В настоящем изобретении также предложена экспрессионная конструкцию, такая как конструкция ДНК, включающая выделенную нуклеиновую кислоту согласно изобретению, функционально связанную с промотором. В примере такие выделенные нуклеиновые кислоты и/или экспрессионные конструкции предоставлены в клетке или не относящемся к человеку организме. В примерах выделенные нуклеиновые кислоты стабильно интегрированы в геном клетки или не относящегося к человеку организма. Различные примеры подходящих экспрессионных конструкций, промоторов и клеток, включающих их, обсуждаются ниже.

Синтез молекул РНК согласно настоящему изобретению может быть выполнен с помощью различных методов, известных в уровне техники. В разделе Примеры представлен пример синтеза in vitro. В этом примере конструкции, включающие молекулы РНК, раскрытые в настоящем документе, расщепляют на 3'-конце, осаждают, очищают и подвергают количественному анализу. Синтез РНК может быть выполнен в бактериальной культуре после трансформации электро-компетентных клеток HT115 и индукции синтеза РНК с использованием T7, IPTG системы.

Рекомбинантные векторы

Один из вариантов осуществления настоящего изобретения включает рекомбинантный вектор, который содержит по меньшей мере одну молекулу РНК, определенную в настоящем документе, и способен доставлять молекулу РНК в клетку-хозяина. Рекомбинантные векторы включают векторы экспрессии. Рекомбинантные векторы содержат гетерологичные полинуклеотидные последовательности, то есть полинуклеотидные последовательности, которые не встречаются в природе в контакте с молекулой РНК, определенной в настоящем документе, которые предпочтительно происходят из разных видов. Вектор может представлять собой либо РНК, либо ДНК и, как правило, является вирусным вектором, полученным из вируса, или плазмидой.

Различные вирусные векторы могут использоваться для доставки и опосредования экспрессии молекулы РНК согласно настоящему изобретению. Выбор вирусного вектора, как правило, будет зависеть от различных параметров, таких как клетка или ткань, являющиеся мишенью для доставки, эффективность трансдукции вектора и патогенность. В одном примере вирусный вектор интегрируется в хозяйский клеточный хроматин (например, лентивирусы). В другом примере вирусный вектор сохраняется в ядре клетки преимущественно в виде внехромосомной эписомы (например, аденовирусы). Примеры этих типов вирусных векторов включают онкоретровирусы, лентивирусы, аденоассоциированные вирусы, аденовирусы, вирусы герпеса и ретровирусы.

Плазмидные векторы обычно включают дополнительные последовательности нуклеиновых кислот, которые обеспечивают легкий отбор, амплификацию и трансформацию кассеты экспрессии в прокариотических клетках, например, векторы на основе pUC, векторы на основе pGEM или бинарные векторы, содержащие одну или несколько областей Т-ДНК. Дополнительные последовательности нуклеиновых кислот включают точки начала репликации для обеспечения автономной репликации вектора, селективные маркерные гены, предпочтительно кодирующие устойчивость к антибиотикам или гербицидам, уникальные сайты множественного клонирования, обеспечивающие множественные сайты для вставки последовательностей нуклеиновых кислот или генов, кодируемых в конструкции нуклеиновой кислоты, и последовательности, которые усиливают трансформацию прокариотических и эукариотических (особенно растительных) клеток.

"Функционально связанный" при использовании в настоящем документе относится к функциональному отношению между двумя или более сегментами нуклеиновых кислот (например, ДНК). Как правило, это относится к функциональному отношению элемента регуляции транскрипции (промотора) к транскрибируемой последовательности. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью молекулы РНК, определенной в настоящем документе, если он стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в подходящей клетке. Обычно промоторные элементы регуляции транскрипции, функционально связанные с транскрибируемой последовательностью, физически примыкают к транскрибируемой последовательности, т.е. они являются цис-действующими. Однако некоторые элементы регуляции транскрипции, такие как энхансеры, не должны физически примыкать или располагаться в непосредственной близости от кодирующих последовательностей, транскрипцию которых они усиливают.

Если присутствует множество промоторов, промоторы могут быть независимо одинаковыми или разными.

Для облегчения идентификации трансформантов, рекомбинантный вектор предпочтительно содержит селективный или скринируемый маркерный ген. Под "маркерным геном" подразумевается ген, который придает клеткам, экспрессирующим маркерный ген, определенный фенотип и, таким образом, позволяет отличать такие трансформированные клетки от клеток, которые не имеют маркера. Селективный маркерный ген придает признак, по которому можно "отбирать" на основе устойчивости к селективному агенту (например, гербициду, антибиотику). Скринируемый маркерный ген (или репортерный ген) придает признак, который можно идентифицировать с помощью визуального наблюдения или анализа, то есть путем "скрининга" (например, β-глюкуронидаза, люцифераза, GFP или другая ферментативная активность, отсутствующая в нетрансформированных клетках). Типичные селективные маркеры для отбора растительных трансформантов включают, без ограничения, ген hyg, который кодирует устойчивость к гигромицину B; ген неомицинфосфотрансферазы (nptII), придающий устойчивость к канамицину, паромомицину; ген глутатион-S-трансферазы из печени крысы, придающий устойчивость к гербицидам, полученным из глутатиона, как, например, описано в ЕР 256223; ген глутаминсинтетазы, придающий при оверэкспрессии устойчивость к ингибиторам глутаминсинтетазы, таким как фосфинотрицин, как, например, описано в WO 87/05327; ген ацетилтрансферазы из Streptomyces viridochromogenes, придающий устойчивость к селективному агенту фосфинотрицину, как, например, описано в ЕР 275957; ген, кодирующий 5-енолшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSPS), придающий устойчивость к N-фосфонометилглицину, как, например, описано в публикации Hinchee et al. (1988); ген bar, придающий устойчивость к биалафосу, как, например, описано в WO91/02071; ген нитрилазы, такой как bxn из Klebsiella ozaenae, который придает устойчивость к бромоксинилу (Stalker et al., 1988); ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), придающий устойчивость к метотрексату (Thillet et al., 1988); мутантный ген ацетолактатсинтазы (ALS), который придает устойчивость к имидазолинону, сульфонилмочевине или другим ингибирующим ALS химическим веществам (EP 154,204); мутантный ген антранилатсинтазы, который придает устойчивость к 5-метил-триптофану; или ген дегалогеназы, который придает устойчивость к гербициду далапону.

Предпочтительно рекомбинантный вектор стабильно включается в геном клетки, такой как клетка растения. Таким образом, рекомбинантный вектор может включать соответствующие элементы, которые позволяют вектору включаться в геном или в хромосому клетки.

Вектор экспрессии

При использовании в настоящем документе, "вектор экспрессии" является вектором ДНК, который способен трансформировать клетку-хозяина и вызывать экспрессию молекулы РНК, определенной в настоящем документе. Векторы экспрессии согласно настоящему изобретению содержат регуляторные последовательности, такие как последовательности контроля транскрипции, последовательности контроля трансляции, точки начала репликации и другие регуляторные последовательности, которые совместимы с клеткой-хозяином и которые регулируют экспрессию молекулы РНК согласно настоящему изобретению. В частности, векторы экспрессии согласно настоящему изобретению включают последовательности контроля транскрипции. Последовательности контроля транскрипции являются последовательностями, регулирующими инициацию, элонгацию и терминацию транскрипции. Особенно важными последовательностями контроля транскрипции являются последовательности, которые регулируют инициацию транскрипции, такие как последовательности промотора, энхансера, оператора и репрессора. Выбор используемых регуляторных последовательностей зависит от целевого организма, такого как растение, и/или целевого органа или представляющей интерес ткани. Такие регуляторные последовательности могут быть получены из любого эукариотического организма, такого как растения или вирусы растений, или могут быть химически синтезированы.

Примеры векторов, подходящие для стабильной трансфекции растительных клеток или для создания трансгенных растений, были описаны, например, в публикациях Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987, Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989, и Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Как правило, растительные векторы экспрессии включают, например, один или более клонированных генов растения под транскрипционным контролем 5'- и 3'-регуляторных последовательностей и доминантный селективный маркер. Такие векторы для экспрессии в растениях также могут содержать промоторную регуляторную область (например, регуляторную область, контролирующую индуцируемую или конститутивную, регулируемую условиями окружающей среды или регулируемую развитием, или клеточно- или тканеспецифическую экспрессию), сайт инициации транскрипции, сайт связывания рибосомы, сайт терминации транскрипции и/или сигнал полиаденилирования.

Векторы изобретения также могут применяться для получения молекул РНК, определенные в настоящем документе, в бесклеточной системе экспрессии, такие системы известны в уровне техники.

В примере полинуклеотид, кодирующий молекулу РНК согласно настоящему изобретению, функционально связан с промотором, способным направлять экспрессию молекулы РНК в клетке-хозяине. В примере промотор функционирует in vitro. В примере промотор является промотором РНК-полимеразы. Например, промотор может быть промотором РНК-полимеразы III. В другом примере промотор может быть промотором РНК-полимеразы II. Однако выбор промотора может зависеть от целевого организма, такого как растение, насекомое, и/или целевого органа или представляющей интерес ткани. Примеры промоторов млекопитающих включают CMV, EF1a, SV40, PGK1, Ubc, человеческий бета-актин, CAG, TRE, UAS, CaMKIIa, CAL1, 10, TEF1, GDS, ADH1, CaMV35S, Ubi, H1 и U6. Примеры промоторов насекомых включают Ac5 и полиэдрин. Также был описан ряд конститутивных промоторов, которые активны в клетках растений. Подходящие промоторы для конститутивной экспрессии в растениях включают, без ограничения перечисленными, 35S промотор вирус мозаики цветной капусты (CaMV), 35S вируса мозаики норичника (FMV), фотоиндуцируемый промотор малой субъединицы (SSU) рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы, промотор цитозольной триозофосфатизомеразы риса, промотор аденин- фосфорибозилтрансферазы Arabidopsis, промотор гена актина-1 риса, промоторы маннопинсинтазы и октопинсинтазы, промотор Adh, промотор сахарозосинтазы, промотор комплекса R-генов и промотор гена хлорофилл α/β-связывающего белка. Эти промоторы использовали для создания ДНК-векторов, экспрессируемых в растениях, см., например, WO 84/02913. Все эти промоторы использовали для создания различных типов экспрессируемых в растениях рекомбинантных ДНК-векторов.

В целях экспрессии в исходных тканях растения, таких как лист, семя, корень или стебель, предпочтительно, чтобы промоторы, применяемые в настоящем изобретении, имели относительно высокую экспрессию в этих определенных тканях. С этой целью можно сделать выбор из различных промоторов генов с тканевой или клеточной специфичностью или повышенной экспрессией. Примеры таких промоторов, описанные в литературе, включают, промотор глутамин-синтетазы GS2 хлоропластов из гороха, промотор фруктозо-1,6-бифосфатазы хлоропластов из пшеницы, ядерный фотосинтетический промотор ST-LS1 из картофеля, промотор серин/треонинкиназы и промотор глюкоамилазы (CHS) из Arabidopsis thaliana. Также описаны промоторы, активные в фотосинтетически активных тканях, такие как промотор рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы из лиственницы американской (Larix laricana), промотор гена Cab, Cab6, из сосны, промотор гена Cab-1 из пшеницы, промотор гена Cab-1 из шпината, промотор гена Cab 1R из риса, промотор пируватортофосфатдикиназы (PPDK) из Zea mays, промотор гена табака Lhcb1*2, промотор симпортера сахарозы-Н³⁰ Suc2 Arabidopsis thaliana и промотор генов белков тилакоидной мембраны из шпината (PsaD, PsaF, PsaE, PC, FNR, AtpC, AtpD, Cab, RbcS). Другие промоторы хлорофилл α/β-связывающих белков также могут быть использоваться в настоящем изобретении, такие как промоторы гена LhcB и гена PsbP из горчицы белой (Sinapis alba).

Различные промоторы генов растений, регулируемые в ответ на сигналы внешней среды, гормональные, химические сигналы и/или сигналы развития, также могут использоваться для экспрессии генов РНК-связывающих белков в клетках растений, включая промоторы, регулируемые: (1) теплом, (2) светом (например, промотор RbcS-3А гороха, промотор RbcS кукурузы), (3) гормонами, такими как абсцизовая кислота, (4) повреждением (например, WunI) или (5) химическими веществами, такими как метилжасмонат, салициловая кислота, стероидные гормоны, спирт, антидоты гербицидов (WO 97/06269), или с преимуществами могут применяться (6) органоспецифические промоторы.

Используемый в настоящем документе термин "специфичный к запасающему органу растения промотор" относится к промотору, который предпочтительно, по сравнению с другими тканями растения, направляет транскрипцию гена в запасающем органе растения. Для экспрессии в запасающих тканях растения, таких как клубни картофеля, плоды томата или семена сои, канолы, хлопка, Zea mays, пшеницы, риса и ячменя предпочтительно, чтобы промоторы, применяемые в настоящем изобретении, обладали относительно высокой экспрессией в этих конкретных тканях. Может использоваться промотор β-конглицинина или другие семяспецифические промоторы, такие как промоторы напина, зеина, линина и фазеолина. Также могут использоваться корнеспецифические промоторы. Примером такого промотора является промотор гена кислой хитиназы. Экспрессия в корневой ткани также может осуществлятья при использовании корнеспецифических субдоменов 35S промотора CaMV, который был идентифицирован.

В особенно предпочтительном варианте осуществления промотор направляет экспрессию в тканях и органах, в которых происходит биосинтез липидов. Такие промоторы могут действовать при развитии семян в подходящее время для модификации липидного состава в семенах. Предпочтительные промоторы для семяспецифической экспрессии включают: 1) промоторы из генов, кодирующих ферменты, участвующие в биосинтезе и накоплении липидов в семенах, таких как десатуразы и элонгазы, 2) промоторы из генов, кодирующих запасные белки семян, и 3) промоторы из генов, кодирующих ферменты, участвующие в биосинтезе и накоплении углеводов в семенах. Подходящими семяспецифическими промоторами являются промотор гена напина рааса (US 5,608,152), промотор USP Vicia faba (Baumlein et al., 1991), промотор олеозина Arabidopsis (WO 98/45461), промотор фазеолина Phaseolus vulgaris (US 5,504,200), промотор Bce4 Brassica (WO 91/13980) или промотор легумина B4 (Baumlein et al., 1992), а также промоторы, которые приводят к семяспецифической экспрессии в однодольных растениях, таких как кукуруза, ячмень, пшеница, рожь, рис и т.п. Важными подходящими промоторами являются промотор гена lpt2 или lpt1 ячменя (WO 95/15389 и WO 95/23230) или промоторы, описанные в WO 99/16890 (промоторы из гена хордеина ячменя, гена глютелина риса, гена оризина риса, гена проламина риса, гена глиадина пшеницы, гена глютелина пшеницы, ген зеина кукурузы, гена глютелина овса, гена казирина сорго, гена секалина ржи). Другие промоторы включают промоторы, описанные в публикациях Broun et al. (1998), Potenza et al. (2004), US 20070192902 и US 20030159173. В одном варианте осуществления семяспецифический промотор предпочтительно экспрессируется в определенных частях семени, таких как семядоля(и) или эндосперм. Примеры семядоля-специфических промоторов включают, без ограничения перечисленными, промотор FP1 (Ellerstrom et al., 1996), промотор легумина гороха (Perrin et al., 2000) и промотор фитогемагглютинина фасоли (Perrin et al., 2000). Примеры эндосперм-специфических промоторов включают, без ограничения перечисленными, промотор зеина-1 кукурузы (Chikwamba et al., 2003), промотор глютелина-1 риса (Yang et al., 2003), промотор D-хордеина ячменя (Horvath et al., 2000) и промоторы глютелина HMW пшеницы (Alvarez et al., 2000). В другом варианте осуществления семяспецифический промотор не экспрессируется или экспрессируется лишь на низком уровне, в зародыше и/или после прорастания семени.

В другом варианте осуществления промотор, специфический для запасающего органа растения, является плодоспецифическим промотором. Примеры включают, без ограничения перечисленными, промоторы полигалактуроназы томата, Е8 и Pds, а также промотор оксидазы АСС яблок (см. обзор Potenza et al., 2004). В предпочтительном варианте осуществления промотор предпочтительно направляет экспрессию в съедобных частях плода, например, в мякоти плода, по сравнению с кожурой плода или с семенами внутри плода.

В одном варианте осуществления индуцируемый промотор представляет собой систему alc Aspergillus nidulans. Примеры индуцируемых систем экспрессии, которые могут использоваться вместо системы alc Aspergillus nidulans, описаны в обзорах Padidam (2003) и Corrado and Karali (2009). В другом варианте осуществления индуцируемый промотор является промотором, индуцируемым антидотом гербицида, таким как, например, промотор ln2-1 или ln2-2 кукурузы (Hershey and Stoner, 1991), промотор, индуцируемый антидотом гербицида, является промотором GST-27 кукурузы (Jepson et al., 1994) или промотором GH2/4 сои (Ulmasov et al., 1995).

В другом варианте осуществления индуцируемый промотор является индуцируемым старением промотором, таким как, например, индуцируемый старением промотор SAG (ассоциированный со старением ген) 12 и SAG 13 из Arabidopsis (Gan, 1995; Gan and Amasino, 1995) и LSC54 из Brassica napus (Buchanan-Wollaston, 1994). Такие промоторы демонстрируют повышенную экспрессию приблизительно при начале старения растительных тканей, в особенности листьев.

Для экспрессии в вегетационной ткани могут использоваться листоспецифические промоторы, такие как промоторы рибулозобифосфаткарбоксилазы (RBCS). Например, гены томата RBCS1, RBCS2 и RBCS3A экспрессируются в листьях и выращенной на свету рассаде (Meier et al., 1997). Могут использоваться промоторы рибулозобифосфаткарбоксилазы, экспрессируемой почти исключительно в мезофильных клетках пластин и влагалищ листьев в высоких концентрациях, описанные в публикации Matsuoka et al., (1994). Другим листоспецифическим промотором является промотор гена светособирающего хлорофилл a/b-связывающего белка (см. Shiina et al., 1997). Промотор myb-родственного гена Arabidopsis thaliana (Atmyb5), описанный в публикации Li et al., (1996), является листоспецифическим. Промотор Atmyb5 экспрессируется в развивающихся трихомах листьев, прилистниках и эпидермальных клетках и по краям молодых розеток и стеблевых листьев, а также в незрелых семенах. Также может использоваться промотор листьев, обнаруженный в кукурузе (Busk et al. (1997)).

В некоторых случаях, например, при рекомбинантной экспрессии LEC2 или BBM, может быть желательно, чтобы трансген не экспрессировался на высоких уровнях. Примером промотора, который может использоваться при таких обстоятельствах, является усеченный промотор напина A, который сохраняет профиль семяспецифической экспрессии, но со сниженным уровнем экспрессии (Tan et al., 2011).

5'-нетранслируемая лидерная последовательность может быть получена из промотора, выбранного для экспрессии последовательности гетерологичного гена молекулы РНК настоящего изобретения, или может быть гетерологичной в отношении кодирующей области продуцируемого фермента, и может быть специфически модифицирована при необходимости для повышения трансляции мРНК. С обзором по оптимизации экспрессии трансгенов можно ознакомиться в публикации Koziel et al. (1996). 5'-нетранслируемые области также могут быть получены из РНК вирусов растений (вируса табачной мозаики, вируса гравировки табака, вируса карликовой мозаики кукурузы, вируса мозаики люцерны и др.), из подходящих эукариотических генов, генов растений (лидерной последовательности из гена хлорофилл a/b-связывающего белка пшеницы и кукурузы) или из синтетических генных последовательностей. Настоящее изобретение не ограничивается конструкциями, в которых нетранслируемая область получена из 5'-нетранслируемой последовательности, которая сопутствует последовательности промотора. Лидерная последовательность также может быть получена из неродственной промоторной или кодирующей последовательности. Лидерные последовательности, подходящие в рамках настоящего изобретения, включают лидер Hsp70 кукурузы (US 5,362,865 и US 5,859,347) и омега элемент ВТМ.

Терминация транскрипции осуществляется 3'-нетранслируемой ДНК последовательностью, функционально связанной в векторе экспрессии с представляющей интерес молекулой РНК. 3'-нетранслируемая область рекомбинантной молекулы ДНК содержит сигнал полиаденилирования, который функционирует в растениях, вызывая присоединение аденилат-нуклеотидов к 3'-концу РНК. 3'-нетранслируемая область может быть получена из различных генов, которые экспрессируются в клетках растений. С этой целью обычно используют 3'-нетранслируемую область нопалинсинтазы, 3'-нетранслируемую область малой субъединицы гена Rubisco гороха, 3'-нетранслируемую область гена запасного белка 7S семян сои. Также подходят 3'-транскрибируемые нетранслируемые области, содержащие полиаденилат-сигнал генов опухолеиндуцирующей (Ti) плазмиды Agrobacterium.

Трансферные нуклеиновые кислоты

Трансферные нуклеиновые кислоты могут использоваться для доставки экзогенного полинуклеотида в клетку и включают одну, предпочтительно две бордерных последовательности и одну или больше представляющих интерес молекул РНК. Трансферная нуклеиновая кислота передачи может кодировать или может не кодировать селективный маркер. Предпочтительно трансферная нуклеиновая кислота является частью бинарного вектора в бактерии, где бинарный вектор дополнительно включает элементы, обеспечивающие репликацию вектора в бактерии, отбор или поддержание бактериальных клеток, содержащих бинарный вектор. После переноса в эукариотическую клетку трансферный компонент нуклеиновой кислоты бинарного вектора способен интегрироваться в геном эукариотической клетки или, в случае экспериментов с транзентной экспрессией, просто экспрессироваться в клетке.

При использовании в настоящем документе термин "внехромосомная трансферная нуклеиновая кислота" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая может быть перенесена из бактерии, такой как бактерия Agrobacterium sp., в эукариотическую клетку, такую как клетка листа растения. Внехромосомная трансферная нуклеиновая кислота представляет собой генетический элемент, который хорошо известен как элемент, способный к переносу с последующей интеграцией нуклеотидной последовательности, содержащейся в его границах, в геном реципиентной клетки. В этом отношении трансферная нуклеиновая кислота фланкирована, как правило, двумя "бордерными" последовательностями, хотя в некоторых случаях может быть использован один бордер с одного конца, а второй конец перенесенной нуклеиновой кислоты образуется случайным образом в процессе переноса. Молекула РНК, представляющая интерес, обычно содержится между левой бордерной последовательностью и правой бордерной последовательностью трансферной нуклеиновой кислоты. Молекула РНК, содержащаяся в трансферной нуклеиновой кислоте, может быть функционально связана с рядом различных регуляторных элементов промоторов и терминаторов, которые способствуют ее экспрессии, то есть транскрипции и/или трансляции молекулы РНК. Трансферные ДНК (Т-ДНК) из таких видов Agrobacterium, как Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes, а также их искусственно созданные варианты/мутанты, вероятно, яляются наиболее полно описанными примерами трансферных нуклеиновых кислот. Другим примером является Р-ДНК ("растительная ДНК"), которая содержит подобные Т-ДНК-бордерам последовательности из растений.

При использовании в настоящем документе термин "Т-ДНК" относится, например, к Т-ДНК Ti-плазмиды Agrobacterium tumefaciens или из Ri-плазмиды Agrobacterium rhizogenes, или их вариантам, которые обеспечивают перенос Т-ДНК в клетки растений. Т-ДНК может содержать полную Т-ДНК, включающую правую и левую бордерные последовательности, но должна содержать лишь минимальные последовательности, требуемые в цис-конфигурации для переноса, то есть правую бордерную последовательность Т-ДНК. Т-ДНК настоящего изобретения содержат встроенную в них, в любом участке между правой и левой бордерными последовательностями (в случае присутствия), представляющую интерес молекулу РНК. Последовательности, кодирующие факторы, требуемые в транс-конфигурации для переноса Т-ДНК в клетку растения, такие как vir гены, могут быть встроены в Т-ДНК или могут присутствовать на том же репликоне, что и Т-ДНК, или предпочтительно находятся в транс-конфигурации на совместимом репликоне в хозяине Agrobacterium. Такие "бинарные векторные системы" хорошо известны в уровне техники. При использовании в настоящем документе "Р-ДНК" относится к трансферной нуклеиновой кислоте, выделенной из генома растения или человека, ее искусственно созданным вариантам/мутантам, и включает на каждом конце, или только на одном конце, последовательность, подобную T-ДНК бордеру.

При использовании в настоящем документе "бордерная" последовательность нуклеиновой кислоты может быть выделена из выбранного организма, такого как растение или бактерия, или может быть ее искусственно созданным вариантом/мутантом. Бордерная последовательность вызывает и облегчает перенос молекулы РНК, с которой она связана, и может облегчать собственную интеграцию в геном реципиентной клетки. В варианте осуществления бордерная последовательность имеет длину 10-80 пн. Бордерные последовательности из T-ДНК Agrobacterium sp. известны в уровне техники и включают последовательности, описанные в публикации Lacroix et al. (2008).

Хотя для переноса генов в клетки растений традиционно использовали только Agrobacterium sp., в настоящее время существует целый ряд систем, которые были идентифицированы/разработаны, которые действуют аналогично Agrobacterium sp. Недавно были генетически модифицированы несколько не относящихся к Agrobacterium видов, которые приобрели способность обеспечивать перенос генов (Chung et al., 2006; Broothaerts et al., 2005). Это включает Rhisobium sp. NGR234, Sinorhizobium meliloti и Mezorhizobium loti.

Прямой перенос эукариотических экспрессионных плазмид из бактерий в эукариотические хозяева был впервые осуществлен несколько десятилетий назад путем слияния клеток млекопитающих и протопластов плазмиданесущих Escherichia coli (Schaffher, 1980). С этого момента количество бактерий, способных доставлять гены в клетки млекопитающих, постоянно увеличивалось (Weiss, 2003), что было независимо установлено четырьмя группами исследователей (Sizemore at al., 1995; Courvalin et al., 1995; Powell et al., 1996; Darji et al., 1997).

При использовании в настоящем документе термины "трансфекция", "трансформация" и их вариации обычно используются попеременно. "Трансфицированные" или "трансформированные" клетки могут быть подвергнуты манипуляциям с целью введения представляющей интерес молекулы (молекул) РНК или могут быть дочерними клетками, полученными из них.

Рекомбинантные клетки

В изобретении также предложена рекомбинантная клетка, например, рекомбинантная клетка бактерии, клетка гриба, клетка растения, клетка насекомого или клетка животного, которая является клеткой-хозяином, трансформированная одной или более молекулами РНК или векторами, определенными в настоящем документе, или их комбинацией. Подходящие клетки настоящего изобретения включают любые клетки, которые могут быть трансформированы молекулой РНК или рекомбинантным вектором согласно настоящему изобретению. В примере трансформированная клетка-хозяин является мертвой.

Рекомбинантная клетка может быть клеткой в культуре, клеткой in vitro или в организме, таком как, например, растение, или в органе, таком как, например, семена или листья. Предпочтительно клетка находится в растении, более предпочтительно в семени растения. В одном варианте осуществления рекомбинантная клетка не является клеткой человека. Таким образом, в примере настоящее изобретение относится к организму, не относящемуся к человеку, включающему одну или более, или все молекулы РНК, раскрытые в настоящем документе.

В одном примере клетки являются клетками насекомого. В одном примере клетки насекомого получены из Trichoplusia.

Другим примером подходящей клетки-хозяина является электро-компетентная клетка HT115.

Клетки-хозяева, в которые вводят молекулу(ы) РНК, могут быть либо нетрансформированными клетками, либо клетками, которые уже трансформированы по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой. Такие нуклеиновые кислоты могут участвовать в синтезе липидов или нет. Клетки-хозяева согласно настоящему изобретению могут быть способны эндогенно (то есть, естественно) экспрессировать молекулу(ы) РНК, определенную в настоящем документе, и в этом случае рекомбинантная клетка, полученная с ними, обладает повышенной способностью продуцировать молекулу(ы) РНК, или может быть способна продуцировать указанную молекулу(ы) РНК только после трансформации по меньшей мере одной молекулой РНК, определенной в настоящем документе. В одном примере клетка является клеткой, которую можно применять для продукции липида. В варианте осуществления рекомбинантная клетка согласно изобретению обладает повышенной способностью продуцировать неполярный липид, такой как TAG.

Клетки-хозяева согласно настоящему изобретению могут быть любыми клетками, способными экспрессировать по меньшей мере одну молекулу РНК, описанную в настоящем документе, и они включают клетки бактерий, грибов (включая дрожжи), паразитов, членистоногих, животных и растений. Примеры клеток-хозяев включают клетки Salmonella, Escherichia, Bacillus, Listeria, Saccharomyces, Spodoptera, Mycobacteria, Trichoplusia, Agrobacterium, клетки BHK (клетки почки новожденного хомяка), клетки MDCK, клетки CRFK, клетки CV-1, клетки COS (например, COS-7) и клетки Vero. Другими примерами клеток-хозяев являются E. coli, включая производные штаммы E. coli K-12; Salmonella typhi; Salmonella typhimurium, включая аттенуированные штаммы; Spodoptera frugiperda; Trichoplusia ni; и нетуморогенные мышиные миобластные клетки G8 (например, ATCC CRL 1246). Дополнительные подходящие клетки-хозяева млекопитающих включают другие линии клеток почек, другие линии клеток фибробластов (например, линии клеток эмбриональных фибробластов человека, мыши или курицы), линии клеток миеломы, клетки яичников китайского хомячка, клетки NIH/3T3 мыши, клетки LMTK и/или клетки HeLa.

В предпочтительном варианте осуществления клетка растения является клеткой семени, в частности, клеткой в семядоле или эндосперме семени. В одном варианте осуществления клетка является клеткой животного. Клетка животного может быть клеткой любого типа животного, такой как, например, клетка не относящегося к человеку животного, клетка не относящегося к человеку позвоночного, клетка не относящегося к человеку млекопитающего или клетками водных животных, таких как рыбы или ракообразные, беспозвоночные, насекомые и т.д. Примеры клеток водорослей, подходящих в качестве клеток-хозяев настоящего изобретения, включают, например, клетки Chlamydomonas sp. (например, Chlamydomonas reinhardtii), Dunaliella sp., Haematococcus sp., Chlorella sp., Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp. и Volvox sp.

Трансгенные растения

В изобретении также предложено растение, включающее одну или более экзогенных молекул РНК, определенных в настоящем документе, клетку согласно настоящему изобретению, вектор согласно настоящему изобретению или их комбинацию. Термин "растение" относится к целым растениям, тогда как термин "его часть" относится к органам растения (например, листьям, стеблям, корням, цветкам, плодам), отдельным клеткам (например, пыльце), семени, частям семени, таким как зародыш, эндосперм, щиток или оболочка семени, тканям растения, таким как сосудистая ткань, клеткам растения и его потомству. При использовании в настоящем документе, части растения содержат клетки растения.

При использовании в настоящем документе термин "в растении", в отношени модификации растения, означает, что модификация произошла по меньшей мере в одной части растения, включая случай, когда модификация произошла во всем растении, и не исключая случай, когда модификация происходит только в одной или нескольких, но не всех, частях растения. Например, тканеспецифический промотор, как говорят, экспрессируется "в растении", даже несмотря на то, что он может экспрессироваться только в некоторых частях растения. Аналогичным образом, "полипептид фактора транскрипции, который повышает экспрессию одного или более гликолитических генов и/или генов биосинтеза жирных кислот в растении" означает, что повышение экспрессии происходит по меньшей мере в части растения.

При использовании в настоящем документе термин "растение" используется в самом широком смысле и включает любой организм в царстве Растений. Он также включает красные и бурые водоросли, а также зеленые водоросли. Он включает, без ограничения перечисленными, любые виды цветковых растений, трав, сельскохозяйственных или зерновых культур (например, масличные культуры, кукурузу, сою), кормовое или фуражное, плодовое или овощное растение, травянистое растение, древесное растение или дерево. Он не подразумевает ограничения растения какой-либо конкретной структурой. Он также относится к одноклеточному растению (например, микроводорослям). Термин "его часть" в отношении растения относится к растительной клетке и ее потомству, множеству растительных клеток, структуре, присутствующей на любой стадии развития растения, или ткани растения. Такие структуры включают, без ограничения перечисленными, листья, стебли, цветки, плоды, орехи, корни, семя, семенную оболочку, зародыши. Термин "растительная ткань" включает дифференцированные и недифференцированные ткани растений, включая те, которые присутствуют в листьях, стеблях, цветках, плодах, орехах, корнях, семенах, например, эмбриональной ткани, эндосперме, покровной ткани (например, эпидермисе, перидереме), сосудистой ткани (например, ксилеме, флоэме) или измельченной ткани (содержащей клетки паренхимы, колленхимы и/или склеренхимы), а также клетки в культуре (например, отдельные клетки, протопласты, каллус, эмбрионы и т.д.). Ткань растения может быть in planta, в культуре органов, культуре ткани или культуре клеток.

Различные количества жирных кислот 18:3 и 16:3 присутствуют в гликолипидах разных видов растений. Это используют, чтобы отличать растения 18:3, жирные кислоты которых с 3 двойными связями, как правило, всегда имеют цепи длиной С₁₈ атомов, от растений 16:3, которые содержат как С₁₆-, так и С₁₈-жирные кислоты. В хлоропластах 18:3 активность ферментов, катализирующих превращение фосфатидата в диацилглицерин и диациглицерина в моногалактозилдиацилглицерин (МГД), значительно ниже, чем в хлоропластах 16:3. В листьях растений 18:3 хлоропласты синтезируют стеароил-АСР2 в строме, вводят первую двойную связь в насыщенную углеводородную цепь, а затем гидролизуют тиоэфир. Высвобождаемый олеат экспортируется через оболочки хлоропластов в мембраны эукариотической части клетки, вероятно, в эндоплазматический ретикулум, где он включается в ФХ. ФХ-связанные олеоильные группы в этих мембранах подвергаются десатурации и затем поступают обратно в хлоропласт. Связанные с МГД ацильные группы являются субстратами для введения третьей двойной связи с получением МГД с двумя линоленоильными остатками. Этот галактолипид характерен для растений 18:3, таких как, например, сложноцветные и бобовые. В фотосинтетически активных клетках растений 16:3, которые представлены, например, представителями семейств Apiaceae и Brassicaceae, два пути действуют параллельно, обеспечивая поступление МГД в тилакоиды. Объединенная "эукариотическая" последовательность в различной степени дополняется "прокариотическим" путем. Его ответы ограничиваются хлоропластом и приводят к типичному расположению ацильных групп, а также к их полной десатурации после их этерификации с образованием МГД. Прокариотические скелеты ДАГ несут С16:0 и продукты его десатурации в положении С-2, из которого удаляются С18: жирные кислоты. Положение C-1 занимают C18 жирные кислоты и в небольшой степени группы C16. Сходство в ДАГ-скелетах липидов сине-зеленых водорослей со скелетами, которые синтезируются в хлоропластном пути у растений 16:3, указывает на филогенетическую связь и оправдывает термин прокариот.

При использовании в настоящем документе термин "вегетативная ткань" или "вегетативная часть растения" является любой тканью, органом или частью растения кроме органов полового размножения растений. Органами полового размножения растений, в частности, являются семеноносные органы, цветки, пыльца, плоды и семена. Вегетативные ткани и части включают, по меньшей мере, листья растения, стебли (включая побеги и отростки, но исключая шаровидные стебли), клубни и корни, но исключая цветки, пыльцу, семена, в том числе семенную оболочку, зародыш и эндосперм, плоды, в том числе ткань мезокарпия, семеноносные коробочки и семеноносные головки. В одном варианте осуществления вегетативная часть растения является надземной частью растения. В другом или дополнительном варианте осуществления вегетативная часть растения является зеленой частью, такую как лист или стебель.

"Трансгенное растение" или его вариации относятся к растению, которое содержит трансген, не обнаруживаемый в растении дикого типа того же вида, разновидности или сорта. Трансгенные растения, как определено в рамках настоящего изобретения, включают растения и их потомство, которые были генетически модифицированы с применением рекомбинантных технологий, чтобы вызвать продукцию по меньшей мере одного полипептида, определенного в настоящем документе, в требуемом растении или его части. Части трансгенных растений имеют соответствующее значение.

Термины "семя" и "зерно" используются в настоящем документе попеременно. "Зерно" относится к зрелому зерну, такому как собранное зерно или зерно, которое все еще находится на растении, но готово к уборке, но может также относиться к зерну после набухания или прорастания, в зависимости от контекста. Зрелое зерно обычно имеет влажность меньше чем приблизительно 18%. В предпочтительном варианте осуществления содержание влаги в зерне находится на уровне, который обычно считается безопасным для хранения, предпочтительно от 5% до 15%, от 6% до 8%, от 8% до 10% или от 10% и 15%. При использовании в настоящем документе "развивающееся семя" относятся к семени до созревания, обычно обнаруживаемому в репродуктивных структурах растения после оплодотворения или прорастания, но также может относиться к таким семенам до созревания, которые выделены из растения. Зрелые семена обычно имеют влажность меньше чем приблизительно 12%.

При использовании в настоящем документе термин "запасающий орган растения" относится к части растения, приспособленной для хранения энергии, например, в форме белков, углеводов, липидов. Примерами запасающих органов растения являются семена, плоды, клубневидные корни и клубни. Предпочтительным запасающим органом растения согласно изобретению является семя.

При использовании в настоящем документе термин "фенотипически нормальный" относится к генетически модифицированному растению или его части, в частности, к запасающему органу, такому как семя, клубень или плод согласно изобретению, не обладающему существенно сниженной способностью к росту и размножению по сравнению с немодифицированным растением или его частью. Предпочтительно, биомасса, скорость роста, скорость прорастания, размер запасающего органа, размер семени и/или количество полученных жизнеспособных семян составляет не меньше 90% от соответствующего показателя растения, не содержащего указанный рекомбинантный полинуклеотид, при выращивании в идентичных условиях. Данный термин не охватывает признаки растения, которые могут отличаться от растения дикого типа, но которые не влияют на применимость растения в промышленных целях, такие как, например, фенотип "балерина" у листьев рассады. В варианте осуществления генетически модифицированное растение или его часть, которые являются фенотипически нормальными, включают рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий сайленсирующий супрессор, функционально связанный с промотором, специфическим для запасающего органа растения, и имеет способность к росту или воспроизводству, которая по существу является такой же, как у соответствующего растения или его части, не включающих указанный полинуклеотид.

Растения, предложенные или предназначенные для применения при практическом осуществлении настоящего изобретения, включают однодольные и двудольные. В предпочтительных вариантах осуществления растения настоящего изобретения представляют собой культурные растения (например, злаковые и зернобобовые, кукурузу, пшеницу, картофель, тапиоку, рис, сорго, просо, маниок, ячмень или горох) или бобовые, такие как сою, бобы или горох. Растения могут быть выращены для производства съедобных корней, клубней, листьев, стеблей, цветков или плодов. Растения могут быть овощными растениями, вегетативные части которых употребляются в пищу. Растениями настоящего изобретения могут быть следующие: Acrocomia aculeate (пальма макауба), Arabidopsis thaliana, Aracinis hypogaea (арахис), Astrocaryum murumuru (мурумуру), Astrocaryum vulgare (тукума), Attalea geraensis (Indaia-rateiro), Attalea humilis (американская масличная пальма), Attalea oleifera (andaia), Attalea phalerata (урикури), Attalea speciosa (бабассу), Avena sativa (овес), Beta vulgaris (сахарная свекла), виды Brassica, такие как Brassica carinata, Brassica juncea, Brassica napobrassica, Brassica napus (канола), Camelina sativa (ложный лен), Cannabis sativa (конопля), Carthamus tinctorius (сафлор), Caryocar brasiliense (кариокар), Cocos nucifera (кокосовый орех), Crambe abyssinica (абиссинская капуста), Cucumis melo (дыня), Elaeis guineensis (африканская пальма), Glycine max (соя), Gossypium hirsutum (хлопок), виды Helianthus, такие как Helianthus annuus (подсолнечник), Hordeum vulgare (ячмень), Jatropha curcas (лекарственный орех), Joannesia princeps (ореховое дерево apapa), виды Lemna (ряска), такие как Lemna aequinoctialis, Lemna disperma, Lemna ecuadoriensis, Lemna gibba (ряска горбатая), Lemna japonica, Lemna minor, Lemna minuta, Lemna obscura, Lemna paucicostata, Lemna perpusilla, Lemna tenera, Lemna trisulca, Lemna turionifera, Lemna valdiviana, Lemna yungensis, Licania rigida (ойтикика), Linum usitatissimum (лен), Lupinus angustifolius (люпин), Mauritia flexuosa (пальма бурити), Maximiliana maripa (пальма инайа), виды Miscanthus, такие как Miscantus х giganteus и Miscanthus sinensis, виды Nicotiana (табак), такие как Nicotiana tabacum или Nicotiana benthamiana, Oenocarpus bacaba (bacaba-do-azeite), Oenocarpus bataua (pataua), Oenocarpus distichus (bacaba-de-leque), виды Oryza (рис), такие как Oryza sativa и Oryza glaberrima, Panicum virgatum (просо прутьевидное), Paraqueiba paraensis (умари), Persea amencana (авокадо), Pongamia pinnata (индийский бук), Populus trichocarpa, Ricinus communis (клещевина обыкновенная), виды Saccharum (сахарный тростник), Sesamum indicum (кунжут), Solanum tuberosum (картофель), виды Sorghum, такие как Sorghum bicolor, Sorghum vulgare, Theobroma grandiforum (купуасу), виды Trifolium, Trithrinax brasiliensis (бразильская игольчатая пальма), виды Triticum (пшеница), такие как Triticum aestivum, Zea mays (кукуруза), люцерна (Medicago sativa), рожь (Secale cerale), батат (Ipomoea batatus), маниок (Manihot esculenta), кофе (виды Cofea), ананас (Anana comosus), цитрусовые деревья (виды Citrus), какао (Theobroma cacao), чай (Camellia senensis), банан (виды Musa), авокадо (Persea Americana), инжир (Ficus casica), гуава (Psidium guajava), манго (Magnifer indica), олива европейская (Olea europaea), папайя (Carica papaya), кешью (Anacardium occidentale), макадамия (Macadamia intergrifolia) и миндаль (Prunus amygdalus). Например, растениями согласно изобретению может быть Nicotiana benthamiana.

Другие предпочтительные растения включают травы C4 такой как, в дополнение к указанным выше, Andropogon gerardi, Bouteloua curtipendula, B. gracilis, Buchloe dactyloides, Schizachyrium scoparium, Sorghastrum nutans, Sporobolus cryptandrus; травы C3, такие как Elymus canadensis, бобовые Lespedeza capitata и Petalostemum villosum, полукустарник Aster azureus; и древесные растения, такие как Quercus ellipsoidalis и Q. macrocarpa. Другие предпочтительные растения включают травы C3.

В предпочтительном варианте осуществления растение является покрытосемянным растением.

В варианте осуществления растение является масличным растением, предпочтительно масличным культурным растением. При использовании в настоящем документе "масличное растение" является видом растения, используемым для промышленного производства липида из семян растения. Масличное растение может быть, например, масличным рапсом (таким как канола), кукурузой, подсолнечником, сафлором, соей, сорго, льном (льном обыкновенным) или сахарной свеклой. Кроме того, масличное растение может быть другим растением Brassica, хлопком, арахисом, маком, брюквой, горчицей, клещевиной, кунжутом, сафлором, Jatropha curcas или ореховым растением. Растение может вырабатывать высокие уровни липидов в плодах, как олива, масличная пальма или кокос. Плодовоовощными растениями, к которым может быть применено настоящее изобретение, являются салат-латук, цикорный салат или овощные культуры Brassica, включая капусту, брокколи или цветную капусту. Настоящее изобретение может применяться в отношении табака, тыквы, моркови, клубники, томатов или перца.

В предпочтительном варианте осуществления трансгенное растение является гомозиготным по каждому гену, который был введен (трансгену), чтобы его потомство не расщеплялось на требуемый фенотип. Трансгенное растение также может быть гетерозиготным по введенному трансгену(ам), предпочтительно однородно гетерозиготным по трансгену, таким как, например, в потомстве F1, которое были выращено из гибридного семени. Такие растения могут обеспечивать преимущества, такие как гибридная сила, известная в уровне техники.

Трансформация

Молекулы РНК, раскрытые в настоящем документе, могут быть стабильно введены в вышеуказанные клетки-хозяева и/или не относящиеся к человеку организмы, такие как растения. Во избежание неопределенности пример настоящего описания охватывает вышеуказанное растение, стабильно трансформированное молекулой РНК, раскрытой в настоящем документе. При использовании в настоящем документе термины "стабильная трансформация", "стабильно трансформированный" и их вариации относятся к интеграции молекулы РНК или нуклеиновой кислоты, кодирующей ее, в геном клетки, в результате чего они передаются клеткам потомства во время деления клеток без необходимости в положительном отборе на их присутствие. Стабильные транформанты или их потомство могут быть идентифицированы любым способом, известных в уровне техники, таким как Саузерн-блоттинг на хромосомной ДНК или гибридизация in situ геномной ДНК, которые позволяют производить их отбор.

Трансгенные растения могут быть получены с помощью методов, известных в уровне техники, таких как методы, описанные в общем виде в Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), и Christou and Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004).

В варианте осуществления растения могут быть трансформированы путем нанесения молекулы РНК согласно настоящему раскрытию на поверхность растения или его части. Например, молекула РНК может быть представлена в виде состава с подходящим носителем и распылена, напылена или иным образом нанесена на поверхность растения или его части. Таким образом, в примере способы настоящего изобретения охватывают введение молекулы РНК, раскрытой в настоящем документе, в растение, где способ включает нанесение композиции, содержащей молекулу РНК, на поверхность растения или его части.

Агробактериальный перенос представляет собой широко применяемую систему введения генов в клетки растений, поскольку ДНК можно вводить в клетки всего растения, ткани, органы растения или эксплантаты в культуре ткани либо для их транзиентной экспрессии, либо для стабильной интеграции ДНК в геном клетки растения. Например, могут использоваться методы с погружением цветков (in planta). Применение агробактериальных растительных интеграционных векторов для введения ДНК в клетки растений известно в уровне техники. Область ДНК, которая будет перенесена, определяется бордерными последовательностями, а расположенная межу ними ДНК (T-ДНК) обычно встраивается в геном растения. Этот метод предпочтителен из-за удобной и определенной природы переноса генов.

Методы ускорения, которые могут использоваться, включают, например, бомбардировку микрочастицами и т.п. Одним примером способа доставки трансформирующих молекул нуклеиновой кислоты в растительные клетки является бомбардировка микрочастицами. Этот метод был описан в обзоре Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994). Небиологические частицы (микрочастицы) могут быть покрыты нуклеиновыми кислотами и доставлены в клетки, например, незрелые зародыши, под действием толкающей силы. Примеры частиц включают частицы из вольфрама, золота, платины и т.п.

В другом способе могут быть стабильно трансформированы пластиды. Способы, раскрытые для трансформации пластид в высших растениях, включают баллистическую доставку частиц с ДНК, содержащей селективный маркер и направление ДНК в геном пластид путем гомологичной рекомбинации (US 5,451,513, US 5,545,818, US 5,877,402, US 5,932479 и WO 99/05265). Другие методы трансформации клеток также могут использоваться и включают, без ограничения перечисленными, введение ДНК в растения путем прямого переноса ДНК в пыльцу, прямой инъекции ДНК в репродуктивные органы растения или прямой инъекции ДНК в клетки незрелых зародышей, с последующей регидратацией высушенных зародышей.

Регенерация, развитие и культивирование растений из одиночных трансформантов протопластов растения или из различных трансформированных эксплантатов хорошо известны в данной области техники (Weissbach et al., в публикации: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif. (1988)). Этот процесс регенерации и выращивания обычно включает этапы отбора трансформированных клеток, выращивания этих обособленных клеток на обычных стадиях развития зародыша до стадии укоренившегося проростка. Трансгенные зародыши и семена регенерируют одинаково. Полученные трансгенные укоренившиеся проростки затем выращивают в подходящей среде для выращивания растений, такой как грунт.

Развитие или регенерация растений, содержащих чужеродный, экзогенный ген, хорошо известны в уровне техники. Предпочтительно, регенерированные растения являются самоопыляемыми с получением гомозиготных трансгенных растений. Или же пыльцу, полученную из регенерированных растений, скрещивают с выращенными из семян растениями агрономически важных линий. И наоборот, пыльцу из растений этих важных линий используют для опыления регенерированных растений. Трансгенное растение настоящего изобретения, содержащее требуемый полинуклеотид, выращивают с применением способов, хорошо известных специалистам в данной области.

Для подтверждения присутствия трансгенов в трансгенных клетках и растениях может быть проведена амплификация методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) или Саузерн-блот анализ с применением способов, известных специалистам в данной области. Продукты экспрессии трансгенов могут быть обнаружены любым из различных способов, в зависимости от природы продукта, которые включают Нозерн-блот гибридизацию, Вестерн-блоттинг и ферментный анализ. После получения трансгенных растений они могут быть выращены с получением тканей или частей растения, обладающих требуемым фенотипом. Ткань растения или части растения могут быть собраны, и/или собраны семена. Семена могут служить в качестве источника для выращивания дополнительных растений с тканями или частями, обладающими нужными характеристиками. Предпочтительно, вегетативные части растения собирают в тот момент, когда выход неполярных липидов является наиболее высоким. В одном варианте осуществления вегетативные части растения собирают примерно во время цветения или после начала цветения. Предпочтительно части растения собирают приблизительно во время начала старения, обычно проявляющегося пожелтением и высыханием листьев.

Трансгенные растения, полученные с помощью агробактериальных или других способов трансформации, обычно содержат один генетический локус на одной хромосоме. Такие трансгенные растения могут именоваться гемизиготными по добавленному гену(ам). Более предпочтительным является трансгенное растение, которое является гомозиготным по добавленному гену(ам), то есть трансгенное растение, которое содержит два добавленных гена, один ген в одном и том же локусе на каждой хромосоме в хромосомной паре. Гомозиготное трансгенное растение может быть получено при самооплодотворении гемизиготоного трансгенного растения, проращивании некоторых полученных семян и анализе полученных растений на присутствие гена, представляющего интерес.

Следует также понимать, что два разных трансгенных растения, которые содержат два независимо расщепляющихся экзогенных гена или локуса, также могут скрещиваться (сочетаться) с получением потомства, которое содержит оба набора генов или локусов. Самоопыление соответствующего потомства F1 может давать растения, которые являются гомозиготными по обоим экзогенным генам или локусам. Также предусмотрено обратное скрещивание с родительским растением и ауткроссинг с нетрансгенным растением, как и вегетативное размножение. Аналогичным образом, трансгенное растение может быть скрещено со вторым растением, включающим генетическую модификацию, такую как мутантный ген, после чего идентифицируют потомство, содержащее и трансген, и генетическую модификацию. Описания других способов скрещивания, которые обычно используются для различных признаков и культур, можно найти в публикации Fehr, In: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).

Композиции

Молекулы РНК согласно настоящему изобретению могут быть предоставлены в виде различных композиций. Например, молекулы РНК могут быть в твердой форме, в форме мази, геля, крема, порошка, пасты, суспензии, коллоида, пены или аэрозоля. Твердые формы могут включать дусты, порошки, гранулы, пеллеты, пилюли, пастилки, таблетки, наполненные пленки (включая покрытия семян) и т.п., которые могут быть воднодиспергируемыми ("смачиваемыми"). В одном примере композиция находится в форме концентрата.

В примере молекулы РНК могут быть предоставлены в виде композиции для нанесения. В примере композиция стабилизирует молекулу РНК в композиции и/или in vivo. Например, молекулы РНК могут быть предоставлены в липидной композиции. Например, молекулы РНК могут быть предоставлены в липосомах. В примере композиция включает средство, способствующее трансфекции.

При использовании в настоящем документе термин "активатор трансфекции" относится к композиции, добавляемой к молекуле РНК для усиления поглощения клеткой, в том числе, без ограничения перечисленными, растительной клеткой, клеткой насекомого или клеткой гриба. Может использоваться любой активатор трансфекции, известный в данной области, подходящий для трансфекции клеток. Примеры включают катионный липид, такой как один или более из DOTMA (N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N, N,N-триметиламмонийхлорид), DOTAP (1,2-бис(олеоилокси)-3-3-(триметиламмоний)пропан), DMRIE (1,2-димиристилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмонийбромид), DDAB (диметилдиоктадециламмонийбромид), липоспермины, в частности DOSPA (2,3-диолеилокси-N-[2(сперминкарбоксамидо)этил]-N, N-диметил-1-пропанаминийтрифторацетат) и DOSPER (1,3-диолеоилокси-2-(6-карбоксоспермил)-пропиламид и ди- и тетраалкил-тетраметил-спермины, включающие, без ограничения перечисленными, TMTPS (тетраметилтетрапальмитоилспермин), TMTOS (тетраметилтетраолеил-спермин), TMTLS (тетраметилтетралаурилспермин), TMTLS (тетраметилтетралаурилспермин), TMTMS (тетраметилтетрамиристил-спермин) и TMDOS (тетраметилдиолеилспермин). Катионные липиды необязательно комбинируют с некатионными липидами, в частности нейтральными липидами, например, такими липидами, как DOPE (диолеоилфосфатидилэтаноламин), DPhPE (дифитаноилфосфатидил-этаноламин) или холестерин. Неограничивающие примеры подходящих, доступных в продаже реагентов для трансфекции включают Lipofectamine (Life Technologies) и Lipofectamine 2000 (Life Technologies).

В примере молекулы РНК могут быть включены в композиции, подходящие для применения на поле. В примере поле включает растения. Подходящие растения включают культурные растения (например, злаковые и зернобобовые, кукурузу, пшеницу, картофель, тапиоку, рис, сорго, сою, просо, маниок, ячмень или горох) или бобовые. Растения могут быть выращены для производства съедобных корней, клубней, листьев, стеблей, цветков или плодов. В примере культурное растение является злаковым растением. Примеры злаковых растений включают, без ограничения перечисленными, пшеницу, ячмень, овес, сорго и рожь. В этих примерах молекула РНК может быть включена в композицию для введения в растение или любую часть растения любым подходящим способом. Например, композиция может быть приготовлена для введения в листья, стебель, корни, плоды, овощи, зерна и/или бобы растения. В одном примере молекула РНК включена в композицию для введения в листья растения и может распыляться на листья растения.

В зависимости от требуемой композиции молекулы РНК, описанные в настоящем документе, могут быть включены в композицию с множеством других веществ. Примеры веществ включают одно или более суспендирующих веществ, гранулирующих веществ, основ, буферов, веществ, придающих горький вкус, ароматизаторов, консервантов, пропеллентов, тиксотропных веществ, добавок, предохраняющих от замерзания, и красителей.

В других примерах, композиции молекулы РНК могут включать инсектицид, пестицид, фунгицид, антибиотик, репеллент от насекомых, противопаразитное средство, противовирусное средство или нематоцид.

В другом примере молекулы РНК могут быть включены в фармацевтические композиции. Такие композиции, как правило, включают молекулу РНК, описанную в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель. При использовании в настоящем документе фраза "фармацевтически приемлемый носитель" включает растворители, дисперсионные среды, покрытия, противобактериальные и противогрибковые средства, изотонические вещества и вещества, задерживающие абсорбцию, и т.п., совместимые с фармацевтическим применением. В композиции также могут быть включены дополнительные активные соединения.

Фармацевтическую композицию изготавливают совместимой с ее предполагаемым путем введения. Примеры путей введения включают парентеральное, например, внутривенное, внутрикожное, подкожное, ингаляционное, трансдермальное (наружный), чресслизистое, пероральное и ректальное введение.

В одном варианте осуществления активные соединения приготовлены с носителями, которые предохраняют соединение от быстрого выведения из организма, например, в композиции с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Могут использоваться биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этилен-винилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Например, в качестве фармацевтически приемлемых носителей также могут использоваться липосомные суспензии. Они могут быть изготовлены согласно способам, известным специалистам в данной области, например, как описано в US 4,522,811.

Молекулы РНК согласно настоящему изобретению могут быть предоставлены в наборе или упаковке. Например, молекулы РНК, раскрытые в настоящем документе, могут быть упакованы в подходящем контейнере с письменными инструкциями по получению вышеуказанной клетки или организма, или лечению заболевания.

Способы контроля не относящихся к человеку организмов

В примере молекулы РНК согласно настоящему изобретению могут применяться для котроля численности не относящихся к человеку организмов, таких как насекомые. Такие применения включают введение молекулы РНК согласно настоящему изобретению с помощью различных способов. В примере молекулы РНК согласно настоящему изобретению могут быть предоставлены насекомым в виде приманки для поедания насекомыми. В другом примере молекулы РНК могут быть распылены на насекомых, как требуется. В другом примере молекулы РНК могут быть распылены на растение или сельскохозяйственную культуру для защиты указанного растения или сельскохозяйственной культуры от насекомых. Примеры сельскохозяйственных культур включают хлопок, кукурузу, томат, нут, голубиный горох, люцерну, рис, сорго и коровий горох.

В примере молекулы РНК могут быть предоставлены для изменения поведения насекомого. В другом примере молекулы РНК могут быть предоставлены для уничтожения насекомых. В другом примере молекулы РНК могут быть предоставлены для уменьшения плодуктивности насекомого. Примеры насекомых-мишеней включают домовых насекомых. Другие примерные насекомые-мишени включают насекомых, питающихся растительными соками, таких как тли (например, Myzus persicae, Metopolophium dirhodum, Rhopalosiphum padi, Aphis glycines, Aphis fabae). Другие примерные насекомые-мишени включают паукообразных, комаров, эктопаразитов, мух, паутинных клещей, трипсов, клещей, куриных клещей, муравьев, тараканов, термитов, сверчков, включая домовых сверчков, чешуйниц, сеноедов, жуков, уховерток, москитов и блох. Другие примерные насекомые-мишени включают сельскохозяйственных вредителей. Примеры включают вредителей, питающихся соками растений, таких как клопы и тли, грызущих насекомых, таких как гусеницы, жуки, черви, трущие насекомые, такие как трипсы и слизни, моль, мухи, такие как плодовые мушки, вредители зерна, такие как зерновой точильщик, долгоносики и зерновая моль.

В варианте осуществления насекомое притается соком растения. В этом примере молекула РНК может обладать антисмысловой активностью в отношении MpC002 и/или MpRack-1. В варианте осуществления насекомое, притающееся соком растения, является тлей. В другом варианте осуществления тлей является Myzus persicae.

В варианте осуществления насекомое-мишень является муравьем (например, Linepithema humile), хлопковой совкой (Helicoverpa armigera) или мясной мухой (например, Lucilia cuprina). В варианте осуществления насекомым-мишенью является Helicoverpa armigera, и молекула РНК обладает антисмысловой активностью в отношении гена ABC-переносчика white (ABC white). В другом варианте осуществления насекомым-мишенью является Linepithema humile, и молекула РНК обладает антисмысловой активностью в отношении нейропептида активации биосинтеза феромонов (PBAN). В другом варианте осуществления целевым насекомым является Lucilia cuprina, и молекула РНК обладает антисмысловой активностью в отношении одного или более генов, кодирующих белки, выбранные из группы, состоящей из каталитической субъединицы A протонной АТФ-азы V-типа, РНКазы 1/2, хитинсинтазы, рецептора экдизона и гамма-тубулин 1/1-подобного.

В вышеуказанном варианте осуществления композиции и молекулы РНК, раскрытые в настоящем документе, могут быть предоставлены в дозирующем устройстве. В примере дозирующее устройство является ловушкой или приманкой. В варианте осуществления ловушка и/или приманка включает съедобную приманку, включающую молекулу(ы) РНК, раскрытую в настоящем документе.

В варианте осуществления настоящее изобретение охватывает способы контроля поведения насекомых, где способ включает распыление, опыление или иное нанесение молекул РНК, раскрытых в настоящем документе, на насекомых. В этом варианте осуществления молекулы РНК могут быть распылены, напылены или иным образом нанесены непосредственно на насекомых. В другом варианте осуществления молекулы РНК могут быть распылены, напылены или иным образом нанесены на растения или сельскохозяйственные культуры до заражения насекомыми.

В одном варианте осуществления изобретения насекомое или паукообразное могут относиться к следующим отрядам: Acari, Arachnida, Anoplura, Blattodea, Coleoptera, Collembola, Dermaptera, Dictyoptera, Diplura, Diptera, Embioptera, Ephemeroptera, Grylloblatodea, Hemiptera, Heteroptera, Homoptera, Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Mecoptera, Neuroptera, Odonata, Orthoptera, Phasmida, Phithiraptera, Plecoptera, Protura, Psocoptera, Siphonaptera, Siphunculata, Thysanura, Sternorrhyncha, Strepsiptera, Thysanoptera, Trichoptera, Zoraptera и Zygentoma.

В предпочтительных, но не ограничивающих, вариантах осуществления изобретения насекомое или паукообразное выбрано из группы, состоящей из следующего: (1) Acari: клещи, включая Ixodida (клещи) (2) Arachnida: Araneae (пауки) и Opiliones (сенокосцы), примеры: Latrodectus mactans (черная вдова) и Loxosceles recluse (коричневый паук-отшельник) (3) Anoplura: вши, такие как Pediculus humanus (человеческая вошь) (4) Blattodea: тараканы, в том числе рыжий таракан (Blatella germanica), рода Periplaneta, в том числе американский таракан (Periplaneta americana) и австралийский таракан (Periplaneta australiasiae), рода Blatta, в том числе восточный таракан (Blatta orientalis) и рода Supella, включая коричневополосого таракана (Supella longipalpa). Наиболее предпочтительной мишенью является рыжий таракан (Blatella germanica). (5) Coleoptera: жуки, примеры включают в себя: семейство бострихоидных (семейство Bostrichoidea); Dendroctonus spp. (лубоед, южный сосновый жук, короед); кожееды (Anthrenus spp, Attagenus spp); усач домовый (семейство Cerambycidae: Hylotrupes bajulus); Anobium punctatum; Tribolium spp (мучной жук); Trogoderma granarium (кожеед зерновой); Oryzaephilus sarinamensis (суринамский рисоед) и т.д. (книжная моль) (6) Dermaptera: семейство уховерток (7) Diptera: комары (Culicidae) и мухи (Brachycera), примеры: Anophelinae, такие как Anopheles spp. и Culicinae, такие как Aedes fulvus; Tabanidae, такие как Tabanus punctifer (западный слепень), Glossina morsitans morsitans (муха цеце), бабочницы (Psychodidae) и Calyptratae, такие как Musca domestica (комнатная муха), мухи (семейство Sarcophagidae) и т.д. (8) Heteroptera: клопы, такие как Cimex lectularius (постельный клоп) (9) Hymenoptera: осы (Apocrita), включая муравьев (Formicoidea), пчел (Apoidea): Solenopsis invicta (красный огненный муравей), Monomorium pharaonis (фараонов муравей), Camponotus spp (муравьи-плотники), Iasius niger (черный садовый муравей), Tetramorium caespitum (дерновый муравей), Myrmica rubra (красный муравей), Formica spp (древесные муравьи), Crematogaster lineolata (муравей-акробат), Iridomyrmex humilis (аргентинский муравей), Pheidole spp. (Крупноголовые муравьи), Dasymutilla occidentalis (бархатный муравей) и т.д. (10) Isoptera: термиты, примеры включают: Amitermes floridensis (флоридский подземный темнокрылый термит), восточный подземный термит (Reticulitermes flavipes), R. hesperus (западный подземный термит), Coptotermes formosanus (тайваньский подземный термит), Incisitermes minor (западный древесный термит), Neotermes connexus (лесной термит) и Termitidae (11) Lepidoptera: моль, примеры включают: Tineidae и Oecophoridae, например, Tineola bisselliella (платяную моль) и Pyralidae, такие как Pyralis farinalis (огневку мучную) и т.д. (12) Psocoptera: сеноеды (13) Siphonaptera: блохи, такие как Pulex allerans (14) Sternorrhyncha: тля (Aphididae) (15) Zygentoma: чешуйницы, примеры: Thermobia domestica и Lepisma saccharina.

Другие целевые насекомые или паукообразные включают домовых насекомых, эктопаразитов и насекомых и/или паукообразных, важных в отношении здравоохранения и гигиены, таких как, в качестве примера, но не ограничения, мухи, паутинные клещи, трипсы, клещи, куриный клещ, муравьи (например, при направленном воздействии на PBAN), тараканы, термиты, сверчки, включая домовых сверчков, чешуйницы, сеноеды, жуки, уховертки, комары и блохи. Более предпочтительными мишенями являются тараканы (Blattodea), такие как Blatella spp. (например, Blatella germanica (рыжий таракан)), Periplaneta spp. (например, Periplaneta americana (американский таракан) и Periplaneta australiasiae (австралийский таракан)), Blatta spp. (например, Blatta orientalis (восточный таракан)) и Supella spp. (например, Supella longipalpa (коричневополосый таракан); муравьи (Formicoidea), такие как, без ограничения перечисленными, виды Solenopsis (например, Solenopsis invicta (красный огненный муравей)), виды Monomorium (например, Monomorium pharaonis (фараонов муравей)), виды Camponotus (например, Camponotus spp (муравьи-плотники)), виды Lasius (например, Lasius niger (черный садовый муравей)), виды Tetramorium (например, Tetramorium caespitum (дерновый муравей)), виды Myrmica (например, Myrmica rubra (красный муравей)), Formica spp (древесные муравьи), Crematogaster spp. (например, Crematogaster lineolata (муравей-акробат)), Iridomyrmex spp. (например, Iridomyrmex humilis (аргентинский муравей)), Pheidole spp. (крупноголовые муравьи) и Dasymutilla spp. (например, Dasymutilla occidentalis (бархатный муравей)), термиты (Isoptera и/или Termitidae), такие как, без ограничения перечисленными, виды Amitermes (например, Amitermes floridensis (флоридский подземный темнокрылый термит)), виды Reticulitermes (например, Reticulitermes flavipes (восточный подземный термит), Reticulitermes hesperus (западный подземный термит)), виды Coptotermes (например, Coptotermes formosanus (тайваньский подземный термит), Incisitermes spp. (например, Incisitermes minor (западный древесный термит)), Neotermes spp. (например, Neotermes connexus (лесной термит)).

В варианте осуществления целевая РНК кодирует ацетолактатсинтазу насекомого.

Молекулы РНК согласно изобретению при доставке и/или экспрессии в растении могут обладать широким спектром желательных свойств, которые влияют, например, на агрономический признак, устойчивость к насекомым (например, в результате направленного воздействия на такие гены, как MpC002, MpRack-1 и ген ABC-переносчика), устойчивость к болезням (например, в результате направленного воздействия на такие гены, как LanR или MLO), устойчивость к гербицидам, стерильность, характеристики зерна и т.п. Молекула РНК-мишени может участвовать в метаболизме масла, крахмала, углеводов, питательных веществ и т.д., или может отвечать за синтез белков, пептидов, жирных кислот, липидов, частоту рекомбинации (в результате направленного воздействия на такие гены, как DDM1 и FANCM), восков, масел (в результате направленного воздействия на такие гены, как TOR), крахмалов, сахаров, углеводов, вкусовых и ароматических веществ, токсинов, каротиноидов, гормонов (в результате направленного воздействия на такие гены, как EIN2, NCED1 и NCED2), полимеров, флавоноидов (в результате направленного воздействия на такой ген как халконсинтаза), запасных белков, фенольных кислот, алкалоидов, лигнинов, дубильных веществ, целлюлоз, гликопротеинов, гликолипидов и др.

В конкретном примере растения вырабатывают повышенные уровни ферментов для продукции масел в растениях, таких как Капустные, например, рапс или подсолнечник, сафлор, лен, хлопок, соя или кукуруза; ферментов, участвующих в синтезе крахмала в растениях, таких как картофель, кукуруза и злаки, такие как пшеница, ячмень или рис; ферментов, которые синтезируют, или белков, которые сами представляют собой, природные лекарственные средства, такие как фармацевтические или ветеринарные продукты.

В другом варианте осуществления молекула РНК согласно настоящему изобретению направлена на профилактическое или терапевтическое лечение инфекции, вызванной грибковым патогеном, выбранным из группы, состоящей из следующих: Altemaria spp.; Armillaria mellae; Arthrobotrys oligosporus; Blumeria graminis (в результате направленного воздействия на гены Mlo с применением молекулы РНК, описанной в Примере 17), Boletus granulatus; Botritis cinerea; Botrytis fabae; Candida albicans; Claviceps purpurea; Cronartium ribicola; Epicoccum purpurescens; Epidermophyton floccosum; Fomes annosus; Fusarium oxysporum; Gaeumannomyces graminis var. tritici; Glomerella cingulata; Gymnosporangium juniperi-virginianae; Microsporum canis; Monilinia fructicola; Physoderma alfalfae; Phytopthera infestans; Pityrosporum orbiculare (Malassezia furfur); Polyporus sulphureus; Puccinia spp.; Saccharomyces cerevisiae; Septoria apiicola; Trichophyton rubrum; T. mentagrophytes; Ustilago spp .; Venturia inaequalis; и Verticillium dahliae.

Примеры состояний, подлежащих лечению

Молекулы РНК согласно настоящему изобретению могут применяться в способах различных состояний. В некоторых примерах настоящее изобретение относится к способу лечения рака, включающему введение молекулы РНК, раскрытой в настоящем документе. Термин "рак" относится или описывает физиологическое состояние у млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом/пролиферацией клеток. Примеры рака включают, без ограничения перечисленным, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз или лимфоидные злокачественные новообразования. Более конкретные примеры таких форм рака включают, без ограничения перечисленными, плоскоклеточный рак (например, эпителиальный плоскоклеточный рак), рак легкого, включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, аденокарциному легкого и плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, гепатоцеллюлярный рак, рак желудка, включая рак желудочно-кишечного тракта и стромальный рак желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичника, рак печени, рак мочевого пузыря, рак мочевыводящих путей, гепатому, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак прямой кишки, рак толстой и прямой кишки, рак эндометрия или матки, карциному слюнной железы, рак почки, рак предстательной железы, рак вульвы, рак щитовидной железы, карциному печени, карциному анального канала, карциному полового члена, меланому, поверхностную распространяющуюся меланому, злокачественную лентиго-меланому, акральную лентигинозную меланому, узловую меланому, множественную миелому и B-клеточную лимфому (включая низкодифференцированную/фолликулярную неходжкинскую лимфому (НХЛ); лимфому из мантийных клеток; СПИД-ассоциированную лимфому; и макроглобулинемию Вальденстрема); хронический лимфолейкоз (ХЛЛ); острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ); волосатоклеточный лейкоз; хронический миелобластный лейкоз; и посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение (PTLD), а также аномальную пролиферацию сосудов, связанную с факоматозами, отеками (такими как отеки, ассоциированные с опухолями головного мозга), синдром Мейгса, раком головного мозга, а также рак головы и шеи, и ассоциированные метастазы. Таким образом, в примере настоящее изобретение относится к способу лечения рака молочной железы, яичников, толстой кишки, предстательной железы, легкого, мозга, головного кожи, печени, желудка, поджелудочной железы или гемобластоза.

В других примерах способ, описанный в настоящем документе, применяется для лечения онкологических заболеваний, связанных с мутациями в генах BRCA1, BRCA2, PALB2 или RAD51B, RAD51C, RAD51D или родственных генах. В других примерах способ, описанный в настоящем документе, применяется для лечения онкологических заболеваний, связанных с мутациями в генах, связанными с репарацией неспаренных оснований ДНК, таких как MSH2, MLH1, PMS2, и родственных генах. В других примерах способ, описанный в настоящем документе, применяется для лечения онкологических заболеваний с сайленсингом генов репарации ДНК, таких как BRCA1, MLH1 или RAD51B, RAD51C, или RAD51D.

В других примерах изобретения способ, описанный в настоящем документе, применяется для уничтожения клеток с нарушенными процессами репарации ДНК. Например, клетки со сниженной репарацией ДНК могут аберрантно экспрессировать ген, участвующий в репарации ДНК, синтезе ДНК или гомологичной рекомбинации. Примеры генов включают: XRCC1, ADPRT (PARP-1), ADPRTL2, (PARP-2), БЕТА-ПОЛИМЕРАЗУ, CTPS, MLH1, MSH2, FANCD2, PMS2, p53, p21, PTEN, RPA, RPAl, RPA2, RPA3, XPD, ERCC1, XPF, MMS19, RAD51, RAD51B, RAD51C, RAD51D, DMC1, XRCCR, XRCC3, BRCA1, BRCA2, PALB2, RAD52, RAD54, RAD50, MREU, NB51, WRN, BLM, KU70, KU80, банкомат, ATR CPIK1, CHK2, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, RAD1 и RAD9. В примере способ, описанный в настоящем документе, применяется для уничтожения клеток с мутантным геном-супрессором опухоли. Например, клетки могут иметь одну или более мутаций в BRCAl или BRCA2.

В других примерах изобретения способ, описанный в настоящем документе, применяется для лечения трансформированных вирусом клеток. В других примерах изобретения способ, описанный в настоящем документе, применяется для уничтожения клеток, трансформированных латентным вирусом. Примеры латентных вирусов включают ЦМВ, ВЭБ, вирус простого герпеса (1 и 2 типа) и вирус ветряной оспы. В других примерах изобретения способ, описанный в настоящем документе, применяется для лечения активных вирусных инфекций, вызванных вирусами, которые приводят к раку, иммуннодефициту, гепатиту, энцефалиту, пневмониту или респираторным заболеваниям. Примеры вирусов включают парвовирус, поксвирус, вирус герпеса.

В других примерах изобретения способ, описанный в настоящем документе, применяется для лечения вируса Зика, колорадской клещевой лихорадки (вызванной колтивирусом, РНК-вирусом), лихорадки Западного Нила (энцефалита, вызванного флавивирусом, который в основном встречается на Ближнем Востоке и в Африке). Желтой лихорадки, бешенства (вызванного рядом разных штаммов нейротропных вирусов семейства Rhabdoviridae), вирусного гепатита, гастроэнтерита (вирусного) - острого вирусного гастроэнтерита, вызванного вирусами Норуолк и норуолк-подобными вирусами, ротавирусов, калицивирусов и астровирусов, полиомиелита, гриппа, вызванного ортомиксовирусами, которые могут подвергаться частым антигенным вариациям, кори, парамиксовирусов, эпидемического паротита, респираторных синдромов, включая вирусную пневмонию и острые респираторные синдромы, включая круп, вызванные различными вирусами, которые в совокупности называются острыми респираторными вирусами, и респираторных заболеваний, вызванных респираторно-синцитиальным вирусом.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Материалы и методы

Синтез генетических конструкций

Для конструирования типичной конструкции кпРНК была идентифицирована область РНК-мишени длиной примерно 100-1000 нуклеотидов, обычно 400-600 нуклеотидов. В одном примере 5'-половина последовательности и приблизительно 130 нт фланкирующей области и, аналогично, 3'-половина и 130 нт фланкирующей области были ориентированы в антисмысловой ориентации относительно промотора. Эти последовательности прерывали нуклеотидной смысловой последовательностью 400-600 (Фигура 1А). Перед 5'-концом полученной конструкции помещали промотор, такой как промотор РНК-полимеразы T7 или SP6, а 3'-конец включал сайт рестрикции, чтобы обеспечить терминацию транскрипции in vitro.

Для транскрипции в клетках, таких как бактериальные клетки, были включены последовательности промотора и терминатора, чтобы облегчить экспрессию в качестве трансгена, например, с помощью индуцируемого промотора. Длина двухцепочечной области и длина последовательности петли могут быть разными. Конструкции получали с помощью стандартных методов клонирования или заказывали у коммерческих поставщиков.

Синтез РНК

После расщепления рестрикционным ферментом для линеаризации ДНК на 3'-конце, транскрипция с использованием РНК-полимеразы привела к получению 5' и 3'-плечей транскрипта кпРНКи, отжигающегося с центральной последовательностью-мишени, причем молекула содержит центральный стебель или двухцепочечный участок с одним ником и концевыми петлями. Центральная последовательность может быть ориентирована в смысловой или антисмысловой ориентации относительно промотора (Фигура 1А, 1В соответственно).

Для in vitro синтеза, ДНК конструкции расщепляли по 3'-сайту рестрикции с помощью подходящего рестрикционного фермента, осаждали, очищали и количественно определяли. Синтез РНК выполняли с использованием РНК-полимеразы согласно инструкциям производителя. кпРНК ресуспендировали в буфере для отжига (25 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 10 мМ MgCl₂) с использованием обработанной DEPC воды для инактивации следов РНКазы. Выход и целостность РНК, полученной при использовании этого метода, определяли с помощью анализа NanoDrop и гель-электрофореза (Фигура 2), соответственно.

Синтез кпРНК обеспечивали в бактериальных клетках путем введения конструкций в штамм E. coli HT115. Трансформированные культуры клеток индуцировали IPTG (0,4 мМ) для экспрессии РНК-полимеразы T7 с обеспечением транскрипции конструкций кпРНК. Выделение РНК из бактериальных клеток и очистку проводили, как по существу описано в публикации Timmons et al. (2001).

Для транскрипции РНК с Cy3-мечением, смесь рибонуклеотидов (рНТФ) содержала по 10 мМ АТФ, ГТФ, ЦТФ, 1,625 мМ УТФ и 8,74 мМ Cy3-УТФ. Реакции транскрипции инкубировали при 37°C в течение 2,5 часов. Реакции транскрипции (160 мкл) переносили в пробирки Эппендорф, добавляли 17,7 мкл буфера turbo DNase и 1 мкл turbo DNA, и инкубировали при 37°C в течение 10 минут для расщепления ДНК. Затем добавляли 17,7 мкл инактивирующего раствора Turbo DNAse, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут. Смесь центрифугировали в течение 2 минут и переносили супернатант в новую пробирку Эппендорф без РНКаз. Образцы по 1,5 мкл каждой реакции транскрипции подвергали гель-электрофорезу для проверки качества продукта РНК. Обычно наблюдали одну полосу РНК размером 500-1000 пн в зависимости от конструкции. РНК осаждали путем добавления в каждую пробирку: 88,5 мкл 7,5 M ацетата аммония и 665 мкл холодного 100% этанола. Пробирки охлаждали до -20°C в течение нескольких часов или в течение ночи, затем центрифугировали при 4°C в течение 30 мин. Супернатант осторожно удаляли и осадок РНК промывали 1 мл 70% этанола (приготовленнного с безнуклеазной водой) при -20°C и центрифугировали. Осадок сушили и ресуспендировали очищенную РНК в 50 мкл 1× буфера для отжига РНКи. Концентрацию РНК измеряли с помощью метода NanoDrop и хранили при -80°C до использования.

Пример 2. Конструкция кпРНК

Как схематично показано на Фигуре 1A, типичная молекула кпРНК включает смысловую последовательность, которая может считаться двумя смежными смысловыми последовательностями, ковалентно связанными и обладающими идентичностью с РНК-мишенью, антисмысловую последовательность, которая комплементарна смысловой последовательности и которая разделена на две области и две петли, отделяющие смысловую от антисмысловой последовательности. Конструкция ДНК, кодирующая эту форму кпРНК таким образом, включает, в порядке от 5' к 3', промотор для транскрипции кодирующей области кпРНК, первую антисмысловую область, обладающую комплементарностью с областью в направлении 5'-конца РНК-мишени, первую последовательность петли, смысловую последовательность, вторую последовательность петли, затем вторую антисмысловую область, обладающую комплементарностью с областью в направлении 3'-конца РНК-мишени, и наконец средство терминации транскрипции. В этой конфигурации две антисмысловых последовательности фланкировали смысловую последовательность и последовательности петли. В ходе транскрипции две области антисмысловой последовательности отжигаются со смысловой последовательностью, образуя стебель дцРНК с двумя фланкирующими петлями.

В другой, но родственной, форме кпРНК смысловая последовательность разделена на две области, тогда как две антисмысловых области остаются в виде единой последовательности (Фигура 1B). Конструкция ДНК, кодирующая эту вторую форму кпРНК, таким образом, включает, в порядке от 5' к 3', промотор для транскрипции кодирующей области кпРНК, первую смысловую область, обладающую идентичностью с областью в направлении 3'-конца РНК-мишени, первую последовательность петли, антисмысловую последовательность, вторую последовательность петли, затем вторую смысловую область, обладающую идентичностью в отношении 5'-конца РНК-мишени, и, наконец, средство терминации транскрипции. В этой конфигурации две смысловых последовательности фланкированы антисмысловой последовательностью и последовательностями петли.

Без ограничения теорией, из-за наличия замкнутых петель на каждом конце, такие структуры кпРНК будут более устойчивы к экзонуклеазам, чем дцРНК с открытыми концами, образованная между одноцепочечной смысловой и антисмысловой РНК и не имеющая петель, а также по сравнению со шпилечной РНК, имеющей только одну петлю. Кроме того, авторы изобретения предположили, что петля на обоих концах стебля дцРНК позволит Dicer эффективно получать доступ к обоим концам, улучшая, таким образом, процессинг дцРНК с образованием кРНК и повышением эффективности сайленсинга.

В качестве первого примера была создана генетическая конструкция для транскрипции in vitro с использованием РНК-полимеразы T7 или SP6 для образования кпРНК, направленных на гены, кодирующие GFP или GUS. Конструкция ledGFP содержала следующие области в порядке: первая половина антисмысловой последовательности соответствовала нуклеотидам 358-131 кодирующей последовательности GFP (CDS) (SEQ ID NO: 7), первая антисмысловая петля соответствовала нуклеотидам 130-1 CDS GFP, смысловая последовательность соответствовала нуклеотидам 131-591 CDS GFP, вторая антисмысловая петля соответствовала нуклеотидам 731-592 CDS GFP, и вторая половина антисмысловой последовательности соответствовала нуклеотидам 591-359 CDS GFP.

Конструкция ledGUS включила следующие области в порядке: первая половина антисмысловой последовательности соответствовала нуклеотидам 609-357 CDS GUS (SEQ ID NO:8); первая антисмысловая петля соответствовала нуклеотидам 356-197 CDS GUS, смысловая последовательность соответствовала нуклеотидам 357-860 CDS GUS, вторая антисмысловая петля соответствовала нуклеотидам 1029-861 CDS GUS; и вторая половина антисмысловой последовательности соответствовала нуклеотидам 861-610 CDS GUS.

Для получения отдельной цепи смысловой/антисмысловой дцРНК GUS (обычной дцРНК), такую же последовательность-мишень, соответствующую нуклеотидам 357-860 CDS GUS, лигировали между T7 и SP6 промоторами в векторе pGEM-T Easy. Смысловые и антисмысловые цепи транскрибировали отдельно с помощью T7 или SP6 полимераз, соответственно, и отжигали в буфера для отжига после смешивания транскриптов и нагревания смеси для денатурации цепей РНК.

Пример 3. Стабильность кпРНК

Способность кпРНК формировать структуры дцРНК сравнивали с дцРНК, имеющей открытые концы (т.е. не имеющей петель, сформированных при отжиге отдельной одноцепочечной смысловой и антисмысловой РНК), и длинной шРНК. кпРНК, длинную шРНК и смесь смысловой и антисмысловой РНК денатурировали при кипячении и позволяли отжигаться в буфера для отжига (250 мМ Трис-HCl, pH 8,0 и 100 мМ MgCl₂), а затем подвергали электрофорезу в 1,0% агарозном геле в неденатурирующих условиях.

Как показано на Фигуре 2, и GUS кпРНК, и GFP кпРНК давали доминирующую полосу РНК с подвижностью, ожидаемой для двухцепочечной молекулы, что указывало на образование ожидаемой структуры кпРНК. Это отличалось от смеси смысловой и антисмысловой РНК, показавшей лишь слабую полосу для дцРНК, что указывало на то, что большая часть смысловых и антисмысловых РНК не отожигались друг с другом, образуя дцРНК. Образцы шпилечной РНК давали две заметных полосы, что указывало на то, что только часть транскрипта формировала ожидаемую структуру шпилечной РНК. Таким образом, кпРНК оказалась наиболее эффективной при формировании ожидаемой структуры дцРНК.

Способность кпРНК оставаться и распространяться на поверхности листа также сравнивали с дцРНК. GUS кпРНК (ledGUS), при нанесении на нижнюю часть поверхности листа табака, можно было легко обнаружить в необработнной верхней части листа через 24 часа (Фигура 3). Однако отдельная цепь GUS дцРНК (dsGUS) не была обнаружена в необработнной верхней части листа (Фигура 3). Этот результат указывает, что кпРНК более устойчива к деградации, чем дцРНК, и поэтому способна распространяться внутрь тканей листьев растения.

Пример 4. Тестирование кпРНК путем наружной доставки

Способность кпРНК вызывать РНКи после наружной доставки тестировали в растениях Nicotiana benthamiana и Nicotiana tabacum, экспрессирующие репортерный ген GFP или GUS, соответственно. Последовательности GFP и GUS последовательностей-мишеней и кодирующие кпРНК конструкции показаны в SEQ ID NO: 7, 8, 4 и 5, соответственно. Рибонуклеотидная последовательность кодируемых молекул РНК представлена в SEQ ID NO:1 (GFP кпРНК) и 2 (GUS кпРНК).

Для облегчения воспроизводимого и равномерного нанесения кпРНК на поверхности листьев, кпРНК в концентрации 75-100 мкг/мл в 25 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 10 мМ MgCl₂ и Silwet 77 (0,05%) наносили на адаксиальную поверхность листьев с помощью мягкой кисти. Через 6 часов и 3 дня после нанесения кпРНК образцы листьев собирали для анализа направленного сайленсинга гена-мишени.

Нанесение кпРНК против GFP в листьях N. benthamiana и против GUS в листьях N. tabacum привело к четкому снижению на 20-40% и 40-50% соответствующей активности гена-мишени на уровне активности мРНК (GFP) или белка (GUS) через 6 часов после обработки. Однако в этом эксперименте снижение не сохранялось через 3 дня после обработки. Авторы изобретения предположили, что такое наблюдение через 3 дня было, вероятно, связано с некоторыми неспецифическими реакциями трансгенов на обработку дцРНК или рассеивания количества кпРНК. Однако в отдельном эксперименте сайленсинг GUS был обнаружен как на обработанных, так и на дистальных необработанных участках листьев через 24 часа после обработки кпРНК (Фигура 4).

Пример 5. кпРНК-индуцированный сайленсинг эндогенного гена-мишени

В следующем примере кпРНК была разработана для направленного воздействия на мРНК, кодируемую эндогенным геном, а именно геном FAD2.1 N. benthamiana. Последовательности мРНК-мишени FAD2.1 и кодирующей конструкции ledFAD2.1 показаны в SEQ ID NO: 9 и 6 соответственно. Рибонуклеотидная последовательность молекулы кодируемой РНК представлена в SEQ ID NO: 3 (кпРНК FAD2.1 N. benthamiana).

Конструкция кпРНК FAD2.1 состояла из следующего: первая половина антисмысловой последовательности, соответствующей нуклеотидам 678-379 CDS FAD2.1 (Niben101Scf09417g01008.1); первая антисмысловая петля, соответствующая нт 378-242 CDS FAD2.1; смысловая последовательность, соответствующая нт 379-979; вторая антисмысловая петля, соответствующая нт 1115-980; и вторая половина антисмысловой последовательности, соответствующая нт 979-679 CDS FAD2.1.

РНК ledGUS из предыдущего примера использовали параллельно в качестве отрицательного контроля. В первом эксперименте сайленсинг гена-мишени анализировали по уровню мРНК FAD2.1 и по накоплению жирной кислоты C18:1 (Фигура 5). Также анализировали уровень активности родственного гена, FAD2.2. Для каждого образца приблизительно 3 мкг суммарную РНК обрабатывали ДНКазой и обратно транскрибировали при 50°C в течение 50 минут с использованием олиго-дТ праймеров. Реакции останавливали при 85°C в течение 5 минут и разбавляли водой до 120 мкл. С помощью ПЦР-амплификатора Rotor Gene по 5 мкл каждого образца в трех экземплярах исследовали на их относительную экспрессию мРНК FAD 2.1 и FAD 2.2 с использованием геноспецифических праймеров с контролем по гену домашнего хозяйства актину. В последующем эксперименте для подтверждения сайленсинга гена FAD2.1 путем наружного применения РНК ledFAD2.1 также использовали нозерн-блот гибридизацию (Фигура 6).

мРНК FAD2.1 была значимо понижена до уровня, который почти не обнаруживался в тканях листьев, обработанных кпРНК, в моменты времени 2, 4 и 10 часов (Фигура 5). В этом эксперименте было неясно, почему уровень мРНК FAD2.1 не уменьшился так сильно через 6 часа. В повторном эксперименте, показанном на Фигуре 6, сильная даунрегуляция FAD2.1 наблюдалась как через 6, так и через 24 часа, особенно в точке времени 24 часа. Родственный ген FAD2.2, с гомологией последовательности с FAD2.1, также демонстрировал даунрегуляцию в точках времени 2 и 4 часа при воздействии кпРНК (Фигура 5).

Поскольку FAD2.1 и FAD2.2 кодируют Δ12-десатуразы жирных кислот, которые десатурируют олеиновую кислоту до линолевой кислоты, уровни этих жирных кислот исследовали в тканях листьев, обработанных кпРНК. Наблюдали четкое увеличение накопления олеиновой кислоты (18:1) в тканях листьев, обработанных кпРНК, в точки времени 2, 4 и 6 часов, что указывало на уменьшение количества фермента FAD2 (Фигура 5). Таким образом, как кОТ-ПЦР, так и анализ состава жирных кислот показали, что кпРНК индуцирует сайленсинг гена FAD2.1.

Пример 6. Конструкция и тестирование шпилечных РНК, включающих пары оснований G:U или неспаренные нуклеотиды

Модифицированные шпилечные РНК, направленно воздействующие на РНК GUS

Репортерные гены, такие как ген, кодирующий фермент β-глюкуронидазу (GUS), обеспечивают простую и удобную систему анализа, которую можно применять для измерения эффективности сайленсинга генов в эукариотической клетке, в том числе в клетках растений (Jefferson et al., 1987). Поэтому авторы изобретения разработали, получили и протестировали некоторые модифицированные шпилечные РНК на их способность снижать экспрессию гена GUS в качестве гена-мишени, используя подход доставки генов для введения шпилечных РНК в клетки, и сравнили модифицированные шпильки с обычной шпилечной РНК. Обычная шпилечная РНК, используемая в качестве контроля в эксперименте, имела двухцепочечную область длиной 200 последовательных пар оснований, в которой все пары оснований были каноническими парами оснований, то есть парами оснований G:C и A:U без пар оснований G:U, и без каких-либо неспаренных нуклеотидов (некомплементарных оснований) в двухцепочечной области, направленную на такую же 200 нт область молекулы мРНК GUS, что и модифицированные шпилечные РНК. Смысловые и антисмысловые последовательности, которые образовывали двухцепочечную область, были ковалентно связаны спейсерной последовательностью, включающей интрон PDK (Helliwell et al., 2005; Smith et al., 2000), с получением РНК-петли длиной 39 или 45 нуклеотидов (в зависимости от используемой стратегии клонирования) после сплайсинга интрона из первичного транскрипта. Фрагмент ДНК, используемый для антисмысловой последовательности, был фланкирован сайтами рестрикции XhoI-BamHI на 5'-конце и сайтами рестрикции HindIII-KpnI на 3'-конце для легкого клонирования в кассету экспрессии, и каждая смысловая последовательность была фланкирована сайтами рестрикции XhoI и KpnI. Область дцРНК размером 200 пн каждой шпилечной РНК, как для контрольной шпильки, так и для модифицированных шпилек, включала антисмысловую последовательность из 200 нуклеотидов, которая была полностью комплементарна последовательности GUS дикого типа в кодирующей белок области. Эта антисмысловая последовательность, соответствующая нуклеотидам 13-212 SEQ ID NO:10, являлась комплементом нуклеотидов 804-1003 открытой рамки считывания GUS (ORF) (последовательность кДНК предоставлена в SEQ ID NO:8). Таким образом, мРНК-мишень GUS имела длину больше 1900 нт. Длина 200 нуклеотидов для смысловой и антисмысловой последовательностей была выбрана как достаточно малая, чтобы она была достаточно удобной для синтеза фрагментов ДНК с использованием синтетических олигонуклеотидов, но также достаточно длинная, чтобы давать множество молекул рРНК при процессинге Dicer. Являясь частью ORF, последовательность, по-видимому, не содержала криптические сайты сплайсинга или сайты терминации транскрипции.

Получение генетических конструкций

Последовательность 200 пн ORF GUS амплифицировали с помощью ПЦР при использовании пары олигонуклеотидных праймеров GUS-WT-F (SEQ ID NO:52) и GUS-WT-R (SEQ ID NO:53), содержащих сайты XhoI и BamHI или сайты HindIII и KpnI, соответственно, для введения сайтов этих рестриктаз 5' и 3' от последовательности GUS. Амплифицированный фрагмент встраивали в вектор pGEM-T Easy и правильную нуклеотидную последовательность подтверждали секвенированием. Фрагмент GUS вырезали путем расщепления BamHI и HindIII и встраивали по сайтам BamHI/HindIII pKannibal (Helliwell and Waterhouse, 2005), что давало вставку последовательности GUS в антисмысловой ориентации относительно функционально связанного e35S промотора CaMV (Grave, 1992) и терминатора полиаденилирования/транскрипции гена ocs (Ocs-T). Полученный вектор был обозначен pMBW606 и содержал, в порядке от 5' к 3', 35S::PDK Интрон::антисмысловой GUS::кассету экспрессии Ocs-T. Этот вектор был промежуточным вектором, который использовали в качестве базового вектора для сборки четырех конструкций шРНК.

Конструкция hpGUS[wt], содержащая только канонические пары оснований

Для получения вектора, обозначенного hpGUS[wt], кодирующего молекулу шпилечной РНК, используемую в качестве контроля в эксперименте, содержащую только канонические пары оснований, ПЦР-фрагмент GUS длиной 200 пн вырезали из плазмиды pGEM-T Easy с помощью XhoI и KpnI и встраивали по сайтам XhoI/KpnI между 35S промотором и интроном PDK в pMBW606. В результате получали вектор, обозначенный pMBW607, содержащий кассету экспрессии 35S::смысловой GUS[wt]::интрон PDK::антисмысловой GUS::OCS-T. Эту кассету вырезали путем расщепления NotI и встраивали в сайт NotI pART27 (Gleave, 1992) с получением в результате вектора, обозначенного hpGUS[wt], кодирующего канонически спаренную шпилечную РНК, направленно воздействующую на мРНК GUS.

При отжиге на себя в результате гибридизации 200 нт смысловой и антисмысловой последовательностей эта шпилька содержала двухцепочечную область из 200 последовательных пар оснований, соответствующих последовательностям GUS. Каждая из смысловой и антисмысловой последовательностей в кассете экспрессии была фланкирована сайтами рестрикции BamHI и HindIII, присутствующими на 5' и 3'-концах, соответственно, по отношению к смысловой последовательности GUS. При транскрипции нуклеотиды, соответствующие этим сайтам, также могли гибридизоваться, удлиняя двухцепочечную область на 6 пн на каждом конце. После транскрипции кассеты экспрессии и сплайсинга интрона PDK из первичного транскрипта предположили, что структура шпилечной РНК перед каким-либо процессингом Dicer или другими РНКазами будет иметь петлевую структуру из 39 нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность структуры шпилечной РНК, включая ее петлю, представлена в SEQ ID NO:15, при этом ее свободная энергия свертывания по расчетам должна была составлять -471,73 ккал/моль. Следовательно, это была энергетически стабильная шпилечная структура. Свободную энергию вычисляли при использовании "RNAfold" (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi) на основе нуклеотидных последовательностей после сплайсинга последовательности интрона PDK.

При транскрипции с кассеты экспрессии, содержащей 35S промотор и терминатор OCS-T, полученные шпилечные РНК встраивали в более крупную молекулу РНК с добавлением 8 нуклеотидов на 5'-конец и добавлением приблизительно 178 нуклеотидов на 3'-конец, без учета добавления какого-либо поли(A)-хвоста на 3'-конец. Поскольку один и тот же дизайн промотора-терминатора использовали для модифицированных шпилечных РНК, эти молекулы также имели такие удлинения на 5' и 3'-концах. Таким образом, длина молекулы шпилечной РНК после сплайсинга интрона PDH составляла приблизительно 630 нуклеотидов.

Конструкции hpGUS[G:U], включающие пары оснований G:U

Сборку фрагмента ДНК, содержащего такую же смысловую последовательность из 200 нуклеотидов, но в которой все 52 цитидин-нуклеотида (С) соответствующей области GUS дикого типа были заменены тимидиновыми нуклеотидами (Т), проводили путем отжига перекрывающихся олигонуклеотидов GUS-GU-F (SEQ ID NO:54) и GUS-GU-R (SEQ ID NO:55) и ПЦР достройки 3'-концов с использованием высокоточной Taq-полимеразы LongAmp (New England Biolabs, номер по каталогу M0323). Амплифицированный фрагмент ДНК встраивали в вектор pGEM-T Easy и правильную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:11) подтверждали секвенированием. Затем фрагмент ДНК, содержащий модифицированную последовательность, вырезали путем расщепления XhoI и KpnI и встраивали по сайтам XhoI/KpnI базового вектора pMBW606. В результате была получена конструкция, обозначенная pMBW608, содержащая кассету экспрессии 35S::смысловой GUS[G:U]::интрон PDK::антисмысловой GUS::OCS-T. Эту кассету экспрессии вырезали путем расщепления NotI и встраивали в сайт NotI pART27 с получением в результате вектора, обозначенного hpGUS[G:U], кодирующего G:U спаренную молекулу шпилечной РНК.

Эта кассета кодировала шпилечную РНК, направленную на мРНК GUS, и которая при отжиге на себя путем гибридизации 200 нт смысловой и антисмысловой последовательностей содержала 52 пары оснований G:U (вместо пар оснований G:C в hpGUS[wt]) и 148 канонических пар оснований, то есть 26% нуклеотидов двухцепочечной области были включены в пары оснований G:U. 148 канонических пар оснований в hpGUS[G:U] были такими же, как в контрольной шпилечной РНК, в соответствующих положениях, включая 49 пар оснований U:A, 45 пар оснований A:U и 54 пары оснований G:C. Наиболее длинные непрерывные отрезки канонических пар оснований в двухцепочечной области содержали 9 пар оснований. Таким образом, антисмысловая нуклеотидная последовательность hpGUS[G:U] имела идентичную длину (200 нт) и последовательность с антисмысловой последовательностью контрольной шпилечной РНК hpGUS[wt]. После транскрипции кассеты экспрессии и сплайсинга интрона PDK из первичного транскрипта ожидали, что структура шпилечной РНК перед процессингом Dicer или другими РНКазами будет содержать петлевую структуру из 45 нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность шпилечной структуры, включая ее петлю, представлена в SEQ ID NO:16, и ее свободная энергия свертывания по расчетам должна была составлять -331,73 ккал/моль. Что касается hpGUS[wt], то это была энергетически стабильная шпилечная структура, несмотря на присутствие 52 пар оснований G:U, которые по отдельности намного слабее, чем пары оснований G:C в hpGUS[wt].

Выравнивание модифицированной смысловой последовательности GUS (нуклеотиды 9-208 SEQ ID NO:11) с соответствующей областью гена-мишени GUS (SEQ ID NO:14) показано на Фигуре 7.

Конструкции hpGUS[1:4], включающие некоплементарные нуклеотиды в каждом четвертом положении

Был разработан и собран фрагмент ДНК, включающий такую же 200 пн смысловую последовательность, но в которой заменяли каждый четвертый нуклеотид соответствующей последовательности GUS дикого типа. Каждый 4-й нуклеотид в каждом блоке из 4 нуклеотидов (нуклеотиды в положениях 4, 8, 12, 16, 20 и т.д.) заменяли путем замены C на G, G на C, A на T и T на A, другие нуклеотиды оставляли без изменений. Все эти замены были трансверсными заменами, которые, как ожидали, будут оказывать более сильный дестабилизирующий эффект на полученную в результате структуру шпилечной РНК, чем транзиционные замены. Сборку фрагмента ДНК проводили путем отжига перекрывающихся олигонуклеотидов GUS-4M-F (SEQ ID NO:56) и GUS-4M-R (SEQ ID NO:57) и ПЦР достройки 3'-концов с помощью Taq-полимеразы LongAmp. Амплифицированный фрагмент ДНК встраивали в вектор pGEM-T Easy и правильную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:12) подтверждали секвенированием. Фрагмент ДНК, включающий модифицированную последовательность, затем вырезали путем расщепления XhoI и KpnI и встраивали по сайтам XhoI/KpnI базового вектора pMBW606. В результате получали конструкцию, обозначенную pMBW609, содержащую кассету экспрессии 35S::смысловой GUS[1:4]::интрон PDK::антисмысловой GUS::OCS-T. Эту кассету экспрессии вырезали при расщеплении NotI и встраивали в сайт NotI pART27 с получением вектора, обозначенного hpGUS[1:4], кодирующего молекулу шпилечной РНК, содержащую 1:4 некомплементарное основание.

Эта кассета кодировала шпилечную РНК, направленную на мРНК GUS, и которая при отжиге на себя путем гибридизации смысловой и антисмысловой последовательностей содержала 50 некомплементарных нуклеотидов из 200 нт антисмысловой последовательности, включая некомплементарное основание нуклеотида в положении 200. За исключением положения 200, двухцепочечная область шпилечной РНК содержала 150 канонических пар оснований и 49 некомплементарных нуклеотидных пар на протяжении длины 199 нт смысловой и антисмысловой последовательностей, т.е. ожидали, что 24,6% нуклеотидов двухцепочечной области будут некомплементарны друг другу (не будут включены в пары оснований). После транскрипции кассеты экспрессии и сплайсинга интрона PDK из первичного транскрипта ожидали, что структура шпилечной РНК перед процессингом Dicer или другими РНКазами будет содержать петлевую структуру из 45 нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность шпилечной структуры, включая ее петлю, представлена в SEQ ID NO:17, и ее свободная энергия свертывания по расчетам должна составлять -214,05 ккал/моль. Что касается hpGUS[wt], то это была энергетически стабильная шпилечная структура, несмотря на некомплементарные нуклеотиды.

Выравнивание модифицированной смысловой последовательности GUS (нуклеотиды 9-208 SEQ ID NO:12) с соответствующей областью гена-мишени GUS (SEQ ID NO:14) показано на Фигуре 8.

Конструкции hpGUS[2:10], в которых нуклеотиды 9 и 10 из 10 нуклеотидов юыли некомплементарными

Выполняли разработку и сборку фрагмента ДНК, включающего такую же 200 пн смысловую последовательность, но в котором каждый девятый и десятый нуклеотид соответствующей последовательности GUS дикого типа был заменен. Каждый 9-й и 10-й нуклеотид в каждом блоке из 10 нуклеотидов (нуклеотиды в положениях 9, 10, 19, 20, 29, 30 и т.д.) заменяли путем замены C на G, G на C, A на T и T на A, другие нуклеотиды оставляли без изменений. Фрагмент ДНК собирали путем отжига перекрывающихся олигонуклеотидов GUS-10M-F (SEQ ID NO:58) и GUS-10M-R (SEQ ID NO:59) и ПЦР достройки 3'-концов с помощью Taq-полимеразы LongAmp. Амплифицированный фрагмент ДНК встраивали в pGEM-T Easy и правильную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:13) подтверждали секвенированием. Фрагмент ДНК, включающий модифицированную последовательность, затем вырезали путм расщепления XhoI и KpnI и встраивали по сайтам XhoI/KpnI базового вектора pMBW606. В результате получали конструкцию, обозначенную pMBW610, содержащую кассеты экспрессии 35S::смысловой GUS[2:10]::интрон PDK::антисмысловой GUS::OCS-T. Эту кассету экспрессии вырезали при расщеплении NotI и встраивали в сайт NotI pART27 с получением вектора, обозначенного hpGUS[2:10], кодирующего молекулу шпилечной РНК, содержащую 2:10 некомплементарных основания.

Эта кассета кодировала шпилечную РНК, направленную на мРНК GUS, которая при отжиге на себя путем гибридизации смысловой и антисмысловой последовательностей содержала 50 некомплементарных нуклеотидов из 200 нт антисмысловой последовательности, включая некомплементарные основания нуклеотидов в положениях 199 и 200. За исключением положений 199 и 200, двухцепочечная область шпилечной РНК содержала 160 канонических пар оснований и 19 некомплементарных динуклеотидов на протяжении длины 198 нт смысловой и антисмысловой последовательностей, т.е. ожидали, что 19,2% нуклеотидов двухцепочечной области будут некомплементарны друг другу (не включены в пары оснований). 160 пар оснований в hpGUS[2:10] были такими же, как в контрольной шпилечной РНК, в соответствующих положениях, включая 41 пару оснований U:A, 34 пары оснований A:U, 42 G:C и 43 C:G пары оснований. После транскрипции кассеты экспрессии и сплайсинга интрона PDK из первичного транскрипта ожидали, что структура шпилечной РНК перед процессингом Dicer или другими РНКазами будет содержать петлевую структуру из 45 нуклеотидов. Нуклеотидная последовательность шпилечной структуры, включая ее петлю, представлена в SEQ ID NO:18, и ее свободная энергия свертывания по расчетам составляет -302,78 ккал/моль. Что касается hpGUS[wt], то это была энергетически стабильная шпилечная структура, несмотря на некомплементарные нуклеотиды, которые, как ожидалось, выступали из стебля шпилечной структуры.

Выравнивание модифицированной смысловой последовательности GUS (нуклеотиды 9-208 SEQ ID NO:13) с соответствующей областью гена-мишени GUS (SEQ ID NO:14) показано на Фигуре 9.

Четыре генетических конструкции для экспрессии контрольной и модифицированной шпилечных РНК схематично показано на Фигуре 10.

Пример 7. Тестирование модифицированных шпилечных РНК в трансгенных растениях

Растения вида Nicotiana tabacum (табак), трансформированные геном-мишенью GUS, использовали для тестирования эффективности четырех конструкций шпилечных РНК, описанных выше. В частности, растения-мишени были из двух гомозиготных, независимых трансгенных линий, PPGH11 и PPGH24, каждая из которых содержала однокопийную вставку трансгена GUS из вектора pWBPPGH, который схематически показан на Фигуре 11. Ген GUS в Т-ДНК pWBPPGH имел кодирующую область GUS (нуклеотиды 7-1812 SEQ ID NO:8), функционально связанную с промотором длиной 1,3 тпн гена белка флоэмы 2 (PP2) из Cucurbita pepo L. cv. Autumn Gold (Wang et al., 1994; Wang, 1994). Конструкцию pWBPPGH получали путем вырезания промотора PP2 плюс 5'-UTR и 54 нуклеотидов кодирующей области белка PP2, кодирующих первые 18 аминокислот PP2, из лямбда-геномного клона CPP1.3 (Wang, 1994) и слияния этого фрагмента с кодирующей последовательностью GUS, начиная с нуклеотидов, кодирующих 3-ю аминокислоту GUS, с получением слитого на N-конце полипептида, обладающего активностью GUS. Кассету pPP2::GUS:Nos-T встраивали в pWBVec2a (Wang et al., 1998) с получением pWBPPGH, который использовали для трансформации растений Nicotiana tabacum cv. Wisconsin 38 при использовании опосредованной Agrobacterium tumefaciens трансформации листовых дисков (Ellis et al., 1987), отбора по устойчивости к гигромицину. Активность GUS у гомозиготных растений потомства двух трансгенных линий PPGH11 и PPGH24 была сходной. Экспрессия GUS в обоих трансгенных растениях не ограничивалась флоэмой, но присутствовала в большей части тканей растений. Следовательно, экспрессия GUS с промотора PP2 в этих растениях, по-видимому, является конститутивной. Имелись две причины выбора растений PP2-GUS в качестве тестируемых растений: i) они дают относительно высокие уровни экспрессии GUS, примерно такие же, как у растений 35S-GUS; ii) промотор PP2 является эндогенным промотором гена PP2, полученным из Cucurbita pepo, с последовательностью, отличной от промотора 35S, используемого для направления экспрессии шРНК трансгенов, которые, таким образом, не будут подвергаться транскрипционной косупрессии входящим 35S промотором.

Все четыре конструкции шпилечных РНК (Пример 6) использовали для трансформации растений PPGH11 и PPGH24 при использовании Agrobacterium-опосредованного метода с листовыми дисками (Ellis et al., 1987), используя 50 мг/л канамицина в качестве селективного агента. Было обнаружено, что эта система отбора с канамицином, агентом, отличающимся от используемого ранее гигромицина, использованного для введения Т-ДНК pWBPPGH, дает только трансформированные растения без регенерации нетрансформированных растений. Регенерированные трансгенные растения, содержащие T-ДНК из конструкций hpGUS, переносили в почву для выращивания в теплице и выдерживали в течение примерно 4 недель перед анализом активности GUS. При анализе трансгенные растения были здоровыми, активно росли и по внешнему виду были идентичны нетрансформированным контрольным растениям и исходным растениям PPGH11 и PPGH24. Всего было получено 59 трансгенных растений, которые трансформировали Т-ДНК, кодирующей hpGUS[wt], были получены 74 растения, которые были трансформированы Т-ДНК, кодирующей hpGUS[G:U], 33 растения, которые были трансформированы T-ДНК, кодирующей hpGUS[1:4], и 41 растение, которые были трансформированы T-ДНК, кодирующей hpGUS[2:10].

Уровни экспрессии GUS измеряли с помощью флуориметрического анализа с 4-метилумбеллиферил-β-D-глюкуронида (MUG) (Jefferson et al., 1987), согласно модифицированному кинетическому методу, описанному в Chen et al. (2005). Растения анализировали, собирая образцы листьев диаметром примерно 1 см из трех разных листьев на каждом растении, выбирая листья, которые были хорошо развернутыми, здоровыми и зелеными. Были предприняты меры для того, чтобы исследуемые растения находились на одной стадии роста и развития, что и контрольные растения. В каждом анализе использовали по 5 мкг белка, выделенного из каждого образца листа, и измеряли скорость расщепления MUG, как описано в Chen et al. (2005).

Репрезентативные данные показаны на Фигуре 12, на которой показана активность GUS (единицы MUG в анализе) для каждого независимого трансгенного растения. Поскольку данные для конструкции hpGUS[wt] показали, что некоторые растения демонстрировали сильный сайленсинг с уменьшением активности по меньшей мере на 90%, а другие - более слабый сайленсинг, 10% активность GUS по сравнению с контрольными растениями в этом контексте была выбрана в качестве уровня активности для разделения растений на две категории и сравнения разных конструкций.

Генетическая конструкция, кодирующая hpGUS[wt] с канонически спаренными основаниями, индуцировала сильный сайленсинг GUS, при использовании уровня 10% активности в качестве критерия сильного сайленсинга, в 32 из 59 протестированных трансгенных растений (54,2%). Остальные 27 растений показали пониженную активность GUS, но сохранили больше 10% активности фермента по сравнению с контрольными растениями, и поэтому считалось, что они демонстрируют слабый сайленсинг в этом контексте. Трансгенные растения с этой конструкцией демонстрировали широкий диапазон уровня сайленсинга гена GUS (Фигура 12), от активности меньше 1% до приблизительно 80% остаточной активности, что было типично для обычных шпилечных конструкций (Smith et al., 2000).

В отличие от этого, конструкция hpGUS[G:U] индуцировала однородный и единообразный сайленсинг в разных независимых трансгенных линиях, при этом 71 из 74 растений (95,9%), которые были протестированы, демонстрировали сильный сайленсинг GUS. И опять же, в отличие от этого все 33 протестированных растения hpGUS[1:4] показали сниженные уровни активности GUS, причем только 8 (24%) давали <10% активности GUS по сравнению с контрольными растениями, а остальные 25 классифицировали как имеющие более слабый сайленсинг. Эти результаты показали, что эта конструкция индуцировала более слабые, но более единообразные уровни даунрегуляции GUS в трансгенных линиях. Конструкция hpGUS[2:10] действовала более подобно конструкции hpGUS[wt], индуцируя хорошие уровни сайленсинга в некоторых линиях (28 из 41, или 68,3%), и вызывала слабый или вообще не вызывала сайленсинга GUS в остальных 13 растениях.

Когда для сравнения использовали только сайленсированные линии (остаточная активность <10%) и вычисляли среднюю активность GUS, растения hpGUS[wt] продемонстрировали наиболее высокую среднюю степень сайленсинга, после чего следовали по порядку растения hpGUS[G:U] и растения hpGUS [2:10] (Фигура 13). Растения hpGUS[1:4] показали наименьшее среднее снижение активности GUS. Степень сайленсинга GUS показала хорошую корреляцию с термодинамической стабильностью предсказанных структур шРНК, полученных из четырех различных конструкций шРНК (Пример 6).

Для проверки, сохранятся ли различия у растений потомства, репрезентативные трансгенные растения, содержащие как ген-мишень GUS, которые были гомозиготными, так и трансген hpGUS (гемизиготные), самоопыляли. Были отобраны устойчивые к канамицину растения потомства из линий hpGUS, поэтому отбрасывали любые нулевые сегреганты, в которых отсутствовали трансгены hpGUS. Это гарантировало, что трансгены hpGUS присутствовали во всем потомстве, в гомозиготном или гетерозиготном состоянии. Растения потомства исследовали на активность GUS, репрезентативные данные представлены на Фигуре 14. Потомство, содержащее трансгены hpGUS[wt], четко разделялось на две категории, а именно растения, которые имели сильный сайленсинг GUS, и другие, которые демонстрировали слабый сайленсинг или его отсутствие. Эти классы хорошо коррелировали с фенотипом предыдущего поколения, показав, что степень сайленсинга гена-мишени была наследуемой. Все растения в протестированных линиях hpGUS[G:U] постоянно демонстрировали сильный сайленсинг, тогда как растения в линиях hpGUS[1:4] постоянно демонстрировали более слабый сайленсинг. Авторы изобретения пришли к выводу, что фенотипы, наблюдаемые в родительском поколении, обычно сохранялись в растениях потомства.

Эксперименты по Саузерн-блот гибридизации с трансформированными растениями

Однородность сильного сайленсинга генов, наблюдаемая в большом количестве независимых трансгенных растений, полученных с конструкцией hpGUS[G:U], была замечательной, а также удивительной и неожиданной. Авторы изобретения стремились установить, присутствовало ли какое-нибудь другое объяснение однородности сайленсинга кроме эффекта, вызванного РНК hpGUS[G:U]. Чтобы проверить, было ли множество трансгенных растений получено в результате независимых событий трансформации, как и предполагали, проводили эксперименты по Саузерн-блот гибридизации с ДНК, выделенной из 18 репрезентативных трансгенных растений, содержащих конструкцию hpGUS[G:U]. ДНК выделяли из тканей листьев при использовании метода горячего фенола, описанного Wang et al. (2008). Для Саузерн-блот гибридизации приблизительно 10 мкг ДНК из каждого образца растения расщепляли ферментом HindIII, разделяли с помощью гель-электрофореза в 1% агарозном геле в буфере TBE и переносили на мембрану Hybond-N+ с использованием капиллярного метода (Sambrook et al., 1989). Мембрану гибридизовали в течение ночи при 42°C с ³²P-меченным фрагментом ДНК из области терминатора OCS-T. Этот зонд выбрали, поскольку он гибридизовался с трансгеном hpGUS[G:U], но не гибридизовался с геном-мишенью GUS, который не содержал последовательность терминатора OCS-T. Мембрану промывали в условиях высокой жесткости и связавшийся зонд визуализировали с помощью PhosphoImager.

Авторадиограф гибридизованного блота показан на Фигуре 15. Каждая полоса показала от одной до пяти или шести гибридизованных полос. Не было двух дорожек, демонстрирующих одинаковую картину, то есть авторадиография показала, что каждое из 16 репрезентативных растений hpGUS[G:U] имело разные паттерны фрагментов HindIII, которые гибридизовались и, следовательно, были получены из разных вставок трансгена. Авторы изобретения пришли к выводу, что единообразный сайленсинг GUS, наблюдаемый для линий hpGUS[G:U], не был обусловлен сходными паттернами вставки трансгена в растениях, и что однородность сайленсинга была вызвана структурой РНК hpGUS[G:U]. Авторы изобретения также пришли к выводу, что для получения сильного сайленсинга генов не требовалось множество копий трансгена hpGUS[G:U]; одной копии трансгена было достаточно.

Эксперименты по Нозерн-блот гибридизации с трансформированными растениями

Для определения, была ли РНК hpGUS[G:U] процессирована так же, как и контрольная шпилечная РНК в трансгенных растениях, проводили эксперименты по Нозерн-блот гибридизации с РНК, выделенной из листьев трансгенных растений. Эксперименты по Нозерн-блоттингу проводили для обнаружения более коротких РНК (кРНК длиной приблизительно 21-24 нуклеотида), которые образовывались в результате процессинга Dicer шпилечной РНК. Эксперимент проводили на малой РНК, выделенной из трансгенных растений hpGUS[wt] и hpGUS[G:U], которые также содержали ген-мишень GUS, который экспрессировался в виде (смысловой) мРНК. Для анализа кРНК были выбраны по девять растений с каждой конструкцией. Для формирования hpGUS[wt] трансгенной популяции включали растения, демонстрирующие слабый сайленсинг GUS, а также некоторые растения, демонстрирующие сильный сайленсинг GUS. Образцы малой РНК выделяли при использовании метода с горячим фенолом (Wang et al., 2008), Нозерн-блот гибридизацию проводили согласно Wang et al. (2008), а гель-электрофорез образцов РНК проводили в денатурирующих условиях. В качестве зондов использовали ³²Р-меченые РНК, соответствующие либо смысловой последовательности, либо антисмысловой последовательности, соответствующей нуклеотидам 804-1003 SEQ ID NO:8.

Авторадиограф Нозерн-блоттинга, гибридизованного либо с антисмысловым зондом (верхняя панель) для обнаружения смысловых молекул кРНК, полученных из шпилечных РНК, либо гибридизованного со смысловым зондом для обнаружения антисмысловых кРНК (нижняя панель), показан на Фигуре 16. Внизу на Фигуре показана качественная оценка уровня экспрессии GUS по сравнению с контрольными растениями, в которых отсутствовали конструкции hpGUS. Наблюдали гибридизацию с малыми РНК длиной приблизительно 20-25 нуклеотидов, основанную на подвижности кРНК по сравнению с РНК известной длины в других экспериментах. Полосы hpGUS[wt] показали диапазон изменения количества накопления кРНК. Это наблюдали как для смысловой, так и для антисмысловой рРНК, хотя полосы антисмысловой рРНК были не такими четкими, как смысловые полосы. Поскольку растения hpGUS[wt] содержали как трансген hpGUS, экспрессирующий смысловые и антисмысловые последовательности, соответствующие 200 нт области-мишени, так и ген-мишень GUS, экспрессирующий полноразмерный смысловой ген, смысловые кРНК могли быть получены из любой шпилечной РНК или мРНК-мишени. По-видимому, между уровнем рРНК и степенью сайленсинга GUS в растениях hpGUS[wt] присутствует отрицательная корреляция. Например, два растения, представленные на дорожках 4 и 5, накапливали относительно больше кРНК, но демонстрировали лишь умеренную степень даунрегуляции GUS. Напротив, два растения, представленные на дорожках 7 и 8, показали сильный сайленсинг GUS, но накапливали относительно низкие уровни кРНК.

В отличие от растений hpGUS[wt] и в соответствии с относительно единообразной степенью сайленсинга под действием конструкции hpGUS[G:U], растения hpGUS[G:U] накапливали единообразное количество антисмысловых кРНК по всем полосам. Кроме того, степень сайленсинга GUS, по-видимому, показывает хорошую корреляцию с количеством антисмысловой кРНК. В этих растениях практически не было обнаружено смысловых кРНК. Это ожидали, так как РНК-зонд, используемый в Нозерн-блоттинге, транскрибировался с последовательности GUS дикого типа и, следовательно, обладал более низким уровнем комплементарности по отношению к смысловым кРНК из hpGUS[G:U], где все C нуклеотиды были заменены U нуклеотидами, допуская только гибридизацию с более низкой жескостью. Тем не менее, данный эксперимент не исключил возможности того, что РНК hpGUS[G:U] процессировалась с получением меньшего количества смысловых кРНК, или что они быстрее разрушались.

Эксперимент по Нозерн-блот гибридизации повторяли, на этот раз с использованием только смыслового зонда для обнаружения антисмысловых рРНК; авторадиограф показан на Фигуре 17. Опять же, продукция антисмысловых рРНК с конструкции hpGUS[wt] отрицательно коррелирует с активностью GUS (верхняя панель на Фигуре 17). Растения, которые подверглись сильному сайленсингу, давали высокие уровни антисмысловых кРНК (дорожки 1, 3, 5, 8 и 10), тогда как растения, которые демонстрировали лишь слабый сайленсинг или отсутствие сайленсинга, не давали сигнал гибридизации в этом эксперименте (дорожки 2, 4, 6, 7 и 9). В явной противоположности от этого, растения, экспрессирующие hpGUS[G:U], продуцировали значительно меньшее, но однородное количество антисмысловых кРНК. Наблюдение того, что растения с сильным сайленсингом, экспрессирующие hpGUS[G:U], накапливали намного более низкие уровни кРНК, чем растения с сильным сайленсингом, экспрессирующие hpGUS[wt], было любопытным и позволило авторам изобретения сделать предположение, что hpGUS[wt] процессируется по другому механизму в растениях, но все же обладал примерно такой же эффективностью, как и конструкция hpGUS[wt]. Дальнейшее наблюдение в этом эксперименте навело на то, что две относительно слабые антисмысловые полосы для растений hpGUS[G:U], по-видимому, имели такую же подвижность, как вторая и четвертая полосы, наблюдаемые для антисмысловых полос кРНК от hpGUS[wt]. Это было подтверждено в последующих экспериментах, описанных ниже. Авторы изобретения предположили, что четыре полосы для кРНК из hpGUS[wt] представляют 24-, 22-, 21- и 20-меры, и что РНК hpGUS[G:U] процессировалась главным образом с получением 22- и 20-мерных антисмысловых рРНК.

Важный, определенный вывод из данных, описанных выше, состоял в том, что молекула РНК hpGUS[G:U] процессировалась одним или несколькими ферментами Dicer с получением кРНК, в частности продукции антисмысловых кРНК, которые считаются медиаторами РНК-интерференции в присутствии различных белков, таких как Argonaute. Наблюдаемая продукция антисмысловых кРНК указывала, что также образовывались смысловые кРНК, но в экспериментах не определяли различия между деградацией/нестабильностью смысловых кРНК или неэффективным обнаружением смысловых кРНК из-за недостаточной гибридизации с зондом, который использовался. В результате этих экспериментов авторы изобретения также пришли к выводу, что в процессинге молекул РНК hpGUS[wt] и hpGUS[G:U] имеются четкие различия. Это указывало на то, что молекулы по-разному распознавались одной или несколькими рибонуклеазами Dicer.

Пример 8. Анализ кРНК из трансгенных растений, экспрессирующих модифицированные шпилечные РНК

Другой эксперимент по Нозерн-блот гибридизации проводили для обнаружения антисмысловых кРНК из hpGUS[G:U] растений и сравнения их размеров с размерами кРНК, полученных из hpGUS[wt]. Авторадиограф показан на Фигуре 18. В этот раз различие в размере двух полос антисмысловой кРНК из hpGUS[G:U] по сравнению с двумя основными полосами из hpGUS[wt] было более выраженным. Это лучше всего было заметно при сравнении подвижности полос в соседних дорожках 9 и 10 на Фигуре 18. Этот результат подтвердил, что две шпилечные РНК процессировались по-разному одной или несколькими рибонуклеазами Dicer в растениях.

Для дальнейшего изучения этого, небольшие популяции РНК из hpGUS[wt] и hpGUS[G:U] исследовали путем глубокого секвенирования суммарных линкер-амплифицируемых кРНК, выделенных из растений. Определяли частоту кРНК, которые были картированы в двухцепочечных областях шпилечной РНК. Также определяли распределение длины таких кРНК. Результаты показали увеличение частоты 22-мерных антисмысловых РНК из конструкции hpGUS[G:U] по сравнению с конструкцией hpGUS[wt]. Увеличение доли кРНК длиной 22 нт указывает на сдвиг в процессинге шпилечной hpGUS[G:U] рибонуклеазой Dicer-2 по сравнению с hpGUS[wt].

Пример 9. Анализ метилирования ДНК трансгенов в растениях

Наблюдения относительно вариабельности степени сайленсинга GUS, вызванного hpGUS[wt], и того, что антисмысловые 24-мерные кРНК были обнаружены в растениях hpGUS[wt], но, по-видимому, не в растениях hpGUS[G:U], привело авторов изобретения к вопросу, различались ли эти две популяции растений по уровню метилирования ДНК гена-мишени GUS. Считается, что сиквенс-специфические 24-мерные кРНК участвуют в стимуляции метилирования ДНК структур инвертированных повторов в растениях (Dong et al., 2011). Поэтому авторы изобретения исследовали уровни метилирования ДНК трансгена GUS в растениях hpGUS, в частности, в области 35S промотора гена, кодирующего шпильку (гена сайленсинга).

Для этого использовали зависимую от метилирования ДНК эндонуклеазу McrBC. McrBC является доступной в продаже эндонуклеазой, которая расщепляет ДНК, содержащую основания метилцитозина (^mC), на одной или обеих цепях двухцепочечной ДНК (Stewart et al., 2000). McrBC распознает сайты на ДНК, которые состоят из двух полусайтов формы 5'-(G или A)^mC-3', предпочтительно G^mC. Эти полусайты могут быть разделены несколькими сотнями пар оснований, но оптимальный интервал составляет от 55 до приблизительно 100 пн. Двухцепочечная ДНК, содержащая такие связанные динуклеотиды G^mC на обеих цепях, служит в качестве лучшего субстрата. Активность McrBC зависит от метилирования одного или обоих GC динуклеотидов. Поскольку растительная ДНК может быть метилирована по C в последовательностях CG, CHG или CHH, где H означает A, C или T (Zhang et al., 2018), расщепление ДНК при использовании McrBC с последующей ПЦР-амплификацией ген-специфических последовательностей может использоваться для обнаружения присутствия или отсутствия ^mC в специфических последовательностях ДНК в геномах растений. В этом анализе ПЦР-амплификация расщепленной McrBC геномной ДНК, которая метилирована, дает сниженные количества продукта амплификации по сравнению с ДНК, которая не метилирована, но будет давать такое же количество ПЦР-продукта, что и необработанная ДНК, если ДНК не метилирована.

Геномную ДНК выделяли с помощью стандартных методов из растений, содержащих конструкцию hpGUS[wt], hpGUS[G:U] или hpGUS[1:4] в дополнение к гену-мишени GUS (Draper and Scott, 1988). Очищенные образцы ДНК обрабатывали McrBC (номер по каталогу M0272; New England Biolabs, Massachusetts) согласно инструкциям производителя, включая присутствие иона Mg²⁺ и ГТФ, необходимых для эндонуклеазной активности. Вкратце, приблизительно 1 мкг геномной ДНК расщепляли McrBC в течение ночи в объеме реакции 30 мкл. Расщепленные образцы ДНК разбавляли до 100 мкл и представляющие интерес области ПЦР-амплифицировали следующим образом.

Обработанные образцы ДНК использовали в реакциях ПЦР с использованием следующих праймеров. Для последовательности соединения 35S-GUS для hpGUS[wt]: Прямой праймер (35S-F3), 5'-TGGCTCCTACAAATGCCATC-3' (SEQ ID NO:60); Обратный праймер (GUSwt-R2), 5'-CARRAACTRTTCRCCCTTCAC-3' (SEQ ID NO:61). Для последовательности соединения 35S-GUS для hpGUS[G:U]: Прямой праймер (GUSgu-R2), 5'-CAAAAACTATTCACCCTTCAC-3' (SEQ ID NO:62); обратный праймер (GUS4m-R2), CACRAARTRTACRCRCTTRAC (SEQ ID NO:63). Для последовательности промотора 35S для обеих конструкций: Прямой праймер (35-F2), 5'-GAGGATCTAACAGAACTCGC-3' (SEQ ID NO:64); обратный праймер (35-R1), 5'-CTCTCCAAATGAAATGAACTTCC-3' (SEQ ID NO:65). В каждом случае R=A или G, Y=C или T. Реакции ПЦР проводили со следующими параметрами циклов: 94°C - 1 мин, 35 циклов при 94°C - 30 сек, отжиг при 55°C - 45 сек, достройка при 68°C - 1 мин и оклюнчательная достройка при 68°C - 5 мин. Продукты ПЦР-амплификации подвергали электрофорезу и количественно определяли интенсивность полос.

Репрезентативные результаты показаны на Фигурах 19 и 20. Для области соединения 35S-GUS, которая включала 200 пн последовательности 35S промотора, включающую сайт инициации транскрипции, большинство растений hpGUS[wt] показали значительные уровни метилирования ДНК. Внутри популяции растений hpGUS[wt] отдельные растения, которые сохраняли более высокие уровни активности GUS, то есть с менее сильным сайленсингом, по-видимому, имеют более высокий уровень метилирования промоторной-GUS смысловой соединенной области. Результаты были аналогичными для области 35S промотора. С другой стороны, большинство растений hpGUS[G:U] и hpGUS[1:4] показали более слабое метилирование ДНК в области соединения 35S-GUS. Авторы изобретения предположили, что эта проксимальная промоторная последовательность важна для экспрессии трансгена, и метилирование в этой области, вероятно, будет снижать экспрессию конструкции сайленсинга посредством транскрипционного сайленсинга (TGS) трансгена. Это называется "аутосайленсинг".

Общее обсуждение касательно Примеров 6-9

Прерывание структуры инвертированных повторов ДНК в трансгене повышает его стабильность

Обе популяции трансгенных растений hpGUS[wt] и hpGUS[2:10] продемонстрировали широкий диапазон степени сайленсинга гена-мишени. С другой стороны, обе популяции, содержащие hpGUS[G:U] и hpGUS[1:4] растения, демонстрировали относительно единообразный сайленсинг GUS во многих независимых линиях, с сильным сайленсингом, наблюдаемым в случае первой конструкции, и относительно более слабым, но все же существенным снижением активности гена под действием последней конструкции. В шпилечных РНК из конструкций [G:U] и [1:4] около 25% нуклеотидов в смысловой и антисмысловой последовательностях были либо включены в пары оснований G:U, либо в некомплементарные основания в последовательности, которые были равномерно распределены по всему протяжению 200-нуклеотидных смысловых/антисмысловых последовательностей. Из-за дивергенции последовательностей между смысловой и антисмысловой последовательностями предположили, что некомплементарные основания в конструкциях ДНК между смысловым и антисмысловым "плечами" или инвертированной запрашиваемой структурой значительно нарушают такую структуру ДНК с инвертированными повторами. Повторяющиеся структуры ДНК могут привлекать метилирование ДНК и сайленсинг в различных организмах (Hsieh and Fire, 2000). Конструкция hpGUS[2:10] также включала некомплементарные основания между смысловой и антисмысловой областями, но при этом каждое 2 пн некомплементарное основание между смысловой и антисмысловой последовательностями было фланкировано последовательными 8 пн сопадающими комплементарными основаниями, поэтому некомплементарные основания могли не нарушать структуру инвертированных повторов ДНК настолько, как в трансгенах [G:U] и [1:4]. Таким образом, единообразие сайленсинга GUS, индуцированного hpGUS[G:U] и hpRNA[1:4], могла быть обусловлена, по меньшей мере частично, прерыванием структуры инвертированных повторов ДНК, что приводило к уменьшению метилирования и, следовательно, к снижению аутосайленсинга двух трансгенов. Другое преимущество некомплементарных оснований между областями смысловой и антисмысловой ДНК состояло в том, что клонирование инвертированного повтора в E. coli было улучшено, поскольку бактерии обычно удаляют или перестраивают совершенные инвертированные повторы.

Термодинамическая стабильность шРНК важна для степени сайленсинга гена-мишени

При сравнении трансгенных линий только с сильным сайленсингом, растения hpGUS[wt] имели наибольшую степень даунрегуляции гена-мишени, затем в указанном порядке следовали hpGUS[G:U], hpGUS[2:10] и hpGUS[1:4]. Анализ RNAFold предсказал, что структура шпильки РНК hpGUS[wt] имела самую низкую свободную энергию, т.е. наибольшую стабильность, затем следовали шпильки hpGUS[G:U], hpGUS[2:10] и hpGUS[1:4]. Авторы изобретения предположили, что чем стабильней структура шпильки РНК, тем больше степень сайленсинга гена-мишени, который она может индуцировать. Это также было в пользу более длинных двухцепочечных структур РНК, чем более коротких. Формирование стабильной двухцепочечной РНК, как предположили, было необходимо для эффективного процессинга Dicer. Результаты экспериментов, описанных в настоящем документе, указали на другое важное преимущество спаренной конструкции G:U по сравнению с конструкциям, включающим главным образом простые некомплементарные нуклеотиды, такие как hpGUS[1:4]; тогда как оба типа конструкций содержали прерванные структуры инвертированных повторов ДНК, что уменьшало аутосайленсинг на уровне РНК, РНК hpGUS[G:U] была более стабильной из-за способности G и U образовывать пары оснований. Также считали полезной комбинацию двух типов модификаций, включающую пары оснований G:U и включающую некоторые неспаренные нуклеотиды в двухцепочечной структуре РНК, но с относительно более высоким числом нуклеотидов, включенных в пары оснований G:U, чем в некомплементарных основаниях, по меньшей мере в 2, 3, 4 или даже 5 раз.

РНК hpGUS[G:U] эффективно подвергалась процессингу Dicer

Один важный вопрос, на который был дан ответ в этих экспериментах, состоял в том, может ли содержащая некомплементарные основания или G:U-спаренная шРНК процессироваться Dicer с образованием коротких РНК (кРНК). Сильный сайленсинг в растениях hpGUS[G:U] и в растениях 1:4 и 2:10 шРНК, содержащей некомплементарные основания, означал, что эти шпилечные РНК-структуры процессировались Dicer. Это было подтверждено для молекулы [G:U] с помощью кРНК нозерн-блот гибридизации, которая легко обнаруживала антисмысловые кРНК. Кроме того, степень сайленсинга GUS в растениях hpGUS[G:U] показала хорошую корреляцию с количеством накопленных антисмысловых кРНК. Анализ малых РНК методом глубокого секвенирования из двух выбранных линий из каждой (только одной для hpGUS[wt]) подтвердил, что растения hpGUS[G:U], такие как растения hpGUS[wt], генерировали большое количество кРНК, тогда как растения hpGUS[1:4] также генерировали кРНК, но с гораздо меньшей представленностью (Фигура 21). Более низкий уровень кРНК в растениях hpGUS[1:4] соответствовал относительно низкой эффективности сайленсинга GUS и указывал, что низкая термодинамическая стабильность стебля дцРНК в РНК hpGUS[1:4] снижала эффективность процессинга Dicer. Было отмечено, что степень сайленсинга GUS демонстрирует относительно слабую корреляцию с уровнем кРНК для конструкции hpGUS[wt], причем некоторые линии с сильным сайленсингом содержали относительно низкие количества кРНК. Это говорит о том, что сайленсинг GUS в некоторых линиях hpGUS[wt] был связан, по меньшей мере частично, с сайленсингом транскрипции, а не с кРНК-направленным PTGS. Авторы изобретения обнаружили, что аутосайленсинг гена, кодирующего шпильку, включавшего метилирование последовательностей генов, таких как область промотора, был снижен в случае использования модифицированных конструкций шпилечной РНК, в частности конструкции G:U.

G:U и 1:4 шРНК трансгены показали уменьшенное метилирование ДНК в проксимальной области 35S промотора

ПЦР-анализ перевара McrBC показал, что уровни метилирования ДНК в 240 пн последовательностях 35S вблизи сайта инициации транскрипции (TSS) были снижены в трансгенных популяциях hpGUS[G:U] и hpGUS[1:4] по сравнению с популяцией hpGUS[wt]. Этот результат указал авторам изобретения, что прерывание совершенной структуры инвертированных повторов из-за модификаций C→T (в hpGUS[G:U]) или 25% некомплементарных нуклеотидов (в hpGUS[1:4]) в смысловой последовательности приводили к снижению до минимума транскрипционный аутосайленсинг трансгенов шРНК. Это согласовывалось с единообразием сайленсинга гена GUS, наблюдаемого в популяциях hpGUS[G:U] и hpGUS[1:4] в сравнении с популяцией hpGUS[wt]. Авторы изобретения установили, что конструкция hpGUS[G:U] была более совершенной, чем конструкция hpGUS[1:4] в снижении метилирования промотора и, следовательно, транскрипционного аутосайленсинга, по меньшей мере, потому что она содержала уменьшенное количество, или даже не содержала, цитозин-нуклеотиды в смысловой последовательности, и поэтому не привлекла метилирование ДНК, которое могло распространяться на промотор.

Пример 10. Дизайн и тестирование шпилечных РНК, включающих пары оснований G:U и направленно воздействующих на эндогенные гены

Модифицированные шпилечные РНК, направленно воздействующие на РНК EIN2 и CHS

Так как G:U модифицированная шпилечная РНК, по-видимому, индуцирует более однородный и единообразный сайленсинг гена-мишени по сравнению с обычной шпилечной РНК, как описано выше, авторы изобретения захотели проверить, будет ли улучшенная конструкция также уменьшать экспрессию эндогенных генов. Поэтому авторы изобретения разработали, получили и протестировали несколько [G:U]-модифицированных конструкций шпилечных РНК, направленных либо на ген EIN2 или CHS, либо на оба гена, которые были эндогенными генами в Arabidopsis thaliana, выбранными в качестве типичных генов-мишеней в попытке вызвать сайленсинг. Ген EIN2 (SEQ ID NO:19) кодирует этилен-нечувствительный белок 2 (EIN2), который является центральным фактором в сигнальных путях, регулируемых сигнальной молекулой растений, этиленом, то есть является регуляторным белком, и ген CHS (SEQ ID NO:20) кодирует фермент халконсинтазу (CHS), которая участвует в синтезе антоцианинов в семенной оболочке A. thaliana. Была получена другая G:U модифицированная конструкция, которая одновременно направленно воздействовала на гены EIN2 и CHS, в которой последовательности EIN2 и CHS были транскрипционно слиты с получением одной шпилечной РНК. Кроме того, были получены три дополнительные конструкции, направленные либо на EIN2 или CHS, либо и на EIN2, и на CHS, в которых цитидиновые основания как в смысловой, так и в антисмысловой последовательностях были заменены тимидиновыми основаниями (в настоящем документе обозначена как конструкция G:U/U:G), а не только в смысловой последовательности, что также было сделано для модифицированных шпилек, направленно воздействующих на GUS. Модифицированные конструкции шпилечных РНК тестировали на их способность снижать экспрессию эндогенного гена EIN2 или генов EIN2 и CHS при использовании метода доставки генов для введения шпилечных РНК в клетки. Обычные шпилечные РНК, используемые в качестве контроля в эксперименте, имели область двухцепочечной РНК длиной 200 пар оснований для направленного воздействия на мРНК EIN2 или CHS по отдельности, или химерную область двухцепочечной РНК, содержащую 200 пар оснований из каждого гена EIN2 и CHS, которые были слиты вместе в виде единой шпилечной молекулы. В слитой РНК двухцепочечная часть EIN2 примыкала к петле шпильки, а область CHS была дистальной по отношению к петле. Все пары оснований в двухцепочечной области контрольной шпилечной РНК были каноническими парами оснований.

Получение конструкции

Фрагменты ДНК, охватывающие 200 пн области EIN2 дикого типа (SEQ ID NO:19) и кДНК CHS (SEQ ID NO:20), амплифицировали с помощью ПЦР с кДНК Colid-0 Arabidopsis thaliana при использовании пар олигонуклеотидных праймеров EIN2wt-F (SEQ ID NO:66) и EIN2wt-R (SEQ ID NO:67) или CHSwt-F (SEQ ID NO:68) и CHSwt-R (SEQ ID NO:69) соответственно. Фрагменты встраивали в pGEMT-Easy, как для шпилечных конструкций GUS (Пример 6). Фрагменты ДНК, содержащие модифицированный смысловой фрагмент EIN2[G:U] (SEQ ID NO:22) и CHS[G:U] (SEQ ID NO:24), 200 пн модифицированный смысловой или 200 пн модифицированный антисмысловой EIN2[G:U] (SEQ ID NO:25) и модифицированные антисмысловые фрагменты CHS[G:U] (SEQ ID NO:26), каждый из которых фланкирован сайтами рестрикции, собирали при отжиге соответствующих пар олигонуклеотидов, EIN2gu-F+EIN2gu-R, CHSgu -F+CHSgu-R, asEIN2gu-F+asEIN2gu-R и asCHSgu-F+asCHSgu-R (SEQ ID NO:70-77) с последующей ПЦР достройкой 3'-концов с использованием Taq-полимеразы LongAmp. Все G:U-модифицированные фрагменты ПЦР клонировали в вектор pGEM-T Easy и предполагаемые нуклеотидные последовательности подтверждали секвенированием. Слитые фрагменты CHS[wt]::EIN2[wt], CHS[G:U]:EIN2[G:U] и asCHS[G:U]::asEIN2[G:U] получали при лигировании соответствующих фрагментов ДНК CHS и EIN2 по общему сайту XbaI в плазмиде pGEM-T Easy.

Кассеты 35S::смысловой фрагмент::интрон PDK::антисмысловой фрагмент::OCS-T получали аналогичным образом, как для конструкций hpGUS. По существу антисмысловые фрагменты вырезали из соответствующих плазмид pGEM-T Easy при расщеплении HindIII и BamHI и встраивали в pKannibal по сайтам BamHI и HindIII, при этом они находились в антисмысловой ориентации относительно 35S промотора. Затем смысловые фрагменты вырезали из соответствующей плазмиды pGEM-T Easy при использовании XhoI и KpnI и встраивали по тем же сайтам соответствующего клона, содержащего антисмысловую последовательсть. Все кассеты в плазмидах pGEM-T Easy вырезали NotI и встраивали в pART27 с получением конечных бинарных векторов для трансформации растений.

Выравнивания модифицированных смысловой[G:U] и антисмысловой[G:U] нуклеотидных последовательностей с соответствующими последовательностями дикого типа, на которых показаны положения замененных нуклеотидов, показаны на Фигурах 22-25. Дизайн кассет экспрессии для шпилечных РНК схематично показан на Фигуре 26.

Расчетную свободную энергию образования шпилечных РНК оценивали с помощью программы FOLD. Показатели были вычислены в (ккал/моль): hpEIN2[wt] -453,5; hpEIN2[G:U] -328,1; hpCHS [wt] -507,7; hpCHS[G:U] -328,5; hpEIN2[G:U/U:G] -173,5; hpCHS[G:Y/U:G] -186,0; hpCHS::EIN2[wt] -916,4; hpCHS::EIN2[G:U] -630,9; hpCHS::EIN2[G:U/U:G) -333,8.

Трансформация растений

Все EIN2, CHS и химерные EIN2/CHS конструкции использовали для трансформации растений Arabidopsis thaliana расы Col-0 с использованием метода погружения цветков (Clough and Bent, 1998). Для отбора трансгенных растений, семена, собранные с обработанных погружением цветков Agrobacterium, стерилизовали хлором и сеяли на среду MS, содержащую 50 мг/л канамицина. Несколько трансгенных линий получали для всех девяти конструкций (Таблица 1). Эти первичные трансформанты (поколение T1) переносили в почву, самоопыляли и выращивали до зрелости. Семена, собранные у этих растений (семена Т2), использовали для получения растений Т2 и проводили скрининг для поиска линий, которые были гомозиготными по трансгену. Их использовали для анализа сайленсинга EIN2 и CHS.

Таблица 1. Обзор трансгенных растений, полученных в генетическом фоне Col-0

Конструкция Количество полученных трансгенных линий hpEIN2[wt] 46 hpCHS [wt] 34 hpEIN2[G:U] 23 hpCHS[G:U] 32 hpEIN2[G:U/U:G] 52 hpCHS[G:U/U:G] 13 hpCHS::EIN2[wt] 28 hpCHS::EIN2[G:U] 26 hpCHS::EIN2[G:U/U:G] 20

Анализ степени сайленсинга EIN2

EIN2 является геном A. thaliana, кодирующим рецепторный белок, участвующий в реагировании на этилен. Ген экспрессируется в ростках вскоре после прорастания семян, а также позднее, при росте и развитии растения. Мутантная EIN2 рассада демонстрирует удлинение гипокотиля по сравнению с изогенной рассадой дикого типа при проращивании в темноте в присутствии 1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты (ACC), промежуточного соединения в синтезе этилена в растениях. Поэтому экспрессию гена EIN2 и степень сайленсинга в трансгенных растениях анализировали путем проращивания семени на среде MS, содержащей 50 мкг/л ACC, в полной темноте и измерения длины их гипокотиля по сравнению с рассадой дикого типа. Длина гипокотиля является удобным фенотипом для легкого измерения и хорошим индикатором степени снижения экспрессии гена EIN2, указывающим на разные уровни сайленсинга EIN2. Растения с сайленсингом экспрессии гена EIN2, как ожидают, будут иметь различные степени удлинения гипокотиля в зависимости от уровня сайленсинга EIN2, примерно в диапазоне между рассадой дикого типа (короткие гипокотили) и нулевой мутантной рассадой (длинные гипокотили). Исследовали семена от 20 рандомизированно отобранных, независимо трансформированных растений для каждой конструкции. Семена от одного растения из 20 содержащих конструкцию hpCHS::EIN2[G:U], не проросли. Данные по длине гипокотиля показаны на Фигуре 27.

Линии hpEIN2[wt] показали значительный диапазон степени сайленсинга EIN2, причем 7 линий (линии растений 2, 5, 9, 10, 12, 14, 16 на Фигуре 27) четко показали низкие уровни сайленсинга или такую же длину гипокотиля, как у дикого типа, а остальные 13 линий имели средний или сильный сайленсинг EIN2. Отдельные растения в рамках каждой независимой линии демонстрировали диапазон степени сайленсинга EIN2, на что указывали различия в длине гипокотиля. Напротив, только две линии (линии растений 5, 18 на Фигуре 27), включающие конструкцию hpEIN2[G:U], демонстрировали слабый сайленсинг EIN2, а остальные 18 демонстрировали однородный сильный сайленсинг EIN2. Кроме того, отдельные растения в каждой из 18 линий, по-видимому, имели относительно однородный сильный EIN2 по сравнению с растениями, трансформированными конструкцией hpEIN2[wt]. Авторы изобретения пришли к выводу, что G:U модифицированная конструкция шпилечной РНК была способна вызывать более единообразный, менее вариабельный сайленсинг эндогенного гена, который был более единообразным и более предсказуемым, чем в случае обычной шпилечной РНК, направленной на ту же область эндогенной РНК.

Трансгенные популяции hpEIN2[wt] и hpEIN2[G:U] также различались по соотношению между степенью сайленсинга EIN2 и числом копий трансгена. Число копий трансгена было указано отношениями сегрегации по маркерному гену устойчивости к канамицину у растений потомства - отношение 3:1 устойчивых:чувствительных ростков, указывающее на одиночную вставку локуса, тогда как отношение, которое было намного выше, указывало на многолокусные вставки трансгена. Несколько многокопийных линий, трансформированных конструкцией hpEIN2[wt], показали низкий уровень сайленсинга EIN2, но это не относилось к линиям hpEIN2[G:U], где и однокопийные, и многокопийные линии показали сильный сайленсинг EIN2.

Ген EIN2 также показал сайленсинг в ростках, трансформированных слитой шпилечной РНК CHS::EIN2. Подобно растениям, содержащим одну конструкцию hpEIN2[G:U], рассада hpCHS::EIN2[G:U] четко продемонстрировала более единообразный сайленсинг EIN2 на независимых линиях, чем рассада hpCHS::EIN2 [wt]. Сайленсинг в отдельных растениях в рамках независимой линии также оказался более единообразным для линий hpCHS::EIN2[G:U], чем линий hpCHS::EIN2[wt]. В то же время степень сайленсинга EIN2 была немного сильнее для растений с высоким сайленсингом hpCHS::EIN2[wt], чем для растений hpCHS::EIN2[G:U], аналогично сравнению между растениями, трансформированными hpGUS[wt] и hpGUS[G:U]. Сравнение степени сайленсинга показало, что слитые конструкции не индуцируют более сильный сайленсинг EIN2, чем одиночная конструкция hpEIN2[G:U], фактически, слитая конструкция шпилечой G:U, по-видимому, индуцирует немного более слабый сайленсинг EIN2, чем одиночная конструкция hpEIN2[G:U], направленно воздействующая на ген.

При исследовании растений, трансформированных конструкциями G:U/U:G, в которых цитидин-нуклеотиды (C) как смысловой, так и антисмысловой последовательностей были модифицированы с заменой на тимидин-нуклеотиды (T), наблюдали незначительное увеличение или отсутствие увеличения длины гипокотиля для все 20 проанализированных независимых линий по сравнению с растениями дикого типа. Это наблюдали для hpEIN2[G:U/U:G] и для hpCHS::EIN2[G:U/U:G] конструкций. Эти результаты показали авторам изобретения, что G:U/U:G спаренные конструкции шпилечных РНК, имеющие около 46% замен, не были эффективными для индукции сайленсинга генов-мишеней, возможно, потому что спаривание шпилечных РНК было слишком сильно дестабилизировано. Авторы изобретения посчитали, что неэффективность может быть вызвана двумя возможными причинами. Во-первых, двухцепочечная область EIN2 шпилечных РНК содержала 92 пары оснований G:U из 200 потенциальных пар оснований между смысловой и антисмысловой последовательностями. Во-вторых, выравнивание модифицированной антисмысловой последовательности с комплементом смысловой последовательности дикого типа показало, что 49 замен C на T в антисмысловой последовательности могли снижать эффективность направленного взаимодействия антисмысловой последовательности с мРНК EIN2. По результатам этого эксперимента авторы изобретения пришли к выводу, что, по меньшей мере для гена-мишени EIN2, существует верхняя допустимая граница количества нуклеотидных замен, которые могут присутствовать в шпилечной РНК, и при этом она сможет сохранять достаточную эффективность для сайленсинга. Например, 92/200=46% замен, вероятно, было слишком высоким процентом.

Анализ степени сайленсинга CHS

Трансгенные растения исследовали по уровню экспрессии гена CHS с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией (кОТ-ПЦР) на РНК, выделенной из цельных растений, выращенных in vitro на среде для культур тканей. Праймеры, используемые для мРНК CHS, были следующими: прямой праймер (CHS-200-F2), 5'-GACATGCCTGGTGCTGACTA-3' (SEQ ID NO:78); обратный праймер (CHS-200-R2) 5'-CCTTAGCGATACGGAGGACA-3' (SEQ ID NO:79). Праймеры, используемые для референсного гена актина 2, используемого в качестве стандарта, были следующими: прямой праймер (Actin2-For) 5'-TCCCTCAGCACATTCCAGCA-3' (SEQ ID NO:80) и обратный праймер (Actin2-Rev) 5'-GATCCCATTCATAAAACCCCAG-3' (SEQ ID NO:81).

Данные показали, что уровень мРНК CHS, накопленной в растениях, по сравнению с референсной мРНК гена актина 2 был снижен в пределах 50-96% (Фигура 28).

Семя A. thaliana, полностью лишенное активности CHS, имеет бледную семенную оболочку по сравнению с коричневым цветом семян дикого типа. Поэтому семя трансгенных растений исследовали визуально на цвет их семенной оболочки. Явное побледнение семенной оболочки наблюдали у семян нескольких растений, но не наблюдали у семян других растений, несмотря на снижение мРНК CHS в листьях тех растений. Предположили, впрочем, что фенотип цвета семенной оболочки проявлялся только тогда, когда активность CHS была почти полностью устранена в развивающейся оболочке семян во время роста растений. Кроме того, 35S промотор, возможно, не был достаточно активен в развивающейся семенной оболочке, чтобы обеспечивать уровень снижения активности CHS с возникновением фенотипа бледных семян, наблюдаемого у нулевых мутантов. Улучшение визуального цветового фенотипа семенной оболочки может быть достигнуто при использовании промотора, который является более активным в семенной оболочке.

Снижение экспрессии гена PDS в Arabidopsis thaliana

Другой ген Arabidopsis был выбран в качестве примера гена-мишени, а именно ген фитоендесатуразы (PDS), который кодирует фермент фитоендесатуразу, который катализирует десатурацию фитоена до дзета-каротина во время биосинтеза каротиноидов. Ожидали, что сайленсинг PDS приведет к обесцвечиванию растений Arabidopsis, которое можно легко наблюдать визуально. Поэтому была создана G:U-модифицированная конструкция шРНК и протестирована в сравнении с традиционными конструкциями шРНК, направленно воздействующими на последовательность мРНК PDS длиной 450 нуклеотидов. Последовательность PDS из 450 нуклеотидов содержала 82 цитозина (C), которые были заменены тимидинами (T), в результате чего 18,2% пар оснований в области дцРНК hpPDS[G:U] являлись парами оснований G:U. Генетическую конструкцию, кодирующую hpPDS[G: U], и контрольную генетическую конструкцию, кодирующую hpPDS[WT], вводили в Arabidopsis thaliana экотипа Col-0 при помощи агробактериальной трансформации.

Для конструкций hpPDS[WT] и hpPDS[G:U] были идентифицированы 100 и 172 трансгенные линии соответственно. Поразительно, но все эти линии показали обесцвечивание семядолей молодых проростков Т1, которые развились на устойчивой к канамицину селективной среде, без очевидной разницы между двумя трансгенными популяциями на этой ранней стадии роста растений. Это указывает на то, что две конструкции были одинаково эффективны при индукции сайленсинга PDS в семядолях. Впрочем, у некоторых растений T1 появились настоящие листья, которые больше не были обесцвеченными и выглядели зелеными или бледно-зелеными, что указывает на то, что сайленсинг PDS в настоящих листьях был снят или ослаблен. Доля трансгенных линий с зелеными настоящими листьями была намного выше для популяции hpPDS[WT], чем для популяции hpPDS[G:U]. Трансгенные растения распределяли в три разные категории на основе сильного сайленсинга PDS (сильное обесцвечивание всего растения), умеренного сайленсинга PDS (бледно-зеленые или пятнистые листья) и слабого сайленсинга PDS (полностью зеленые или слабо пятнистые листья). Доля растений со слабым сайленсингом PDS составляла 43% для линий hpPDS[WT] по сравнению с 7% для линий hpPDS[G:U]. По сути все линии hpPDS[G:U] из группы слабого сайленсинга по-прежнему демонстрировали легкую пятнистость на настоящих листьях, в отличие от растений hpPDS[WT] со слабым сайленсингом, у которых в основном листья были полностью зелеными. Эти результаты показали, что G:U-модифицированная конструкция hpPDS обеспечивала более равномерный сайленсинг PDS в независимой трансгенной популяции, чем обычная (полностью канонически спаренная) конструкция hpPDS, что согласовывалось с результатами анализов сайленсинга GUS и EIN2, описанных выше. Еще более важно то, что результаты сайленсинга PDS указывают на онтогенетическую изменчивость шРНК-трансген-индуцированного сайленсинга генов в растениях, который не отмечали ранее, и дают основания предполагать, что шРНК-трансгенный сайленсинг был более эффективным и стабильным в семядолях, чем в настоящих листьях. В соответствии с равномерным сайленсингом гена в независимых линиях, результат сайленсинга PDS свидетельствует о том, что G:U-модифицированный шРНК трансген был более стабильным в процессе развития, чем обычная конструкция шРНК, обеспечивая более стабильный и длительный сайленсинг.

Пример 11. Анализ кРНК из конструкций шпилечной РНК

Нозерн-блот гибридизацию проводили на образцах РНК для обнаружения антисмысловых кРНК из растений hpEIN2[G:U] и сравнения их количества и размеров с кРНК, полученными из hpEIN2[wt]. Этот зонд представлял собой ³²P-меченный РНК-зонд, соответствующий смысловой последовательности из 200 нуклеотидов в конструкции hpEIN2[wt], гибридизацию проводили в условиях низкой жесткости для обеспечения возможности обнаружения более коротких (20-24 нуклеотидов) последовательностей. Авторадиограф меченного зондами Нозерн-блота показан на Фигуре 29. Этот эксперимент показал, что шпилечная РНК hpEIN2 [G:U] процессировалась в кРНК, и уровень накопления был относительно однородным у 9 проанализированных независимо трансформированных растений hpEIN2[G:U] по сравнению с линиями hpEIN2[wt]. Как и в аналогичном эксперименте для шпилечных РНК к GUS, различие в подвижности двух антисмысловых полос кРНК из hpEIN2[G:U] по сравнению с двумя основными полосами от hpEIN2[wt] было совершенно очевидным. Это лучше всего видно при сравнении подвижности полос в соседних дорожках 10 и 11 на Фигуре 28.

Для дальнейшего исследования, популяции коротких РНК из hpEIN2[wt] и hpEIN2[G:U] анализировали путем глубокого секвенирования совокупных популяций кРНК, выделенных из цельных растений. Определяли долю каждой популяции, которую картировали в двухцепочечных областях hpEIN2[wt] и hpEIN2[G:U]. Примерно из 16 миллионов считываний в каждой популяции около 50000 кРНК были картированы в двухцепочечной области hpEIN2[wt], тогда как только около 700 - в hpEIN2[G:U]. Это указывало на то, что из шпильки [G:U] образовывалось гораздо меньше кРНК. Также наблюдали увеличение доли EIN2-специфических 22-меров.

Фигура 29 показала, что и традиционные (полностью канонически спаренные), и G:U-модифицированные линии шРНК накапливали две доминирующие по размеру фракции миРНК. В соответствии с предыдущими сообщениями, доминирующие миРНК из традиционных линий шРНК мигрировали аналогично 21- и 24-нт мРНК маркерам размера. Однако две доминирующие полосы миРНК от обоих G:U-модифицированных трансгенов двигались в геле немного быстрее, что позволяет предположить, что они либо имели меньший размер, либо различные концевые химические модификации по сравнению с традиционными шРНК трансгенами.

Чтобы исследовать, может ли профиль размера миРНК различаться между двумя разными типами конструкций, малые РНК выделяли из одной линии hpGUS[WT] и двух линий каждой из hpGUS[G:U], hpEIN2[WT] и hpEIN2[G:U] и секвенировали с помощью платформы Illumina, получив в результате примерно 16 миллионов чтений мРНК для каждого образца. Также секвенировали образцы из двух линий hpGUS[1:4] с сильным сайленсингом. Определяли количество мРНК, которые были картированы в двухцепочечных областях и в интронной спейсерной области шпилечных РНК. миРНК также были картированы в вышестоящих и нижестоящих областях в мРНК-мишени GUS и ENI2 для обнаружения транзитивных миРНК. Данные секвенирования подтвердили, что линии hpGUS[G:U], такие как линии hpGUS[WT], дают представленные в достаточных уровнях миРНК, тогда как линии hpGUS[1:4] также дают миРНК, но с гораздо более низкой представленностью. Более низкие уровни миРНК с линий hpGUS[1:4] соответствовали относительно низкой эффективности сайленсинга GUS с помощью hpGUS[1:4] и указывали, что низкая термодинамическая стабильность стебля дцРНК в РНК hpGUS[1:4] снижала эффективность процессинга Dicer по сравнению с традиционной шпилькой. Не было обнаружено четкого различия в распределении размеров миРНК между линиями традиционных и некомплементарных шРНК, несмотря на явное изменение в подвижности антисмысловых миРНК, показанных на Нозерн-блоте, причем все образцы показали 21-нт малую РНК в качестве доминирующего класса размерности. Наблюдали некоторые легкие различия в процентной представленности 22-нт антисмысловых миРНК между линиями традиционных и некомплементарных hpGUS: линии hpGUS[G:U] и hpGUS[1:4] показали более высокую долю 22-нт класса размерности, чем линия hpGUS[WT]. Характерным признаком данных секвенирования как для традиционных, так и для некомплементарных линий шРНК было то, что 24-нт миРНК показали гораздо более низкую представленность, чем 21-нт миРНК во всех образцах, а именно приблизительно в 3-21 раз меньше для смысловой 24-нт миРНК и приблизительно в 4-35 раз меньше для антисмысловых 24-нт миРНК. Это заметно отличалось от результата Нозерн-блоттинга, который показал относительно равные количества двух доминирующих классов размерности. Также было интересно отметить, что образцы hpEIN2[WT]-7 и hpEIN2[G:U]-14/15 показали одинаковое количество антисмысловых миРНК на Нозерн-блоте, но по данным секвенирования линии hpEIN2[G:U] дали гораздо меньшие количества чтений 20-24 нт антисмысловых миРНК (17290 и 29211), чем линия hpEIN2[WT]-7 (134112 чтения).

Что касается линий hpGUS[G:U] и hpEIN2[G:U], почти все смысловые миРНК совпадали с G:U-модифицированной смысловой последовательностью hpRNA, тогда как большинство антисмысловых миРНК имели антисмысловую последовательность дикого типа. Это указывает на то, что большая часть этих смысловых и антисмысловых миРНК процессируется непосредственно из первичных транскриптов шРНК[G:U], но не из-за RDR-опосредованной амплификации с шРНК или транскриптов РНК-мишени, которые в противном случае давали как смысловые, так и антисмысловые миРНК с одинаковыми матричными последовательностями. В соответствии с этим, лишь небольшое количество чтений 20-24 нт малых РНК (транзитивных миРНК) было обнаружено из области петли (интрон PDK) шРНК трансгенов или нецелевой нижестоящей области мРНК GUS или EIN2. Однако две линии hpGUS[1:4] показали относительно высокую долю смысловых миРНК дикого типа, что позволяет предположить, что сильный сайленсинг GUS в этих двух линиях, относительно редкий случай для популяции hpGUS[1:4], может включать RDR амплификацию. Фактически, было обнаружено большее количество миРНК из последовательности гена-мишени после области-мишени шРНК, чем из ствола дцРНК в линиях hpGUS[1:4], что указывает на присутствие транзитивного сайленсинга в этих линиях.

Взятые в совокупности, данные секвенирования малых РНК показали, что миРНК из линий традиционных и некомплементарных шРНК имели схожий профиль размерности, за исключением 22 нт класса размерности, что позволяет предположить, что разная подвижность, обнаруженная с помощью Нозерн-блоттинга, была вызвана разными 5' или 3' химическими модификациями. Несоответствие в относительной представленности малых РНК (например, миРНК, полученных с hpEIN2[WT] или hpEIN2[G:U], и 21 нт в сравнении с 24 нт) между результатом Нозерн-блоттинга и данными секвенирования означало, что разные популяции миРНК и классы размерности могут обладать разной эффективностью клонирования при получении библиотеки малых РНК.

Известно, что малые РНК растений имеют 2'-O-метильную группу на 3'-концевом нуклеотиде, которая, как считают, стабилизирует малые РНК. Ранее было показано, что такое 3'-метилирование ингибирует, но не предотвращает лигирование 3'-адаптера, снижающее эффективность клонирования малых РНК (Ebhardt et al. 2005). Таким образом, миРНК, полученные с hpRNA[WT] и hpRNA[G:U], обрабатывали периодатом натрия в анализах β-элиминирования. Обработка не вызывала изменения подвижности в геле для миРНК, полученных как с hpRNA[WT], так и с hpRNA[G:U], что указывает на то, что обе популяции миРНК были метилированы на 3'-конце и не было различий в 3'-химической модификации между миРНК, полученными с hpRNA[WT] и hpRNA[G:U].

Стандартный протокол секвенирования мРНК основан на малых РНК, содержащих 5'-монофосфат, допускающий лигирование 5'-адаптер (Lau et al., 2001). Ранее предполагали, что процессированные Dicer малые РНК содержат 5'-монофосфат, однако было обнаружено, что у C. elegans многие миРНК содержат ди- или трифосфат на 5'-конце, который меняет подвижность малых РНК в геле и препятствует лигированию 5'-адаптера на малых РНК в стандартной процедуре клонирования малой РНК (Pak and Fire 2007). Не было известно, обладают ли также растительные малые РНК различным 5'-фосфорилированием. Таким образом, исследовали статус 5'-фосфорилирования миРНК, полученных с hpRNA[WT] и hpRNA[G:U], при обработке суммарной РНК щелочной фосфатазой с последующей Нозерн-блот гибридизацией. Такая обработка снижает подвижность в геле всех малых РНК, полученных с шРНК, что указывает на присутствие 5'-фосфорилирования. Однако миРНК, полученные с hpRNA[G:U], показали большее изменение подвижности, чем миРНК, полученные с hpRNA[WT], после обработки фосфатазой, что привело к двум группам дефосфорилированных миРНК, мигрирующих в одном и том же положении на геле. Маркеры размерности 21 и 24 нт малой РНК были помечены на 5 'конце радиоизотопом ³²P при использовании полинуклеотидкиназной реакции, и поэтому они должны были иметь монофосфорилированный 5'-конец. Это указывает, что миРНК, полученные с hpRNA[WT], мигрирующие в таких же положениях, что и маркеры размерности, вероятно, представляют собой монофосфорилированные миРНК, тогда как hpRNA[G:U]-производные миРНК, мигрирующие быстрее, имеют больше одного фосфата на 5'-конце. Таким образом, был сделан вывод, что миРНК, получаемые с традиционных и G:U-модифицированных шРНК трансгенов в растительных клетках, фосфорилированы по-разному.

Пример 12. Анализ метилирования ДНК растений с сайленсингом EIN2

Результаты сайленсинга GUS и EIN2 показали, что конструкции шРНК, имеющие немодифицированные смысловые последовательности, индуцировали сильно различающиеся уровни сайленсинга гена-мишени по сравнению с конструкциями, имеющими модифицированные смысловые последовательности, обеспечивающие пары оснований G:U. Как описано выше, промоторная область конструкции hpGUS[G:U], по-видимому, имеет меньшее метилирование по сравнению с конструкцией hpGUS[wt]. Для проверки метилирования ДНК и сравнения трансгенных растений hpEIN2[wt] и hpEIN2[G:U], 12 растений из каждой популяции проанализировали на метилирование ДНК в 35S промоторе и в области соединения 35S-промотор-смыслового EIN2 с использованием метода McrBC. Праймеры, используемые для области 35S промотора: прямой праймер (Top-35S-F2), 5'-AGAAAATYTTYGTYAAYATGGTGG-3' (SEQ ID NO:82), обратный праймер (Top-35S-R2), 5'-TCARTRRARATRTCACATCAATCC-3' (SEQ ID NO:83). Праймеры, используемые для области соединения 35S промотора со смысловым EIN2: прямой праймер (Link-35S-F2), 5'-YYATYATTGYGATAAAGGAAAGG-3' (SEQ ID NO:84) и обратный праймер (Link-EIN2-R2), 5' -TAATTRCCACCAARTCATACCC-3' (SEQ ID NO:85). В каждой из этих последовательностей праймеров Y=C или T и R=A или G.

Количественную оценку степени метилирования ДНК производили путем проведения ПЦР-анализа в реальном времени. Для каждого растения вычисляли показатель: скорость амплификации фрагмента ДНК после обработки геномной ДНК McrBC/скорость амплификации фрагмента ДНК без обработки геномной ДНК McrBC.

Почти каждое растение hpEIN2[wt] показало значимые уровни метилирования ДНК 35S промотора, особенно в соединении 35S-EIN2, но некоторые растения показали более высокие уровни, чем другие. Как показано на Фигурах 30 и 31, все линии растений, представленные на дорожках 1, 4, 7, 9, 11 и 12, демонстрировали сильный сайленсинг EIN2, на что указывала большая длина гипокотиля. С другой стороны, остальные шесть линий, представленные на дорожках 2, 3, 5, 6, 8 и 10, демонстрировали относительно слабый сайленсинг EIN2, что приводило к более коротким гипокотилям. Эти линии с более слабым сайленсингом показали более сильное метилирование ДНК в промоторной и соединительной последовательностях, на что указывает гораздо более низкая интенсивность полосы ПЦР, когда геномную ДНК предварительно расщепляли McrBC. Количественные анализы ПЦР в реальном времени (кПЦР) подтвердили эти наблюдения (Фигура 31). Все 12 протестированных линий показали некоторую степень метилирования ДНК как в области 35S промотора, так и в области 35S смыслового соединения ("соединение"). Наибольшая степень метилирования, т.е. самый низкий показатель в анализах кПЦР, была отмечена для линий hpEIN2[wt] 2, 3, 5, 6, 8 и 10, что коррелирует с уменьшенной степенью сайленсинга, измеренной по длине гипокотиля. Эти результаты подтвердили, что снижение сайленсинга EIN2 в некоторых линиях hpEIN2[wt] было связано с повышенным метилированием промотора. Даже в линиях растений hpEIN2[wt] с сайленсингом EIN2 все еще наблюдались значимые уровни метилирования ДНК, особенно в области фрагмента соединения 35S-смыслового EIN2. В случае метилирования промоторов считается, что это вызывает транскрипционный сайленсинг. В случае сайленсирующих конструкций, как в данном случае, это является формой "аутосайленсинга".

В отличие от линий hpEIN2[wt], линии hpEIN2[G:U] показали меньшее метилирование ДНК как 35S промотора, так и соединения 35S-EIN2. Фактически, четыре из этих 12 линий G:U, соответствующих дорожкам 1, 2, 3 и 7 на Фигуре 30 (дорожки 13, 14, 15 и 20 на Фигуре 31), не имели явного метилирования ДНК, о чем свидетельствует одинаковая сила ПЦР-полосы McrBC-обработанных и необработанных образцов. При количественном анализе этих амплификаций с помощью кПЦР, шесть из 12 линий показали малое или полное отсутствие снижения фрагмента после обработки McrBC и, следовательно, малое или полное отсутствие метилирования ДНК, см. нижнюю панель на Фигуре 31, линии 13, 14, 15, 18, 19 и 20. Эти результаты показали, что относительно единообразный сайленсинг EIN2 конструкцией hpEIN2[G:U], по меньшей мере, в некоторых линиях, было обусловлен значительно меньшим метилированием промотора и, следовательно, меньшим транскрипционным аутосайленсингом по сравнению с hpEIN2[wt].

Эти выводы дополнительно подтверждали анализом геномной ДНК из трансгенных линий растений с секвенированием после обработки бисульфитом. В этом анализе использовали тот факт, что обработка ДНК бисульфитом превращала неметилированные цитозиновые основания в ДНК в урацил (U), но оставляла 5-метилцитозиновые основания (^mC) без изменений. После обработки бисульфитом определенный интересующий участок ДНК амплифицировали в реакциях ПЦР таким образом, что амплифицировалась только смысловая цепь обработанной ДНК. Затем продукт ПЦР подвергали массовому секвенированию, определяя положения и степень метилирования отдельных цитозиновых оснований в сегменте ДНК. Таким образом, анализ предоставил информацию с разрешением один нуклеотид о статусе метилирования сегмента ДНК.

Три линии растений, показавшие наиболее сильные уровни сайленсинга EIN2 для каждого из hpEIN2[wt] и hpEIN2[G:U], анализировали путем секвенирования с обработкой бисульфитом, соответствующие линиям 1, 7 и 9 hpEIN2[wt] и линиям 13, 15 и 18 hpEIN2[G:U] на Фигуре 31. Эти линии растений показали наибольшую длину гипокотиля и поэтому, как ожидалось, имели наиболее низкие уровни метилирования ДНК из 20 линий для каждой конструкции. Результаты представлены на Фигурах 32 и 33 для hpEIN2[wt] и hpEIN2[G:U] соответственно. При сравнении было ясно, что многочисленные цитозины в области 35S промотора и смысловой области EIN2 в растениях hpEIN2[wt] были сильно метилированы. В отличие от этого, три линии растений hpEIN2[G:U] показали гораздо более низкие уровни метилирования цитозина в области 35S промотора.

Пример 13. Уровни метилирования ДНК в промоторе конструкции hpGUS[1:4]

При анализе геномной ДНК, выделенной из растений hpGUS[1:4], на метилирование ДНК с использованием McrBC и бисульфитного метода, как описано выше, аналогично наблюдали, что метилирование цитозиновых оснований в 35S промоторе и областях 35S промотор-GUS смысловой последовательности было меньше по сравнению с растениями hpGUS[wt].

Общее обсуждение касательно Примеров 10-13

Двухцепочечная РНК, содержащая пары оснований G:U, вызывает больше единообразный сайленсинг гена, чем обычная дцРНК

Аналогично конструкциям GUS, hpEIN2[G:U] и hpCHS:EIN2[G:U] индуцировали более однородный и единообразный сайленсинг EIN2, чем соответствующие конструкции hpRNA[wt], кодирующие обычную шпилечную РНК. Единообразие наблюдали не только по многим независимым трансгенным линиям, но также по родственным растениям внутри трансгенной линии, каждая из которых имеет одинаковую вставку трансгена. В дополнение к единообразию степень сайленсинга EIN2, индуцированного hpEIN2[G:U], была близка таковой у линий hpEIN2[wt] с сильным сайленсингом. Анализ сайленсинга гена CHS показал, что конструкция hpCHS[G:U] была эффективна при снижении уровней мРНК CHS на 50-97%, но лишь немногие растения демонстрировали четко видимый фенотип при побледнении семенной оболочки. Вероятное объяснение отсутствию видимых фенотипов окраски семян, заключается в том, что даже низкие уровни активности CHS могут быть достаточными для продукции флавоноидных пигментов. Другие возможные объяснения состояли в том, что 35S промотор не был достаточно активен при развитии семенной оболочке с образованием фенотипа, или что последовательность конструкции hpCHS[G:U] содержала 65 замен цитозина (32,5%), по сравнению только с 43 (21,5%) для последовательности EIN2 и 52 (26%) для последовательности GUS. Кроме того, многие из этих цитозиновых оснований в последовательности CHS встречаются в наборах из двух или трех последовательных цитозинов, поэтому не все они должны быть заменены. При замене всех цитозинов в смысловой цепи, это приводило к большему количеству пар оснований G:U в РНК hpCHS[G:U], чем в РНК hpEIN2[G:U] и hpGUS[G:U], возможно, большему, чем оптимальное. Чтобы убедиться в этом, другой набор конструкций CHS получали с использованием последовательности, содержащей ряд цитозиновых замен, примерно из 5%, 10%, 15%, 20% или 25% замещенных оснований цитозина. Эти конструкции тестировали и определяли оптимальный уровень.

Линии hpEIN2[G:U] экспрессируют более единообразные уровни миРНК

В соответствии с относительно единообразным сайленсингом гена EIN2, линии hpEIN2[G:U] накапливали кРНК с более единообразным уровнем в независимых линиях. Это подтвердило вывод, сделанный в отношении конструкций hpGUS, что [G:U] модифицированная шРНК эффективно процессировалась Dicer и была способна индуцировать эффективный сайленсинг гена-мишени.

Слитые конструкции также обеспечивают сайленсинг генов

Цель включения слитых конструкций CHS:EIN2 в эксперимент состояла в проверке, можно ли вызвать сайленсинг двух генов-мишеней с использованием одной конструкции, кодирующей шпильку. Эксперимент с GUS показал, что свободная энергия и, следовательно, стабильность шпилечной РНК положительно коррелировали со степенью сайленсинга гена-мишени. Результаты показали, что слитая конструкция CHS:EIN2 действительно приводила к сайленсингу обоих генов - для CHS, по меньшей мере, на уровне мРНК.

Две конструкции hpRNA, hpEIN2[G:U/U:G] и hpCHS:EIN2[G:U/U:G], в которых как смысловая, так и антисмысловая последовательности были модифицированы с заменой C на T, в результате чего 46% пар оснований были превращены из канонических пар оснований в пары оснований G:U, вызывали лишь слабый или не вызывали сайленсинг EIN2 в большей части трансгенных растений. Возможные объяснения включают в себя следующее: i) слишком много пар оснований G:U, что привело к неэффективному процессингу Dicer, и ii) кРНК, связывающаяся с мРНК-мишенью, включала слишком много пар оснований G:U, не вызывала эффективного расщепления мРНК, или комбинация факторов.

Увеличенное единообразие сайленсинга гена-мишени G:U спаренными конструкциями связано с снижением метилирования промотора

Анализ метилирования ДНК с помощью ПЦР с расщеплением McrBC и секвенирования с обработкой бисульфитом показал, что все линии растений hpEIN2[wt] демонстрировали метилирование ДНК в промоторной области, при этом степень метилирования отрицательно коррелировала с уровнем сайленсинга EIN2. Даже три наименее метилированных линии, при оценке по ПЦР с расщеплением McrBC, показали примерно 40% уровни метилирования ДНК в 35S промоторе относительно всех метилированных цитозинов. Широко распространенное метилирование промотора, как предположили, было обусловлено кРНК-направленным метилированием ДНК в повторяющейся последовательности EIN2, которое распространялось в смежную промоторную область. В отличие от линий растений шРНК[wt], ряд линий hpEIN2[G:U] показали низкое метилирование или отсутствие метилирования промотора, при этом большинство проанализированных растений показало менее метилированные цитозины. Как обсуждалось в отношении линий hpGUS, снижению метилирования могут способствовать несколько факторов: i) структура инвертированных повторов ДНК была прервана путем замены оснований C основаниями T в смысловой последовательности, и ii) смысловая последовательность EIN2 не содержала цитозинов, поэтому она не могла быть метилирована путем кРНК-направленного метилирования ДНК, и iii) сниженный уровень продукции 24-мерных РНК из-за изменения в структуре области дцРНК с парами оснований G:U, приводящий к изменениям в распознавании некоторыми Dicer-рибонуклеазами и в результате уменьшению активности Dicer 3 и/или Dicer 4 и относительно более высокой активности Dicer 2. Таким образом, трансген hpEIN2[G:U] может проявлять себя как нормальный не-РНКи трансген (такой как овер-экспрессируемый трансген), и метилирование промотора, наблюдаемое в некоторых линиях, было обусловлено профилями вставки T-ДНК, а не нативной структурой инвертированных повторов ДНК шРНК трансгена.

Пример 14. Модифицированные шпильки для снижения экспрессии другого эндогенного гена

Были разработаны и синтезированы генетические конструкции для получения модифицированных сайленсирующих РНК либо для шпилечных РНК, либо для кпРНК, направленно воздействующие на другие эндогенные гены. Они включали следующее.

Ген FANCM в A. thaliana и в Brassica napus кодирует белок группы комплементации M анемии Фанкони (FANCM), который представляет собой белок РНК-геликазу с DEAD/DEAH боксом, рег. номера NM_001333162 и XM_018659358. Нуклеотидная последовательность кодирующей белок области кДНК, соответствующей гену FANCM A. thaliana, представлена в SEQ ID NO:31, а для B. napus - в SEQ ID NO:32.

Генетические конструкции были сконструированы и получены для экспрессии шпилечных РНК с заменами C на T или без замен и кпРНК, направленно воздействующей на ген FANCM в A. thaliana и в Brassica napus. Область-мишень была выбрана в гене A. thaliana: нуклеотиды 675-1174 (500 нуклеотидов) SEQ ID NO:31. Область-мишень была выбрана в гене B. napus: нуклеотиды 896-1395 (500 п.н.) SEQ ID NO:32. Были сконструированы и собраны конструкции, кодирующие шпилечные РНК, в которых использовали смысловую последовательность дикого типа или модифицированную (G:U) смысловую последовательность. Нуклеотидные последовательности конструкций hpFANCM-At[wt], hpFANCM-At[G:U], hpFANCM-Bn[wt] и hpFANCM-Bn[G:U] представлены в SEQ ID NO:33-36. Для создания конструкций G:U все цитозиновые основания в смысловых последовательностях заменяли тиминовыми основаниями - 102/500 (с получением 20,4% пар оснований G:U) в конструкции A. thaliana и 109/500 (21,8% оснований G:U)) в конструкции B. napus. Наиболее длинный непрерывный участок из канонических пар оснований в двухцепочечной области G:U модифицированной шпильки B. napus составлял 17 пар оснований, а второй по длине - 16 последовательных пар оснований.

Ген DDM1 в B. napus кодирует метилтрансферазу, метилирующую цитозиновые основания в ДНК (Zhang et al., 2018). Нуклеотидная последовательность кодирующей белок области кДНК соответствует гену DDM1 B. napus в SEQ ID NO:37.

Генетические конструкции были сконструированы и получены для экспрессии шпилечных РНК с заменами C на T или без замен и кпРНК, направленно воздействующей на ген DDM1 в Brassica napus. Были выбраны две несмежные области-мишени гена B. napus: нуклеотиды 504-815 и 1885-2074 с последовательностью SEQ ID NO:37, которые непосредственно соединяли с получением химерной смысловой последовательности. Таким образом, общая длина смысловой последовательности составила 502 нуклеотида. Были сконструированы и собраны конструкции, кодирующие шпилечные РНК, в которых использовали смысловую последовательность дикого типа или модифицированную (G:U) смысловую последовательность. Нуклеотидные последовательности конструкций hpDDM1-Bn[wt] и hpDDM1-Bn[G:U] представлены в SEQ ID NO:38-39. Для получения G:U конструкции цитозины в смысловых последовательностях заменяли тиминами - 106/502 (21,1% пар оснований G:U) в конструкции B. napus. Наиболее длинный непрерывный участок из канонических пар оснований в двухцепочечной области G:U модифицированной шпильки составлял 20 пар оснований, а второй по длине - 15 последовательных пар оснований.

Для другой конструкции, направленно воздействующей на эндогенный ген, разработали генетическую конструкцию для экспрессии шпилечной РНК с 95 заменами C на T в смысловой последовательности из 104 C в смысловой последовательности из 350 нуклеотидов, с получением 95/350=27,1% G:U пар оснований в двухцепочечной области шпилечной РНК. То есть не все C в смысловой последовательности были заменены T. В частности, если в последовательности присутствовал фрагмент из 3, 4 или 5 последовательных C, только 1 или 2 из трех C, или только 2 или 3 из четырех C, или только 2, 3 или 4 из 5 последовательных C были заменены T. Это обеспечило более равномерное распределение пар оснований G:U в области двухцепочечной РНК. Наиболее длинный непрерывный участок из канонических пар оснований в двухцепочечной области составлял 15 пар оснований, а второй по длине - 13 последовательных пар оснований.

Была разработана другая конструкция, в которой одна или две пары оснований в каждом блоке из 4, 5, 6 или 7 нуклеотидов были модифицированы с заменами C на T или A на G. Если смысловая последовательность дикого типа содержала участок из 8 или более нуклеотидов, состоящих из T или G, один или более нуклеотидов были заменены либо в смысловой цепи с получением некомплементарного нуклеотида в этом блоке, либо замена C на T или A на G была сделана в антисмысловой цепи, чтобы исключить возникновения двухцепочечного участка из 8 или более последовательных канонических пар оснований в двухцепочечной области полученной в результате шпилечной РНК, транскрибируемой с конструкции.

Пример 15. Модифицированные шпильки для снижения экспрессии генов в клетках животных

Для проверки модифицированных сайленсирующих РНК в клетках животных, в G:U спаренной форме, в форме кпРНК или в комбинации двух модификаций, в следующих экспериментах в качестве модельного гена-мишени использовали ген, кодирующий усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP). Нуклеотидная последовательность кодирующей области EGFP показана в SEQ ID NO:40. Была выбрана область-мишень из 460 нуклеотидов, соответствующая нуклеотидам 131-591 SEQ ID NO:40.

Была сконструирована и получена генетическая конструкция, обозначенная hpEGFP[wt], которая экспрессировала шпилечную РНК, включающую, в порядке от 5' к 3' относительно промотора для экспрессии, антисмысловую последовательность EGFP из 460 нуклеотидов, которая была полностью комплементарна соответствующей области (нуклеотиды 131-590) кодирующей области EGFP, последовательность петли из 312 нуклеотидов, частично полученную из кодирующей области GUS (соответствует нуклеотидам 802-1042 ORF GUS), и смысловую последовательность EGFP из 460 нуклеотидов, которая была идентична по последовательности нуклеотидам 131-590 кодирующей области EGFP. Последовательность ДНК, кодирующая шпилечную РНК hpEGFP[wt] (SEQ ID NO:41), включала сайт рестрикции NheI на 5'-конце и сайт SalI на 3'-конце для обеспечения клонирования в вектор pCI (Promega Corporation). Этот вектор подходит для экспериментов по трансфекции клеток млекопитающих и должен обеспечивать экспрессию с сильного промотора/энхансера ЦМВ. Конструкция также содержла последовательность промотора Т7, встроенную между сайтом NheI и началом антисмысловой последовательности для обеспечения транскрипции in vitro с получением шпилечной РНК с использованием РНК-полимеразы Т7. Кассету, кодирующую шпильку, встраивали по сайтам NheI-SalI в вектор экспрессии pCI, в результате чего область, кодирующая РНК, была функционально связана с промотором ЦМВ и поздней областью полиаденилирования/терминации транскрипции SV40.

Была сконструирована и получена соответствующая шпилечная конструкция, которая содержала 157 замен C на T в смысловой последовательности и не содержала замен в антисмысловой последовательности, обозначенная hpEGFP[G:U] (SEQ ID NO:42). Область-мишень в области, кодирующей EGFP, представляла собой нуклеотиды 131-590. Процент замен C на T и, следовательно, пар оснований G:U в стебле шпилечной РНК составлял 157/460=34,1%. Смысловая и антисмысловая последовательности имели идентичную длину, 460 нуклеотидов. В области сайленсинга генов длинных двухцепочечных РНК обычно стараются избегать из-за вероятности активации клеточного ответа, включая активацию интерферонами.

Конструкция кпРНК, обозначенная ledEGFP[wt], была сконструирована и получена для экспрессии кпРНК, содержащей, в порядке от 5' к 3' относительно промотора для экспрессии, антисмысловую последовательность EGFP из 228 нуклеотидов, которая была полностью комплементарна нуклеотидам 131-358 кодирующей последовательности EGFP, последовательность петли из 150 нуклеотидов, смысловая последовательность EGFP из 460 нуклеотидов, которая была идентична по последовательности нуклеотидам 131-590 кодирующей области EGFP (SEQ ID NO:40), последовательность петли из 144 нуклеотидов и антисмысловая последовательность из 232 нуклеотидов, которая полностью комплементарна нуклеотидам 359-590 кодирующей последовательности EGFP, фланкированная сайтами рестрикции NheI и SalI (SEQ ID NO:43). Таким образом, кодируемая кпРНК относится к типу, показанному на Фигуре 1А. Структура кпРНК при отжиге на себя путем спаривания оснований между одной смысловой и двумя антисмысловыми последовательностями содержала двухцепочечную область из 460 пар оснований, соответствующую области-мишени EGFP, при этом две антисмысловые последовательности не были непосредственно ковалентно связаны друг с другом, но имели "пропуск" или "ник" между концами, соответствующими нуклеотидам 358 и 359. Структура кпРНК была встроена в более протяженный РНК транскрипт, включающий 5'- и 3'-области, полученные из последовательностей в промоторе ЦМВ и SV40-поздних областей полиаденилирования/терминации транскрипции.

Также была сконструирована и получена соответствующая конструкция кпРНК, которая содержала 162 замены C на T в смысловой последовательности и не содержала замен в антисмысловой последовательности, обозначенная ledEGFP[G:U] (SEQ ID NO:44). В каждом случае область-мишень в кодирующей области EGFP являлась нуклеотидами 131-590 относительно кодирующей белок области, начиная со старт-кодона ATG (SEQ ID NO:40). Процент замен C на T и, таким образом, пар оснований G:U в стебле кпРНК составлял 162/460=35,2%.

Плазмиды, кодирующие сайленсирующие РНК hpEGFP[wt], hpEGFP[G:U], ledEGFP[wt] и ledEGFP[G:U], тестировали на активность сайленсинга генов в клетках CHO, HeLa и VERO путем трансфекции векторов в клетки. Анализы проводили путем котрансфекции тестируемых плазмид с плазмидой, экспрессирующей GFP. Все анализы проводили в тройной повторности. Клетки СНО (клетки яичника китайского хомячка) и клетки VERO (клетки почек африканской зеленой мартышки) сеяли в 24-луночные планшеты при плотности 1×10⁵ клеток на лунку. Клетки СНО выращивали в модификации MEMα (Sigma, USA), а клетки HeLa и VERO выращивали в DMEM (Invitrogen, USA). В обе базальных среды добавляли 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 10 мМ Hepes, 1,5 г/л бикарбоната натрия, 0,01% пенициллина и 0,01% стрептомицина. Клетки выращивали при 37°C в 5% CO₂. Затем клетки трансфицировали 1 мкг на лунку плазмидной ДНК или миРНК в качестве контроля сайленсинга EGFP при использовании Lipofectamine 2000. Вкратце, тестируемую миРНК или плазмиду объединяли с репортерной плазмидой GFP (pGFP N1) и затем смешивали с 1 мкл Lipofectamine 2000, обе разбавляли в 50 мкл OPTI-MEM (Invitrogen, USA) и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. Затем комплекс добавляли к клеткам и инкубировали в течение 4 часов. Клеточную среду заменяли и инкубировали клетки в течение 72 часов. Затем клетки подвергали проточной цитометрии для измерения сайленсинга GFP. Вкратце, анализируемые клетки трипсинизировали, промывали в PBSA, ресуспендировали в 200 мкл 0,01% азида натрия и 2% FCS в PBSA и анализировали с использованием проточного цитофлуориметра FACScalibur (Becton Dickinson). Анализ данных проводили с использованием программы CELLQuest (Becton Dickinson) и представляли как среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) в процентах от контрольных клеток с репортерной и нерелевантной (отрицательный контроль) шРНК.

миРНК против GFP, называемая si22, была получена от Qiagen (USA). Последовательность миРНК против GFP si22 была смысловой 5'-GCAAGCUGACCCUGAAGUUCAU-3' (SEQ ID NO:86) и антисмысловой 5'-GAACUUCAGGGUCAGCUUGCCG-3' (SEQ ID NO:87). Генетическую конструкцию положительного контроля, обозначенную pshGFP, создавали с помощью одностадийной реакции ПЦР при использовании мышиной последовательности U6 в качестве матрицы. В качестве прямого праймера использовали 5'-TTTTAGTATATGTGCTGCCG-3' (SEQ ID NO:88), и в качестве обратного праймера использовали 5'-CTCGAGTTCCAAAAAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTCTCTTGAAGATGAACTTCAGGGTCAGCCAAACAAGGCTTTTCTCCAA-3' (SEQ ID NO:89). Продукт амплификации, который включал полноразмерную кассету экспрессии, лигировали в pGEM-T Easy. Нерелевантную контрольную плазмиду шРНК также конструировали с помощью того же метода ПЦР. Для ее конструирования использовали прямой праймер 5'-TTTTAGTATATGTGCTGCCG-3' (SEQ ID NO:90), и обратный праймер 5'-ctcgagttccaaaaaaataagtcgcagcagtacaatctcttgaattgtactgctgcgacttatgaataccgcttcctcctgag-3' (SEQ ID NO:91).

Полученные в результате одного эксперимента данные показаны на Фигуре 34. Четкое снижение активности EGFP (сайленсинг РНК) наблюдали как в клетках VERO, так и в клетках CHO, как для si22, так и для pshGFP-положительных контролей при сравнении с нерелевантным шРНК контролем. Эти положительные контроли являлись хорошо проверенной малой молекулой дцРНК (si22) или кодировали шРНК (pshGFP), которые, как известно, обладают очень сильной сайленсирующей активностью в клетках млекопитающих. Контрольные молекулы РНК имеют двухцепочечные области из 20 последовательных пар оснований и 21 последовательной пары оснований, соответственно, с использованием только канонических пар оснований и без некомплементарных нуклеотидов в двухцепочечных областях и в пределах 20-30 пар оснований, обычно используемых в клетках млекопитающих. С другой стороны, конструкции шРНК и кпРНК экспрессируют молекулы, имеющие протяженные области дцРНК. Было обнаружено, что все четыре конструкции специфично подавляют экспрессию EGFP в значимой степени в клетках обоих типов (Фигура 34). Включение замен G:U приводили к четкому улучшению сайленсинга для обеих конструкций в клетках СНО. В клетках VERO заметное улучшение сайленсинга наблюдали только при использовании конструкции ledEGFP[G:U] в сравнении с ledEGFP[wt].

Во втором эксперименте с использованием (человеческих) клеток HeLa и анализом активности EGFP через 48 ч после трансфекции, были получены аналогичные результаты (Фигура 35).

Важно отметить, что сайленсинг генов наблюдали в клетках млекопитающих при использовании эффекторных молекул шРНК и кпРНК, с учетом того, что они имели более протяженные двухцепочечные области, чем обычный диапазон от 20 до 30 пн. Также было ясно, что модификация с заменой нуклеотидов с образованием пар оснований G:U значительно усиливает эффект сайленсинга генов этих более длинных молекул дцРНК. Этот эффект может быть обусловлен тем, что эти структуры более схожи с эндогенными преРНК, предшественниками миРНК, наблюдаемыми в эукариотических клетках, и, таким образом, улучшают процессинг более протяженной дцРНК для загрузки в эффекторные белки РНК-индуцируемого комплекса сайленсинга (RISC).

Пример 16. Конструкции РНК, направленно воздействующие с генами DDM1 и FANCM в растениях

Авторы изобретения рассмотрели способы увеличения скорости, с которой могут быть получены и исследованы новые генетические профили и разнообразие (генетический эффект) для определения желаемых продуктивных признаков у растений. Один из способов, который был рассмотрен, заключался в том, чтобы найти способ увеличить скорость рекомбинации, которая происходит при половом размножении растений. Селекционеры растений полагаются на события рекомбинации для создания различных генетических (аллельных) комбинаций, среди которых они могут искать требуемый генетический профиль, связанный с повышением продуктивности. Однако количество событий рекомбинации на каждом этапе размножения чрезвычайно мало по сравнению с количеством возможных генетических профилей, которые можно исследовать. Кроме того, элементы, которые контролируют, где эти события происходят в геноме, исследованы недостаточно. Поэтому авторы изобретения рассмотрели вопрос о том, можно ли использовать кпРНК, доставляемую либо экзогенно, либо эндогенно посредством трансгенного подхода, для изменения скоростей рекомбинации у растений, чтобы обеспечить быстрое увеличение генетического разнообразия и сделать возможным более быстрое получение генетического эффекта в скрещиваемых популяциях.

Эпигеном растений находится под влиянием ряда различных химических модификаций ДНК и ассоциированных белков, которые организуют, упаковывают и стабилизируют геном. Эти модификации также регулируют, где происходит рекомбинация, при этом плотная упаковка генома является сильным ингибитором рекомбинации (Yelina et al, 2012; Melamed-Bessudo et al., 2012). Белок УМЕНЬШЕННОЕ МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК 1 (DDM1) представляет собой фермент, который регулирует метилирование ДНК и упаковку генома. Мутация в этом гене может изменять положение событий рекомбинации (Yelina et al, 2012; Melamed-Bessudo et al., 2012).

События рекомбинации во время мейоза жестко регулируются, при этом только 1-2 события происходят в каждой хромосоме, чтобы обеспечить надлежащую хромосомную сегрегацию в метафазе 1. События рекомбинации инициируются при образовании двухцепочечных разрывов (DSB) ДНК, которые создает фермент SPO11 (Wijnker et al, 2008). Это приводит к возникновению сотен DSB на хромосоме. Хотя некоторые из этих DSB приводят к кроссоверам, большинство восстанавливаются ферментами репарации ДНК, прежде чем может произойти событие рекомбинации. Кроме того, существует ряд негативных регуляторов, которые ингибируют превращение DSB в кроссоверы. В первоначальном подходе, предложенном авторами изобретения, генетические конструкции, кодирующие молекулы кпРНК или обычные молекулы шпилечных РНК для сравнения должны были вводить в растения A. thaliana с целью направленного воздействия на ген, кодирующий белковый фактор, который потенциально может влиять на скорость рекомбинации, такой как белок ГРУППЫ КОМПЛЕМЕНТАЦИИ M АНЕМИИ ФАНКОНИ (FANCM).

Нуклеотидная последовательность гена DDM1 A. thaliana была представлена под рег. номером AF143940 (Jeddeloh et al., 1999). Как было показано, снижение экспрессии гена DDM1 уменьшало метилирование ДНК и увеличивало число и количество положений событий кроссовера в A. thaliana (Melamed-Bessudo and Levy, 2012).

Brassica napus является аллотетраплоидным видом и имеет два гена DDM1 на каждом из субгеномов A и C, на хромосомах A7, A9, C7 и C9, и поэтому имеет в общей сложности четыре гена DDM1. Эти гены называются BnaA07g37430D-1, BnaC07g16550D-1, BnaA09g52610D-1 и BnaC09g07810D-1. Нуклеотидная последовательность гена DDM1 BnaA07g37430D-1 B. napus предоставлена под рег. номером XR_001278527 (SEQ ID NO:93). Была сконструирована и получена конструкция шпилечной РНК, направленно взаимодействующая с областью из 500 нуклеотидов четырех генов, соответствующая нуклеотидам 650-959 и 2029-2218 SEQ ID NO:93. Нуклеотидная область, используемая для конструирования конструкций шРНК и кпРНК, направленно воздействует на все четыре гена DDM1 BnaA07g37430D-1, BnaC07g16550D-1, BnaA09g52610D-1 и BnaC09g07810D-1, присутствующих в B. napus, на основе консервативности последовательности между генами. Порядок элементов в конструкции шРНК был следующим: промотор-смысловая последовательность-последовательность петли, включающая интрон из вектора Hellsgate-антисмысловая последовательность-терминатор транскрипции/область полиаденилирования. Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей шРНК, представлена в SEQ ID NO:94.

Была изготовлена вторая конструкция шпилечной РНК, кодирующая шпилечную РНК, направленно взаимодействующую с той же областью из 500 нуклеотидов и имеющая такую же структуру, за исключением того, что 97 цитозин-нуклеотидов (C) смысловой последовательности были заменены тимидин-нуклеотидами (T). При транскрипции химерной ДНК и отжиге на себя G:U замещенной шРНК происходило спаривание 97/500=19,4% нуклеотидов в области дцРНК с образованием пар оснований G:U. Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей G:U модифицированную шРНК, представлена в SEQ ID NO:95. Кроме того, была получена химерная ДНК, кодирующая кпРНК, направленно взаимодействующую с той же областью гена DDM1 B. napus. Нуклеотидная последовательность этой химерной ДНК, кодирующей кпРНК, представлена в SEQ ID NO:96.

Для получения РНК путем транскрипции in vitro препараты ДНК расщепляли рестриктазой HincII, которая создавала разрыв сразу после кодирующей области, транскрибировали in vitro с использованием РНК-полимеразы Т7, очищали РНК и затем концентрировали в водном буферном растворе. кпРНК использовали для направленного воздействия на эндогенные транскрипты DDM1 в семядолях B. napus (канола). Семядоли пятидневных ростков, выращенных в асептических условиях на среде для культур тканей, осторожно вырезали и помещали в чашку Петри, содержащую 2 мл жидкой среды MS, содержащей 2% (в/об) сахарозы, с 113 мкг кпРНК или 100 мкл водного буферного раствора в качестве контроля. Жидкая среда MS, используемая для обработок, содержала поверхностно-активное вещество Silwett-77 (0,5 мкл в 60 мл). Чашки Петри инкубировали в шейкере при легком встряхивании, чтобы семядоли пропитались раствором, содержащим кпРНК. Образцы собирали через 5 и 7 часов после нанесения кпРНК. В параллельном эксперименте верхнюю поверхность семядолей покрывали либо 10 мкг кпРНК, либо буферным раствором и инкубировали на влажной бумажной салфетке. Образцы собирали через 7 часов после нанесения кпРНК.

Кроме того, для направленного воздействия на эндогенные транскрипты DDM1 в репродуктивной ткани B. napus, цветочные почки канолы обрабатывали кпРНК либо в присутствии, либо в отсутствие аликвоты суспензии клеток штамма Agrobacterium tumafecians AGL1, то есть живых клеток AGL1. Водный буферный раствор с клетками AGL1 или без них служил в качестве соответствующего контроля. AGL1 выращивали в 10 мл жидкой среды LB, содержащей 25 мг/мл рифампицина, в течение двух дней при 28°C. Клетки собирали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 минут. Осадок клеток промывали и клетки ресуспендировали в 2 мл жидкой среды MS. Цветочные почки инкубировали в чашке Петри, содержащей 2 мл жидкой среды MS, включающей 0,5 мкл Silwett-77, в 50 мл жидкой среды MS, с 62 мкг кпРНК или 62 мкг +50 мкл культуры AGL1. В качестве контроля использовали 50 мкл буферного раствора или 50 мкл буферного раствора +50 мкл культуры AGL1. Образцы инкубировали на шейкере с мягким встряхиванием в течение 7 часов. Три биологических повторности использовали для каждой обработки.

Обработанные и контрольные семядоли и цветочные почки два раза промывали в стерильной дистиллированной воде, с помощью бумажной салфетки удаляли воду с поверхности и быстро замораживали в жидком азоте. РНК выделяли из обработанных и контрольных тканей, обрабатывали ДНКазой для удаления геномной ДНК и подвергали количественному анализу. кДНК первой цепи синтезировали с использованием равных количеств суммарной РНК из образцов, обработанных кпРНК, и их соответствующих контролей. Экспрессию DDM1 анализировали с использованием количественной ПЦР в реальном времени (кОТ-ПЦР).

В обработанных семядолях, пропитанных кпРНК, представленность транскрипта DDM1 снижалась приблизительно на 83-86% через 5 ч, а затем еще падала со снижением 91% через 7 ч по сравнению с контролями. Аналогичным образом снижение уровня мРНК DDM1 по сравнению с контролем приблизительно на 78-85% наблюдали в семядолях, которые были покрыты кпРНК. В цветочных почках, обработанных кпРНК, не было обнаружено различий в представленности мРНК DDM1 по сравнению с контролем в отсутствие клеток Agrobacterium. Тем не менее, снижение приблизительно на 60-75% уровней транскрипта DDM1 наблюдали в цветочных почках, которые были обработаны кпРНК в присутствии Agrobacterium по сравнению с соответствующим контролем. Не было обнаружено существенного различия в уровнях транскрипта DDM1 при сравнении контроля без Agrobacterium с контролем, в котором присутствовала Agrobacterium, что показывало, что сами клетки Agrobacterium не вызывали снижения транскрипта DDM1. В совокупности эти результаты показали, что кпРНК способна снижать уровни эндогенного транскрипта DDM1 как в семядолях, так и в цветочных почках, тогда как живые клетки Agrobacterium, по-видимому, способствуют проникновению кпРНК в цветочные почки. Такая доступность кпРНК также может быть достигнута физическими способами, такими как прокалывание наружных слоев цветочных почек, центрифугирование или вакуумная инфильтрация, или с помощью комбинации таких способов.

У некоторых мутантов Arabidopsis thaliana, таких как мутанты zip4, отсутствуют мейотические кроссоверы, что вызывает нарушение сегрегации гомологов хромосом и, таким образом, снижает фертильность и приводит к укорачиванию стручков (плодов), которые можно визуально отличить от стручков растений дикого типа. Фенотип мутантов zip4 может быть устранен путем снижения экспрессии гена FANCM.

Нуклеотидная последовательность гена FANCM A. thaliana представлена под рег. номером NM_001333162 (SEQ ID NO:97). Была сконструирована и получена конструкция шпилечной РНК, направленно воздействующая на область гена из 500 нуклеотидов, соответствующую нуклеотидам 853-1352 SEQ ID NO:97. Порядок элементов в конструкции являлся следующим: промотор-смысловая последовательность-последовательность петли, включающая интрон из вектора Hellsgate-антисмысловая последовательность-терминатор транскрипции/область полиаденилирования. Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей шРНК, представлена в SEQ ID NO:98. Была получена вторая конструкция шпилечной РНК, кодирующая аналогичную шпилечную РНК, направленно воздействующую на ту же область из 500 нуклеотидов, за исключением того, что 102 цитозин-нуклеотидов (C) смысловой последовательности были заменены тимидин-нуклеотидами (T). При транскрипции химерной ДНК и отжиге на себя полученной G:U замещенной шРНК происходило спаривание 102/500=20,4% нуклеотидов в области дцРНК с образованием пар оснований G:U. Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей G:U-модифицированную шРНК, представлена в SEQ ID NO:99. Кроме того, была получена химерная ДНК, кодирующая кпРНК, последовательность на ту же область гена FANCM A. thaliana. Нуклеотидная последовательность этой химерной ДНК, кодирующей кпРНК, представлена в SEQ ID NO:100.

B. napus имеет по одному гену FANCM на каждом из его субгеномов A и C, обозначенные BnaA05g18180D-1 и BnaC05g27760D-1. Нуклеотидная последовательность одного из генов FANCM B. napus представлена под рег. номером XM_022719486.1; SEQ ID NO:101). Была сконструирована и получена химерная ДНК, кодирующая шпилечную РНК, направленно воздействующую на область гена из 503 нуклеотидов, соответствующую нуклеотидам 2847-3349 SEQ ID NO:101. Порядок элементов в конструкции являлся следующим: промотор-смысловая последовательность-последовательность петли, включающая интрон из вектора Hellsgate-антисмысловая последовательность-терминатор транскрипции/область полиаденилирования. Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей шРНК, представлена в SEQ ID NO:102. Была получена вторая конструкция шпилечной РНК, кодирующая аналогичную шпилечную РНК, направленно воздействующую на ту же область из 503 нуклеотидов, за исключением того, что 107 цитозин-нуклеотидов (C) смысловой последовательности были заменены тимидин-нуклеотидами (T). При транскрипции химерной ДНК и отжиге на себя полученной G:U замещенной шРНК происходило спаривание 107/500=21,4% нуклеотидов в области дцРНК с образованием пар оснований G:U. Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей G:U-модифицированную шРНК, представлена в SEQ ID NO:103. Кроме того, была получена химерная ДНК, кодирующая кпРНК, направленно воздействующую на ту же область гена FANCM B. napus. Нуклеотидная последовательность этой химерной ДНК, кодирующей кпРНК, представлена в SEQ ID NO:104.

Для продукции РНК путем транскрипции in vitro, препараты ДНК расщепляли рестриктазой HincII, которая создавала разрыв сразу после кодирующей области, транскрибировали in vitro с помощью РНК-полимеразы Т7, очищали РНК и затем концентрировали в водном буферном растворе. кпРНК использовали вместе с AGL1 Agrobacterium tumefacians для направленного воздействия на транскрипты FANCM в пре-мейотических почках мутанта zip4 A. thaliana. Стручки мутанта zip4 были более короткими, что можно легко наблюдать визуально, по сравнению со стручками дикого типа из-за ослабления образования кроссовера, что привело к снижению фертильности. Было показано, что репрессия FANCM у мутанта zip4 восстанавливает фертильность и восстанавливает длину стручков.

Соцветия A. thaliana zip4, содержащие пре-мейотические зародыши, обрабатывали кпРНК, направленно воздействующим на FANCM, вместе с AGL1 или буферным раствором с AGL1 в качестве контроля, в каждом случае в присутствии поверхностно-активного вещества, в данном случае Silwett-77. После завершения посева семян стручки, полученные из пре-мейотических почек, разрезали для определения количества семян. Из 15 стручков обработанных кпРНК образцов, два стручка содержали 10 семян, один стручок содержал 9 семян, тогда как количество семян в контрольных стручках изменялось в пределах 3-6. Эти результаты показали, что наблюдаемое увеличение количества семян было связано с репрессией уровней транскрипта FANCM под действием кпРНК, что приводит к увеличению числа мейотических кроссоверов и повышению фертильности.

Пример 17. Конструкции РНК для резистентности к грибковому заболеванию

кпРНК, направленно воздействующая на гены Mlo ячменя и пшеницы

Грибковое заболевание зерновых растений, мучнистая роса, которое вызвает аскомицет Blumeria graminis f. sp. hordei в ячмене и родственный гриб Blumeria graminis f. sp. tritici в пшенице. B. graminis является облигатным биотрофным грибковым патогенном из отряда Erysiphales (Glawe, 2008), которому для размножения требуется растение-хозяин, включая непосредственное взаимодействие между грибом и клетками-хозяевами, чтобы гриб мог получать питательные вещества из растения. Вначале гриб поражает эпидермальный слой листьев, листовых влагалищ или колосьев после контакта аскоспор или конидий гриба с поверхностью. Листья остаются зелеными и активными в течение некоторого времени после заражения, затем разрастаются порошистые, мицелиальные массы, листья постепенно становятся хлоротическими и отмирают. По мере развития заболевания мицелий гриба может быть усеян мелкими черными точками, которые являются половыми плодоносящими телами гриба. Такое заболевание, как мучнистая роса, распространено по всему миру и наиболее опасно в прохладном, влажном климате. Болезнь влияет на урожай зерна главным образом за счет уменьшения количества головок, а также уменьшения размера и веса зерна. В настоящее время борьба с болезнями осуществляется путем обработки сельскохозяйственных культур аэрозолями фунгицида, который необходимо часто применять в прохладных и влажных условиях, и является дорогостоящей, или необходимо выращивать устойчивые сорта. Кроме того, устойчивость к фунгицидам у мучнистой росы на пшенице развивалась в Австралии.

Гены Mlo ячменя и пшеницы кодируют полипептиды Mlo, которые придают восприимчивость к B. graminis по неизвестному механизму. Существует множество близко родственных белков MLO, кодируемых семейством генов Mlo, которые являются уникальными для растений. Каждый ген кодирует белок с семью трансмембранными доменами и неизвестной биохимической активностью, локализованный в плазматической мембране. Примечательно, что только специфические гены Mlo в семействе способны действовать как гены восприимчивости к мучнистой росе, и они кодируют полипептиды с консервативными мотивами в цитоплазматическом C-концевом домене белков Mlo. Механизм, с помощью которого полипептиды Mlo действуют как факторы восприимчивости к мучнистой росе, неизвестен. Появление природных mlo мутантов пшеницы не было описано, по-видимому, из-за полиплоидной природы пшеницы. Однако искусственно созданные мутанты mlo демонстрируют некоторую устойчивость к заболеванию, но часто демонстрируют существенно сниженную урожайность зерна или преждевременное старение листьев (Wang et al., 2014; Acevedo-Garcia et al., 2017).

Гексаплоидная пшеница имеет три гомолога генов Mlo, обозначенных TaMlo-A1, TaMlo-B1 и TaMlo-D1, которые расположены на хромосомах 5AL, 4BL и 4DL соответственно (Elliott et al., 2002). Нуклеотидные последовательности кДНК, соответствующие генам, доступны под рег. номерами: TaMlo-A1, AF361933 и AX063298; TaMlo-B1, AF361932, AX063294 и AF384145; и TaMlo-D1, AX063296. Нуклеотидные последовательности генов в геномах A, B и D и аминокислотные последовательности кодируемых полипептидов идентичны приблизительно на 95-97% и 98% соответственно. Все три гена экспрессируются в листьях растений, при этом уровни экспрессии повышаются по мере роста и созревания растений. Поэтому авторы изобретения разработали и получили конструкцию кпРНК, которая может снижать экспрессию всех трех генов, воспользовавшись степенью идентичности последовательностей между генами и направленно воздействуя на область гена с высокой степенью консервативности последовательности.

Была получена химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно воздействующую на все три гена TaMlo-A1, TaMlo-B1 и TaMlo-D1. Генетическая конструкция была получена с помощью принципов создания кпРНК, описанных выше, с разделенной последовательностью, являющейся антисмысловой последовательностью, и сплошной последовательностью, являющейся смысловой последовательностью (Фигура 1A).

Была выбрана нуклеотидная последовательность длиной 500 пн гена-мишени TaMlo, соответствующая нуклеотидам 916-1248, слитым с 1403-1569 SEQ ID NO:136. Область дцРНК каждой кпРНК имела длину 500 пн; смысловая последовательность в области дцРНК являлась непрерывной сплошной последовательностью, например, соответствовала нуклеотидам 916-1248, слитым с 1403-1569 SEQ ID NO:136. Нуклеотидная последовательность, кодирующая кпРНК, представлена в настоящем документе в SEQ ID NO:137.

кпРНК получали путем транскрипции in vitro при использовании РНК-полимеразы T7, очищали и ресуспендировали в буфере. По 10 мкг кпРНК на лист наносили кистью на зону листьев растений пшеницы на стадии роста 23 по шкале Задокса. В качестве контроля некоторые листья подвергали ложной обработке с использованием только буфера. Обработанные и контрольные образцы листьев собирали и выделяли РНК. Анализы кПЦР на выделенных РНК показали, что уровни мРНК TaMlo, являющиеся комбинацией трех мРНК TaMlo, были снижены на 95,7%. Растения на стадии роста Z73 также обрабатывали и анализировали. Они показали снижение экспрессии гена TaMlo на QPCR на 91% по сравнению с контрольными образцами листьев. Снижение экспрессии гена TaMlo, наблюдаемое в обработанных участках листьев, было специфичным для обработанных зон - в дистальных, необработанных частях листьев снижение уровней мРНК TaMlo отсутствовало.

В mlo мутантах ячменя наблюдается повышение экспрессии различных генов, связанных с защитой от заболеваний. Поэтому обработанные кпРНК листья пшеницы анализировали с помощью кПЦР на уровни связанных с защитой генов, кодирующих PR4, PR10, β-1,3-глюканазу, хитиназу, гермин и фактор рибозилирования АДФ. Уровень экспрессии ни у одного из этих генов не был значимо изменен в обработанных участках листьев по сравнению с контрольными участками листьев.

Для проверки способности кпРНК повышать устойчивость к заболеваниям путем снижения экспрессии гена Mlo споры гриба мучнистой росы наносят на обработанные и необработанные зоны листьев. Листья отделяли от растений пшеницы, обрабатывали кпРНК, как раньше, и выдерживали на среде (50 мг бензимидазола и 10 г агара на литр воды) для предотвращения старения листьев, при освещении. Через двадцать четыре часа листья инокулировали спорами мучнистой росы и наблюдали развитие заболевания в течение 5-24 дней. На обработанных листьях наблюдался слабый или полностью отсутствовал рост мицелия гриба и отсутствовал хлороз листьев по сравнению с контрольными листьями, не обработанными кпРНК, которые показали обширный рост мицелия, окруженного хлоротическими зонами.

В последующих экспериментах более низкие уровни кпРНК применяли для определения минимального уровня кпРНК, который является эффективным. Кроме того, листья инокулировали через 2, 4, 7 или более дней после обработки кпРНК, чтобы увидеть, как долго сохраняется защитный эффект. Целые растения также опрыскивали препаратами кпРНК и проверяли на устойчивость к болезням после инокуляции патогенным грибом.

В последующих экспериментах более низкие уровни кпРНК применяли для определения минимального уровня кпРНК, который являлся эффективным. Нанесение РНК в концентрациях до 200 нг/мкл (в общей сложности 2 мкг на лист) показало значимое подавление очагов мучнистой росы в текущих составах, что дает основание для предположения, что количество ингибиторной РНК можно существенно снизить при сохранении подавления роста и развития грибка. Кроме того, листья инокулировали через 1, 2, 4, 7 и 14 дней после обработки кпРНК, чтобы увидеть, насколько долго сохранялся защитный эффект. Эффективный сайленсинг эндогенного гена наблюдали в течение всего времени, начиная с точки времени через 24 часа после обработки до последней точки времени через 14 дней после обработки, когда эндогенные гены все еще показывали 91% снижение экспрессии. Препараты кпРНК также будут распылять на целые растения и проверять на устойчивость к болезни после инокуляции грибкового патогена.

кпРНК, направленно воздействующая на гены VvMLO Vitis vinifera

Гены MLO Vitis vinifera и Vitis pseudoreticulata кодируют полипептиды MLO, которые придают восприимчивость грибковому заболеванию мучнистой росе, вызываемой грибом аскомицетом Erysiphe necator. E. necator является облигатным биотрофным грибковым патогеном, которому для размножения требуется растение-хозяин, включая непосредственное взаимодействие между грибом и клетками-хозяевами, чтобы гриб мог получать питательные вещества из растения. Существует множество близко родственных белков MLO, кодируемых семейством генов, каждый из которых уникален для растений и кодирует белки с семью трансмембранными доменами и неизвестной биохимической активностью, локализованные в плазматической мембране. Примечательно, что только специфические гены MLO в семействе способны действовать в качестве генов восприимчивости к мучнистой росе, при этом они кодируют полипептиды с консервативными мотивами в цитоплазматическом C-концевом домене белков MLO. Механизм, посредством которого полипептиды MLO действуют как факторы восприимчивости к мучнистой росе, неизвестен.

Конструкции кпРНК, направленно воздействующие на три разных, но родственных гена MLO видов Vitis, а именно VvMLO3, VvMLO4 и VvMLO17 (номенклатура согласно Feechan et al., Functional Plant Biology, 2008, 35:1255-1266), были сконструированы и получены следующим образом. Например, для первой конструкции была выбрана последовательность гена-мишени VvMLO3 длиной 860 нуклеотидов, соответствующая нуклеотидам 297-1156 в SEQ ID NO:138. Были получены химерные ДНК, кодирующие три конструкции кпРНК, направленно воздействующие на гены VvMLO3, VvMLO4 и VvMLO17. Генетические конструкции были созданы с использованием принципов конструирования кпРНК, описанных выше, при этом раздельная последовательность является антисмысловой последовательностью, а сплошная последовательность является смысловой последовательностью (Фигура 1А). Область дцРНК каждой кпРНК имела длину 600 пн; смысловая последовательность в области дцРНК являлась непрерывной сплошной последовательностью, например, соответствовала нуклеотидам 427-1156 в SEQ ID NO:138. Нуклеотидная последовательность, кодирующая одну из кпРНК, представлена в настоящем документе в SEQ ID NO:139.

кпРНК получали путем транскрипции in vitro и наносили, отдельно или в виде смеси всех трех, на листья растений Vitis vinifera сорта Каберне-совиньон. Затем споры гриба-возбудителя мучнистой росы наносили на обработанные и необработанные участки листьев. Снижение уровней мРНК-мишеней наблюдали с помощью количественной ОТ-ПЦР. Развитие заболевания наблюдали в динамике. Существенную даунрегуляцию VvMlo4 наблюдали после нанесения раствора с концентрацией 1 мкг/мл кпРНК, направленно воздействующей на VvMlo3, VvMlo4 или VvMlo11.

КпРНК, направленно воздействующая на гены грибка

Конструкции кпРНК были сконструированы против кодирующей области гена Cyp51 грибкового патогена Rhizoctonia solani, гена, необходимого для синтеза эргостерола и выживания и роста гриба. Генетические конструкции были созданы с использованием принципов конструирования кпРНК, описанных выше, с разделенной последовательностью, которой являлась антисмысловая последовательность, и непрерывной последовательностью, которой являлась смысловая последовательность (Фигура 1A). Одну конструкцию кпРНК сконструировали для воздействия на два гена R. solani с областью дцРНК кпРНК, содержащей 350 п.н. из каждого гена; смысловая последовательность в области дцРНК представляла собой единую непрерывную последовательность, например, соответствующую нуклеотидам 884-1233 из SEQ ID NO: 140 и нуклеотидам 174-523 из SEQ ID NO: 141. Нуклеотидная последовательность, кодирующая одну из кпРНК, представлена в настоящем документе как SEQ ID NO: 142. КпРНК получали путем транскрипции in vitro и наносили на культуральную среду в концентрации 5 мкг на 100 мкл культуры с инокулятом мицелия R. solani. Рост гриба измеряли в нулевой точке времени и ежедневно в течение следующей недели, измеряя оптическую плотность культуры при 600 нм. Рост R. solani в культурах, содержащих ledRsCyp51, был значительно меньше, чем в контрольных культурах, содержащих либо РНК-буфер, либо контрольный ledGFP, который не имеет соответствующей мишени в R. solani.

Конструкция, кодирующая кпРНК, также была разработана и создана против кодирующей области гена CesA3 целлюлозосинтазы в изоляте Phytophthora cinnamomi 94.48. Генетические конструкции были созданы с использованием принципов конструирования кпРНК, описанных выше, с разделенной последовательностью, которой являлась антисмысловая последовательность, и непрерывной последовательностью, которой являлась смысловая последовательность (Фигура 1A). Конструкция кпРНК была сконструирована для направленного воздействия на ген CesA3 Phytophthora cinnamomi с областью дцРНК кпРНК, содержащей 500 п.н. из кодирующей области гена; смысловая последовательность в области дцРНК представляла собой единую непрерывную последовательность, например, соответствующую нуклеотидам 884-1233 в SEQ ID NO: 143. Нуклеотидная последовательность, кодирующая одну из кпРНК, представлена в настоящем документе как SEQ ID NO: 144. кпРНК транскрибировали in vitro и наносили на питательную среду в количестве 3 мкг на 100 мкл культуры. Существенную потерю направленного роста мицелия наблюдали в культурах с кпРНК, воздействующей на PcCesA3, по сравнению с культурами, обработанными холостым контролем (только РНК-буфером), или культурами, обработанными ledGFP. Потеря направленного роста и, как результат, аморфный, булавовидный вид растущего мицелия напоминал клетки с нарушением биосинтеза клеточной стенки и, таким образом, соответствовал сайленсингу гена PcCesA3.

Пример 18. Конструкции РНК, направленно воздействующие на другие гены в растениях

кпРНК, направленно воздействующие на гены TOR A. thaliana и N. benthamiana

Ген Мишень Рапамицина (TOR) кодирует полипептид серин-треониновой протеинкиназы, которая регулирует множество клеточных функций в эукариотических клетках, например в ответ на различные гормоны, стресс и доступность питательных веществ. Он известен как основной регулятор, регулирующий трансляционный аппарат для оптимизации клеточных ресурсов для роста (Abraham, 2002). По меньшей мере, у животных и дрожжей полипептид TOR инактивируется противогрибковым средством рапамицином, что объясняет его обозначение как Мишень Рапамицина (TOR, от англ. Target of Rapamycin). В растениях TOR важен для эмбрионального развития в развивающемся семени, что продемонстрировано летальностью гомозиготных мутантов в TOR (Mahfouz et al., 2006), а также участвует в захвате факторов роста в клеточном метаболизме. Даунрегуляция экспрессии гена TOR, как считают, приводит к увеличению синтеза жирных кислот, приводящему к повышению содержанию липидов в тканях растений.

Конструкции кпРНК, направленно воздействующие на ген TOR Nicotiana benthamiana, нуклеотидная последовательность области кДНК, кодирующей белок, представлена в SEQ ID NO:105, конструировали и получали с использованием принципов конструирования для кпРНК, где раздельная последовательность является смысловой последовательностью, а сплошная последовательность является антисмысловой последовательностью (Фигура 1B). Длина области-мишени составляла 603 нуклеотида, что соответствует нуклеотидам 2595-3197 SEQ ID NO:105. Область дцРНК кпРНК имела длину 603 пн; антисмысловая последовательность в области дцРНК являлась непрерывной сплошной последовательностью, соответствующей комплементу нуклеотидов 2595-3197 SEQ ID NO:105. Нуклеотидные последовательности, кодирующие кпРНК, представлены в настоящем документе в SEQ ID NO:106. Препараты ДНК генетических конструкций, кодирующих конструкции кпРНК, расщепляли рестриктазой MlyI, которая создавала разрыв ДНК сразу после кодирующей области, транскрибировали in vitro с помощью РНК-полимеразы SP6 и очищали РНК, а затем концентрировали в водном буферном растворе. Образцы кпРНК наносили на верхнюю поверхность листьев N. benthamiana. Через 2 дня и 4 дня обработанные образцы листьев собирали, сушили и измеряли общее содержание жирных кислот с помощью количественной газовой хроматографии (ГХ). Образцы листьев, обработанные TOR кпРНК, показали увеличение общего содержания жирных кислот (TFA) с 2,5-3,0% (масса TFA/сухой вес), наблюдаемого в контрольных (необработанных) образцах, до 3,5-4,0% для обработанных кпРНК образцов. Это соответствует увеличению содержания TFA на 17-60% по сравнению с контролем, что указывает на снижение экспрессии гена TOR в тканях, обработанных кпРНК.

кпРНК, направленно воздействующая на ген ALS H. vulgare

Гены ацетолактатсинтазы (ALS) кодируют фермент (EC 2.2.1.6), обнаруженный в растениях и микроорганизмах, катализирующих первую стадию синтеза разветвленных аминокислот лейцина, валина и изолейцина. Фермент ALS катализирует превращение пирувата в ацетолактат, который затем превращается в аминокислоты с разветвленными цепями под действием других ферментов. Ингибиторы ALS используются в качестве гербицидов, таких как гербициды классов сульфонилмочевины, имидазолинона, триазолопиримидина, пиримидинилоксибензоата и сульфониламино-карбонилтриазолинонов.

Для проверки, может ли кпРНК снижать экспрессию гена ALS при экзогенной доставке РНК в растения, была разработана и получена генетическая конструкция, кодирующая кпРНК, которая наравленно воздействовала на ген ALS в ячмене, Hordeum vulgare. Последовательность гена ALS H. vulgare представлена в настоящем документе в SEQ ID NO:107 (рег. номер LT601589). Генетическая конструкция была получена с использованием принципов конструирования кпРНК, при этом раздельная последовательность является смысловой последовательностью, а сплошная последовательность является антисмысловой последовательностью (Фигура 1B). Длина области-мишени составляла 606 нуклеотидов, что соответствует нуклеотидам 1333-1938 SEQ ID NO:107. Область дцРНК кпРНК имела длину 606 пн; антисмысловая последовательность в области дцРНК являлась непрерывной сплошной последовательностью, соответствующей комплементу нуклеотидов 1333-1938 SEQ ID NO:107. Нуклеотидные последовательности, кодирующие кпРНК, представлены в настоящем документе в SEQ ID NO:108. Кодирующая область находилась под контролем промотора РНК-полимеразы SP6 для транскрипции in vitro.

Генетическую конструкцию, кодирующую кпРНК, расщепляли рестриктазой MlyI, которая создавала разрыв после кодирующей области кпРНК, и транскрибировали in vitro с помощью РНК-полимеразы SP6 в соответствии с инструкциями в наборе для транскрипции. РНК наносили на верхнюю поверхность листьев растений ячменя. РНК выделяли из обработанных образцов листьев (через 24 часа). Количественные анализы методом ПЦР с обратной транскрипцией (кПЦР) проводили на образцах РНК. Анализы показали, что уровень мРНК ALS снижался в тканях, обработанных кпРНК. Суммарную РНК выделяли из обработанных и необработанных растений, обрабатывали ДНКазой, проводили количественный анализ и 2 мкг подвергали обратной транскрипции с использованием праймера CTTGCCAATCTCAGCTGGATC. кДНК использовали в качестве матрицы для количественной ПЦР с использованием прямого праймера TAAGGCTGACCTGTTGCTTGC и обратного праймера CTTGCCAATCTCAGCTGGATC. Экспрессию мРНК ALS нормализовали по гену ликопинциклазы Hordeum chilense изолята H1. Экспрессия ALS была снижена на 82% в обработанных LED растениях.

кпРНК, направленно воздействующие на гены NCED1 и NCED2 пшеницы и ячменя

В растениях растительный гормон абсцизовая кислота (АБК) синтезируется из предшественников каротиноидов, причем первая стадия, проходящая в пути синтеза, катализируется ферментом 9-цис-эпокси-каротиноид-диоксигеназой (NCED), которая расщепляет 9-цис-ксантофиллы до ксантоксина (Schwartz et al., 1997). Известно, что гормон АБК способствует состоянию покоя семян (Millar et al., 2006), а также участвует в других процессах, таких как реакция на стресс. Считалось, что повышенная экспрессия гена NCED повышает концентрацию АБК и, таким образом, способствует состоянию покоя. В злаках, таких как пшеница и ячмень, присутствуют два изофермента NCED, обозначенных NCED1 и NCED2, которые кодируют отдельные гомологичные гены.

Для расщепления АБК, фермент АБК-8-гидроксилаза (ABA8OH-2, также известная как CYP707A2), гидроксилирует АБК в качестве стадии в ее катаболизме, что приводит к снятию состояния покоя и протастанию семени.

Конструкции кпРНК, направленно воздействующие на гены, кодирующие HvNCED1 (рег. номер AK361999, SEQ ID NO:109) или HvNCED2 (рег. номер AB239298; SEQ ID NO:110) в ячмене Hordeum vulgare, и соответствующие гомологичные гены в пшенице, были разработаны для трансгенной экспрессии в растениях ячменя и пшеницы. Эти конструкции включали высококонсервативную область генов NCED1 и NCED2 пшеницы и ячменя, причем нуклеотидные последовательности пшеницы и ячменя были приблизительно на 97% идентичны в консервативной области. Генетические конструкции создавали с использованием принципов конструирования кпРНК, описанных выше, причем разделенная последовательность является антисмысловой последовательностью, а сплошная последовательность является смысловой последовательностью (Фигура 1А). Длина области-мишени составляла 602 нуклеотида, что соответствует нуклеотидам 435-1035 последовательности SEQ ID NO:109. Область дцРНК кпРНК имела длину 602 пн; смысловая последовательность в области дцРНК являлась непрерывной сплошной последовательностью, соответствующей нуклеотидам 435-1035 SEQ ID NO:110. Нуклеотидные последовательности, кодирующие кпРНК NCED1 и NCED2, представлены в настоящем документе в SEQ ID NO:111 и 112.

Аналогичным образом, была получена конструкция кпРНК, направленно воздействующая на ген ABA-OH-2 пшеницы T. aestivum и ячменя H. vulgare (рег. номер DQ145933, SEQ ID NO:113). Область-мишень имела длину 600 нуклеотидов, соответствующих нуклеотидам 639-1238 SEQ ID NO:113. Область дцРНК кпРНК имела длину 600 пн; смысловая последовательность в области дцРНК была непрерывной, сплошной последовательностью, соответствующей нуклеотидам 639-1238 SEQ ID NO:113. Нуклеотидная последовательность химерной ДНК, кодирующей кпРНК, представлена в SEQ ID NO:114.

Химерные ДНК, кодирующие кпРНК, встраивали в вектор экспрессии под контролем промотора гена Ubi, конститутивно экспрессирующегося в большинстве тканей, в том числе в развивающемся семени. Кассеты экспрессии вырезали и встраивали в бинарный вектор. Их использовали для получения трансформированных растений пшеницы.

Трансгенные растения пшеницы выращивали до зрелости, из них получали семена и исследовали на пониженную экспрессию генов NCED или ABA-OH-2 и влияние на состояние покоя зерна, соответствующее сниженной экспрессии генов. Ожидали ряд фенотипов по степени изменения состояния покоя. Для модуляции степени измененных фенотипов создавали модифицированные генетические конструкции для экспрессии кпРНК, содержащих пары оснований G:U в областях двухцепочечной РНК, особенно для кпРНК, где примерно 15-25% нуклеотидов в области двухцепочечных кпРНК участвуют в спаривании оснований G:U в процентах от общего числа нуклеотидов в двухцепочечной области.

кпРНК, направленно воздействующие на ген EIN2 A. thaliana

Как описано в Примере 10, ген EIN2 Arabidopsis thaliana кодирует рецепторный белок, участвующий в реагировании на этилен. Рассада мутанта EIN2 демонстрирует удлинение гипокотиля по сравнению с рассадой дикого типа при проращивании на ACC. Так как ген экспрессируется в ростках вскоре после прорастания семян, доставку кпРНК трансгенными средствами считали наиболее подходящим методом для проверки степени даунрегуляции EIN2 в сравнении с экзогенной доставкой предварительно полученной РНК.

Была разработана конструкция кпРНК, направленно воздействующая на ген EIN2 Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:115) в области длиной 400 нуклеотидов мРНК гена-мишени. Конструкцию получали путем вставки последовательности (SEQ ID NO:116), кодирующей кпРНК, в вектор, включающий 35S промотор для экспрессии кпРНК в растениях A. thaliana. Трансгенные растения A. thaliana получали и тестировали на снижение экспрессии гена EIN2 с помощью кПЦР и анализа длины гипокотиля в присутствии ACC. Снижение уровней экспрессии EIN2 и увеличение длины гипокотиля наблюдается в растениях некоторых трансгенных линий.

кпРНК, направленно воздействующие на ген CHS A. thaliana

Ген халконсинтазы (CHS) в растениях кодирует фермент, катализирующий превращение 4-кумароил-КоА и малонил-КоА в нарингенин-халкон, который является первым ферментом, участвующим в биосинтезе флавоноидов. Флавоноиды являются классом органических соединений, обнаруженных в основном в растениях, участвующих в защитных механизмах и устойчивости к стрессам.

Была разработана конструкция кпРНК, направленно воздействующая на ген CHS Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:117) в области из 338 нуклеотидов мРНК ген-мишени. Конструкцию получали путем вставки последовательности ДНК (SEQ ID NO:118), кодирующей кпРНК, в вектор, включающий 35S промотор для экспрессии кпРНК в растениях A. thaliana. Трансгенные растения A. thaliana получали путем трансформации генетической конструкцией в бинарном векторе и проверяли на снижение экспрессии гена CHS с помощью кПЦР и на снижение продукции флавоноидов. Снижение уровней экспрессии CHS и снижение уровней флавоноидов наблюдается в растениях некоторых трансгенных линий, например, в семенной оболочке трансгенных семян.

кпРНК, направленно воздействующая на ген LanR Lupinus angustifolius

Ген LanR узколистного люпина, Lupinus angustifolius L., кодирует полипептид, который является родственным по последовательности N-гену табака, который придает устойчивость к вирусному заболеванию, вызываемому вирусом табачной мозаики (ВТМ).

Была сконструирована и получена химерная ДНК для продукции молекулы кпРНК, направленно воздействующей на ген LanR L. angustifolius (рег. номер XM_019604347, SEQ ID NO:119). Генетическая конструкция была получена с помощью принципов конструирования кпРНК, описанных выше, при этом разделенная последовательность являлась антисмысловой последовательностью, а сплошная последовательность являлась смысловой последовательностью (Фигура 1A). Нуклеотидная последовательность, кодирующая кпРНК, представлена в настоящем документе в SEQ ID NO:120. кпРНК получали путем транскрипции in vitro, очищали и концентрировали, и аликвоты РНК наносили на листья растений L. angustifolius, содержащих ген LanR. Образцы вируса наносили на обработанные и необработанные растения и через несколько дней сравнивали симптомы заболевания.

КпРНКи, направленно воздействующая на ген VRN2, придающий пшенице способность к яровизации

Кандидатные гены пшеницы VRN2A, VRN2B и VRN2D, идентифицированные в TGACv1_scaffold_374416_5AL, TGACv1_scaffold_320642_4BL и TGACv1_scaffold_342601_4DL, являющиеся гомологами гена пшеницы ZCCT1 (рег. номер в Genbank AAS58481.1), были идентифицированы в качестве мишеней для создания конструкции кпРНКи. Область гена VRN2B длиной 309 пн использовали в качестве области дцРНК конструкции кпРНКи, обозначенной LedTaVRN2. кпРНКи получали путем транскрипции in vitro при использовании T7 РНК-полимеразы и разбавляли водой. Раствор использовали для пропитки зерна пшеницы для проращивания при 4°C в течение 3 дней. Использовали семена чувствительного к яровизации сорта пшеницы CSIRO W7. Обработанные семена высаживали в почву, и полученные растения наблюдали в динамике на предмет перехода от вегетативного роста к развитию цветков. Регистрировали время цветения, о котором свидетельствовало появление колоса из трубки, и количество листьев на главном стебле во время цветения. Растения, полученные из семян, инкубированных с LedTaVRN2, зацветали в среднем по меньшей мере на 17 дней раньше, чем растения, полученные из семян, инкубированных только с буфером, или неспецифическими контрольными дцРНК. Кроме того, растения, полученные из семян, инкубированных с LedTaVRN2, имели в среднем на 2,3 меньше листьев на основном стебле во время цветения, что указывает на то, что для выхода листьев было предназначено меньшее число узлов, а для цветков/зерна - большее число узлов.

Пример 19. Конструкции РНК, направленно воздействующие на ген насекомого

Введение

Тли являются насекомыми, которые питаются соком растений и наносят существенный, и иногда серьезный ущерб растениям непосредственно в результате питания растительным соком, а в некоторых случаях - косвенно, путем передачи различных вирусов, вызывающих болезни у растений. Хотя Bt-токсин в некоторых случаях был эффективен для защиты сельскохозяйственных растений от грызущих насекомых, он, как правило, не был эффективен против насекомых, питающихся соком растений. Применение сортов растений, которые содержат гены устойчивости, могут быть эффективным способом борьбы с тлей. Однако большинство генов устойчивости являются высокоспецифичными к определенным видам или биотипам тли, и устойчивость часто преодолевается вследствие быстрой эволюции новых биотипов посредством генетических или эпигенетических изменений. Более того, гены устойчивости недоступны во многих культурных растениях или могут отсутствовать для некоторых видов многоядных тлей, таких как зеленая персиковая тля, которые поражают широкий спектр хозяев. В настоящее время борьбу с тлей осуществляют главным образом путем частого применения пестицидов, что приводит к устойчивости тли к пестицидам. Например, в Австралии против зеленой персиковой тли эффективной осталась только одна группа пестицидов по механизму действия, поскольку ей удалось приобрести устойчивость ко всем остальным зарегистрированным инсектицидам.

В нескольких исследованиях было показано, что РНКи-опосредованный сайленсинг генов может быть полезен в качестве инструмента исследования в ряде видов тли, см. обзоры Scott et al., 2013; Yu et al., 2016, но не было показано, что он эффективно защищает растения от тли. В этих исследованиях дцРНК, направленно воздействующие на ключевые гены, участвующие в росте и развитии тли, процессах заражения или питания, доставляли путем прямой инъекции тлям или путем питания тлей искусственными диетами, содержащими дцРНК.

Для проверки потенциала модифицированных молекул РНКи, таких как молекулы кпРНК, описанные в настоящем документе, в борьбе с насекомыми, питающимися соком растений, авторы изобретения выбрали зеленую персиковую тлю (Myzus persicae) в качестве модельного сокососущего насекомого по нескольким причинам. Во-первых, зеленая персиковая тля - это многоядное насекомое, которое поражает широкий спектр видов растений-хозяев, включая основные зерновые и плодоовощные культуры по всему миру. Во-вторых, зеленая персиковая тля является переносчиком некоторых опасных вирусов, таких как вирус западной желтухи свеклы, который наносит большой ущерб в некоторых районах выращивания канолы. Для этого исследования в качестве генов-мишеней для даунрегуляции первоначально были выбраны два гена тли, один из которых кодирует ключевой эффекторный белок (C002), а второй кодирует рецептор активированной протеинкиназы C (Rack-1). Белок C002 представляет собой белок слюнной железы тли, который необходим для питания тли на своем растении-хозяине (Mutti et al., 2006; Mutti et al., 2008). Rack1 является внутриклеточным рецептором, который связывает активированную протеинкиназу C, фермент, который в основном участвует в каскадах сигнальной трансдукции (McCahill et al., 2002; Seddas et al., 2004). MpC002 преимущественно экспрессируется в слюнной железе тли, а MpRack1 преимущественно экспрессируется в кишечнике. В предыдущих исследованиях применение РНКи путем прямой инъекции или кормления искусственной диетой привело к гибели нескольких тестируемых видов тлей (Pitino et al., 2011; Pitino and Hogenhout, 2012; Yu et al., 2016).

Материалы и методы: Культура тлей и растительные материалы

Зеленых персиковых тлей (Myzus persicae) собирали в Западной Австралии. Перед каждым экспериментом тлей разводили на растениях редьки (Raphanus sativus L.) при естественном освещении в комнате инсектария. Тлей переносили в экспериментальные клетки с искусственной диетой с помощью тонкой кисти.

Компоненты искусственной диеты для кормления тлей были такими же, как описано в публикации Dadd and Mittler (1966). В устройстве для искусственного кормления тлей использовалась пластиковая трубка диаметром 1 см и высотой 1 см. Искусственную диету для тлей, 100 мкл, с или без кпРНК, помещали между двумя слоями парафильма для создания пищевого пакетика. Сверху на этом пакете помещали камеру для тлей, которые могли перемещаться и питаться диетой, протыкая своими хоботками верхний слой натянутого парафильма. Восемь нимф первого или второго возраста осторожно переносили в камеру для тлей с помощью тонкой кисти. Эксперимент проводили в климакамере при 20°C.

Листья табака и редиса, используемые в одном эксперименте, собирали с растений, выращенных в почве в условиях цикла 16 ч света/8 ч темноты при 22°C. В экспериментах с использованием срезанных листьев редиса вырезали небольшой лист редиса (2-4 см²), прикрепленный к фрагменту стебля (длиной ~2 см). Чтобы лист оставался свежим, стебель помещали в среду, содержащую 1,5 г агара Bacto Agar и 1,16 г Aquasol на 100 мл воды в чашке Петри диаметром 5 см. Тлю переносили на листья с помощью тонкой кисти. Чашки Петри с листьями и тлей хранили в климакамере в условиях светового цикла 16 ч света/8 ч темноты при 20°C.

Двухцепочечную РНК (дцРНК) получали путем in vitro транскрипции РНК с ДНК матриц, содержащих один или несколько Т7 промоторов и Т7 РНК-полимеразу, при использовании стандартных методов.

Гены MpC002 и MpRack-1 и конструкции кпРНК

Гены зеленой персиковой тли MpC002 и MpRack-1, тестируемые в качестве генов-мишеней, были такими же, как описано в публикации Pitino et al. (2011; 2012). Последовательности ДНК обоих генов были получены с веб-сайта NCBI, MpC002 (>MYZPE13164_0_v1.0_000024990.1 | 894 нт) и MpRack-1 (>MYZPE13164_0_v1.0_000198310.1 | 960 нт). Последовательности кДНК двух генов представлены в настоящем документе в SEQ ID NO:123 и 124. Конструкции кпРНК были сконструированы так же образом, как описано в предыдущих примерах. Последовательности ДНК, кодирующие молекулы кпРНК, представленные в настоящем документе в SEQ ID NO:125 и 126, использовали в качестве матриц транскрипции для синтеза кпРНК. Векторные ДНК, кодирующие молекулы кпРНК, направленно воздействующие на гены MpC002 и MpRack-1, вводили в штамм E. coli DH5α для получения плазмидной ДНК для транскрипции РНК in vitro и в штамм Е.coli HT115 для транскрипции in vivo (в бактериях).

Эффективность молекул кпРНК при снижении продуктивности тли

Для исследования, влияют ли кпРНК, направленно воздействующие на гены MpC002 или MpRack-1, на продуктивность тли, каждую кпРНК доставляли тлям посредством искусственной диеты, как описано в Примере 1. В каждый эксперимент включали десять биологических повторностей; каждая биологическая повторность включала по восемь нимф зеленой персиковой тли первой - второй возрастной стадии. В качестве контроля в каждом эксперименте использовали эквивалентные концентрации нерелевантной кпРНК, а именно ledGFP.

При более низкой концентрации 50 нг/мкл каждой молекулы кпРНК выживаемость тли после кормления искусственной диетой, содержащей кпРНК MpC002 или MpRack-1, существенно не отличалась от контрольной ledGFP. Однако кпРНК, направленно воздействующая на ген MpC002, значимо (P<0,05) снижала скорость размножения зеленой персиковой тли (Фигура 37А). Среднее число нимф от взрослой тли было уменьшено примерно на 75% по сравнению с количеством нимф у имаго, которых содержали на контрольной диете с контрольной кпРНК. При более высокой концентрации, 200 нг/мкл, кпРНК, направленно воздействующие либо на MpC002, либо на MpRack-1, увеличивали летальность у взрослых тлей (Фигура 37B). Снижение выживаемости тли на диетах, включающих кпРНК MpC002 или MpRack-1, также наблюдали через 24 часа и в течение пятидневного периода эксперимента. Результаты показали, что применение кпРНК, направленно воздействующих на жизненно важные гены тли, могло вызывать гибель тли и уменьшать размножение тли. Эффективность каждой кпРНК сравнивали с молекулами двухцепочечной РНК (дцРНКи), состоящими из отдельных, но отожженных смысловой и антисмысловой цепей РНК, направленно воздействующих на ту же область гена-мишени.

Захват молекул кпРНК тлями

Для отслеживания захвата и распределения молекул кпРНК в организме тлей, кпРНК, направленно воздействующие на гены MpC002 или MpRack-1, метили Cy3 (меченными цианиновым красителем нуклеотидтрифосфатами) в процессе синтеза, как описано в примере 1. Мечение Cy3, согласно имеющимся сообщениям, не влияет на биологическую функцию обычных молекул дцРНК и поэтому может использоваться в качестве метки для детектирования по флуоресценции. Тлей, которые получали с питанием меченые кпРНК, исследовали с помощью конфокальной микроскопии при использовании микроскопа Leica EL6000. Меченную Cy3 кпРНК, направленно воздействующую на MpC002 или MpRack-1, обнаруживали в кишечнике тли в течение нескольких часов после кормления на искусственной диете, а затем в репродуктивной системе и даже у новорожденных нимф, которые являлись потомством зрелых особей, получавших диету. Результаты показали, что гены тли, критически важные для функции пищеварительной системы или репродукции, могут быть эффективными мишенями для молекул кпРНК посредством питания.

Стабильность кпРНК

Для исследования стабильности кпРНК в диете и после выделения из получавших диету тлей, РНК выделяли из искусственной диеты и из медвяной пади тлей после питания диетами, содержащими меченые молекулы кпРНК. Образцы РНК подвергали электрофорезу в гелях и исследовали с помощью флуоресцентного детектирования. РНК ledMpC002 до питания четко отображала один продукт примерно 700 пн в агарозном геле. РНК, выделенная из искусственной диеты, показала шмер РНК размером 100-700 пн, что указывает на некоторую деградацию после контакта с диетой при комнатной температуре в течение 25 дней, но все еще в значительной степени интактную. РНК, выделенная из медвяной пади тли, показала флуоресценцию в диапазоне РНК от 350 до 700 пн, поэтому, опять же, была в значительной степени интактной. Несмотря на деградацию некоторых кпРНК, значительная часть молекул кпРНК была способна оставаться интактной в искусственной диете, а также в медвяной пади тли в течение значительного периода времени. Эта степень стабильности молекул кпРНК должна позволять кпРНК оставаться активной и сохранять активность при экзогенном применении.

Поглощение меченой кпРНК листьями растений

Cy3-меченную РНК ledMpC002 наносили кистью на верхнюю поверхность листьев табака с целью наблюдения, могла ли она проникать через ткани листа. Десять микролитров Cy3-меченной ledMpC002 (концентрация 1 мкг/мл) наносили в круг диаметром 2 см и отмечали область нанесения черным маркером. Снимки флуоресценции листьев при возбуждении 525 нм делали в течение пятичасового периода с помощью микроскопа Leica EL6000, сравнивая окрашеные ткани с неокрашеными. Метка Cy3 поддавалась четкому обнаружению в паренхиме листа в течение одного часа после применения, то есть явно проникала через восковой слой кутикулы на поверхности листа. Уровень флуоресценции увеличился через 2 часа и сохранялся до 5 часов. Было неясно, проникли ли молекулы кпРНК в клетки или в ядра клеток. Однако, поскольку сокососущие насекомые питаются исключительно из ситовидных элементов флоэмы листьев и стеблей растения, перенос РНК в растительные клетки не требовался для сайленсинга генов тли. Эксперимент показал, что молекулы кпРНК были обнаружены в растительных тканях после нанесения на поверхность.

Поглощение кпРНК на поверхности тлей

Cy3-меченную РНК ledGFP наносили на листья редиса с целью проверки, способны ли тли поглощать кпРНК, нанесенную на поверхность растений. По десять микролитров каждой Cy3-меченной ledGFP (концентрация 10 мкг/мкл) наносили на небольшой вырезанный лист редиса (~2 см²). На контрольный лист наносили такое же количество немеченого ledGFP. Каждый из меченых и контрольных листьев редиса заражали восемью особями тли на разных стадиях развития. Изображения флуоресценции листьев и тли получали при использовании метода, описанного выше для листьев табака. Тогда как в контрольных листьях и тле флуоресценции не обнаруживали, лист, на который наносили Cy3-меченный ledGFP, показал высокую флуоресценцию. В течение 24 часов после поедания листа с Cy3-меченной кпРНК тля демонстрировала сильную флуоресценцию всего тела, но более выраженную в кишечнике и ногах, чем в других частях тела. Эксперимент показал, что тля была способна поглощать молекулы кпРНК из растений при нанесении на поверхность.

Скрининг дополнительных генов-мишеней РНКи у тли

Для идентификации других генов-мишеней у тли, в общей сложности 16 генов тли оценивали на предмет их пригодности в качестве мишеней РНКи. Отобранные кандидатные гены участвовали в развитии, воспроизводстве, питании или детоксикации у тли. Обычная дцРНК (дцРНКи), направленно воздействующая на каждый ген благодаря содержанию смысловых и антисмысловых последовательностей, соответствующих области мРНК гена-мишени, добавляли в искусственный рацион для тли в концентрации 2 мкг РНК на мкл рациона. Влияние на выживаемость и скорость воспроизводства тли использовали для определения пригодности генов-мишеней РНКи у тли. Из 16 исследованных генов девять показали снижение выживаемости и/или воспроизводства тли. Помимо MpC002 и MpRack-1, другими подходящими генами-мишенями являлись гены, кодирующие следующие полипептиды и тип функции, которую они выполняли у тлей: тубулин (рег. номер XM_022321900.1, клеточная структура), инсулин-родственный пептид (XM_022313196.1), развитие эмбриона), субъединица АТФазы E V-типа (XM_022312248.1, энергетический обмен), gap-ген hunchback (XM_022313819.1, рост и развитие), гормон, вызывающий линьку (XM_022323100.1, развитие - линька), короткий нейропептид F (XM_022314068.1, нервная система) и лейкокинин (XM_022308286.1, водный баланс и питание). В случае большинства генов влияние РНКи оказалось более эффективным и сильным на воспроизводство тли, чем на выживаемость, то есть влияние на воспроизводство было более сильным.

Эффект трансгенерации экзогенной РНКи у тли

Для изучения, насколько долго может длиться эффект РНКи, тлей на двух или трех возрастных стадиях развития кормили искусственной диетой с добавлением дцРНКи, направленно воздействующей на MpC002, MpRack-1, MpGhb, или контрольным dsGFP, в течение 10 дней. Затем выживших тлей переносили на вырезанные листья редиса без нанесения РНК. Для всех трех генов в течение периода до 6 дней количество нимф, которое давала одна выжившая тля, было значительно ниже, чем количество нимф, поглощавших контрольные молекулы РНК dsGFP или воду. Для дцРНК MpC002 и MpRack-1 более низкая скорость воспроизводства на листьях редиса сохранялась в течение по меньшей мере 9 дней. Чтобы выяснить, влияет ли дцРНКи на следующие поколения, тлей, которые родились в течение трех дней на листьях редиса и которые не питались непосредственно РНК-содержащей диетой, переносили на свежие вырезанные листья редиса, и их выживаемость и продуктивность отслеживали в течение 15 дней. Хотя не было обнаружено значимых различий в выживаемости, особи тли, родившиеся от исходных особей тли, получавших рацион с MpC002, MpRack-1 или MpGh dsRNA, давала значительно меньше потомства по сравнению с исходными тлями, получавшими рацион с контрольным dsGFP или воду. Сделали вывод, что эффекты, вызванные поеданием молекул дцРНК родительской особью тли, сохраняются в потомстве тли.

Выводы

Цели данного исследования состояли в том, чтобы протестировать применение экзогенной РНКи с использованием конструкции кпРНК для борьбы с тлями, основной группой сокососущих насекомых-вредителей, которые являются проблемой во всем мире, и определить подходящие гены-мишени. Известно, что тля обладает аппаратом РНКи для процессинга экзогенной РНК (Scott et al., 2013; Yu et al., 2016). В данном случае пероральная доставка через искусственную диету, содержащую молекулы кпРНК, направленные на гены MpC002 или MpRack-1, была способна вызвать гибель тли и уменьшить размножение тли. Молекулы были протестированы против двух разных генов-мишеней, один из которых кодирует эффекторный белок C002, а другой - рецептор активированной протеинкиназы (Rack-1), которые необходимы для питания и развития зеленой персиковой тли (Myzus persicae). При добавлении в искусственную диету в концентрации до 50 нг/мкл, молекулы кпРНК, направленно воздействующие на эти гены, значительно снижают размножение тли. При более высокой концентрации, составляющей 200 нг/мкл, кпРНК также увеличивали гибель тли. При исследовании поглощения кпРНК с использованием мечения Cy3, молекулы кпРНК наблюдали в кишечнике тли в течение нескольких часов после поглощения искусственной диеты, а затем в репродуктивной системе и даже в новорожденных нимфах, которые были потомством зрелых особей, получавших диету. Влияние кпРНК на воспроизводство тли может сохраняться в течение по меньшей мере двух поколений, как показано в результатах с традиционной дцРНК.

Также было показано, что молекулы кпРНК оставались в значительной степени интактными в искусственной диете в течение по меньшей мере трех с половиной недель. По существу интактные молекулы кпРНК также были обнаружены в медвяной росе тли, продукте, выделяемом тлей. При нанесении меченой кпРНК на листья растений, она могла попадать во флоэму, из которой питаются тли, и была обнаружена в тле. В совокупности эти результаты указывают на высокий потенциал применения кпРНК для борьбы с тлей и другими сокососущими насекомыми, в том числе путем экзогенной доставки через пищу, обеспечивая практический подход к борьбе с тлями и другими сокососущими насекомыми. Эти молекулы РНК также могут экспрессироваться в трансгенных растениях при использовании промоторов, которые способствуют синтезу РНК в тканях флоэмы, для борьбы с тлей и другими сокососущими насекомыми. Кроме того, ожидается, что применение кпРНК[G:U] или шпилечной [G:U] РНК, содержащей 10-30% пар оснований G:U в дцРНК области молекул, обеспечит еще более эффективный контроль, основанный на повышенных уровнях накопления этих молекул дцРНК за счет снижения аутосайленсинга трансгенов, кодирующих такие молекулы.

Пример 20. Конструкции РНК, направленно воздействующие на другие гены насекомых

кпРНК, направленно воздействующие на гены насекомых-вредителей

Helicoverpa armigera является насекомым-вредителем из отряда Чешуекрылых, также известным как совка хлопковая. Личинки H. armigera питаются широким спектром растений включая многие важные культурные зерновые культуры и приносят значительный ущерб урожаю стоимостью в миллиарды долларов в год. Личинки являются многоядными и космополитными вредителями, которые могут питаться широким спектром растений, включая хлопок, кукурузу, помидор, нут, голубиный горох, люцерну, рис, сорго и коровий горох.

Ген ABC-переносчика white H. armigera (ABCwhite) был выбран в качестве гена-мишени с легко обнаруживаемым фенотипом для проверки конструкций кпРНК и кпРНК(G:U) в личинке насекомого. Белки переносчики ABC (от англ. ATP Binding Cassette - АТФ-связывающая кассета) относятся к суперсемейству переносчиков АТФ-связывающей кассеты, например, в геноме Helicoverpa были идентифицированы 54 различных гена ABC-переносчика. Переносчики ABC кодируют мембраносвязанные белки, которые переносят одну или более из целого ряда молекул через мембраны. Белки используют энергию, высвобождаему при гидролизе АТФ, для транспорта молекул через мембрану. Некоторые ABC-переносчики участвовали в деградации растительных вторичных метаболитов у хлопковой совки, H. armigera (Khan et al., 2017). Белок ABCwhite переносит предшественники пути оммохромов и птеридинов в пигментные гранулы в глазах, поэтому нокаутные мутанты имеют белые глаза.

Нуклеотидная последовательность гена ABCwhite представлена в SEQ ID NO:127 (рег. номер KU754476). Для проверки, может ли кпРНК снижать экспрессию гена ABCwhite при экзогенной доставке РНК в пищу личинок, была разработана и получена генетическая конструкция, кодирующая кпРНК, которая направленно воздействует на ген. Генетическая конструкция была получена с использованием принципов конструирования кпРНК, при этом раздельная последовательность является смысловой последовательностью, а сплошная последовательность является антисмысловой последовательностью (Фигура 1B). Длина области-мишени составляла 603 нуклеотида, что соответствует нуклеотидам 496-1097 SEQ ID NO:127. Область дцРНК кпРНК имела длину 603 пн; антисмысловая последовательность в области дцРНК являлась непрерывной сплошной последовательностью, соответствующей комплементу нуклеотидов 496-1097 SEQ ID NO:127. Нуклеотидные последовательности, кодирующие кпРНК, представлены в настоящем документе в SEQ ID NO:128. Кодирующая область находилась под контролем промотора РНК-полимеразы Т7 для транскрипции in vitro.

Генетическую конструкцию, кодирующую кпРНК, расщепляли эндонуклеазой рестрикции SnaBI, которая создает разрыв после кодирующей кпРНК области, и транскрибировали in vitro с использованием РНК-полимеразы T7 согласно инструкциям в наборе для транскрипции. РНК добавляли в искусственную диету и давали личинкам H. armigera.

Соответствующую конструкцию кпРНК, содержащую пары оснований G:U в двухцепочечном стебле, получали и сравнивали с канонически спаренной кпРНК.

кпРНК, направленно воздействующие на ген у муравьев

Linepithema humile, обычно известный как аргентинский муравей, является насекомым-вредителем, широко распространившимся на нескольких континентах. Ген, кодирующий нейропептид активации биосинтеза феромонов (PBAN) L. humile, подобный нейропептидам (LOC105673224), был выбран в качестве гена-мишени, участвующий в коммуникации между насекомыми посредством феромонов.

Нуклеотидная последовательность гена PBAN представлена в SEQ ID NO:129 (рег. номер XM_012368710). Для проверки, может ли кпРНК снижать экспрессию гена PBAN при экзогенной доставке РНК с пищей в форме приманки, была разработана и получена генетическая конструкция, кодирующая кпРНК, которая направленно воздействует на ген. Генетическая конструкция была получена с использованием принципов конструирования кпРНК, при этом раздельная последовательность является смысловой последовательностью, а сплошная последовательность является антисмысловой последовательностью (Фигура 1B). Длина области-мишени составляла 540 нуклеотидов, что соответствует нуклеотидам 136-675 SEQ ID NO:129. Область дцРНК кпРНК имела длину 540 пн; антисмысловая последовательность в области дцРНК являлась непрерывной сплошной последовательностью, соответствующей комплементу нуклеотидов 136-675 SEQ ID NO:129. Нуклеотидные последовательности, кодирующие кпРНК, представлены в настоящем документе в SEQ ID NO:130. Кодирующая область находилась под контролем промотора РНК-полимеразы Т7 для транскрипции in vitro.

Генетическую конструкцию, кодирующую кпРНК, расщепляли эндонуклеазой рестрикции SnaBI, которая создает разрыв после кодирующей кпРНК области, и транскрибировали in vitro с использованием РНК-полимеразы T7 согласно инструкциям в наборе для транскрипции. РНК наносили на кукурузную муку для пероральной доставки муравьям L. humile.

кпРНК, направленно воздействующие на гены L. cuprina

Lucilia cuprina - насекомое-вредитель, более известное как австралийская зеленая мясная муха. Оно относится к семейству мясных мух, Calliphoridae, и является членом отряда насекомых Diptera. Пять генов-мишеней были выбраны для тестирования с конструкциями кпРНК, а именно гены, кодирующие каталитическую субъединицу A протонной АТФазы V-типа (рег. номер XM_023443547), РНКазу 1/2 (рег. номер XM_023448015), хитинсинтазу (рег. номер XM_023449557), рецептор экдизона (EcR; рег. номер U75355) и гамма-тубулин 1/1-подобный (рег. номер XM_023449717) L. cuprina. Каждая из генетических конструкций была получена с использованием принципов конструирования кпРНК, при этом раздельная последовательность является смысловой последовательностью, а сплошная последовательность является антисмысловой последовательностью (Фигура 1B). В каждом случае область-мишень имела длину около 600 нуклеотидов, а антисмысловая последовательность в области дцРНК являлась непрерывной сплошной последовательностью. Нуклеотидная последовательность, кодирующая кпРНК, направленно воздействующую на ген АТФазы-A, представлена в настоящем документе в SEQ ID NO:131. Нуклеотидная последовательность, кодирующая кпРНК, направленно воздействующую на ген РНКазы 1/2, представлена в настоящем документе в SEQ ID NO:132. Нуклеотидная последовательность, кодирующая кпРНК, направленно воздействующую на ген хитинсинтазы, представлена в настоящем документе в SEQ ID NO:133. Нуклеотидная последовательность, кодирующая кпРНК, направленно воздействующую на ген EcR, представлена в настоящем документе в SEQ ID NO:134. Нуклеотидная последовательность, кодирующая кпРНК, направленно воздействующую на ген, подобный 1/1 гамма-тубулину, представлена в настоящем документе в SEQ ID NO:135. В каждой конструкции кодирующая область находилась под контролем промотора РНК-полимеразы Т7 для транскрипции in vitro.

Пример 21. Полученная с трансгена кпРНК накапливается в высоких уровнях на стабильно трансформированных растениях

Фрагменты ДНК, кодирующие последовательности кпРНК, направленно воздействующие на мРНК репортерного гена GUS или гена EIN2 A. thaliana, синтезировали и клонировали в pART7 с получением кассет экспрессии p35S:кпРНК:Ocs3' области полиаденилирования/терминатора для экспрессии в клетках растений. Затем фрагменты вырезали с использованием NotI и встраивали в сайт NotI в pART27 с получением векторов ledGUS и ledEIN2 для трансформации растений. Конструкция ledGUS и существующая конструкция hpGUS, созданные для продукции длинной шРНК с дцРНК стеблем длиной 563 пн и 1113 нт петлей, вводили отдельно в GUS-экспрессирующую линию PPGH24 N. tabacum с помощью методов агробактериальной трансформации. Образцы РНК из независимых трансформантов, которые демонстрировали либо сильный сайленсинг GUS, либо слабое снижение или отсутствие заметного снижения активности GUS, использовали в анализах Нозерн-блот гибридизации для обнаружения кодируемой трансгеном РНК hpGUS или ledGUS. Как показано на Фигуре 38, намного более интенсивные сигналы гибридизации обнаруживали от растений, трансформированных ledGUS, чем от растений, трансформированных hpGUS, которые показали сильный сайленсинг GUS (обозначенный знаком "-" на Фигуре 38). Фактически, большая часть сигналов гибридизации для образцов РНК hpGUS представляла собой неспецифические фоновые сигналы, которые также наблюдали для РНК из контрольных нетрансформированных растений (WT). Несколько интенсивных полос гибридизации наблюдали для линий ledGUS, предположительно из-за некоторого частичного процессинга полноразмерной кпРНК.

Нуклеотидная последовательность генетической конструкции, кодирующей ledGUS, показана в SEQ ID NO:5. Нуклеотиды 1-17 соответствуют промотору РНК-полимеразы T7 для in vitro синтеза РНК, нуклеотиды 18-270 соответствуют 5'-половине антисмысловой последовательности GUS, нуклеотиды 271-430 соответствуют последовательности петли 1, нуклеотиды 431-933 соответствуют смысловой последовательности GUS, нуклеотиды 934-1093 соответствуют последовательности петли 2, и нуклеотиды, 1094-1343 соответствует 3'-половине антисмысловой последовательности GUS.

Подобным способом конструкции ledEIN2 и hpEIN2 отдельно вводили в растения A. thaliana экотипа Col-0 с помощью агробактериальной трансформации. Конструкция hpEIN2, кодирующая РНК hpEIN2[wt], была такой, как описано ранее, и содержала 200 пн смысловую и антисмысловую последовательности EIN2 в конфигурации инвертированных повторов, разделенные интроном PDK. Нуклеотидная последовательность генетической конструкции, кодирующей ledEIN2, показана в SEQ ID NO: 116. Нуклеотиды 37-225 соответствуют 5'-половине антисмысловой последовательности EIN2, нуклеотиды 226-373 соответствуют последовательности петли 1, нуклеотиды 374-773 соответствуют смысловой последовательности EIN2, нуклеотиды 774-893 соответствуют последовательности петли 2, и нуклеотиды 894-1085 соответствуют 3'-половине антисмысловой последовательности EIN2. Нуклеотиды 37-225 (антисмысловые) комплементарны нуклеотидам 374-573 (смысловым), и нуклеотиды 894-1085 (антисмысловые) комплементарны нуклеотидам 574-773 (смысловым).

Образцы РНК из первичных независимых трансформантов использовали для анализа методом Нозерн-блот гибридизации. Как показано на Фигуре 39, растения ledEIN2 показали более интенсивные сигналы гибридизации, чем растения hpEIN2, из-за более крупных молекул РНК (Фигура 39, верхняя панель), что указывает на то, что РНК, полученная из ledEIN2, накапливается в более высоких уровнях, чем hpEIN2-производные РНК. Для процессированных РНК в диапазоне размеров 20-25 нуклеотидов (миРНК), миРНК были обнаружены в растениях ledEIN2 в большем количестве, чем в растениях hpEIN2 (Фигура 39, нижняя панель), при этом количество миРНК хорошо коррелировало с представленностью более крупных молекул РНК. Эти результаты показали, что кпРНК, полученная с трансгена, в некоторой степени, но не полностью, процессировалась рибонуклеазой Dicer в миРНК. Это также указывает, что кпРНК трансгены дают больше миРНК, чем соответствующий шРНК трансген.

Эти результаты показали, что конструкции кпРНК при экспрессии в клетках растений приводили к более высоким уровням накапливаемых транскриптов, непроцессированных и процессированных, чем соответствующие конструкции шРНК. Предположили, что это является показателем повышенной стабильности молекул кпРНК.

Пример 22. Шпилечная РНК является эффективным предшественником кольцевой РНК в растениях

Кольцевые РНК (circRNA) представляют собой ковалентно связанные замкнутые кольца, не имеющие свободных 5' и 3' концов или полиаденилированных последовательностей в виде 3'-областей. Как правило, они являются некодирующими, так как они не кодируют полипептиды и поэтому не транслируются. circRNA относительно устойчивы к расщеплению РНКазами, в частности устойчивы к экзонуклеазам, таким как РНКаза R. Молекулы circRNA вирусного или вироидного происхождения, или в виде сателлитных РНК, ассоциированных с вирусами, уже давно наблюдали у растений и животных. Например, вироид веретеновидности клубней картофеля, субвирусный РНК-патоген растений, имеет кольцевой РНК-геном размером около 360 нт. В растениях такие сателлитные РНК часто могут реплицироваться в присутствии хелперного вируса. Напротив, вироиды полностью зависят от функций хозяина, включая эндогенную РНК-полимеразу растений, необходимую для их репликации.

С помощью технологий глубокого секвенирования РНК в сочетании со специально разработанными биоинформационными инструментами, в настоящее время идентифицировали большое количество различных cirRNA в геномах растений и животных. Тысячи предполагаемых circRNA были идентифицированы в растениях, включая A. thaliana, рис и сою, которые, как правило, демонстрируют тканеспецифические или биотические и абиотические стресс-зависимые профили экспрессии, однако биологическая функция(и) circRNA в растениях пока не была продемонстрирована. Тканеспецифические или чувствительные к стрессу профили экспрессии многих предполагаемых растительных circRNA указывают, что они могут играть потенциальные роли в развитии растений и защитных ответах, но это еще предстоит продемонстрировать.

Консенсусный взглая на биогенез кольцевых РНК заключается в том, что они образуются в результате обратного сплайсинга интронов, а именно аппарат сплайсинга снова вставляет вырезанные участки пре-мРНК и ковалентно соединяет сплайсированные экзоны. Таким образом, эндогенный аппарат сплайсинга интронов важен для современной модели биогенеза кольцевой РНК. Эта модель биогенеза основана в первую очередь на исследованиях в системах млекопитающих, где показано, что большинство экзонных кольцевых РНК содержат канонические сигналы сплайсинга интронов, включая консенсусные динуклеотиды GT/AG на границах интронов. У животных интронные области, фланкирующие экзонные кольцевые РНК, часто содержат короткие инвертированные повторы последовательностей мобильных элементов, и это привело к предположению, что комплементарные интронные последовательности облегчают образование кольцевой РНК. Действительно, векторные системы для экспрессии кольцевых РНК у животных были разработаны на основе природных экзон-интронных последовательностей со сплайсируемыми интронами, содержащими комплементарные ТЕ повторы. Однако роль комплементарных фланкирующих последовательностей в образовании кольцевой РНК у растений остается неясной, так как доля идентифицированных экзонных кольцевых РНК с такими фланкирующими интронными последовательностями крайне мала, составляя от 0,3% в Arabidopsis до 6,2% в рисе.

Трансгены длинной шпилечной РНК (шРНК) широко используются для индукции сайленсинга генов или РНК-интерференции в растениях (Wesley et al., 2001). Конструкция шРНК трансгена обычно состоит из инвертированного повтора, содержащего комплементарные смысловые и антисмысловые последовательности по отношению к промоторной последовательности, и со спейсерной последовательностью между ними для разделения и соединения смысловой и антисмысловой последовательностей. Спейсер также стабилизирует структуру инвертированных повторов в плазмиде ДНК в клетках бактерий в процессе конструирования вектора. Следовательно, ожидается, что РНК-транскрипт из типичного шРНК трансгена будет образовывать структуру "стебель-петля" с двухцепочечным (дц) стеблем из спаренных оснований смысловой и антисмысловой последовательностей и "петлей", соответствующей спейсерной последовательности. Такие РНК-транскрипты также называют самокомплементарными РНК из-за способности смысловой и антисмысловой областей отжигаться при спаривании оснований с образованием области дцРНК или области стебля такой молекулы.

Фрагменты петли из длинной шРНК накапливаются в растительных клетках и устойчивы к воздействию РНКазы R

Был получен трансген, который кодировал длинную шРНК, направленно воздействующую на мРНК GUS, содержащую 563 пн смысловую и антисмысловую последовательности и 1113 пн спейсер (Фигура 40, GUShp1100). Также был создан второй трансген, который кодировал более короткую шРНК, направленно воздействующую на ту же мРНК GUS, содержащую 93 пн смысловую и антисмысловую последовательности и 93 пн спейсер (GUShp93-1). Обе конструкции вводили отдельно в клетки листьев Nicotiana benthamiana для транзиентной экспрессии шпилечных РНК, а также использовали для трансформации растений A. thaliana с целью экспрессии в виде стабильно интегрированных и наследуемых трансгенов. Как сообщали ранее, обе конструкции давали определенные фрагменты РНК ожидаемого размера для последовательностей петли при введении и экспрессии в растительных клетках (Фигура 41; Wang et al., 2008; Shen et al., 2015). В настоящем исследовании авторы изобретения хотели определить, превращаются ли последовательности петель в кольцевые РНК.

Была получена третья конструкция с промотором U6 Arabidopsis, а не с промотором 35S, для экспрессии более короткой шРНК (GUShp93-2). Также была получена четвертая конструкция GUS шРНК, которая включала интрон PDK в качестве спейсерной последовательности (GUShpPDK на Фигуре 40). Эта конструкция кодировала шпилечную РНК, в которой интрон, как предполагали, должен был подвергаться сплайсингу после транскрипции с получением намного более короткой последовательности петли. Эти конструкции также вводили в листья N. benthamiana с целью проверки, можно ли обнаружить последовательности петель и образуют ли они кольцевую РНК. Последовательности стебля дцРНК и петель в этих конструкциях были получены из кодирующей последовательности GUS, при этом не вводили никаких известных последовательностей интронов. Конструкции вводили отдельно в листья N. benthamiana с использованием агробактериальной инфильтрации, в присутствии или в отсутствие целевой GUS-экспрессирующей конструкции, вместе с генетической конструкцией, кодирующей и экспрессирующей 2b белок вируса мозаики огурца в качестве вирусного супрессорного белка (VSP) для усиления экспрессии трансгена. Накопление и размер фрагментов петель анализировали при использовании Нозерн-блот гибридизации. Авторадиограмма репрезентативного Нозерн-блота показана на Фигуре 42.

Как показано на Фигуре 42, длинный фрагмент петли GUShp1100 легко обнаруживался в образцах, инфильтрированных Agrobacterium, как сообщали ранее (Shen et al., 2015). Для проверки, является ли этот фрагмент петли кольцевым, образцы РНК обрабатывали РНКазой R и подвергали электрофорезу в полиакриламидных гелях. Для обработки РНКазой R использовали 10 мкг суммарной РНК (или 50 нг in vitro транскрипта), смешанной с буфером для РНКазы R и водой в общем объеме 20 мкл. Смеси нагревали в кипящей воде в течение 3 минут, быстро охлаждали во льду, затем добавляли 0,5 мкл РНКазы R и инкубировали пробирку при 37°C в течение 10 мин. Фермент инактивировали, а остаточную РНК выделяли путем осаждения этанолом. Обработка РНКазой R приводила к деградации большей части РНК, о чем свидетельствует резкое уменьшение количества материала, окрашиваемого бромистым этидием в гелях (Фигура 42, нижняя панель). Во всех анализах при обработке РНКазой R несколько фрагментов рибосомной РНК оставались видимыми в гелях, что указывает на частичную устойчивость некоторых типов РНК к РНКазе R. Несмотря на снижение количества суммарной РНК в образцах, обработанных РНКазой R, фрагмент петли размером примерно 1100 нт оставался интенсивным, с уменьшением количества приблизительно лишь на 24% по сравнению с необработанными образцами. Это указывает на то, что фрагмент петли относительно устойчив к расщеплению РНКазой R и, следовательно, имеет кольцевую структуру. Снижение количества РНК петли на 24% по сравнению с необработанным образцом связывали либо с остаточным количествам эндонуклеазной активности в коммерческом ферменте РНКазе R, либо с уменьшением выхода РНК после расщепления РНКазой R в стадии осаждения этанолом.

Анализ с обработкой РНКазой R повторяли с включением 50 нг транскрибированной in vitro РНК, соответствующей последовательности петли, в качестве контрольной линейной РНК. Кроме того, образец РНК N. benthamiana после инфильтрации hpGUS1100 обрабатывали с двумя циклами обработки РНКазой R для более строгого тестирования устойчивости к РНКазе R. Было обнаружено, что 76% фрагмента петли из листьев N. benthamiana, подвергнутых инфильтрации GUShp1100, сохранялось после одной обработки РНКазой R, тогда как сохранялось лишь около 8,5% линейного in vitro транскрипта. Двойная обработка РНКазой R дополнительно уменьшала количество материалов петли, но не устраняла их полностью. Также было отмечено, что полоса РНК из образцов N. benthamiana, соответствующая последовательности петли, оказалась больше на гель-блоте, чем транскрипт in vitro, что соответствовало кольцевой РНК, которая, согласно имеющимся сообщениям, мигрирует медленнее в процессе гель-электрофореза, чем линейные молекулы РНК, содержащие такое же количество нуклеотидов. Из этих экспериментов был сделан вывод, что последовательность петли длиной около 1100 нуклеотидов являлась кольцевой.

Анализ методом Нозерн-блот гибридизации образцов РНК GUShp93-1 и GUShpPDK-инфильтрированных N. benthamiana также выявил молекулы РНК размера, соответствующего длине последовательностей петли. В случае конструкций GUShp93-1 и GUShp93-2, направляемая U6 промотором GUShp93-2 давала больше фрагмента петли, чем направляемая 35S промотором GUShp93-1, что указывает на то, что U6 промотор обладал более сильной транскрипционной активностью, чем 35S промотор в клетках листьев N. benthamiana, или что молекулы по какой-то причине были более стабильными.

Конструкция GUShpPDK имела спейсерную последовательность, которая включала сплайсируемый интрон PDK размером 0,76 тпн, и поэтому первичные транскрипты из этой конструкции содержали петлю размером примерно 0,8 тпн. Нозерн-блоты обрабатывали для удаления зонда GUS и повторно метили полноразмерным антисмысловым зондом против последовательности интрона PDK. Зонд PDK сильно гибридизовался с неизвестной РНК, что наблюдали в виде интенсивной полосы на всех дорожках. Обработка РНКазой A уменьшала, но не могла полностью устранить эту неспецифическую полосу. Тем не менее, интрон-специфическая полоса PDK ожидаемого размера могла быть обнаружена в образцах GUShpPDK-инфильтрированных РНК, хотя количество фрагмента выглядело относительно низким, возможно, потому, что последовательность интрона была удалена в результате сплайсинга из большинства первичных транскриптов GUShpPDK. Для проверки, был ли фрагмент петли PDK кольцевым, РНК из GUShpPDK-инфильтрированных листьев N. benthamiana обрабатывали РНКазой R. Неспецифическая полоса гибридизации почти полностью исчезала после обработки РНКазой R. Напротив, полосу интрона PDK после обработки РНКазой R можно было легко обнаружить, хотя количественно ее не удалось легко сравнить с необработанным образцом из-за сильного сигнала от неспецифической полосы. Взятые в совокупности, эти результаты указывают, что транскрипты шРНК были эффективными предшественниками для образования кольцевой РНК, и дают основание предполагать, что кольцевая РНК соответствует полной последовательности петли.

Устойчивый к действию РНКазы R фрагмент петли также накапливается в стабильно трансформированных растениях Arabidopsis.

HpGUS347 и две hpGFP конструкции (Фигура 40) использовали для трансформации растений A. thaliana экотипа Col-0 и двух растений, экспрессирующих трансген, выбранный для каждой конструкции. Конструкцию hpGUS347 использовали в этом эксперименте в качестве контроля для конструкций hpGFP, в которые были введены сайты связывания miR165/166 для тестирования функции миРНК "губки" (обсуждаемой в Примере 24). Трансгенные растения поколения T2 анализировали на накопление молекул РНК, продуцируемых с конструкции hpGUS347, в частности, для определения последовательностей петли и того, являются ли они кольцевыми. Полоса, соответствующая петле транскриптов hpGUS347, была обнаружена как в обработанных РНКазой R, так и в необработанных образцах РНК из двух линий hpGUS347. Что касается образцов РНК из Agrobacterium-инфильтрированных тканей N. benthamiana, то наблюдалось небольшое снижение интенсивности полосы в образцах, обработанных РНКазой R, по сравнению с необработанными образцами, однако большая часть сигнала РНК сохранялась. Анализ ОТ-кПЦР с использованием праймеров, сконструированных для обнаружения кольцевой РНК, подтвердил присутствие кольцевой РНК в обработанных РНКазой R образцах hpGUS347 с небольшим снижением представленности по сравнению с необработанными образцами. Эти результаты указывают, что стабильно интегрированные шРНК трансгены, которые экспрессировались с продукцией шпилечных РНК, также давали кольцевые РНК с последовательностей петли.

Петли шРНК транскриптов вырезали по соединению дцРНК стебель-петли с получением кольцевой РНК

Чтобы дополнительно подтвердить кольцевую природу молекул РНК, полученных из последовательностей петли, и охарактеризовать их соединительные последовательности, последовательности петли амплифицировали с помощью ОТ-ПЦР из GUShp1100, GUShp93 и GUShpPDK-инфильтрованных образцов при использовании олигонуклеотидных праймеров, которые будут амплифицировать предполагаемые соединительные последовательности. Затем продукты ОТ-ПЦР клонировали в вектор pGEM-T Easy и секвенировали, подтверждая нуклеотидные последовательности на участке соединений. Положения нуклеотидов при вырезании и соединении петли в кольцевых РНК в некоторой степени изменялось: 5'-сайты располагались на 3'-конце стебля дцРНК, а 3'-сайты около 3'-конца петли, при этом 5'-сайты показали явное предпочтение нуклеотида G, расположенного за 10 нуклеотидов от 3'-конца стебля дцРНК. Было отмечено, что сайты вырезания и присоединения кольцевой РНК интрона PDK имели такое же расположение, что и в РНК GUShp1100 и GUShp93, и находились за пределами канонических сайтов сплайсинга интронов. Сделали вывод, что образование кольцевой РНК определялось структурой стебель-петли независимо от сплайсинга интронов. Также сделали вывод, что, по меньшей мере, в этом примере шпилечная РНК подвергалась процессингу с высвобождением и циркуляризацией последовательности петли в результате 5'-расщепления на 3'-конце стебля дцРНК и 3'-расщепления около 3'-конца последовательности петли с образованием ковалентной связи между 5'- и 3'-концами вырезанной последовательности.

Пример 23. шРНК, экспрессируемая в Saccharomyces cerevisiae , не процессировалась в кольцевую РНК

Вид дрожжей, Saccharomyces cerevisiae, является эукариотическим организмом и обладает аппаратом сплайсинга интронов, как и все эукариоты. Поскольку существующая консенсусная модель образования кольцевой РНК основана на сплайсинге интронов, авторы изобретения исследовали, может ли шРНК образовывать кольцевую РНК в S. cerevisiae, как это происходило в клетках растений. С целью создания конструкции для экспрессии шРНК область инвертированных повторов GUShp1100 вырезали из растительного вектора экспрессии и встраивали в дрожжевой вектор экспрессии под контролем дрожжевого промотора ADH1 (Фигура 43), и полученную генетическую конструкцию вводили в клетки S. cerevisiae. Как показано на Фигуре 43, анализ методом Нозерн-блот гибридизации РНК, выделенной из каждого из трех независимых штаммов трансгенных дрожжей, выявил одну полосу высокого молекулярного веса, соответствующую транскрипту GUShp1100. Это указывало на то, что транскрипт GUShp1100 не процессировался в S. cerevisiae, а оставался полноразмерным. Для подтверждения этого транскрипты GUShp1100, экспрессируемые S. cerevisiae и N. benthamiana, сравнивали по их ответу на обработку РНКазой R. Как показано на Фигуре 44, РНК, экспрессируемая S. cerevisiae, показала полосу с высоким молекулярным весом, которая была высокочувствительной к обработке РНКазой R и, следовательно, не была кольцевой. То есть образцы дрожжевой РНК не демонстрировали присутствия кольцевых молекул, полученных из последовательности петли, как это было в клетках N. benthamiana. Результаты показывали, что транскрипт GUShp1100, экспрессируемый в S. cerevisiae, не подвергался процессингу и оставался полноразмерным. Размер полосы РНК S. cerevisiae казался больше при гель-электрофорезе, чем размер in vitro транскрипта GUShp1100, предположительно из-за 5' и 3' UTR и поли(A) последовательностей, которые присутствовали в РНК, экспрессируемой S. cerevisiae, но не присутствовали в in vitro транскрипте. Таким образом, присутствие аппарата сплайсинга интронов у S. cerevisiae было недостаточным для обеспечения процессинга петли шРНК и образования кольцевой РНК, как это происходило в клетках растений.

Аналогичным образом, генетическая конструкция GUShp347 была введена в S. cerevisiae и экспрессирована. Анализ методом Нозерн-блот гибридизации снова показал, что шРНК выглядела полноразмерной и, по-видимому, не подвергалась процессингу, по меньшей мере, не с расщеплением последовательности петли или области дцРНК.

Авторы изобретения пришли к выводу, что дрожжи S. cerevisiae и родственные им почкующиеся дрожжи, не содержащие ферментов Dicer (Drinnenberg et al., 2003), полезны в качестве организма для получения полноразмерных шпилечных и кпРНК, включая модифицированные молекулы РНК, описанные в настоящем документе. Такие полноразмерные РНК полезны в случаях, когда требуется непроцессированная дцРНК, например, для сайленсинга гена путем нанесения на насекомых.

Пример 24. Петли шРНК могут функционировать в качестве эффективной "губки" для подавления функции мкРНК

Было обнаружено, что несколько кольцевых РНК у животных содержат множество последовательностей, которые комплементарны специфическим мкРНК и, таким образом, действуют как сайты связывания для этих мкРНК, называемые мкРНК "губками". Авторы изобретения проверили, может ли кольцевая РНК, полученная из длинных конструкций шРНК, функционировать как мкРНК губка в растительных клетках. Были сконструированы две конструкции GFP шРНК (Фигура 40), которые имели один и тот же спейсер, полученный из последовательности GUS, за исключением того, что последовательность одной из них была модифицирована путем включения двух сайтов связывания miR165/166 Arabidopsis. Эта конструкция, GFPhp[G:U], содержала последовательность с инвертированным повтором, которая имела такую же антисмысловую последовательность, что и вторая (контрольная) конструкция GFPhp[WT], но с модифицированной смысловой последовательностью, в которой все цитозиновые нуклеотиды были заменены тиминами. Транскрипт с GFPhp[G:U] будет, таким образом, формировать область дцРНК, соответствующую последовательности GFP, за исключением того, что около 25% пар оснований будет представлять собой пары оснований G:U. Другая конструкция, GFPhp[WT], кодировала шпилечную РНК со дцРНК стеблем с полностью канонически спаренными основаниями, такой же длины, что и шпилька из GFPhp[G:U], и использовалась в качестве контроля (Фигура 40). Конструкция GUS шРНК GUShp347, содержащая спейсер без сайтов связывания miR165/166, была включена в качестве второго контроля.

Конструкции использовали для отдельной трансформации A. thaliana, и трансгенные растения были получены для каждой из трех конструкций. Трансформированные растения визуально проверяли на фенотипы, связанные с редукцией miR165/166, которые включали характерное скручивание листьев в "трубы". Как и ожидали, растения, трансформированные GUShp347, не показывали фенотипы, связанные с репрессией miR165/166. Аналогичным образом, не наблюдали четкого фенотипа у растений, трансформированных GFPhp[WT]. Напротив, большинство растений GFPhp[G:U] показывали различные уровни фенотипов, напоминающих репрессию miR165/166, включая фенотип трубы.

Нозерн-блот гибридизацию проводили с РНК, выделенной из растений, трансформированных GFPhp[G:U], с диапазоном фенотипов, изменяющихся от легкого, умеренного и сильного или тяжелого, чтобы исследовать накопление экспрессии шРНК. В качестве зонда использовали полноразмерную антисмысловую РНК, соответствующую мРНК GUS. Зонд имел 822 пн последовательность с непрерывной комплементарностью со смысловой и примыкающей петлей транскрипта GUShp347. Зонд обладал меньшей комплементарностью последовательности с транскриптами GFPhp, которые имели в общей сложности 228 пн область петли в виде GUS-производной последовательности, в трех несмежных областях длиной 49, 109 и 70 пн, фланкирующих две мкРНК-связывающие последовательности. Как показано на Фигуре 45B, в растениях GFPhp[G:U] были обнаружены очень большие количества молекул GFP шРНК, причем количества молекул РНК, обнаруженные на Нозерн-блотах, положительно коррелировали с тяжестью фенотипов. Растения GFPhp[WT] демонстрировали низкие уровни накопления молекул шРНК, которые были обнаружены только при Нозерн-блот анализах, что согласуется с относительно низкими уровнями транскрипции традиционных шРНК трансгенов по сравнению с G:U-модифицированными шРНК трансгенами. То есть, как показано в Примерах выше, трансгены hpRNA[G:U] в меньшей степени подвержены аутосайленсингу по сравнению с соответствующим трансгеном hpRNA[WT].

ОТ-кПЦР использовали для количественного определения накопления молекул кольцевых РНК, полученных из последовательностей петли. Результаты показали, что большое количество кольцевой РНК присутствовало в GFPhp[G:U] трансгенных растениях, что коррелировало с уровнями накопления полноразмерной шРНК (Фигура 45C). Анализы методом Нозерн-блот гибридизации для обнаружения малых РНК в диапазоне размерности 20-25 нт подтвердили даунрегуляцию miR165/166 в GFPhp[G:U] растениях. Степень снижения коррелировала с количеством шРНК и кольцевой РНК и тяжестью фенотипов. Анализ экспрессии гена-мишени miR165/166 с помощью ОТ-кПЦР показал, что репрессия гена-мишени, вызванная miR165/166, была снята в растениях, показавших сильную даунрегуляцию miR165/166 и тяжелые фенотипы. Взятые в совокупности, эти результаты показали, что петли шРНК могли использоваться в качестве специфично мкРНК губки, чтобы подавлять функцию мкРНК в растениях.

Авторы изобретения также предложили применение кольцевых РНК, продуцируемых в высоких уровнях в растительных клетках, в качестве стабильных молекул, транслируемых в качестве средства для получения высоких уровней полипептидов. Для инициации кэп-независимой трансляции идеально подходят участки внутренней посадки рибосомы (IRES). Были идентифицированы многочисленные последовательности IRES.

Для специалистов в данной области будет очевидно, что в изобретение могут быть внесены многочисленные изменения и/или модификации, как показано в конкретных вариантах осуществления, без отступления от сущности или объема изобретения, которые описаны в общем виде. Таким образом, настоящие варианты осуществления следует рассматривать во всех отношениях как иллюстративные, а не ограничивающие.

Настоящая заявка испрашивает приоритет AU 2018902840, поданной 3 августа 2018 года, AU 2018902896, поданной 8 августа 2018 года, PCT/AU2018/051015, поданной 17 сентября 2018 года, и AU 2019900941, поданной 20 марта 2019 года, описания которых включены в настоящий документ посредством отсылки.

Все публикации, обсуждаемые и/или цитируемые в настоящем документе, включены в настоящий документ во всей своей полноте.

Любые обсуждения документов, действий, материалов, устройств, изделий или т.п., которые включены в настоящее описание, предназначены исключительно для обеспечения контекста для настоящего изобретения. Не следует воспринимать как допущение того, что какие-либо или все эти положения являются частью предшествующего уровня техники или были общеизвестными в области, относящейся к настоящему изобретению, поскольку они существовали до даты приоритета каждого пункта формулы настоящей заявки.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ ИСТОЧНИКИ

Abraham (2002). Cell 111:9-12.

Acevedo-Garcia et al., (2017). Plant Biotechnology Journal 15:367-378.

Alvarez et al., (2000). Theor Appl Genet 100:319-327.

Baumlein et al., (1991). Mol. Gen. Genet. 225:459-467.

Baumlein et al., (1992). Plant J. 2:233-239.

Bhattacharyya et al., (1990) Cell 60:155-122.

Brar et al., (1996) Biotech Genet. Eng Rev 13:167-79.

Broothaerts et al., (2005). Nature 433:629-633.

Broun et al., (1998). Plant J. 13:201-210.

Buchanan-Wollaston, (1994) Plant physiology 105:839-846.

Busk et al., (1997). Plant J. 11:1285-1295.

Chen et al., (2005). Functional Plant Biology 32:671-681.

Chikwamba et al., (2003). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:11127-11132.

Christou and Klee, (2004) Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons.

Chung et al., (2006). BMC Genomics 7:120.

Clough and Bent (1998). Plant J. 16:735-743.

Corrado and Karali (2009). Biotechnol. Adv. 27:733-743.

Courvalin et al., (1995). Life Sci. 318:1209-1212.

Dadd and Mittler (1966). Experientia 22:832-833.

Darji et al., (1997). Cell 91:765-775.

Dong et al., (2011) Plant J. 68:633-45.

Draper and Scott (1988). In: J. Draper et al., (Eds.), Plant Genetic Transformation and Gene Expression: A Laboratory Manual, Alden Press, Oxford, pp. 199-236.

Drinnenberg et al.. (2009) Science 326:544-550.

Dunwell (2000). J Exp Botany 51Spec No:487-496.

Ebhardt et al., (2005) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 102:13398-13403.

Ellerstrom et al., (1996). Plant Mol. Biol. 32:1019-1027.

Elliott et al., (2002). Mol. Plant Microbe Interact. 15:1069-1077.

Ellis et al., (1987). EMBO J 6:11-16.

Feechan et al., Functional Plant Biology, 2008, 35: 1255-1266.

Fehr, In: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).

Gan (1995). Molecular characterization and genetic manipulation of plant senescence. PhD thesis. University of Wisconsin, Madison.

Gan and Amasino (1995). Science 270:1986-1988.

Glawe (2008). Ann. Rev. Phytopathol. 46:27-51.

Gleave (1992). Plant Mol Biol 20: 1203-1207.

Guo et al., (2016) Curr. Genom. 17: 476-489.

Gupta et al., (1988) Plant Mol. Biol. 10:215-224.

Helliwell and Waterhouse (2005). Methods in Enzymology 392:24-35.

Hershey and Stoner, (1991) Plant Molecular Biol. 17:679-690.

Hinchee et al., (1988). Biotechnology 6:915-922.

Horvath et al., (2000). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:1914-1919.

Hsieh and Fire (2000) Annu Rev Genet 14:187-204.

Jeddeloh, et al., (1999). Nat. Genet. 22:94-97.

Jefferson et al., (1987). EMBO J 6:3901-3907.

Jepson et al., (1994). Plant Mol. Biol. 26:1855-1866.

Khan (2017). Sci Rep 7, 40025

Kim et al., (2019) J. Gen. Plant Path. https://doi.org/10.1007/s10327-019-00865-7

Kishore and Somerville (1993). Curr Opin Biotechnol. 4:152-158.

Koziel et al., (1996). Plant Mol. Biol. 32:393-405.

Lacroix et al., (2008). Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 105: 15429-15434.

Lau et al., (2001) Science 294:858-862.

Li et al., (1996). FEBS Lett. 379:117-121.

McCahill et al., (2002). Molecular Pharmacology 62:1261-1273.

McCullough and Schuler (1997). Nucl Acids Res. 25:1071-1077.

Mahfouz et al., (2006). Plant Cell 18:477-490.

Matsuoka et al., (1994). Plant J. 6:311-319.

Meier et al., (1997). FEBS Lett. 415:91-95.

Melamed-Bessudo et al., (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(16):e981-988.

Millar et al., (2006). Plant J. 45:942-954.

Mutti et al., (2006). J Insect Sci 6:38.

Mutti et al., (2008). Proceedings of the National Academy of Sciences 105:9965-9969.

Olive et al., (1989) Plant Mol Biol 12:525-538.

Padidam (2003). Transgenic Res. 12:101-109.

Perrin et al., (2000). Mol Breed 6:345-352.

Pitino et al., (2011). PLoS ONE 6, e25709.

Pitino and Hogenhout (2012). Molecular Plant-Microbe Interactions 26:130-139.

Potenza et al., (2004). In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 40:1-22.

Powell et al., (1996). Vaccines 183, Abstract.

Preiss et al., (1987). In: Tailoring Genes for Crop Improvement (Bruening et al., eds.), Plenum Press, S.133-152.

Sambrook et al., (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press.

Schaffner (1980). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:2163-2167.

Schwartz et al., (1997). Science 276:1872-1874.

Scott et al., (2013). Journal of Insect Physiology 59:1212-1221.

Seddas et al., (2004). Virology 325:399-412.

Shen et al., (2015) Frontiers in Plant Science 6:281.

Shiina et al., (1997). Plant Physiol. 115:477-483.

Shure et al., (1983). Cell 35:225-233.

Sizemore et al., (1995). Science 270:299-302.

Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003).

Smith et al., (2000). Nature 407:319-320.

Stalker et al., (1988). Science 242: 419-423.

Stewart et al., (2000). J Mol Biol 298:611-622.

Tan et al., (2011). Plant Physiol. 156:1577-1588.

Thillet et al., (1988). J. Biol. Chem 263:12500-12508.

Timmons et al., (2001). Gen 263:103-112.

Ulmasov et al., (1995). Plant Physiol. 108:919-927.

Wang (1994) Isolation of phloem specific gene promoters for use in genetic engineering of insect resistance in rice. PhD thesis, University of Durham, UK.

Wang et al., (1994) Plant Molecular Biology 24:159-170.

Wang et al., (1998) Acta Horticulturae 461:401-407.

Wang et al., (2008) RNA 14: 903-913.Wang et al., (2013). PLoS Genet 9, e1003865.

Wang et al., (2014). Nature Biotechnology 32:9.

Weiss (2003). Int. J. Med. Microbiol. 293:95:106.

Weissbach et al., (1988). In: Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, Calif.

Wijnker et al., (2008). Trends in Plant Science 13:640-646.

Wesley et al. (2001) Plant J. 27:581-590.

Yang et al., (1994) Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England.

Yang et al., (2003). Planta 216:597-603.

Yelina et al., (2012). PLoS Genetics 8(8):e1002844. doi:10.1371/journal.pgen.1002844

Yu et al., (2016). Pest Management Science 72:1090-1098.

Zhang et al., (2018). Nat Rev Mol Cell Biol. 19:489-506.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Commonwealth Scientific and Industrial Research

Organisation

<120> Молекулы РНК, включающие неканонические пары оснований

<130> 526425PCT

<150> AU 2018902840

<151> 2018-08-03

<150> AU 2018902896

<151> 2018-08-08

<150> PCT/AU2018/051015

<151> 2018-09-17

<150> AU 2019900941

<151> 2019-03-04

<160> 144

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1229

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GFP кпРНК

<400> 1

gggugucgcc cucgaacuuc accucggcgc gggucuugua guugccgucg uccuugaaga

60

agauggugcg cuccuggacg uagccuucgg gcauggcgga cuugaagaag ucgugcugcu

120

ucaugugguc gggguagcgg cugaagcacu gcacgccgua ggugaaggug gucacgaggg

180

ugggccaggg cacgggcagc uugccggugg ugcagaugaa cuucaggguc agcuugccgu

240

agguggcauc gcccucgccc ucgccggaca cgcugaacuu guggccguuu acgucgccgu

300

ccagcucgac caggaugggc accaccccgg ugaacagcuc cucgcccuug cucacuaugg

360

aucaacuagg gaucccccug aaguucaucu gcaccaccgg caagcugccc gugcccuggc

420

ccacccucgu gaccaccuuc accuacggcg ugcagugcuu cagccgcuac cccgaccaca

480

ugaagcagca cgacuucuuc aaguccgcca ugcccgaagg cuacguccag gagcgcacca

540

ucuucuucaa ggacgacggc aacuacaaga cccgcgccga ggugaaguuc gagggcgaca

600

cccuggugaa ccgcaucgag cugaagggca ucgacuucaa ggaggacggc aacauccugg

660

ggcacaagcu ggaguacaac uacaacagcc acaacgucua uaucauggcc gacaagcaga

720

agaacggcau caaggugaac uucaagaucc gccacaacau cgaggacggc agcgugcagc

780

ucgccgacca cuaccagcag aacaccccca ucggcgacgg ccccgugcug cugccaagcu

840

uuaggugauc caagcuugau ccgggcuuua cuuguacagc ucguccaugc cgagagugau

900

cccggcggcg gucacgaacu ccagcaggac caugugaucg cgcuucucgu uggggucuuu

960

gcucagggcg gacugggugc ucagguagug guugucgggc agcagcacgg ggccgucgcc

1020

gaugggggug uucugcuggu aguggucggc gagcugcacg cugccguccu cgauguugug

1080

gcggaucuug aaguucaccu ugaugccguu cuucugcuug ucggccauga uauagacguu

1140

guggcuguug uaguuguacu ccagcuugug ccccaggaug uugccguccu ccuugaaguc

1200

gaugcccuuc agcucgaugc gguucacca

1229

<210> 2

<211> 1326

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GUS кпРНК

<400> 2

gggaacagac gcgugguuac agucuugcgc gacaugcguc accacgguga uaucguccac

60

ccagguguuc ggcguggugu agagcauuac gcugcgaugg auuccggcau aguuaaagaa

120

aucauggaag uaagacugcu uuuucuugcc guuuucgucg guaaucacca uucccggcgg

180

gauagucugc caguucaguu cguuguucac acaaacggug auacguacac uuuucccggc

240

aauaacauac ggcgugacau cggcuucaaa uggcguauag ccgcccugau gcuccaucac

300

uuccugauua uugacccaca cuuugccgua augagugacc gcaucgaaac gcagcacgau

360

acgcuggccu gcccaaccuu ucgguauaaa gacuucgcgc ugauaccaga cgugccguau

420

guuauugccg ggaaaagugu acguaucacc guuuguguga acaacgaacu gaacuggcag

480

acuaucccgc cgggaauggu gauuaccgac gaaaacggca agaaaaagca gucuuacuuc

540

caugauuucu uuaacuaugc cggaauccau cgcagcguaa ugcucuacac cacgccgaac

600

accugggugg acgauaucac cguggugacg caugucgcgc aagacuguaa ccacgcgucu

660

guucccgacu ggcagguggu ggccaauggu gaugucagcg uugaacugcg ugaugcggau

720

caacaggugg uugcaacugg acaaggcacu agcgggacuu ugcaaguggu gaauccgcac

780

cucuggcaac cgggugaagg uuaucucuau gaacugugcg ucacagccaa aagccagaca

840

gagugugaua ucuacccgcu ucgcgucggc auccggucag uggcagugaa gggccaacag

900

uuccugauua accacaaacc guucuacuuu acuggcuuug gucgucauga agaugcggac

960

uuacguggca aaggauucga uaacgugcug auggugcacg accacgcauu aauggacugg

1020

auuggggcca acuccuaccg uaccucgcau uacccuuacg cugaagagau gcucgaugug

1080

guuaaucagg aacuguuggc ccuucacugc cacugaccgg augccgacgc gaagcgggua

1140

gauaucacac ucugucuggc uuuuggcugu gacgcacagu ucauagagau aaccuucacc

1200

cgguugccag aggugcggau ucaccacuug caaagucccg cuagugccuu guccaguugc

1260

aaccaccugu ugauccgcau cacgcaguuc aacgcugaca ucaccauugg ccaccaccug

1320

ccaguc

1326

<210> 3

<211> 1485

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FAD2.1 кпРНК

<400> 3

gaagaucugu agccucucgc ggucauugua gauugggccg uaagggucau agugacaugc

60

aaagcgauca uaaugucggc cagaaacauu gaaagccaag uacaaaggcc agccaagagu

120

aagggugauc guaagugaaa uaacccggcc ugguggauug uucaaguacu uggaauacca

180

uccgaguugu gauuucggcu uaggcacaaa aaccucaucg cgcucgagug agccaguguu

240

ggaguggugg cgacgaugac uauauuucca agagaaguag ggcaccauca gagcagagug

300

gaggauaagc ccgacagugu caucaaccca cugguaguca cuaaaggcau gguggccaca

360

uucgugcgca auaacccaaa uaccagugca aacacaaccc ugacaaaucc aguaaauagg

420

ccaugcaagg uagcaauccu aggcacucug cucugauggu gcccuacuuc ucuuggaaau

480

auagucaucg ucgccaccac uccaacacug gcucacucga gcgcgaugag guuuuugugc

540

cuaagccgaa aucacaacuc ggaugguauu ccaaguacuu gaacaaucca ccaggccggg

600

uuauuucacu uacgaucacc cuuacucuug gcuggccuuu guacuuggcu uucaauguuu

660

cuggccgaca uuaugaucgc uuugcauguc acuaugaccc uuacggccca aucuacaaug

720

accgcgagag gcuacagauc uuccuuucug augcuggagu uauuggagcu gguuaucuac

780

uauaucguau ugccuuggua aaagggcuag cuuggcucgu guguauguau ggcguaccac

840

uccuaaucgu gaacggcuuc cuugucuuga ucacuuauuu gcagcacacu cacccgucau

900

ugccucacua cgauucaucc gaaugggauu ggcuaagggg agcuuuggca accgucgaca

960

gagacuaugg cauucuaaac aaggucuucc acaacaucac cgauacucac guaguccacc

1020

aucuguucuc gaccaugcca cacucuagag ugaugcuuca ucuuucucca cauagauaca

1080

cucuuuugcu ucccuccaca uugccuugaa aaccgggguu ccgucaaauu gguaguaguc

1140

uccgaguaau ggcuugacug cuuuuguugc cuccauugca uuguagugug gcauggucga

1200

gaacagaugg uggacuacgu gaguaucggu gauguugugg aagaccuugu uuagaaugcc

1260

auagucucug ucgacgguug ccaaagcucc ccuuagccaa ucccauucgg augaaucgua

1320

gugaggcaau gacgggugag ugugcugcaa auaagugauc aagacaagga agccguucac

1380

gauuaggagu gguacgccau acauacacac gagccaagcu agcccuuuua ccaaggcaau

1440

acgauauagu agauaaccag cuccaauaac uccagcauca gaaag

1485

<210> 4

<211> 1258

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК конструкция, кодирующая GFP кпРНК

<400> 4

taatacgact cactataggg tgtcgccctc gaacttcacc tcggcgcggg tcttgtagtt

60

gccgtcgtcc ttgaagaaga tggtgcgctc ctggacgtag ccttcgggca tggcggactt

120

gaagaagtcg tgctgcttca tgtggtcggg gtagcggctg aagcactgca cgccgtaggt

180

gaaggtggtc acgagggtgg gccagggcac gggcagcttg ccggtggtgc agatgaactt

240

cagggtcagc ttgccgtagg tggcatcgcc ctcgccctcg ccggacacgc tgaacttgtg

300

gccgtttacg tcgccgtcca gctcgaccag gatgggcacc accccggtga acagctcctc

360

gcccttgctc actatggatc aactagggat ccccctgaag ttcatctgca ccaccggcaa

420

gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccttcacc tacggcgtgc agtgcttcag

480

ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc ccgaaggcta

540

cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc gcgccgaggt

600

gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg acttcaagga

660

ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca acgtctatat

720

catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc acaacatcga

780

ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg gcgacggccc

840

cgtgctgctg ccaagcttta ggtgatccaa gcttgatccg ggctttactt gtacagctcg

900

tccatgccga gagtgatccc ggcggcggtc acgaactcca gcaggaccat gtgatcgcgc

960

ttctcgttgg ggtctttgct cagggcggac tgggtgctca ggtagtggtt gtcgggcagc

1020

agcacggggc cgtcgccgat gggggtgttc tgctggtagt ggtcggcgag ctgcacgctg

1080

ccgtcctcga tgttgtggcg gatcttgaag ttcaccttga tgccgttctt ctgcttgtcg

1140

gccatgatat agacgttgtg gctgttgtag ttgtactcca gcttgtgccc caggatgttg

1200

ccgtcctcct tgaagtcgat gcccttcagc tcgatgcggt tcaccattgt cgggatac

1258

<210> 5

<211> 1346

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК конструкция, кодирующая Gus кпРНК

<400> 5

taatacgact cactataggg aacagacgcg tggttacagt cttgcgcgac atgcgtcacc

60

acggtgatat cgtccaccca ggtgttcggc gtggtgtaga gcattacgct gcgatggatt

120

ccggcatagt taaagaaatc atggaagtaa gactgctttt tcttgccgtt ttcgtcggta

180

atcaccattc ccggcgggat agtctgccag ttcagttcgt tgttcacaca aacggtgata

240

cgtacacttt tcccggcaat aacatacggc gtgacatcgg cttcaaatgg cgtatagccg

300

ccctgatgct ccatcacttc ctgattattg acccacactt tgccgtaatg agtgaccgca

360

tcgaaacgca gcacgatacg ctggcctgcc caacctttcg gtataaagac ttcgcgctga

420

taccagacgt gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg tatcaccgtt tgtgtgaaca

480

acgaactgaa ctggcagact atcccgccgg gaatggtgat taccgacgaa aacggcaaga

540

aaaagcagtc ttacttccat gatttcttta actatgccgg aatccatcgc agcgtaatgc

600

tctacaccac gccgaacacc tgggtggacg atatcaccgt ggtgacgcat gtcgcgcaag

660

actgtaacca cgcgtctgtt cccgactggc aggtggtggc caatggtgat gtcagcgttg

720

aactgcgtga tgcggatcaa caggtggttg caactggaca aggcactagc gggactttgc

780

aagtggtgaa tccgcacctc tggcaaccgg gtgaaggtta tctctatgaa ctgtgcgtca

840

cagccaaaag ccagacagag tgtgatatct acccgcttcg cgtcggcatc cggtcagtgg

900

cagtgaaggg ccaacagttc ctgattaacc acaaaccgtt ctactttact ggctttggtc

960

gtcatgaaga tgcggactta cgtggcaaag gattcgataa cgtgctgatg gtgcacgacc

1020

acgcattaat ggactggatt ggggccaact cctaccgtac ctcgcattac ccttacgctg

1080

aagagatgct cgatgtggtt aatcaggaac tgttggccct tcactgccac tgaccggatg

1140

ccgacgcgaa gcgggtagat atcacactct gtctggcttt tggctgtgac gcacagttca

1200

tagagataac cttcacccgg ttgccagagg tgcggattca ccacttgcaa agtcccgcta

1260

gtgccttgtc cagttgcaac cacctgttga tccgcatcac gcagttcaac gctgacatca

1320

ccattggcca ccacctgcca gtcaac

1346

<210> 6

<211> 1512

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК конструкция, кодирующая FAD2.1 кпРНК

<400> 6

atttaggtga cactatagaa gatctgtagc ctctcgcggt cattgtagat tgggccgtaa

60

gggtcatagt gacatgcaaa gcgatcataa tgtcggccag aaacattgaa agccaagtac

120

aaaggccagc caagagtaag ggtgatcgta agtgaaataa cccggcctgg tggattgttc

180

aagtacttgg aataccatcc gagttgtgat ttcggcttag gcacaaaaac ctcatcgcgc

240

tcgagtgagc cagtgttgga gtggtggcga cgatgactat atttccaaga gaagtagggc

300

accatcagag cagagtggag gataagcccg acagtgtcat caacccactg gtagtcacta

360

aaggcatggt ggccacattc gtgcgcaata acccaaatac cagtgcaaac acaaccctga

420

caaatccagt aaataggcca tgcaaggtag caatcctagg cactctgctc tgatggtgcc

480

ctacttctct tggaaatata gtcatcgtcg ccaccactcc aacactggct cactcgagcg

540

cgatgaggtt tttgtgccta agccgaaatc acaactcgga tggtattcca agtacttgaa

600

caatccacca ggccgggtta tttcacttac gatcaccctt actcttggct ggcctttgta

660

cttggctttc aatgtttctg gccgacatta tgatcgcttt gcatgtcact atgaccctta

720

cggcccaatc tacaatgacc gcgagaggct acagatcttc ctttctgatg ctggagttat

780

tggagctggt tatctactat atcgtattgc cttggtaaaa gggctagctt ggctcgtgtg

840

tatgtatggc gtaccactcc taatcgtgaa cggcttcctt gtcttgatca cttatttgca

900

gcacactcac ccgtcattgc ctcactacga ttcatccgaa tgggattggc taaggggagc

960

tttggcaacc gtcgacagag actatggcat tctaaacaag gtcttccaca acatcaccga

1020

tactcacgta gtccaccatc tgttctcgac catgccacac tctagagtga tgcttcatct

1080

ttctccacat agatacactc ttttgcttcc ctccacattg ccttgaaaac cggggttccg

1140

tcaaattggt agtagtctcc gagtaatggc ttgactgctt ttgttgcctc cattgcattg

1200

tagtgtggca tggtcgagaa cagatggtgg actacgtgag tatcggtgat gttgtggaag

1260

accttgttta gaatgccata gtctctgtcg acggttgcca aagctcccct tagccaatcc

1320

cattcggatg aatcgtagtg aggcaatgac gggtgagtgt gctgcaaata agtgatcaag

1380

acaaggaagc cgttcacgat taggagtggt acgccataca tacacacgag ccaagctagc

1440

ccttttacca aggcaatacg atatagtaga taaccagctc caataactcc agcatcagaa

1500

agcccgggac tc

1512

<210> 7

<211> 732

<212> ДНК

<213> Aequorea victoria

<400> 7

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac

60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac

120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc

180

ctcgtgacca ccttcaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag

240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc

300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg

360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac

420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac

480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc

540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac

600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc

660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa

720

agcccggatc tc

732

<210> 8

<211> 1855

<212> ДНК

<213> Escherichia coli

<400> 8

atggtccgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca

60

ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa

120

gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt

180

cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca

240

ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat

300

aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg

360

tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg

420

cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac

480

ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg

540

aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg

600

tctgttcccg actggcaggt ggtggccaat ggtgatgtca gcgttgaact gcgtgatgcg

660

gatcaacagg tggttgcaac tggacaaggc actagcggga ctttgcaagt ggtgaatccg

720

cacctctggc aaccgggtga aggttatctc tatgaactgt gcgtcacagc caaaagccag

780

acagagtgtg atatctaccc gcttcgcgtc ggcatccggt cagtggcagt gaagggccaa

840

cagttcctga ttaaccacaa accgttctac tttactggct ttggtcgtca tgaagatgcg

900

gacttacgtg gcaaaggatt cgataacgtg ctgatggtgc acgaccacgc attaatggac

960

tggattgggg ccaactccta ccgtacctcg cattaccctt acgctgaaga gatgctcgac

1020

tgggcagatg aacatggcat cgtggtgatt gatgaaactg ctgctgtcgg ctttaacctc

1080

tctttaggca ttggtttcga agcgggcaac aagccgaaag aactgtacag cgaagaggca

1140

gtcaacgggg aaactcagca agcgcactta caggcgatta aagagctgat agcgcgtgac

1200

aaaaaccacc caagcgtggt gatgtggagt attgccaacg aaccggatac ccgtccgcaa

1260

gtgcacggga atatttcgcc actggcggaa gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg

1320

atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt

1380

gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg

1440

gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt

1500

atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg

1560

tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc

1620

agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata

1680

ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg

1740

gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga

1800

ggcaaacaat gaatcaacaa ctctcctggc gcaccatcgt cggctacagc ctcgg

1855

<210> 9

<211> 1152

<212> ДНК

<213> Nicotiana benthamiana

<400> 9

atgggagctg gtggtaatat gtctcttgta accagcaaga ctggcgaaaa gaagaatcct

60

cttgaaaagg taccaacctc aaagcctcct ttcacagttg gtgatatcaa gaaggccatc

120

ccacctcact gctttcagcg gtctctcgtt cgttcgttct cctatgttgt gtatgacctt

180

ttactggtgt ccgtcttcta ctacattgcc accacttact tccacctcct cccgtcccca

240

tattgctacc ttgcatggcc tatttactgg atttgtcagg gttgtgtttg cactggtatt

300

tgggttattg cgcacgaatg tggccaccat gcctttagtg actaccagtg ggttgatgac

360

actgtcgggc ttatcctcca ctctgctctg atggtgccct acttctcttg gaaatatagt

420

catcgtcgcc accactccaa cactggctca ctcgagcgcg atgaggtttt tgtgcctaag

480

ccgaaatcac aactcggatg gtattccaag tacttgaaca atccaccagg ccgggttatt

540

tcacttacga tcacccttac tcttggctgg cctttgtact tggctttcaa tgtttctggc

600

cgacattatg atcgctttgc atgtcactat gacccttacg gcccaatcta caatgaccgc

660

gagaggctac agatcttcct ttctgatgct ggagttattg gagctggtta tctactatat

720

cgtattgcct tggtaaaagg gctagcttgg ctcgtgtgta tgtatggcgt accactccta

780

atcgtgaacg gcttccttgt cttgatcact tatttgcagc acactcaccc gtcattgcct

840

cactacgatt catccgaatg ggattggcta aggggagctt tggcaaccgt cgacagagac

900

tatggcattc taaacaaggt cttccacaac atcaccgata ctcacgtagt ccaccatctg

960

ttctcgacca tgccacacta caatgcaatg gaggcaacaa aagcagtcaa gccattactc

1020

ggagactact accaatttga cggaaccccg gttttcaagg caatgtggag ggaagcaaaa

1080

gagtgtatct atgtggagaa agatgaagca tcacaaggca aaggtgtttt ctggtacaaa

1140

aacaaattct ga

1152

<210> 10

<211> 225

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая область GUS для конструкций, кодирующих молекулы

шпилечной

РНК, направленно воздействующие на мРНК GUS

<400> 10

cctcgaggat cctcgcgtcg gcatccggtc agtggcagtg aagggcgaac agttcctgat

60

taaccacaaa ccgttctact ttactggctt tggtcgtcat gaagatgcgg acttgcgtgg

120

caaaggattc gataacgtgc tgatggtgca cgaccacgca ttaatggact ggattggggc

180

caactcctac cgtacctcgc attaccctta cgaagcttgg taccc

225

<210> 11

<211> 216

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая область GUS для конструкции, кодирующей молекулу

шпилечной

РНК hpGUS[G:U]

<400> 11

ccctcgagtt gtgttggtat ttggttagtg gtagtgaagg gtgaatagtt tttgattaat

60

tataaattgt tttattttat tggttttggt tgttatgaag atgtggattt gtgtggtaaa

120

ggatttgata atgtgttgat ggtgtatgat tatgtattaa tggattggat tggggttaat

180

ttttattgta ttttgtatta tttttatggg tacccc

216

<210> 12

<211> 216

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая область GUS для конструкций, кодирующих молекулу

шпилечной

РНК hpGUS[1:4]

<400> 12

ccctcgagtc gggtccgcaa ccgctcactg ggagtcaagc gcgtacactt cgtgaataag

60

cactaacggt tgtacattag tgggtttcgt cctcaagaac atggggagtt gggtgccaat

120

ggaatcgtta aggtggtgaa ggtccaccac ctcgctttat tggtctgcat tcggggcaag

180

tccaacccta cgtcggattt cccataccgg tacccc

216

<210> 13

<211> 216

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая область GUS для конструкций, кодирующих молекулу

шпилечной

РНК hpGUS[2:10]

<400> 13

ccctcgagtc gcgtcgcgat ccggtctctg gcagtgttgg gcgaactctt cctgatatac

60

cacaaagggt tctactaaac tggcttacgt cgtcatctag atgcggtgtt gcgtgggtaa

120

ggattcctta acgtgcacat ggtgcagcac cacgcaaaaa tggactccat tggggcgtac

180

tcctacgcta cctcgctata cccttagcgg tacccc

216

<210> 14

<211> 240

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ДНК последовательность нуклеотидов 781-1020 кодирующей белок

области

гена GUS

<400> 14

gagtgtgata tctacccgct tcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag

60

ttcctgatta accacaaacc gttctacttt actggctttg gtcgtcatga agatgcggac

120

ttgcgtggca aaggattcga taacgtgctg atggtgcacg accacgcatt aatggactgg

180

attggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat gctcgactgg

240

<210> 15

<211> 463

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> шпилечная структура (включающая петлю) РНК hpGUS[wt]

<400> 15

ggauccucgc gucggcaucc ggucaguggc agugaagggc gaacaguucc ugauuaacca

60

caaaccguuc uacuuuacug gcuuuggucg ucaugaagau gcggacuugc guggcaaagg

120

auucgauaac gugcugaugg ugcacgacca cgcauuaaug gacuggauug gggccaacuc

180

cuaccguacc ucgcauuacc cuuacgaagc uugguacccc agcuuguugg gaagcugggu

240

ucgaaaucga uaagcuucgu aaggguaaug cgagguacgg uaggaguugg ccccaaucca

300

guccauuaau gcguggucgu gcaccaucag cacguuaucg aauccuuugc cacgcaaguc

360

cgcaucuuca ugacgaccaa agccaguaaa guagaacggu uugugguuaa ucaggaacug

420

uucgcccuuc acugccacug accggaugcc gacgcgagga ucc

463

<210> 16

<211> 457

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> шпилечная структура (включающая петлю) РНК hpGUS[G:U]

<400> 16

cucgaguugu guugguauuu gguuaguggu agugaagggu gaauaguuuu ugauuaauua

60

uaaauuguuu uauuuuauug guuuugguug uuaugaagau guggauuugu gugguaaagg

120

auuugauaau guguugaugg uguaugauua uguauuaaug gauuggauug ggguuaauuu

180

uuauuguauu uuguauuauu uuuaugggua ccccagcuug uugggaagcu ggguucgaaa

240

ucgauaagcu ucguaagggu aaugcgaggu acgguaggag uuggccccaa uccaguccau

300

uaaugcgugg ucgugcacca ucagcacguu aucgaauccu uugccacgca aguccgcauc

360

uucaugacga ccaaagccag uaaaguagaa cgguuugugg uuaaucagga acuguucgcc

420

cuucacugcc acugaccgga ugccgacgcg aggaucc

457

<210> 17

<211> 457

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> шпилечная структура (включающая петлю) РНК hpGUS[1:4]

<400> 17

cucgagucgg guccgcaacc gcucacuggg agucaagcgc guacacuucg ugaauaagca

60

cuaacgguug uacauuagug gguuucgucc ucaagaacau ggggaguugg gugccaaugg

120

aaucguuaag guggugaagg uccaccaccu cgcuuuauug gucugcauuc ggggcaaguc

180

caacccuacg ucggauuucc cauaccggua ccccagcuug uugggaagcu ggguucgaaa

240

ucgauaagcu ucguaagggu aaugcgaggu acgguaggag uuggccccaa uccaguccau

300

uaaugcgugg ucgugcacca ucagcacguu aucgaauccu uugccacgca aguccgcauc

360

uucaugacga ccaaagccag uaaaguagaa cgguuugugg uuaaucagga acuguucgcc

420

cuucacugcc acugaccgga ugccgacgcg aggaucc

457

<210> 18

<211> 457

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> шпилечная структура (включающая петлю) РНК hpGUS[2:10]

<400> 18

cucgagucgc gucgcgaucc ggucucuggc aguguugggc gaacucuucc ugauauacca

60

caaaggguuc uacuaaacug gcuuacgucg ucaucuagau gcgguguugc guggguaagg

120

auuccuuaac gugcacaugg ugcagcacca cgcaaaaaug gacuccauug gggcguacuc

180

cuacgcuacc ucgcuauacc cuuagcggua ccccagcuug uugggaagcu ggguucgaaa

240

ucgauaagcu ucguaagggu aaugcgaggu acgguaggag uuggccccaa uccaguccau

300

uaaugcgugg ucgugcacca ucagcacguu aucgaauccu uugccacgca aguccgcauc

360

uucaugacga ccaaagccag uaaaguagaa cgguuugugg uuaaucagga acuguucgcc

420

cuucacugcc acugaccgga ugccgacgcg aggaucc

457

<210> 19

<211> 4851

<212> ДНК

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 19

atctctctct ttcgatggaa ctgagctctt tctctctttc ctcttctttt ctctctctat

60

ctctatctct cgtagcttga taagagtttc tctcttttga agatccgttt ctctctctct

120

cactgagact attgttgtta ggtcaacttg cgatcatggc gatttcgaag gtctgaagct

180

gatttcgaat ggtttggaga tatccgtagt ggttaagcat atggaagtct atgttctgct

240

cttggttgct ctgttagggc ttcctccatt tggaccaact tagctgaatg ttgtatgatc

300

tctctccttg aagcagcaaa taagaagaag gtctggtcct taacttaaca tctggttact

360

agaggaaact tcagctatta ttaggtaaag aaagactgta cagagttgta taacaagtaa

420

gcgttagagt ggctttgttt gcctcggtga tagaagaacc gactgattcg ttgttgtgtg

480

ttagctttgg agggaatcag atttcgcgag ggaaggtgtt ttagatcaaa tctgtgaatt

540

ttactcaact gaggctttta gtgaaccacg actgtagagt tgaccttgaa tcctactctg

600

agtaattata ttatcagata gatttaggat ggaagctgaa attgtgaatg tgagacctca

660

gctagggttt atccagagaa tggttcctgc tctacttcct gtccttttgg tttctgtcgg

720

atatattgat cccgggaaat gggttgcaaa tatcgaagga ggtgctcgtt tcgggtatga

780

cttggtggca attactctgc ttttcaattt tgccgccatc ttatgccaat atgttgcagc

840

tcgcataagc gttgtgactg gtaaacactt ggctcagatc tgcaatgaag aatatgacaa

900

gtggacgtgc atgttcttgg gcattcaggc ggagttctca gcaattctgc tcgaccttac

960

catggttgtg ggagttgcgc atgcacttaa ccttttgttt ggggtggagt tatccactgg

1020

agtgtttttg gccgccatgg atgcgttttt atttcctgtt ttcgcctctt tccttgaaaa

1080

tggtatggca aatacagtat ccatttactc tgcaggcctg gtattacttc tctatgtatc

1140

tggcgtcttg ctgagtcagt ctgagatccc actctctatg aatggagtgt taactcggtt

1200

aaatggagag agcgcattcg cactgatggg tcttcttggc gcaagcatcg tccctcacaa

1260

tttttatatc cattcttatt ttgctgggga aagtacatct tcgtctgatg tcgacaagag

1320

cagcttgtgt caagaccatt tgttcgccat ctttggtgtc ttcagcggac tgtcacttgt

1380

aaattatgta ttgatgaatg cagcagctaa tgtgtttcac agtactggcc ttgtggtact

1440

gacttttcac gatgccttgt cactaatgga gcaggtattt atgagtccgc tcattccagt

1500

ggtctttttg atgctcttgt tcttctctag tcaaattacc gcactagctt gggctttcgg

1560

tggagaggtc gtcctgcatg acttcctgaa gatagaaata cccgcttggc ttcatcgtgc

1620

tacaatcaga attcttgcag ttgctcctgc gctttattgt gtatggacat ctggtgcaga

1680

cggaatatac cagttactta tattcaccca ggtcttggtg gcaatgatgc ttccttgctc

1740

ggtaataccg cttttccgca ttgcttcgtc gagacaaatc atgggtgtcc ataaaatccc

1800

tcaggttggc gagttcctcg cacttacaac gtttttggga tttctggggt tgaatgttgt

1860

ttttgttgtt gagatggtat ttgggagcag tgactgggct ggtggtttga gatggaatac

1920

cgtgatgggc acctcgattc agtacaccac tctgcttgta tcgtcatgtg catccttatg

1980

cctgatactc tggctggcag ccacgccgct gaaatctgcg agtaacagag cggaagctca

2040

aatatggaac atggatgctc aaaatgcttt atcttatcca tctgttcaag aagaggaaat

2100

tgaaagaaca gaaacaagga ggaacgaaga cgaatcaata gtgcggttgg aaagcagggt

2160

aaaggatcag ttggatacta cgtctgttac tagctcggtc tatgatttgc cagagaacat

2220

tctaatgacg gatcaagaaa tccgttcgag ccctccagag gaaagagagt tggatgtaaa

2280

gtactctacc tctcaagtta gtagtcttaa ggaagactct gatgtaaagg aacagtctgt

2340

attgcagtca acagtggtta atgaggtcag tgataaggat ctgattgttg aaacaaagat

2400

ggcgaaaatt gaaccaatga gtcctgtgga gaagattgtt agcatggaga ataacagcaa

2460

gtttattgaa aaggatgttg aaggggtttc atgggaaaca gaagaagcta ccaaagctgc

2520

tcctacaagc aactttactg tcggatctga tggtcctcct tcattccgca gcttaagtgg

2580

ggaaggggga agtgggactg gaagcctttc acggttgcaa ggtttgggac gtgctgcccg

2640

gagacactta tctgcgatcc ttgatgaatt ttggggacat ttatatgatt ttcatgggca

2700

attggttgct gaagccaggg caaagaaact agatcagctg tttggcactg atcaaaagtc

2760

agcctcttct atgaaagcag attcgtttgg aaaagacatt agcagtggat attgcatgtc

2820

accaactgcg aagggaatgg attcacagat gacttcaagt ttatatgatt cactgaagca

2880

gcagaggaca ccgggaagta tcgattcgtt gtatggatta caaagaggtt cgtcaccgtc

2940

accgttggtc aaccgtatgc agatgttggg tgcatatggt aacaccacta ataataataa

3000

tgcttacgaa ttgagtgaga gaagatactc tagcctgcgt gctccatcat cttcagaggg

3060

ttgggaacac caacaaccag ctacagttca cggataccag atgaagtcat atgtagacaa

3120

tttggcaaaa gaaaggcttg aagccttaca atcccgtgga gagatcccga catcgagatc

3180

tatggcgctt ggtacattga gctatacaca gcaacttgct ttagccttga aacagaagtc

3240

ccagaatggt ctaacccctg gaccagctcc tgggtttgag aattttgctg ggtctagaag

3300

catatcgcga caatctgaaa gatcttatta cggtgttcca tcttctggca atactgatac

3360

tgttggcgca gcagtagcca atgagaaaaa atatagtagc atgccagata tctcaggatt

3420

gtctatgtcc gcaaggaaca tgcatttacc aaacaacaag agtggatact gggatccgtc

3480

aagtggagga ggagggtatg gtgcgtctta tggtcggtta agcaatgaat catcgttata

3540

ttctaatttg gggtcacggg tgggagtacc ctcgacttat gatgacattt ctcaatcaag

3600

aggaggctac agagatgcct acagtttgcc acagagtgca acaacaggga ccggatcgct

3660

ttggtccaga cagccctttg agcagtttgg tgtagcggag aggaatggtg ctgttggtga

3720

ggagctcagg aatagatcga atccgatcaa tatagacaac aacgcttctt ctaatgttga

3780

tgcagaggct aagcttcttc agtcgttcag gcactgtatt ctaaagctta ttaaacttga

3840

aggatccgag tggttgtttg gacaaagcga tggagttgat gaagaactga ttgaccgggt

3900

agctgcacga gagaagttta tctatgaagc tgaagctcga gaaataaacc aggtgggtca

3960

catgggggag ccactaattt catcggttcc taactgtgga gatggttgcg tttggagagc

4020

tgatttgatt gtgagctttg gagtttggtg cattcaccgt gtccttgact tgtctctcat

4080

ggagagtcgg cctgagcttt ggggaaagta cacttacgtt ctcaaccgcc tacagggagt

4140

gattgatccg gcgttctcaa agctgcggac accaatgaca ccgtgctttt gccttcagat

4200

tccagcgagc caccagagag cgagtccgac ttcagctaac ggaatgttac ctccggctgc

4260

aaaaccggct aaaggcaaat gcacaaccgc agtcacactt cttgatctaa tcaaagacgt

4320

tgaaatggca atctcttgta gaaaaggccg aaccggtaca gctgcaggtg atgtggcttt

4380

cccaaagggg aaagagaatt tggcttcggt tttgaagcgg tataaacgtc ggttatcgaa

4440

taaaccagta ggtatgaatc aggatggacc cggttcaaga aaaaacgtga ctgcgtacgg

4500

atcattgggt tgaagaagaa gaacattgtg agaaatctca tgatcaaagt gacgtcgaga

4560

gggaagccga agaatcaaaa ctctcgcttt tgattgctcc tctgcttcgt taattgtgta

4620

ttaagaaaag aagaaaaaaa atggattttt gttgcttcag aatttttcgc tctttttttc

4680

ttaatttggt tgtaatgtta tgtttatata catatatcat catcatagga ccatagctac

4740

aaaccgaatc cggtttgtgt aattctatgc ggaatcataa agaaatcgtc ggtttgaaat

4800

gttaaatctc ctaaaccgga tctctgcacg tagctgacac atcgacgcta g

4851

<210> 20

<211> 1703

<212> ДНК

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 20

gttgcaaata tataaatcaa tcaaaagatt taaaacccac cattcaatct tggtaagtaa

60

cgaaaaaaaa gggaagcaag aagaaccaca gaaaaggggg ctaacaacta gacacgtaga

120

tcttcatctg cccgtccatc taacctacca cactctcatc ttctttttcc cgtgtcagtt

180

tgttatataa gctctcactc tccggtatat ttccaaatac acctaacttg tttagtacac

240

aacagcaaca tcaaactcta ataaacccaa gttggtgtat actataatgg tgatggctgg

300

tgcttcttct ttggatgaga tcagacaggc tcagagagct gatggacctg caggcatctt

360

ggctattggc actgctaacc ctgagaacca tgtgcttcag gcggagtatc ctgactacta

420

cttccgcatc accaacagtg aacacatgac cgacctcaag gagaagttca agcgcatgtg

480

cgacaagtcg acaattcgga aacgtcacat gcatctgacg gaggaattcc tcaaggaaaa

540

cccacacatg tgtgcttaca tggctccttc tctggacacc agacaggaca tcgtggtggt

600

cgaagtccct aagctaggca aagaagcggc agtgaaggcc atcaaggagt ggggccagcc

660

caagtcaaag atcactcatg tcgtcttctg cactacctcc ggcgtcgaca tgcctggtgc

720

tgactaccag ctcaccaagc ttcttggtct ccgtccttcc gtcaagcgtc tcatgatgta

780

ccagcaaggt tgcttcgccg gcggtactgt cctccgtatc gctaaggatc tcgccgagaa

840

caatcgtgga gcacgtgtcc tcgttgtctg ctctgagatc acagccgtta ccttccgtgg

900

tccctctgac acccaccttg actccctcgt cggtcaggct cttttcagtg atggcgccgc

960

cgcactcatt gtggggtcgg accctgacac atctgtcgga gagaaaccca tctttgagat

1020

ggtgtctgcc gctcagacca tccttccaga ctctgatggt gccatagacg gacatttgag

1080

ggaagttggt ctcaccttcc atctcctcaa ggatgttccc ggcctcatct ccaagaacat

1140

tgtgaagagt ctagacgaag cgtttaaacc tttggggata agtgactgga actccctctt

1200

ctggatagcc caccctggag gtccagcgat cctagaccag gtggagataa agctaggact

1260

aaaggaagag aagatgaggg cgacacgtca cgtgttgagc gagtatggaa acatgtcgag

1320

cgcgtgcgtt ctcttcatac tagacgagat gaggaggaag tcagctaagg atggtgtggc

1380

cacgacagga gaagggttgg agtggggtgt cttgtttggt ttcggaccag gtctcactgt

1440

tgagacagtc gtcttgcaca gcgttcctct ctaaacagaa cgcttgcctt ctatctgcct

1500

acctacctac gcaaaacttt aatcctgtct tatgttttat ataatataat cattatatgt

1560

ttacgcaata attaaggaag aattcatttg atgtgatatg tgatatgtgc tggacaggtc

1620

tattcgactg tttttgtact ctcttttttg tgtcttttta caatattaaa tctatgggtc

1680

ttgaatgaca tcaaatcttt gtt

1703

<210> 21

<211> 229

<212> ДНК

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 21

cctcgaggat cctctagacc tcagctaggg tttatccaga gaatggttcc tgctctactt

60

cctgtccttt tggtttctgt cggatatatt gatcccggga aatgggttgc aaatatcgaa

120

ggaggtgctc gtttcgggta tgacttggtg gcaattactc tgcttttcaa ttttgccgcc

180

atcttatgcc aatatgttgc agctcgcata agcgttaagc ttggtaccc

229

<210> 22

<211> 218

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент, включающий смысловую последовательность 200 нт EIN2

<400> 22

cctcgagtct agattttagt tagggtttat ttagagaatg gtttttgttt tattttttgt

60

ttttttggtt tttgttggat atattgattt tgggaaatgg gttgtaaata ttgaaggagg

120

tgtttgtttt gggtatgatt tggtggtaat tattttgttt tttaattttg ttgttatttt

180

atgttaatat gttgtagttt gtataagtgt tggtaccc

218

<210> 23

<211> 230

<212> ДНК

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 23

cctcgaggat ccgttgtctg ctctgagatc acagccgtta ccttccgtgg tccctctgac

60

acccaccttg actccctcgt cggtcaggct cttttcagtg atggcgccgc cgcactcatt

120

gtggggtcgg accctgacac atctgtcgga gagaaaccca tctttgagat ggtgtctgcc

180

gctcagacca tccttccaga ctctgatggt gctctagaag cttggtaccc

230

<210> 24

<211> 219

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент, включающий смысловую последовательность 200 нт CHS

<400> 24

cctcgaggtt gtttgttttg agattatagt tgttattttt tgtggttttt ttgatattta

60

ttttgatttt tttgttggtt aggttttttt tagtgatggt gttgttgtat ttattgtggg

120

gttggatttt gatatatttg ttggagagaa atttattttt gagatggtgt ttgttgttta

180

gattattttt ttagattttg atggtgtcta gaggtaccc

219

<210> 25

<211> 219

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент, включающий антисмысловую последовательность 200 нт

EIN2

<400> 25

caagcttaat gtttatgtga gttgtaatat attggtataa gatggtggta aaattgaaaa

60

gtagagtaat tgttattaag ttatatttga aatgagtatt ttttttgata tttgtaattt

120

attttttggg attaatatat ttgatagaaa ttaaaaggat aggaagtaga gtaggaatta

180

ttttttggat aaattttagt tgaggttcta gaggatccc

219

<210> 26

<211> 219

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> фрагмент, включающий антисмысловую последовательность 200 нт

CHS

<400> 26

caagcttcta gagtattatt agagtttgga aggatggttt gagtggtaga tattatttta

60

aagatgggtt tttttttgat agatgtgtta gggtttgatt ttataatgag tgtggtggtg

120

ttattattga aaagagtttg attgatgagg gagttaaggt gggtgttaga gggattatgg

180

aaggtaatgg ttgtgatttt agagtagata atggatccc

219

<210> 27

<211> 300

<212> ДНК

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 27

agtaattata ttatcagata gatttaggat ggaagctgaa attgtgaatg tgagacctca

60

gctagggttt atccagagaa tggttcctgc tctacttcct gtccttttgg tttctgtcgg

120

atatattgat cccgggaaat gggttgcaaa tatcgaagga ggtgctcgtt tcgggtatga

180

cttggtggca attactctgc ttttcaattt tgccgccatc ttatgccaat atgttgcagc

240

tcgcataagc gttgtgactg gtaaacactt ggctcagatc tgcaatgaag aatatgacaa

300

<210> 28

<211> 300

<212> ДНК

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 28

tccgtatcgc taaggatctc gccgagaaca atcgtggagc acgtgtcctc gttgtctgct

60

ctgagatcac agccgttacc ttccgtggtc cctctgacac ccaccttgac tccctcgtcg

120

gtcaggctct tttcagtgat ggcgccgccg cactcattgt ggggtcggac cctgacacat

180

ctgtcggaga gaaacccatc tttgagatgg tgtctgccgc tcagaccatc cttccagact

240

ctgatggtgc catagacgga catttgaggg aagttggtct caccttccat ctcctcaagg

300

<210> 29

<211> 240

<212> ДНК

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 29

tcttcattgc agatctgagc caagtgttta ccagtcacaa cgcttatgcg agctgcaaca

60

tattggcata agatggcggc aaaattgaaa agcagagtaa ttgccaccaa gtcatacccg

120

aaacgagcac ctccttcgat atttgcaacc catttcccgg gatcaatata tccgacagaa

180

accaaaagga caggaagtag agcaggaacc attctctgga taaaccctag ctgaggtctc

240

<210> 30

<211> 300

<212> ДНК

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 30

gatggaaggt gagaccaact tccctcaaat gtccgtctat ggcaccatca gagtctggaa

60

ggatggtctg agcggcagac accatctcaa agatgggttt ctctccgaca gatgtgtcag

120

ggtccgaccc cacaatgagt gcggcggcgc catcactgaa aagagcctga ccgacgaggg

180

agtcaaggtg ggtgtcagag ggaccacgga aggtaacggc tgtgatctca gagcagacaa

240

cgaggacacg tgctccacga ttgttctcgg cgagatcctt agcgatacgg aggacagtac

300

<210> 31

<211> 4035

<212> ДНК

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 31

atgggatcta gggttccaat agaaaccatc gaagaagacg gcgaattcga ttgggaagca

60

gcagtcaaag aaatcgactt ggcttgtctt aaaaccacaa acgcttcttc ttcttcgtca

120

tcccatttca ctcctttggc taatccacca attacggcaa atctcactaa gccacctgcg

180

aagagacaat ctactctcga taaattcatc ggcagaaccg aacataaacc ggagaatcat

240

caagttgttt ccgagtgtgg tgttaacgat aacgataata gtcctttagt tgggattgat

300

cctgaggcag ctaaaacttg gatttatcca gtgaatggga gtgttccttt aagagattat

360

cagtttgcta taacgaagac tgctttgttt tcgaatacat tggtggcttt gcctacggga

420

cttggtaaaa cgcttatagc tgcggttgtt atgtataatt acttcagatg gtttccacaa

480

ggtaaaatag tatttgcggc gccttctagg cctcttgtga tgcagcagat tgaggcgtgt

540

cataatattg ttggaatacc acaagaatgg acgattgact tgacgggtca gacatgtcct

600

tcgaaaagag cttttttgtg gaaaagcaaa cgggttttct ttgtcactcc acaagtgtta

660

gagaaggata tacagtcagg aacatgtctt actaactact tggtttgctt ggtgatcgac

720

gaggcacatc gagctttagg gaattattct tattgtgttg tagttcgtga gttgatggcg

780

gtaccgatac agctgagaat actggctctt actgcaactc ctggatcaaa gacacaggcc

840

atccagggta tcattgataa tttgcagata tccacacttg aatatcgaaa tgagagtgac

900

catgatgttt gcccttatgt ccacgacaga aaattagaag tcatcgaggt tcccttgggt

960

caagatgcag atgatgtatc gaaacgcctg tttcatgtta tacgtccata tgcagtcagg

1020

cttaaaaact ttggggttaa tctaaataga gatatacaaa ctttaagtcc acacgaagta

1080

cttatggcaa gggataagtt tcgtcaagca cctctaccag gccttcccca tgtaaatcac

1140

ggagatgtag aatcttgctt tgcagctctt atcactcttt atcatattcg taagctcctt

1200

tctagtcatg gaataagacc agcgtatgag atgctagaag agaaattgaa agaagggcca

1260

tttgctaggt tgatgagtaa gaatgaagat attaggatga cgaagctttt gatgcagcaa

1320

aggttgtcac atggagcacc aagcccaaaa ttgtcgaaga tgttagaaat actggttgat

1380

catttcaaag tgaaagatcc gaagacatca cgggtcatta ttttctcaaa tttcagagga

1440

agcgtaagag acataatgaa cgcattaagt aatattggag atatggtcaa agcaactgag

1500

tttattggtc aaagttcagg taagacattg aaaggccagt cgcaaaaaat tcagcaggct

1560

gttttggaga aatttagagc tggggggttc aatgttattg tcgcaacatc tattggtgaa

1620

gaaggcttgg atatcatgga agttgaccta gttatatgtt ttgatgctaa tgtatctcct

1680

ctgaggatga ttcaacggat gggaagaact ggaaggaaaa ataatggtcg agttgtagtt

1740

cttgcttgtg aaggatcaga aaagaacagc tatatgcgaa agcaagcaag tggacgggct

1800

attaaaaaac acatgcggaa tggaggaaca aatagtttta attttcatcc tagtccaagg

1860

atgattcccc atgtttataa gccagaagtt cagcatgttg agttttcaat caagcaattc

1920

gttccacgtg gaaagaaact acaagaggag tatgccactg agactccagc tttccagaaa

1980

aagcttacac ctgcagagac gcatatgctc gctaagtatt acaacaaccc cgatgaggaa

2040

aagttgagag tgtccttaat tgcgttccct cacttccaga cattgccatc caaggtgcac

2100

aaagtaatgc attcacgtca aacaggcatg ttaattgacg ctatgcagca cttgcaagag

2160

ccaacttttt cagaacagag taaaagcttc ttcactgagt ttcgagctcc tttgggtgaa

2220

agagaagagc ttgatacagg tctgagggtt actaatgatc caaaagatct acactctgtc

2280

cgtgatttgg aagtcaacac atcacagaga aaggcaaaac aagttgaatc tcccacaagc

2340

accttagaga caacagagaa ggattacgaa gaatcttcac ccacacaccg ttatcttttc

2400

agttcagaat gtgcatccgt tgatactctg gggaacgtct tcgtaatgcc agttcctctt

2460

ttattctttc ctaatgttct ggagtcagac aatacgcctc tgcctaaaac agaaaaacaa

2520

cattcttgcc ggaatacatc tcacattgac ttagttccag tagatacttc ggaaaaacat

2580

cggcaagata atatctcatg caagttaaag gaaagattct cgccagacgg tgccagcgag

2640

acactagaga ctcatagcct tgtgaaaagg aactccacca gagtaggtga agatgatgta

2700

gcgaattctg ttggagaaat tgtgttatca tcggatgaag atgactgtga gggattggag

2760

cttagtccac ggctcactaa cttcatcaag agcggcattg ttccagagtc acctgtctat

2820

gaccaagggg aagcgaacag agaagaagat cttgaatttc ctcagctttc ttcacccatg

2880

aggttcagta acgaattggc aggagagtct tctttccctg agagaaaggt tcagcataag

2940

tgcaacgatt ataacattgt gtctacaacc actgaattga gaactcctca gaaggaggta

3000

ggtttggcca acggaacaga atgcttggct gtttctccta ttcctgagga ttggagaact

3060

cccttggcga atctgacaaa cacaaacagc agcgctcgca aagattggcg ggtgagttct

3120

ggagaaaagt tagaaactct tcgacagcct cgcaagttga agagactacg tagacttgga

3180

gattgctcga gtgctgtaaa ggagaattat cctggtatta cagaggcaga ccatatcaga

3240

tctcgttctc gcggtaaaaa gcacattaga ggtaagaaga agatgatcat ggatgatgat

3300

gtccaagtct tcattgacga ggaagctgag gtctcttcgg gagcagagat gtcggctgat

3360

gagaacgaag atgtgactgg cgattcattt gaagatagtt tcatagatga cggaacaatg

3420

cctacagcaa atactcaagc cgagtctggt aaagttgaca tgatggctgt ttacaggcgt

3480

tctcttctca gccagtcacc attaccggcg agatttcgtg atttagccgc atcaagtctg

3540

agtccttatt ctgctggacc cttgacgaga ataaatgaga gcagaagcga ctcagataaa

3600

tcattgtctt ctcttcgaac accaaaaaca acaaactctg agtcaaacca agatgcaatg

3660

atgataggaa acctttcggt agtacaaatc tcgtcagata gccggaaaag gaaatttagc

3720

ttatgcaact cggcgaatgc ccccgtgatt aacttagaaa gcaagtttgc agctcatgca

3780

caagccacgg agaaggaaag ccatgaaggc gtgagaagca atgcaggtgc gttagagtac

3840

aatgatgatg atgatgatgc attctttgcg acactagact ttgatgcaat ggaagcacaa

3900

gccacattgt tattgtcgaa acagagatcc gaagcaaaag agaaagaaga cgcaacggtt

3960

atacctaatc caggcatgca gagaagtgat ggtatggaga aagatgcacc atcttttgat

4020

cttggtctgt ggtga

4035

<210> 32

<211> 2310

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 32

atgtcaaatg aaaataaaaa tataaaaact aaatttcatc ctagttcaag gatgattccc

60

catgtttata agccagaagt tcagcatgtt aagttttcga tcgagcaatt cattccacgt

120

ggaaagaagc tacaagatga gcctgccact gagactccag ctttcaagaa aaagcttaca

180

ccggaagaga tggatatgct cgccaagtat ttcaaaccca acgaggaaaa gtggagagtt

240

tccttgattg ctttccctca cttccaaaca ttgccatcca aagtgcacaa agtaatgcat

300

tcacgccaaa caagcatatt aattgatgct atgcagcatc tgcaagagac aactttgaca

360

gagcaaagta aaagtttctt cattaagtat ggagctcctt tggctgaaag agatgagctt

420

gacgcaggtc tgagggttgg tgatgatccg aaagatttac cctcttccga tgatttggat

480

gtcaacacat cacagagaaa ggcaaaacaa attttagaat ctcccacaag cacattagag

540

actacagaga aggatttcga agcatcttca cccacacact gttatctttt cagttcagaa

600

tgtgcgtccg ttgatactct ggggaaggtc tttgtattgc cggttcctct ctcattctct

660

tctaatgtac cagggtcaga ctgcgtggga agagaaaaag aactttcttc cccgaataag

720

tcccacactg acgttgttcc gatagatagt tcctcaaaac atcggcaaga taatatttca

780

tgcaagttaa agcaaggatt cttgccagat tgtgccaacg agactttgga gtcccaaagc

840

cttttgaaaa ggcactccac cgatgtaggt aaaggagata tagagaattg tgctggagaa

900

attatgatat catcggatga agaagacgac tgtgaggatt tggagcttag tccaaggctc

960

actaacttca tcaagagtgg cgttgttcca gattcacctg tctatgacca agttgcatac

1020

gaagcaaaca gagaagaaga ccttgatctt ccacacacga gtttaactaa tgaattggca

1080

gaagagccat cgacacctga gaaaaaggtt cacattgctt ctacggccaa tgaattcaga

1140

actcctcaga aggaagaaga tttagccaac gaaacagaaa gcttcgctgt ttctccaatg

1200

cctgaggagt ggagaactcc cttggcgaat atcaccaacg caagcagcag cgctagcaaa

1260

gattggcgcg tgagttcggg agaaaagtca gaaactcttc gacagcctcg caagttgaag

1320

agacttcgta gacttggaga ttgctcgagt gctgtgaagg agaataatcc tggtattgca

1380

aagacagacc atatcagatc tcgttctcgc agtgtaaaga acataagagg taaaatgatt

1440

ctgtatttcc ttttgctctg tgttcaaggc aagaagaaga tacgcgcgga taataatgct

1500

agaatcttca ttgaagcgga agctgaggtg tcttcggaat cagaaatgtc ggttgatgag

1560

aacgtagatt tgaccagcga ttcatttgaa gatagcttca tagatgacgg tacaatgcct

1620

acagcaaata ctcaagccga gtgtgctaaa gttgacatga tggccgttta caggtatata

1680

tcgaatcaaa acaagtcttt cttctactat gatttactaa gaatcataag ctatggtttc

1740

cacagacgtt ctctactcag ccaatcacca ttaccggcaa gatttcgtga tgtagctgca

1800

tcaagtccga gtccttattc ttctggtctc ttgaagacaa taaatgagag cagaagcgac

1860

tcagataaat cattgtcttc tcttagaacc ccacaaacaa cgaacaacga gtcaaacaag

1920

gatgcaatgg ccacaggaga cctttcggta gcacaaatct caacagacag ccggaaaagg

1980

aaattcagct tatgcaactc agcgaatgtc ccagtgatta acttggaaaa caagtttgaa

2040

gctcatgcac aagccacgga gaaggaaagc catgaaggtc cgagaagcaa tgcaggtgca

2100

tcacagtaca aggatgagga tgaagatgat gatgcattct acgcgacact ggactttgat

2160

gccatggaag cgcatgcgac attgctattg tcgaaacaaa ggtcagaaac gaaaacaaaa

2220

gaagatgcat cggtgaaacc tcatttgggc aatcagagga atgatggttt gccgaaggat

2280

gggccatctt ttgatcttgg tttgtggtga

2310

<210> 33

<211> 1822

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hpFANCM-At[wt]

<400> 33

ggctcgagaa ccgaattcta atacgactca ctatagggtc aggaacatgt cttactaact

60

acttggtttg cttggtgatc gacgaggcac atcgagcttt agggaattat tcttattgtg

120

ttgtagttcg tgagttgatg gcggtaccga tacagctgag aatactggct cttactgcaa

180

ctcctggatc aaagacacag gccatccagg gtatcattga taatttgcag atatccacac

240

ttgaatatcg aaatgagagt gaccatgatg tttgccctta tgtccccgac agaaaattag

300

aagtcatcga ggttcccttg ggtcaagatg cagatgatgt atcgaaacgc ctgtttcatg

360

ttatacgtcc atatgcagtc aggcttaaaa actttggggt taatctaaat agagatatac

420

aaactttaag tccacacgaa gtacttatgg caagggataa gtttcgtcaa gcacctctac

480

caggccttcc ccatgtaaat cacggagatg tagaatcttg ctttgcagct cttatcaggt

540

aaggaaataa ttattttctt ttttcctttt agtataaaat agttaagtga tgttaattag

600

tatgattata ataatatagt tgttataatt gtgaaaaaat aatttataaa tatattgttt

660

acataaacaa catagtaatg taaaaaaata tgacaagtga tgtgtaagac gaagaagata

720

aaagttgaga gtaagtatat tatttttaat gaatttgatc gaacatgtaa gatgatatac

780

tagcattaat atttgtttta atcataatag taattctagc tggtttgatg aattaaatat

840

caatgataaa atactatagt aaaaataaga ataaataaat taaaataata tttttttatg

900

attaatagtt tattatataa ttaaatatct ataccattac taaatatttt agtttaaaag

960

ttaataaata ttttgttaga aattccaatc tgcttgtaat ttatcaataa acaaaatatt

1020

aaataacaag ctaaagtaac aaataatatc aaactaatag aaacagtaat ctaatgtaac

1080

aaaacataat ctaatgctaa tataacaaag cgcaagatct atcattttat atagtattat

1140

tttcaatcaa cattcttatt aatttctaaa taatacttgt agttttatta acttctaaat

1200

ggattgacta ttaattaaat gaattagtcg aacatgaata aacaaggtaa catgatagat

1260

catgtcattg tgttatcatt gatcttacat ttggattgat tacagttgat aagagctgca

1320

aagcaagatt ctacatctcc gtgatttaca tggggaaggc ctggtagagg tgcttgacga

1380

aacttatccc ttgccataag tacttcgtgt ggacttaaag tttgtatatc tctatttaga

1440

ttaaccccaa agtttttaag cctgactgca tatggacgta taacatgaaa caggcgtttc

1500

gatacatcat ctgcatcttg acccaaggga acctcgatga cttctaattt tctgtcgggg

1560

acataagggc aaacatcatg gtcactctca tttcgatatt caagtgtgga tatctgcaaa

1620

ttatcaatga taccctggat ggcctgtgtc tttgatccag gagttgcagt aagagccagt

1680

attctcagct gtatcggtac cgccatcaac tcacgaacta caacacaata agaataattc

1740

cctaaagctc gatgtgcctc gtcgatcacc aagcaaacca agtagttagt aagacatgtt

1800

cctgaccccg ggatccaagc tt

1822

<210> 34

<211> 1822

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hpFANCM-At[G:U]

<400> 34

ggctcgagaa ccgaattcta atacgactca ctatagggtt aggaatatgt tttattaatt

60

atttggtttg tttggtgatt gatgaggtat attgagtttt agggaattat ttttattgtg

120

ttgtagtttg tgagttgatg gtggtattga tatagttgag aatattggtt tttattgtaa

180

tttttggatt aaagatatag gttatttagg gtattattga taatttgtag atatttatat

240

ttgaatattg aaatgagagt gattatgatg tttgttttta tgtttttgat agaaaattag

300

aagttattga ggtttttttg ggttaagatg tagatgatgt attgaaatgt ttgttttatg

360

ttatatgttt atatgtagtt aggtttaaaa attttggggt taatttaaat agagatatat

420

aaattttaag tttatatgaa gtatttatgg taagggataa gttttgttaa gtatttttat

480

taggtttttt ttatgtaaat tatggagatg tagaattttg ttttgtagtt tttattaggt

540

aaggaaataa ttattttctt ttttcctttt agtataaaat agttaagtga tgttaattag

600

tatgattata ataatatagt tgttataatt gtgaaaaaat aatttataaa tatattgttt

660

acataaacaa catagtaatg taaaaaaata tgacaagtga tgtgtaagac gaagaagata

720

aaagttgaga gtaagtatat tatttttaat gaatttgatc gaacatgtaa gatgatatac

780

tagcattaat atttgtttta atcataatag taattctagc tggtttgatg aattaaatat

840

caatgataaa atactatagt aaaaataaga ataaataaat taaaataata tttttttatg

900

attaatagtt tattatataa ttaaatatct ataccattac taaatatttt agtttaaaag

960

ttaataaata ttttgttaga aattccaatc tgcttgtaat ttatcaataa acaaaatatt

1020

aaataacaag ctaaagtaac aaataatatc aaactaatag aaacagtaat ctaatgtaac

1080

aaaacataat ctaatgctaa tataacaaag cgcaagatct atcattttat atagtattat

1140

tttcaatcaa cattcttatt aatttctaaa taatacttgt agttttatta acttctaaat

1200

ggattgacta ttaattaaat gaattagtcg aacatgaata aacaaggtaa catgatagat

1260

catgtcattg tgttatcatt gatcttacat ttggattgat tacagttgat aagagctgca

1320

aagcaagatt ctacatctcc gtgatttaca tggggaaggc ctggtagagg tgcttgacga

1380

aacttatccc ttgccataag tacttcgtgt ggacttaaag tttgtatatc tctatttaga

1440

ttaaccccaa agtttttaag cctgactgca tatggacgta taacatgaaa caggcgtttc

1500

gatacatcat ctgcatcttg acccaaggga acctcgatga cttctaattt tctgtcgggg

1560

acataagggc aaacatcatg gtcactctca tttcgatatt caagtgtgga tatctgcaaa

1620

ttatcaatga taccctggat ggcctgtgtc tttgatccag gagttgcagt aagagccagt

1680

attctcagct gtatcggtac cgccatcaac tcacgaacta caacacaata agaataattc

1740

cctaaagctc gatgtgcctc gtcgatcacc aagcaaacca agtagttagt aagacatgtt

1800

cctgaccccg ggatccaagc tt

1822

<210> 35

<211> 1818

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hpFANCM-Bn[wt]

<400> 35

ggatccttgg tacctaatac gactcactat agggagaaat tatgatatca tcggatgaag

60

aagacgactg tgaggatttg gagcttagtc caaggctcac taacttcatc aagagtggcg

120

ttgttccaga ttcacctgtc tatgaccaag ttgcatacga agcaaacaga gaagaagacc

180

ttgatcttcc acacacgagt ttaactaatg aattggcaga agagccatcg acacctgaga

240

aaaaggttca cattgcttct acggccaatg aattcagaac cccaacgaag gaagaagatt

300

tagccaacga aacagaaagc ttcgctgttt ctccaatgcc tgaggagtgg agaactccct

360

tggcgaatat caccaacgca agcagcagcg ctagcaaaga ttggcgcgtg agttcgggag

420

aaaagtcaga aactcttcga cagcctcgca agttgaagag acttcgtaga cttggagatt

480

gctcgagtgc tgtgaaggag aataatcctg gtattgcaaa gacagaccat atcgtaagga

540

aataattatt ttcttttttc cttttagtat aaaatagtta agtgatgtta attagtatga

600

ttataataat atagttgtta taattgtgaa aaaataattt ataaatatat tgtttacata

660

aacaacatag taatgtaaaa aaatatgaca agtgatgtgt aagacgaaga agataaaagt

720

tgagagtaag tatattattt ttaatgaatt tgatcgaaca tgtaagatga tatactagca

780

ttaatatttg ttttaatcat aatagtaatt ctagctggtt tgatgaatta aatatcaatg

840

ataaaatact atagtaaaaa taagaataaa taaattaaaa taatattttt ttatgattaa

900

tagtttatta tataattaaa tatctatacc attactaaat attttagttt aaaagttaat

960

aaatattttg ttagaaattc caatctgctt gtaatttatc aataaacaaa atattaaata

1020

acaagctaaa gtaacaaata atatcaaact aatagaaaca gtaatctaat gtaacaaaac

1080

ataatctaat gctaatataa caaagcgcaa gatctatcat tttatatagt attattttca

1140

atcaacattc ttattaattt ctaaataata cttgtagttt tattaacttc taaatggatt

1200

gactattaat taaatgaatt agtcgaacat gaataaacaa ggtaacatga tagatcatgt

1260

cattgtgtta tcattgatct tacatttgga ttgattacag gatatggtct gtctttgcaa

1320

taccaggatt attctccttc acagcactcg agcaatctcc aagtctacga agtctcttca

1380

acttgcgagg ctgtcgaaga gtttctgact tttctcccga actcacgcgc caatctttgc

1440

tagcgctgct gcttgcgttg gtgatattcg ccaagggagt tctccactcc tcaggcattg

1500

gagaaacagc gaagctttct gtttcgttgg ctaaatcttc ttccttcgtt ggggttctga

1560

attcattggc cgtagaagca atgtgaacct ttttctcagg tgtcgatggc tcttctgcca

1620

attcattagt taaactcgtg tgtggaagat caaggtcttc ttctctgttt gcttcgtatg

1680

caacttggtc atagacaggt gaatctggaa caacgccact cttgatgaag ttagtgagcc

1740

ttggactaag ctccaaatcc tcacagtcgt cttcttcatc cgatgatatc ataatttctc

1800

tctagaaagg atcccggg

1818

<210> 36

<211> 1818

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hpFANCM-Bn[G:U]

<400> 36

ggatccttgg tacctaatac gactcactat agggagaaat tatgatatta ttggatgaag

60

aagatgattg tgtggatttg gagtttagtt taaggtttat taattttatt aagagtggtg

120

ttgttttaga tttatttgtt tatgattaag ttgtatatga agtaaatagt gaagaagatt

180

ttgatttttt atatatgagt ttaattaatg aattggtaga agagttattg atatttgaga

240

aaaaggttta tattgttttt atggttaatg aatttagaat tttaatgaag gaagaagatt

300

tagttaatga aatagaaagt tttgttgttt ttttaatgtt tgaggagtgg agaatttttt

360

tggtgaatat tattaatgta agtagtagtg ttagtaaaga ttggtgtgtg agtttgggag

420

aaaagttaga aattttttga tagttttgta agttgaagag attttgtaga tttggagatt

480

gtttgagtgt tgtgaaggag aataattttg gtattgtaaa gatagattat attgtaagga

540

aataattatt ttcttttttc cttttagtat aaaatagtta agtgatgtta attagtatga

600

ttataataat atagttgtta taattgtgaa aaaataattt ataaatatat tgtttacata

660

aacaacatag taatgtaaaa aaatatgaca agtgatgtgt aagacgaaga agataaaagt

720

tgagagtaag tatattattt ttaatgaatt tgatcgaaca tgtaagatga tatactagca

780

ttaatatttg ttttaatcat aatagtaatt ctagctggtt tgatgaatta aatatcaatg

840

ataaaatact atagtaaaaa taagaataaa taaattaaaa taatattttt ttatgattaa

900

tagtttatta tataattaaa tatctatacc attactaaat attttagttt aaaagttaat

960

aaatattttg ttagaaattc caatctgctt gtaatttatc aataaacaaa atattaaata

1020

acaagctaaa gtaacaaata atatcaaact aatagaaaca gtaatctaat gtaacaaaac

1080

ataatctaat gctaatataa caaagcgcaa gatctatcat tttatatagt attattttca

1140

atcaacattc ttattaattt ctaaataata cttgtagttt tattaacttc taaatggatt

1200

gactattaat taaatgaatt agtcgaacat gaataaacaa ggtaacatga tagatcatgt

1260

cattgtgtta tcattgatct tacatttgga ttgattacag gatatggtct gtctttgcaa

1320

taccaggatt attctccttc acagcactcg agcaatctcc aagtctacga agtctcttca

1380

acttgcgagg ctgtcgaaga gtttctgact tttctcccga actcacgcgc caatctttgc

1440

tagcgctgct gcttgcgttg gtgatattcg ccaagggagt tctccactcc tcaggcattg

1500

gagaaacagc gaagctttct gtttcgttgg ctaaatcttc ttccttcgtt ggggttctga

1560

attcattggc cgtagaagca atgtgaacct ttttctcagg tgtcgatggc tcttctgcca

1620

attcattagt taaactcgtg tgtggaagat caaggtcttc ttctctgttt gcttcgtatg

1680

caacttggtc atagacaggt gaatctggaa caacgccact cttgatgaag ttagtgagcc

1740

ttggactaag ctccaaatcc tcacagtcgt cttcttcatc cgatgatatc ataatttctc

1800

tctagaaagg atcccggg

1818

<210> 37

<211> 2274

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 37

atggttagtc tgcgctccac agaaaacact ccggcttcgg aaatggccag cgacggcaaa

60

acggagaaag atggctccgg cgactcaccc acttctgttc tcagcgatga ggaaaactgt

120

gaagagaaaa ctgctactgt tgctgtagag gaagagatac ttctagccaa gaatggagat

180

tcgtctctta tctctgaggc catggctcag gaagaagagc agcttctcaa aatccgggaa

240

gatgaagaga ttgctaaacg tgctgctggc tctggtgaag ctcctgatct gaatgatact

300

cagtttacta aacttgatga gctcttgacc caaacccagc tctactctga gtttctcctt

360

gagaaaatgg aggatatcac caaaaatggg atagaaggtg agacccaaaa ggccgagcct

420

gagcctgagc ctgagcccga gaagaaaggc cgtggacgta aaagaaaggc tgctcctcag

480

ggcgacagta tgaaggctaa gaaagctgtt gctgctatga tttcaagatc caaagaaggc

540

cgtgaatctg ccgactcaga tctgacagag gaagaaagag tcatgaaaga gcagggtgaa

600

cttgttcctc ttctgactgg cggaaagtta aagtcttatc agctcaaagg tgtcaaatgg

660

ctgatatcat tgtggcaaaa tggtttgaat ggaattttag ctgatcaaat gggtcttgga

720

aagacaattc aaaccattgg tttcctatca cacctcaaag gaaatgggtt ggatggtcca

780

tatctagtca ttgccccact ctctactctt tcaaactgga tgaatgagat cgctaggttc

840

acgccttcca ttaatgcaat catttaccat ggagataaga aagaaaggga tgagctcagg

900

aagaggcaca tgcccagaac tgttggtccg aagttcccta tagtcataac ttcttatgag

960

gttgctatga atgatgctaa aaagaatctg cggcactatc catggaaata tgttgtgatt

1020

gatgagggtc acaggttgaa aaaccacaag tgtaaactgc tgagggagct aagatacttg

1080

aatatggaga acaaacttct gctgacagga acacctctgc aaaataattt gtctgagctt

1140

tggtcactgt tgaattttat tctgcctgac atctttgcat cacatgacga atttgaatca

1200

tggtttgatt tttctggaaa gaataataat gaagcaacta aggaagaagg agaagagaaa

1260

agaagagctc aagtggttgc gaaacttcat aatatactac gacctttcat cctccggaga

1320

atgaaatgtg atgttgagct ctcacttccc cggaaaaaag agattatcat ctatgctaca

1380

atgacggacc atcagaagaa gttccaggaa catcttgtga accacacctt ggaagcacac

1440

attagagatg atactgtccg aggtcatggc ttgaagggaa agcttaacaa tcttgctatt

1500

caacttcgaa agaactgcaa ccatcctgac cttcttgtgg ggcaactaga tggctcatat

1560

ctctacccac ctttggaaga cattgtggga cagtgcggta aattccgctt attggagaga

1620

ttgcttgttc ggttatttgc caaaaatcac agagtcctta tcttctccca gtggacaaaa

1680

atactggaca ttatggatta ctacttcagt gagaaggggt ttgaggtttg ccgaatcgac

1740

ggtagtgtga aactagaaga aaggagaaga cagatccaag aattcaatga tgagaagagc

1800

aactgcagga tatttcttct cagtaccaga gccggaggac tcggaattaa tcttactgct

1860

gcagatacat gcatcctcta cgatagcgat tggaaccctc aaatggactt gcaagccatg

1920

gacagatgcc acagaattgg tcagacaaaa cctgttcatg tttacaggct tgcgacggct

1980

cagtcaatag agggccgagt tctgaaacga gcatacagta agcttaagct ggaacatgtg

2040

gttattggca aggggcagtt tcatcaagaa cgtgccaagt cttcaacacc gttagaggaa

2100

gatgacatac tggcgttgct taaggacgac gaaaatgctg aagataaact gatacaaacc

2160

gacataagcg aggaggatct tgacagggtg cttgaccgta gtgatctgat gattacctta

2220

ccgggcgaga ctcaagcaca tgaagctttt ccagtgaagg gtccgggttg ggaa

2274

<210> 38

<211> 1824

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hpDDM1-Bn[wt]

<400> 38

ggatccttgg tacctaatac gactcactat agggagctgt tgctgctatg atttcaagat

60

ccaaagaagg ccgtgaatct gccgactcag atctgacaga ggaagaaaga gtcatgaatg

120

agcagggtga acttgttcct cttctgactg gcggaaagtt aaagtcttat cagctcaaag

180

gtgtcaaatg gctgatatca ttgtggcaaa atggtttgaa tggaatttta gctgatcaaa

240

tgggtcttgg aaagacaatt caaaccattg gtttcctatc accccaacaa ggaaatgggt

300

tggatggtcc atatctagtc attgccccac tctctactct ttcaaaagcg attggaaccc

360

tcaaatggac ttgcaagcca tggacagatg ccacagaatt ggtcagacaa aacctgttca

420

tgtttacagg cttgcgacgg ctcagtcaat agagggccga gttctgaaac gagcatacag

480

taagcttaag ctggaacatg tggttattgg caaggggcag tttcatcaag aacgtggtaa

540

ggaaataatt attttctttt ttccttttag tataaaatag ttaagtgatg ttaattagta

600

tgattataat aatatagttg ttataattgt gaaaaaataa tttataaata tattgtttac

660

ataaacaaca tagtaatgta aaaaaatatg acaagtgatg tgtaagacga agaagataaa

720

agttgagagt aagtatatta tttttaatga atttgatcga acatgtaaga tgatatacta

780

gcattaatat ttgttttaat cataatagta attctagctg gtttgatgaa ttaaatatca

840

atgataaaat actatagtaa aaataagaat aaataaatta aaataatatt tttttatgat

900

taatagttta ttatataatt aaatatctat accattacta aatattttag tttaaaagtt

960

aataaatatt ttgttagaaa ttccaatctg cttgtaattt atcaataaac aaaatattaa

1020

ataacaagct aaagtaacaa ataatatcaa actaatagaa acagtaatct aatgtaacaa

1080

aacataatct aatgctaata taacaaagcg caagatctat cattttatat agtattattt

1140

tcaatcaaca ttcttattaa tttctaaata atacttgtag ttttattaac ttctaaatgg

1200

attgactatt aattaaatga attagtcgaa catgaataaa caaggtaaca tgatagatca

1260

tgtcattgtg ttatcattga tcttacattt ggattgatta cagtcacgtt cttgatgaaa

1320

ctgccccttg ccaataacca catgttccag cttaagctta ctgtatgctc gtttcagaac

1380

tcggccctct attgactgag ccgtcgcaag cctgtaaaca tgaacaggtt ttgtctgacc

1440

aattctgtgg catctgtcca tggcttgcaa gtccatttga gggttccaat cgcttttgaa

1500

agagtagaga gtggggcaat gactagatat ggaccatcca acccatttcc ttgttggggt

1560

gataggaaac caatggtttg aattgtcttt ccaagaccca tttgatcagc taaaattcca

1620

ttcaaaccat tttgccacaa tgatatcagc catttgacac ctttgagctg ataagacttt

1680

aactttccgc cagtcagaag aggaacaagt tcaccctgct ctttcatgac tctttcttcc

1740

tctgtcagat ctgagtcggc agattcacgg ccttctttgg atcttgaaat catagcagca

1800

acagcttcta gaaaggatcc cggg

1824

<210> 39

<211> 1823

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hpDDM1-Bn[G:U]

<400> 39

ggatccttgg tacctaatac gactcactat agggttgttg ttgttatgat tttaagattt

60

aaagaaggtt gtgaatttgt tgatttagat ttgatagagg aagaaagagt tatgaatgag

120

tagggtgaat ttgttttttt tttgattggt ggaaagttaa agttttatta gtttaaaggt

180

gttaaatggt tgatattatt gtggtaaaat ggtttgaatg gaattttagt tgattaaatg

240

ggttttggaa agataattta aattattggt tttttattat attttaaagg aaatgggttg

300

gatggtttat atttagttat tgttttattt tttatttttt taaaagtgat tggaattttt

360

aaatggattt gtaagttatg gatagatgtt atagaattgg ttagataaaa tttgtttatg

420

tttataggtt tgtgatggtt tagttaatag agggttgagt tttgaaatga gtatatagta

480

agtttaagtt ggaatatgtg gttattggta aggggtagtt ttattaagaa tgtgtggtaa

540

ggaaataatt attttctttt ttccttttag tataaaatag ttaagtgatg ttaattagta

600

tgattataat aatatagttg ttataattgt gaaaaaataa tttataaata tattgtttac

660

ataaacaaca tagtaatgta aaaaaatatg acaagtgatg tgtaagacga agaagataaa

720

agttgagagt aagtatatta tttttaatga atttgatcga acatgtaaga tgatatacta

780

gcattaatat ttgttttaat cataatagta attctagctg gtttgatgaa ttaaatatca

840

atgataaaat actatagtaa aaataagaat aaataaatta aaataatatt tttttatgat

900

taatagttta ttatataatt aaatatctat accattacta aatattttag tttaaaagtt

960

aataaatatt ttgttagaaa ttccaatctg cttgtaattt atcaataaac aaaatattaa

1020

ataacaagct aaagtaacaa ataatatcaa actaatagaa acagtaatct aatgtaacaa

1080

aacataatct aatgctaata taacaaagcg caagatctat cattttatat agtattattt

1140

tcaatcaaca ttcttattaa tttctaaata atacttgtag ttttattaac ttctaaatgg

1200

attgactatt aattaaatga attagtcgaa catgaataaa caaggtaaca tgatagatca

1260

tgtcattgtg ttatcattga tcttacattt ggattgatta cagtcacgtt cttgatgaaa

1320

ctgccccttg ccaataacca catgttccag cttaagctta ctgtatgctc gtttcagaac

1380

tcggccctct attgactgag ccgtcgcaag cctgtaaaca tgaacaggtt ttgtctgacc

1440

aattctgtgg catctgtcca tggcttgcaa gtccatttga gggttccaat cgcttttgaa

1500

agagtagaga gtggggcaat gactagatat ggaccatcca acccatttcc ttgttggggt

1560

gataggaaac caatggtttg aattgtcttt ccaagaccca tttgatcagc taaaattcca

1620

ttcaaaccat tttgccacaa tgatatcagc catttgacac ctttgagctg ataagacttt

1680

aactttccgc cagtcagaag aggaacaagt tcaccctgct ctttcatgac tctttcttcc

1740

tctgtcagat ctgagtcggc agattcacgg ccttctttgg atcttgaaat catagcagca

1800

acagttctag aaaggatccc ggg

1823

<210> 40

<211> 720

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> EGFP

<400> 40

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac

60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac

120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc

180

ctcgtgacca ccttcaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag

240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc

300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg

360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac

420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac

480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc

540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac

600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc

660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa

720

<210> 41

<211> 1262

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hpEGFP[wt]

<400> 41

gctagctaat acgactcact atagggcagc agcacggggc cgtcgccgat gggggtgttc

60

tgctggtagt ggtcggcgag ctgcacgctg ccgtcctcga tgttgtggcg gatcttgaag

120

ttcaccttga tgccgttctt ctgcttgtcg gccatgatgt atacgttgtg gctgttgaag

180

ttgtactcca gcttgtgccc caggatgttg ccgtcctcct tgaagtcgat gcccttcagc

240

tcgatgcggt tcaccagggt gtcgccctcg aacttcacct cggcgcgggt cttgtagttg

300

ccgtcgtcct tgaagaagat ggtgcgctcc tggacgtagc cttcgggcat ggcggacttg

360

aagaagtcgt gctgcttcat gtggtcgggg tagcggctga agcactgcac gccgtaagcg

420

aaggtggtca ctagtgtggg ccagggcacg ggcagcttgc cggtggtgca gatgaacttc

480

agggtctaga ccgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag ttcctgatta

540

gggggatgaa gctacctggt ccgaaccaca aaccgttcta ctttactggc tttggtcgtc

600

atgaagatgc ggacttgcgt ggcaaaggat tcgataacgt gctgatggtg cacgaccacg

660

cattaatgga ctttaccttt taatggggaa tgaagctacc tggtccgaac tcctaccgta

720

cctcgcatta cccttacgct gaagagatgc tcgactgggc agatgaacat ggcatcgtat

780

ttaggtgaca ctatagccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg

840

cccacactag tgaccacctt cgcttacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac

900

atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc

960

atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac

1020

accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg

1080

gggcacaagc tggagtacaa cttcaacagc cacaacgtat acatcatggc cgacaagcag

1140

aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag

1200

ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgccgtcg

1260

ac

1262

<210> 42

<211> 1262

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hpEGFP[G:U]

<400> 42

gctagctaat acgactcact atagggcagc agcacggggc cgtcgccgat gggggtgttc

60

tgctggtagt ggtcggcgag ctgcacgctg ccgtcctcga tgttgtggcg gatcttgaag

120

ttcaccttga tgccgttctt ctgcttgtcg gccatgatgt atacgttgtg gctgttgaag

180

ttgtactcca gcttgtgccc caggatgttg ccgtcctcct tgaagtcgat gcccttcagc

240

tcgatgcggt tcaccagggt gtcgccctcg aacttcacct cggcgcgggt cttgtagttg

300

ccgtcgtcct tgaagaagat ggtgcgctcc tggacgtagc cttcgggcat ggcggacttg

360

aagaagtcgt gctgcttcat gtggtcgggg tagcggctga agcactgcac gccgtaagcg

420

aaggtggtca ctagtgtggg ccagggcacg ggcagcttgc cggtggtgca gatgaacttc

480

agggtctaga ccgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag ttcctgatta

540

gggggatgaa gctacctggt ccgaaccaca aaccgttcta ctttactggc tttggtcgtc

600

atgaagatgc ggacttgcgt ggcaaaggat tcgataacgt gctgatggtg cacgaccacg

660

cattaatgga ctttaccttt taatggggaa tgaagctacc tggtccgaac tcctaccgta

720

cctcgcatta cccttacgct gaagagatgc tcgactgggc agatgaacat ggcatcgtat

780

ttaggtgaca ctatagcctt gaagtttatt tgtattattg gtaagttgtt tgtgttttgg

840

tttatattag tgattatttt tgtttatggt gtgtagtgtt ttagttgtta ttttgattat

900

atgaagtagt atgatttttt taagtttgtt atgtttgaag gttatgttta ggagtgtatt

960

atttttttta aggatgatgg taattataag atttgtgttg aggtgaagtt tgagggtgat

1020

attttggtga attgtattga gttgaagggt attgatttta aggaggatgg taatattttg

1080

gggtataagt tggagtataa ttttaatagt tataatgtat atattatggt tgataagtag

1140

aagaatggta ttaaggtgaa ttttaagatt tgttataata ttgaggatgg tagtgtgtag

1200

tttgttgatt attattagta gaatattttt attggtgatg gttttgtgtt gttgttgtcg

1260

ac

1262

<210> 43

<211> 1259

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ledEGFP[wt]

<400> 43

gctagctaat acgactcact atagggtgtc gccctcgaac ttcacctcgg cgcgggtctt

60

gtagttgccg tcgtccttga agaagatggt gcgctcctgg acgtagcctt cgggcatggc

120

ggacttgaag aagtcgtgct gcttcatgtg gtcggggtag cggctgaagc actgcacgcc

180

gtaggtgaag gtggtcacga gggtgggcca gggcacgggc agcttgccgg tggtgcagat

240

gaacttcagg gtctagaccg cgtcggcatc cggtcagtgg cagtgaaggg cgaacagttc

300

ctgattaggg ggatgaagct acctggtccg aaccacaaac cgttctactt tactggcttt

360

ggtcgtcatg aagatgcgga cttgcgtggc aaaggattcg accctgaagt tcatctgcac

420

caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accttcacct acggcgtgca

480

gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc

540

cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg

600

cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga

660

cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa

720

cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca

780

caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg

840

cgacggcccc gtgctgctgc ctaacgtgct gatggtgcac gaccacgcat taatggactt

900

taccttttaa tggggaatga agctacctgg tccgaactcc taccgtacct cgcattaccc

960

ttacgctgaa gagatgctcg actgggcaga tgaacatggc atcgtggcag cagcacgggg

1020

ccgtcgccga tgggggtgtt ctgctggtag tggtcggcga gctgcacgct gccgtcctcg

1080

atgttgtggc ggatcttgaa gttcaccttg atgccgttct tctgcttgtc ggccatgata

1140

tagacgttgt ggctgttgta gttgtactcc agcttgtgcc ccaggatgtt gccgtcctcc

1200

ttgaagtcga tgcccttcag ctcgatgcgg ttcaccattg tcgggataca ctcgtcgac

1259

<210> 44

<211> 1259

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ledEGFP[G:U]

<400> 44

gctagctaat acgactcact atagggtgtc gccctcgaac ttcacctcgg cgcgggtctt

60

gtagttgccg tcgtccttga agaagatggt gcgctcctgg acgtagcctt cgggcatggc

120

ggacttgaag aagtcgtgct gcttcatgtg gtcggggtag cggctgaagc actgcacgcc

180

gtaggtgaag gtggtcacga gggtgggcca gggcacgggc agcttgccgg tggtgcagat

240

gaacttcagg gtctagaccg cgtcggcatc cggtcagtgg cagtgaaggg cgaacagttc

300

ctgattaggg ggatgaagct acctggtccg aaccacaaac cgttctactt tactggcttt

360

ggtcgtcatg aagatgcgga cttgcgtggc aaaggattcg attttgaagt ttatttgtat

420

tattggtaag ttgtttgtgt tttggtttat ttttgtgatt atttttattt atggtgtgta

480

gtgttttagt tgttattttg attatatgaa gtagtatgat ttttttaagt ttgttatgtt

540

tgaaggttat gtttaggagt gtattatttt ttttaaggat gatggtaatt ataagatttg

600

tgttgaggtg aagtttgagg gtgatatttt ggtgaattgt attgagttga agggtattga

660

ttttaaggag gatggtaata ttttggggta taagttggag tataattata atagttataa

720

tgtttatatt atggttgata agtagaagaa tggtattaag gtgaatttta agatttgtta

780

taatattgag gatggtagtg tgtagtttgt tgattattat tagtagaata tttttattgg

840

tgatggtttt gtgttgttgt ttaacgtgct gatggtgcac gaccacgcat taatggactt

900

taccttttaa tggggaatga agctacctgg tccgaactcc taccgtacct cgcattaccc

960

ttacgctgaa gagatgctcg actgggcaga tgaacatggc atcgtggcag cagcacgggg

1020

ccgtcgccga tgggggtgtt ctgctggtag tggtcggcga gctgcacgct gccgtcctcg

1080

atgttgtggc ggatcttgaa gttcaccttg atgccgttct tctgcttgtc ggccatgata

1140

tagacgttgt ggctgttgta gttgtactcc agcttgtgcc ccaggatgtt gccgtcctcc

1200

ttgaagtcga tgcccttcag ctcgatgcgg ttcaccattg tcgggataca ctcgtcgac

1259

<210> 45

<211> 200

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hpGUS[G:U]

<400> 45

ttgtgttggt atttggttag tggtagtgaa gggtgaatag tttttgatta attataaatt

60

gttttatttt attggttttg gttgttatga agatgtggat ttgtgtggta aaggatttga

120

taatgtgttg atggtgtatg attatgtatt aatggattgg attggggtta atttttattg

180

tattttgtat tatttttatg

200

<210> 46

<211> 200

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hpGUS[1:4]

<400> 46

tcgggtccgc aaccgctcac tgggagtcaa gcgcgtacac ttcgtgaata agcactaacg

60

gttgtacatt agtgggtttc gtcctcaaga acatggggag ttgggtgcca atggaatcgt

120

taaggtggtg aaggtccacc acctcgcttt attggtctgc attcggggca agtccaaccc

180

tacgtcggat ttcccatacc

200

<210> 47

<211> 200

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hpGUS[2:10]

<400> 47

tcgcgtcgcg atccggtctc tggcagtgtt gggcgaactc ttcctgatat accacaaagg

60

gttctactaa actggcttac gtcgtcatct agatgcggtg ttgcgtgggt aaggattcct

120

taacgtgcac atggtgcagc accacgcaaa aatggactcc attggggcgt actcctacgc

180

tacctcgcta tacccttagc

200

<210> 48

<211> 200

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hpEIN2[G:U]

<400> 48

gattttagtt agggtttatt tagagaatgg tttttgtttt attttttgtt tttttggttt

60

ttgttggata tattgatttt gggaaatggg ttgtaaatat tgaaggaggt gtttgttttg

120

ggtatgattt ggtggtaatt attttgtttt ttaattttgt tgttatttta tgttaatatg

180

ttgtagtttg tataagtgtt

200

<210> 49

<211> 200

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hpCHS[G:U]

<400> 49

gttgtttgtt ttgagattat agttgttatt ttttgtggtt tttttgatat ttattttgat

60

ttttttgttg gttaggtttt ttttagtgat ggtgttgttg tatttattgt ggggttggat

120

tttgatatat ttgttggaga gaaatttatt tttgagatgg tgtttgttgt ttagattatt

180

tttttagatt ttgatggtgt

200

<210> 50

<211> 200

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hpEIN2[G:U/U:G]

<400> 50

aatgtttatg tgagttgtaa tatattggta taagatggtg gtaaaattga aaagtagagt

60

aattgttatt aagttatatt tgaaatgagt attttttttg atatttgtaa tttatttttt

120

gggattaata tatttgatag aaattaaaag gataggaagt agagtaggaa ttattttttg

180

gataaatttt agttgaggtt

200

<210> 51

<211> 199

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hpCHS[G:U/U:G]

<400> 51

gtattattag agtttggaag gatggtttga gtggtagata ttattttaaa gatgggtttt

60

tttttgatag atgtgttagg gtttgatttt ataatgagtg tggtggtgtt attattgaaa

120

agagtttgat tgatgaggga gttaaggtgg gtgttagagg gattatggaa ggtaatggtt

180

gtgattttag agtagataa

199

<210> 52

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GUS-WT-F

<400> 52

cctcgaggat cctcgcgtcg gcatccggtc

30

<210> 53

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GUS-WT-R

<400> 53

gggtaccaag cttcgtaagg gtaatgcgag gta

33

<210> 54

<211> 118

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GUS-GU-F

<400> 54

ccctcgagtt gtgttggtat ttggttagtg gtagtgaagg gtgaatagtt tttgattaat

60

tataaattgt tttattttat tggttttggt tgttatgaag atgtggattt gtgtggta

118

<210> 55

<211> 118

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GUS-GU-R

<400> 55

ggggtaccca taaaaataat acaaaataca ataaaaatta accccaatcc aatccattaa

60

tacataatca tacaccatca acacattatc aaatccttta ccacacaaat ccacatct

118

<210> 56

<211> 118

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GUS-4M-F

<400> 56

ccctcgagtc gggtccgcaa ccgctcactg ggagtcaagc gcgtacactt cgtgaataag

60

cactaacggt tgtacattag tgggtttcgt cctcaagaac atggggagtt gggtgcca

118

<210> 57

<211> 118

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GUS-4M-R

<400> 57

ggggtaccgg tatgggaaat ccgacgtagg gttggacttg ccccgaatgc agaccaataa

60

agcgaggtgg tggaccttca ccaccttaac gattccattg gcacccaact ccccatgt

118

<210> 58

<211> 118

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GUS-10M-F

<400> 58

ccctcgagtc gcgtcgcgat ccggtctctg gcagtgttgg gcgaactctt cctgatatac

60

cacaaagggt tctactaaac tggcttacgt cgtcatctag atgcggtgtt gcgtgggt

118

<210> 59

<211> 118

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GUS-10M-R

<400> 59

ggggtaccgc taagggtata gcgaggtagc gtaggagtac gccccaatgg agtccatttt

60

tgcgtggtgc tgcaccatgt gcacgttaag gaatccttac ccacgcaaca ccgcatct

118

<210> 60

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер (35S-F3)

<400> 60

tggctcctac aaatgccatc

20

<210> 61

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер (GUSwt-R2)

<220>

<221> R

<222> (3)..(4)

<223> A или G

<220>

<221> R

<222> (9)..(9)

<223> A или G

<220>

<221> R

<222> (13)..(13)

<223> A или G

<400> 61

carraactrt tcrcccttca c

21

<210> 62

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер (GUSgu-R2)

<400> 62

caaaaactat tcacccttca c

21

<210> 63

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер (GUS4m-R2)

<220>

<221> R

<222> (4)..(4)

<223> A или G

<220>

<221> R

<222> (7)..(7)

<223> A или G

<220>

<221> R

<222> (9)..(9)

<223> A или G

<220>

<221> R

<222> (13)..(13)

<223> A или G

<220>

<221> R

<222> (15)..(15)

<223> A или G

<220>

<221> R

<222> (19)..(19)

<223> A или G

<400> 63

cacraartrt acrcrcttra c

21

<210> 64

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер (35S-F2)

<400> 64

gaggatctaa cagaactcgc

20

<210> 65

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер (35S-R1)

<400> 65

ctctccaaat gaaatgaact tcc

23

<210> 66

<211> 36

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> EIN2wt-F

<400> 66

cctcgaggat cctctagacc tcagctaggg tttatc

36

<210> 67

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> EIN2wt-R

<400> 67

gggtaccaag cttaacgctt atgcgagctg caa

33

<210> 68

<211> 32

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CHSwt-F

<400> 68

cctcgaggat ccgttgtctg ctctgagatc ac

32

<210> 69

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CHSwt-R

<400> 69

gggtaccaag cttctagagc accatcagag tctggaag

38

<210> 70

<211> 119

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> EIN2gu-F

<400> 70

cctcgagtct agattttagt tagggtttat ttagagaatg gtttttgttt tattttttgt

60

ttttttggtt tttgttggat atattgattt tgggaaatgg gttgtaaata ttgaaggag

119

<210> 71

<211> 119

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> EIN2gu-R

<400> 71

gggtaccaac acttatacaa actacaacat attaacataa aataacaaca aaattaaaaa

60

acaaaataat taccaccaaa tcatacccaa aacaaacacc tccttcaata tttacaacc

119

<210> 72

<211> 119

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CHSgu-F

<400> 72

cctcgaggtt gtttgttttg agattatagt tgttattttt tgtggttttt ttgatattta

60

ttttgatttt tttgttggtt aggttttttt tagtgatggt gttgttgtat ttattgtgg

119

<210> 73

<211> 119

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CHSgu-R

<400> 73

gggtacctct agacaccatc aaaatctaaa aaaataatct aaacaacaaa caccatctca

60

aaaataaatt tctctccaac aaatatatca aaatccaacc ccacaataaa tacaacaac

119

<210> 74

<211> 120

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> asEIN2gu-F

<400> 74

caagcttaat gtttatgtga gttgtaatat attggtataa gatggtggta aaattgaaaa

60

gtagagtaat tgttattaag ttatatttga aatgagtatt ttttttgata tttgtaattt

120

<210> 75

<211> 120

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> asEIN2gu-R

<400> 75

gggatcctct agaacctcaa ctaaaattta tccaaaaaat aattcctact ctacttccta

60

tccttttaat ttctatcaaa tatattaatc ccaaaaaata aattacaaat atcaaaaaaa

120

<210> 76

<211> 120

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> asCHSgu-F

<400> 76

caagcttcta gagtattatt agagtttgga aggatggttt gagtggtaga tattatttta

60

aagatgggtt tttttttgat agatgtgtta gggtttgatt ttataatgag tgtggtggtg

120

<210> 77

<211> 120

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> asCHSgu-R

<400> 77

gggatccatt atctactcta aaatcacaac cattaccttc cataatccct ctaacaccca

60

ccttaactcc ctcatcaatc aaactctttt caataataac accaccacac tcattataaa

120

<210> 78

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CHS-200-F2

<400> 78

gacatgcctg gtgctgacta

20

<210> 79

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CHS-200-R2

<400> 79

ccttagcgat acggaggaca

20

<210> 80

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Actin2-For

<400> 80

tccctcagca cattccagca

20

<210> 81

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Actin2-Rev

<400> 81

gatcccattc ataaaacccc ag

22

<210> 82

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Top-35S-F2

<220>

<221> Y

<222> (8)..(8)

<223> C или T

<220>

<221> Y

<222> (11)..(11)

<223> C или T

<220>

<221> Y

<222> (14)..(14)

<223> C или T

<220>

<221> Y

<222> (17)..(17)

<223> C или T

<400> 82

agaaaatytt ygtyaayatg gtgg

24

<210> 83

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Top-35S-R2

<220>

<221> R

<222> (4)..(4)

<223> A или G

<220>

<221> R

<222> (6)..(7)

<223> A или G

<220>

<221> R

<222> (9)..(9)

<223> A или G

<220>

<221> R

<222> (12)..(12)

<223> A или G

<400> 83

tcartrrara trtcacatca atcc

24

<210> 84

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Link-35S-F2

<220>

<221> Y

<222> (1)..(2)

<223> C или T

<220>

<221> Y

<222> (5)..(5)

<223> C или T

<220>

<221> Y

<222> (10)..(10)

<223> C или T

<400> 84

yyatyattgy gataaaggaa agg

23

<210> 85

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Link-EIN2-R2

<220>

<221> R

<222> (6)..(6)

<223> A или G

<220>

<221> R

<222> (14)..(14)

<223> A или G

<400> 85

taattrccac caartcatac cc

22

<210> 86

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> смысловой si22

<400> 86

gcaagcugac ccugaaguuc au

22

<210> 87

<211> 22

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> антисмысловой si22

<400> 87

gaacuucagg gucagcuugc cg

22

<210> 88

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 88

ttttagtata tgtgctgccg

20

<210> 89

<211> 83

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 89

ctcgagttcc aaaaaagctg accctgaagt tcatctctct tgaagatgaa cttcagggtc

60

agccaaacaa ggcttttctc caa

83

<210> 90

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Прямой праймер

<400> 90

ttttagtata tgtgctgccg

20

<210> 91

<211> 83

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Обратный праймер

<400> 91

ctcgagttcc aaaaaaataa gtcgcagcag tacaatctct tgaattgtac tgctgcgact

60

tatgaatacc gcttcctcct gag

83

<210> 92

<211> 88

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> молекулы дцРНК

<400> 92

aagugauuug ugaauggauu cgguuaaguu agugauaggu aucacgcugg ccauuacuga

60

caugaccgga uucguucgcg agucacuu

88

<210> 93

<211> 2653

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 93

agaaaaatcg aaaaatgtga cagtgcgtct tttcacttaa taccctcgtt ttgaatttgc

60

tctcggaaag cgtctgagag agtgttcggt gatttctccc gccgcttggg gttttttccg

120

ttaccggaat atccttctcc tccgatggtt agtctgcgct ccacagaaaa cactccggct

180

tcggaaatgg ccagcgacgg caaaacggag aaagatggct ccggcgactc acccacttct

240

gttctcagcg atgaggaaaa ctgtgaagag aaaactgcta ctgttgctgt agaggaagag

300

atacttctag ccaagaatgg agattcgtct cttatctctg aggccatggc tcaggaagaa

360

gagcagcttc tcaaaatccg ggaagatgaa gagattgcta aacgtgctgc tggctctggt

420

gaagctcctg atctgaatga tactcagttt actaaacttg atgagctctt gacccaaacc

480

cagctctact ctgagtttct ccttgagaaa atggaggata tcaccaaaaa tgggatagaa

540

ggtgagaccc aaaaggccga gcctgagcct gagcctgagc ccgagaagaa aggccgtgga

600

cgtaaaagaa aggctgctcc tcagggcgac agtatgaagg ctaagaaagc tgttgctgct

660

atgatttcaa gatccaaaga aggccgtgaa tctgccgact cagatctgac agaggaagaa

720

agagtcatga aagagcaggg tgaacttgtt cctcttctga ctggcggaaa gttaaagtct

780

tatcagctca aaggtgtcaa atggctgata tcattgtggc aaaatggttt gaatggaatt

840

ttagctgatc aaatgggtct tggaaagaca attcaaacca ttggtttcct atcacacctc

900

aaaggaaatg ggttggatgg tccatatcta gtcattgccc cactctctac tctttcaaac

960

tggatgaatg agatcgctag gttcacgcct tccattaatg caatcattta ccatggagat

1020

aagaaagaaa gggatgagct caggaagagg cacatgccca gaactgttgg tccgaagttc

1080

cctatagtca taacttctta tgaggttgct atgaatgatg ctaaaaagaa tctgcggcac

1140

tatccatgga aatatgttgt gattgatgag ggtcacaggt tgaaaaacca caagtgtaaa

1200

ctgctgaggg agctaagata cttgaatatg gagaacaaac ttctgctgcc aggaacacct

1260

ctgcaaaata atttgtctga gcttcggtca ctgttgaatt ttattctgcc tgacatcttt

1320

gcatcacatg acgaatttga atcatggttt gatttttctt gaaagaataa taatgaagca

1380

actaaggaag aaggagaaga gaaaagaaga gctcaagtgg ttgcgaaact tcataatata

1440

ctacgacctt tcatcctccg gagaatgaaa tgtgatgttg agctctcact tccccggaaa

1500

aaagagatta tcatctatgc tacaatgacg gaccatcaga agaagttcca ggaacatctt

1560

gtgaaccaca ccttggaagc acacattaga gatgatactg tccgaggtca tggcttgaag

1620

ggaaagctta acaatcttgc tattcaactt cgaaagaact gcaaccatcc tgaccttctt

1680

gtggggcaac tagatggctc atatctctac ccacctttgg aagacattgt gggacagtgc

1740

ggtaaattcc gcttattgga gagattgctt gttcggttat ttgccaaaaa tcacagagtc

1800

cttatcttct cccagtggac aaaaatactg gacattatgg attactactt cagtgagaag

1860

gggtttgagg tttgccgaat cgacggtagt gtgaaactag aagaaaggag aagacagatc

1920

caagaattca atgatgagaa gagcaactgc aggatatttc ttctcagtac cagagccgga

1980

ggactcggaa ttaatcttac tgctgcagat acatgcatcc tctacgatag cgattggaac

2040

cctcaaatgg acttgcaagc catggacaga tgccacagaa ttggtcagac aaaacctgtt

2100

catgtttaca ggcttgcgac ggctcagtca atagagggcc gagttctgaa acgagcatac

2160

agtaagctta agctggaaca tgtggttatt ggcaaggggc agtttcatca agaacgtgcc

2220

aagtcttcaa caccgttaga ggaagatgac atactggcgt tgcttaagga cgacgaaaat

2280

gctgaagata aactgataca aaccgacata agcgaggagg atcttgacag ggtgcttgac

2340

cgtagtgatc tgatgattac cttaccgggc gagactcaag cacatgaagc ttttccagtg

2400

aagggtccgg gttgggaagt ggtctcgtct agctcagctg gagggatgct gtcttccctc

2460

aacagttaga accactcttt gcaaaaccac ttcggtgtgt ttttttttcc ggaacataac

2520

cggttacttt tgcctgctac tcggaagttt taacttgaaa ccttggaaac atctgatgaa

2580

aacaattgcg gatattatgt tattagacta tttatttatg ccttttgaaa tttggcagta

2640

attttttagt taa

2653

<210> 94

<211> 1773

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая шпилечную конструкцию РНКи (шРНК),

направленно воздействующую на ген DDM1 B. napus

<400> 94

gggagctgtt gctgctatga tttcaagatc caaagaaggc cgtgaatctg ccgactcaga

60

tctgacagag gaagaaagag tcatgaatga gcagggtgaa cttgttcctc ttctgactgg

120

cggaaagtta aagtcttatc agctcaaagg tgtcaaatgg ctgatatcat tgtggcaaaa

180

tggtttgaat ggaattttag ctgatcaaat gggtcttgga aagacaattc aaaccattgg

240

tttcctatca ccccaacaag gaaatgggtt ggatggtcca tatctagtca ttgccccact

300

ctctactctt tcaaaagcga ttggaaccct caaatggact tgcaagccat ggacagatgc

360

cacagaattg gtcagacaaa acctgttcat gtttacaggc ttgcgacggc tcagtcaata

420

gagggccgag ttctgaaacg agcatacagt aagcttaagc tggaacatgt ggttattggc

480

aaggggcagt ttcatcaaga acgtggtaag gaaataatta ttttcttttt tccttttagt

540

ataaaatagt taagtgatgt taattagtat gattataata atatagttgt tataattgtg

600

aaaaaataat ttataaatat attgtttaca taaacaacat agtaatgtaa aaaaatatga

660

caagtgatgt gtaagacgaa gaagataaaa gttgagagta agtatattat ttttaatgaa

720

tttgatcgaa catgtaagat gatatactag cattaatatt tgttttaatc ataatagtaa

780

ttctagctgg tttgatgaat taaatatcaa tgataaaata ctatagtaaa aataagaata

840

aataaattaa aataatattt ttttatgatt aatagtttat tatataatta aatatctata

900

ccattactaa atattttagt ttaaaagtta ataaatattt tgttagaaat tccaatctgc

960

ttgtaattta tcaataaaca aaatattaaa taacaagcta aagtaacaaa taatatcaaa

1020

ctaatagaaa cagtaatcta atgtaacaaa acataatcta atgctaatat aacaaagcgc

1080

aagatctatc attttatata gtattatttt caatcaacat tcttattaat ttctaaataa

1140

tacttgtagt tttattaact tctaaatgga ttgactatta attaaatgaa ttagtcgaac

1200

atgaataaac aaggtaacat gatagatcat gtcattgtgt tatcattgat cttacatttg

1260

gattgattac agtcacgttc ttgatgaaac tgccccttgc caataaccac atgttccagc

1320

ttaagcttac tgtatgctcg tttcagaact cggccctcta ttgactgagc cgtcgcaagc

1380

ctgtaaacat gaacaggttt tgtctgacca attctgtggc atctgtccat ggcttgcaag

1440

tccatttgag ggttccaatc gcttttgaaa gagtagagag tggggcaatg actagatatg

1500

gaccatccaa cccatttcct tgttggggtg ataggaaacc aatggtttga attgtctttc

1560

caagacccat ttgatcagct aaaattccat tcaaaccatt ttgccacaat gatatcagcc

1620

atttgacacc tttgagctga taagacttta actttccgcc agtcagaaga ggaacaagtt

1680

caccctgctc tttcatgact ctttcttcct ctgtcagatc tgagtcggca gattcacggc

1740

cttctttgga tcttgaaatc atagcagcaa cag

1773

<210> 95

<211> 1773

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая шпилечную конструкцию РНКи (шРНК) с

парами оснований G:U, направленно воздействующую на ген DDM1

B. napus

<400> 95

gggttgttgt tgttatgatt ttaagattta aagaaggttg tgaatttgtt gatttagatt

60

tgatagagga agaaagagtt atgaatgagt agggtgaatt tgtttttttt ttgattggtg

120

gaaagttaaa gttttattag tttaaaggtg ttaaatggtt gatattattg tggtaaaatg

180

gtttgaatgg aattttagtt gattaaatgg gttttggaaa gataatttaa attattggtt

240

ttttattata ttttaaagga aatgggttgg atggtttata tttagttatt gttttatttt

300

ttattttttt aaaagtgatt ggaattttta aatggatttg taagttatgg atagatgtta

360

tagaattggt tagataaaat ttgtttatgt ttataggttt gtgatggttt agttaataga

420

gggttgagtt ttgaaatgag tatatagtaa gtttaagttg gaatatgtgg ttattggtaa

480

ggggtagttt tattaagaat gtgtggtaag gaaataatta ttttcttttt tccttttagt

540

ataaaatagt taagtgatgt taattagtat gattataata atatagttgt tataattgtg

600

aaaaaataat ttataaatat attgtttaca taaacaacat agtaatgtaa aaaaatatga

660

caagtgatgt gtaagacgaa gaagataaaa gttgagagta agtatattat ttttaatgaa

720

tttgatcgaa catgtaagat gatatactag cattaatatt tgttttaatc ataatagtaa

780

ttctagctgg tttgatgaat taaatatcaa tgataaaata ctatagtaaa aataagaata

840

aataaattaa aataatattt ttttatgatt aatagtttat tatataatta aatatctata

900

ccattactaa atattttagt ttaaaagtta ataaatattt tgttagaaat tccaatctgc

960

ttgtaattta tcaataaaca aaatattaaa taacaagcta aagtaacaaa taatatcaaa

1020

ctaatagaaa cagtaatcta atgtaacaaa acataatcta atgctaatat aacaaagcgc

1080

aagatctatc attttatata gtattatttt caatcaacat tcttattaat ttctaaataa

1140

tacttgtagt tttattaact tctaaatgga ttgactatta attaaatgaa ttagtcgaac

1200

atgaataaac aaggtaacat gatagatcat gtcattgtgt tatcattgat cttacatttg

1260

gattgattac agtcacgttc ttgatgaaac tgccccttgc caataaccac atgttccagc

1320

ttaagcttac tgtatgctcg tttcagaact cggccctcta ttgactgagc cgtcgcaagc

1380

ctgtaaacat gaacaggttt tgtctgacca attctgtggc atctgtccat ggcttgcaag

1440

tccatttgag ggttccaatc gcttttgaaa gagtagagag tggggcaatg actagatatg

1500

gaccatccaa cccatttcct tgttggggtg ataggaaacc aatggtttga attgtctttc

1560

caagacccat ttgatcagct aaaattccat tcaaaccatt ttgccacaat gatatcagcc

1620

atttgacacc tttgagctga taagacttta actttccgcc agtcagaaga ggaacaagtt

1680

caccctgctc tttcatgact ctttcttcct ctgtcagatc tgagtcggca gattcacggc

1740

cttctttgga tcttgaaatc atagcagcaa cag

1773

<210> 96

<211> 1260

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на ген DDM1 B. napus

<400> 96

ggggtgatag gaaaccaatg gtttgaattg tctttccaag acccatttga tcagctaaaa

60

ttccattcaa accattttgc cacaatgata tcagccattt gacacctttg agctgataag

120

actttaactt tccgccagtc agaagaggaa caagttcacc ctgctctttc atgactcttt

180

cttcctctgt cagatctgag tcggcagatt cacggccttc tttggatctt gaaatcatag

240

cagcaacagc tttcttagcc ttcatactgt cgccctgagg agcagccttt cttttacgtc

300

cacggccttt cttctcgggc tcaggctcag gctcaggctc ggccttttgg gtctcacctt

360

ctatcccatt tttggtgata gctgttgctg ctatgatttc aagatccaaa gaaggccgtg

420

aatctgccga ctcagatctg acagaggaag aaagagtcat gaatgagcag ggtgaacttg

480

ttcctcttct gactggcgga aagttaaagt cttatcagct caaaggtgtc aaatggctga

540

tatcattgtg gcaaaatggt ttgaatggaa ttttagctga tcaaatgggt cttggaaaga

600

caattcaaac cattggtttc ctatcacccc aacaaggaaa tgggttggat ggtccatatc

660

tagtcattgc cccactctct actctttcaa aagcgattgg aaccctcaaa tggacttgca

720

agccatggac agatgccaca gaattggtca gacaaaacct gttcatgttt acaggcttgc

780

gacggctcag tcaatagagg gccgagttct gaaacgagca tacagtaagc ttaagctgga

840

acatgtggtt attggcaagg ggcagtttca tcaagaacgt cactacggtc aagcaccctg

900

tcaagatcct cctcgcttat gtcggtttgt atcagtttat cttcagcatt ttcgtcgtcc

960

ttaagcaacg ccagtatgtc atcttcctct aacggtgttg aagacttggc acgttcttga

1020

tgaaactgcc ccttgccaat aaccacatgt tccagcttaa gcttactgta tgctcgtttc

1080

agaactcggc cctctattga ctgagccgtc gcaagcctgt aaacatgaac aggttttgtc

1140

tgaccaattc tgtggcatct gtccatggct tgcaagtcca tttgagggtt ccaatcgctt

1200

ttgaaagagt agagagtggg gcaatgacta gatatggacc atccaaccca tttccttgtt

1260

<210> 97

<211> 4421

<212> ДНК

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 97

tcttccaaaa tttgcccgcc attctctgtg tctcttcgtc taagggtttc ttccaaagaa

60

cgacgacaaa accactgaac ctaaaatccg aaatccaaaa gattcatgcg aaaaaatcgt

120

taaagagtac caatttcaga aagttacatt cttacagaga acaagtaatt ccccagaaat

180

gggatctagg gttccaatag aaaccatcga agaagacggc gaattcgatt gggaagcagc

240

agtcaaagaa atcgacttgg cttgtcttaa aaccacaaac gcttcttctt cttcgtcatc

300

ccatttcact cctttggcta atccaccaat tacggcaaat ctcactaagc cacctgcgaa

360

gagacaatct actctcgata aattcatcgg cagaaccgaa cataaaccgg agaatcatca

420

agttgtttcc gagtgtggtg ttaacgataa cgataatagt cctttagttg ggattgatcc

480

tgaggcagct aaaacttgga tttatccagt gaatgggagt gttcctttaa gagattatca

540

gtttgctata acgaagactg ctttgttttc gaatacattg gtggctttgc ctacgggact

600

tggtaaaacg cttatagctg cggttgttat gtataattac ttcagatggt ttccacaagg

660

taaaatagta tttgcggcgc cttctaggcc tcttgtgatg cagcagattg aggcgtgtca

720

taatattgtt ggaataccac aagaatggac gattgacttg acgggtcaga catgtccttc

780

gaaaagagct tttttgtgga aaagcaaacg ggttttcttt gtcactccac aagtgttaga

840

gaaggatata cagtcaggaa catgtcttac taactacttg gtttgcttgg tgatcgacga

900

ggcacatcga gctttaggga attattctta ttgtgttgta gttcgtgagt tgatggcggt

960

accgatacag ctgagaatac tggctcttac tgcaactcct ggatcaaaga cacaggccat

1020

ccagggtatc attgataatt tgcagatatc cacacttgaa tatcgaaatg agagtgacca

1080

tgatgtttgc ccttatgtcc acgacagaaa attagaagtc atcgaggttc ccttgggtca

1140

agatgcagat gatgtatcga aacgcctgtt tcatgttata cgtccatatg cagtcaggct

1200

taaaaacttt ggggttaatc taaatagaga tatacaaact ttaagtccac acgaagtact

1260

tatggcaagg gataagtttc gtcaagcacc tctaccaggc cttccccatg taaatcacgg

1320

agatgtagaa tcttgctttg cagctcttat cactctttat catattcgta agctcctttc

1380

tagtcatgga ataagaccag cgtatgagat gctagaagag aaattgaaag aagggccatt

1440

tgctaggttg atgagtaaga atgaagatat taggatgacg aagcttttga tgcagcaaag

1500

gttgtcacat ggagcaccaa gcccaaaatt gtcgaagatg ttagaaatac tggttgatca

1560

tttcaaagtg aaagatccga agacatcacg ggtcattatt ttctcaaatt tcagaggaag

1620

cgtaagagac ataatgaacg cattaagtaa tattggagat atggtcaaag caactgagtt

1680

tattggtcaa agttcaggta agacattgaa aggccagtcg caaaaaattc agcaggctgt

1740

tttggagaaa tttagagctg gggggttcaa tgttattgtc gcaacatcta ttggtgaaga

1800

aggcttggat atcatggaag ttgacctagt tatatgtttt gatgctaatg tatctcctct

1860

gaggatgatt caacggatgg gaagaactgg aaggaaaaat aatggtcgag ttgtagttct

1920

tgcttgtgaa ggatcagaaa agaacagcta tatgcgaaag caagcaagtg gacgggctat

1980

taaaaaacac atgcggaatg gaggaacaaa tagttttaat tttcatccta gtccaaggat

2040

gattccccat gtttataagc cagaagttca gcatgttgag ttttcaatca agcaattcgt

2100

tccacgtgga aagaaactac aagaggagta tgccactgag actccagctt tccagaaaaa

2160

gcttacacct gcagagacgc atatgctcgc taagtattac aacaaccccg atgaggaaaa

2220

gttgagagtg tccttaattg cgttccctca cttccagaca ttgccatcca aggtgcacaa

2280

agtaatgcat tcacgtcaaa caggcatgtt aattgacgct atgcagcact tgcaagagcc

2340

aactttttca gaacagagta aaagcttctt cactgagttt cgagctcctt tgggtgaaag

2400

agaagagctt gatacaggtc tgagggttac taatgatcca aaagatctac actctgtccg

2460

tgatttggaa gtcaacacat cacagagaaa ggcaaaacaa gttgaatctc ccacaagcac

2520

cttagagaca acagagaagg attacgaaga atcttcaccc acacaccgtt atcttttcag

2580

ttcagaatgt gcatccgttg atactctggg gaacgtcttc gtaatgccag ttcctctttt

2640

attctttcct aatgttctgg agtcagacaa tacgcctctg cctaaaacag aaaaacaaca

2700

ttcttgccgg aatacatctc acattgactt agttccagta gatacttcgg aaaaacatcg

2760

gcaagataat atctcatgca agttaaagga aagattctcg ccagacggtg ccagcgagac

2820

actagagact catagccttg tgaaaaggaa ctccaccaga gtaggtgaag atgatgtagc

2880

gaattctgtt ggagaaattg tgttatcatc ggatgaagat gactgtgagg gattggagct

2940

tagtccacgg ctcactaact tcatcaagag cggcattgtt ccagagtcac ctgtctatga

3000

ccaaggggaa gcgaacagag aagaagatct tgaatttcct cagctttctt cacccatgag

3060

gttcagtaac gaattggcag gagagtcttc tttccctgag agaaaggttc agcataagtg

3120

caacgattat aacattgtgt ctacaaccac tgaattgaga actcctcaga aggaggtagg

3180

tttggccaac ggaacagaat gcttggctgt ttctcctatt cctgaggatt ggagaactcc

3240

cttggcgaat ctgacaaaca caaacagcag cgctcgcaaa gattggcggg tgagttctgg

3300

agaaaagtta gaaactcttc gacagcctcg caagttgaag agactacgta gacttggaga

3360

ttgctcgagt gctgtaaagg agaattatcc tggtattaca gaggcagacc atatcagatc

3420

tcgttctcgc ggtaaaaagc acattagagg taagaagaag atgatcatgg atgatgatgt

3480

ccaagtcttc attgacgagg aagctgaggt ctcttcggga gcagagatgt cggctgatga

3540

gaacgaagat gtgactggcg attcatttga agatagtttc atagatgacg gaacaatgcc

3600

tacagcaaat actcaagccg agtctggtaa agttgacatg atggctgttt acaggcgttc

3660

tcttctcagc cagtcaccat taccggcgag atttcgtgat ttagccgcat caagtctgag

3720

tccttattct gctggaccct tgacgagaat aaatgagagc agaagcgact cagataaatc

3780

attgtcttct cttcgaacac caaaaacaac aaactctgag tcaaaccaag atgcaatgat

3840

gataggaaac ctttcggtag tacaaatctc gtcagatagc cggaaaagga aatttagctt

3900

atgcaactcg gcgaatgccc ccgtgattaa cttagaaagc aagtttgcag ctcatgcaca

3960

agccacggag aaggaaagcc atgaaggcgt gagaagcaat gcaggtgcgt tagagtacaa

4020

tgatgatgat gatgatgcat tctttgcgac actagacttt gatgcaatgg aagcacaagc

4080

cacattgtta ttgtcgaaac agagatccga agcaaaagag aaagaagacg caacggttat

4140

acctaatcca ggcatgcaga gaagtgatgg tatggagaaa gatgcaccat cttttgatct

4200

tggtctgtgg tgattcttct ttcatacgaa gatactaagt tatgtatata gattgacaaa

4260

ggagacagta gagcataggc atttggatgt atgttttgtg tattaagttt aggtatatcc

4320

tattgaagta cagtgcttaa ggcagtgcac atggttaaat caaggttaat gcctcaattc

4380

gttgaaccct ttaagtaatg acacaaatat gactacatcg g

4421

<210> 98

<211> 1771

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая шпилечную конструкцию РНКи (шРНК),

направленно воздействующую на ген FANCM A. thaliana

<400> 98

gggtcaggaa catgtcttac taactacttg gtttgcttgg tgatcgacga ggcacatcga

60

gctttaggga attattctta ttgtgttgta gttcgtgagt tgatggcggt accgatacag

120

ctgagaatac tggctcttac tgcaactcct ggatcaaaga cacaggccat ccagggtatc

180

attgataatt tgcagatatc cacacttgaa tatcgaaatg agagtgacca tgatgtttgc

240

ccttatgtcc ccgacagaaa attagaagtc atcgaggttc ccttgggtca agatgcagat

300

gatgtatcga aacgcctgtt tcatgttata cgtccatatg cagtcaggct taaaaacttt

360

ggggttaatc taaatagaga tatacaaact ttaagtccac acgaagtact tatggcaagg

420

gataagtttc gtcaagcacc tctaccaggc cttccccatg taaatcacgg agatgtagaa

480

tcttgctttg cagctcttat caggtaagga aataattatt ttcttttttc cttttagtat

540

aaaatagtta agtgatgtta attagtatga ttataataat atagttgtta taattgtgaa

600

aaaataattt ataaatatat tgtttacata aacaacatag taatgtaaaa aaatatgaca

660

agtgatgtgt aagacgaaga agataaaagt tgagagtaag tatattattt ttaatgaatt

720

tgatcgaaca tgtaagatga tatactagca ttaatatttg ttttaatcat aatagtaatt

780

ctagctggtt tgatgaatta aatatcaatg ataaaatact atagtaaaaa taagaataaa

840

taaattaaaa taatattttt ttatgattaa tagtttatta tataattaaa tatctatacc

900

attactaaat attttagttt aaaagttaat aaatattttg ttagaaattc caatctgctt

960

gtaatttatc aataaacaaa atattaaata acaagctaaa gtaacaaata atatcaaact

1020

aatagaaaca gtaatctaat gtaacaaaac ataatctaat gctaatataa caaagcgcaa

1080

gatctatcat tttatatagt attattttca atcaacattc ttattaattt ctaaataata

1140

cttgtagttt tattaacttc taaatggatt gactattaat taaatgaatt agtcgaacat

1200

gaataaacaa ggtaacatga tagatcatgt cattgtgtta tcattgatct tacatttgga

1260

ttgattacag ttgataagag ctgcaaagca agattctaca tctccgtgat ttacatgggg

1320

aaggcctggt agaggtgctt gacgaaactt atcccttgcc ataagtactt cgtgtggact

1380

taaagtttgt atatctctat ttagattaac cccaaagttt ttaagcctga ctgcatatgg

1440

acgtataaca tgaaacaggc gtttcgatac atcatctgca tcttgaccca agggaacctc

1500

gatgacttct aattttctgt cggggacata agggcaaaca tcatggtcac tctcatttcg

1560

atattcaagt gtggatatct gcaaattatc aatgataccc tggatggcct gtgtctttga

1620

tccaggagtt gcagtaagag ccagtattct cagctgtatc ggtaccgcca tcaactcacg

1680

aactacaaca caataagaat aattccctaa agctcgatgt gcctcgtcga tcaccaagca

1740

aaccaagtag ttagtaagac atgttcctga c

1771

<210> 99

<211> 1771

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая шпилечную конструкцию РНКи (шРНК) с

парами

оснований G:U, направленно воздействующую на ген FANCM A.

thaliana

<400> 99

gggttaggaa tatgttttat taattatttg gtttgtttgg tgattgatga ggtatattga

60

gttttaggga attattttta ttgtgttgta gtttgtgagt tgatggtggt attgatatag

120

ttgagaatat tggtttttat tgtaattttt ggattaaaga tataggttat ttagggtatt

180

attgataatt tgtagatatt tatatttgaa tattgaaatg agagtgatta tgatgtttgt

240

ttttatgttt ttgatagaaa attagaagtt attgaggttt ttttgggtta agatgtagat

300

gatgtattga aatgtttgtt ttatgttata tgtttatatg tagttaggtt taaaaatttt

360

ggggttaatt taaatagaga tatataaatt ttaagtttat atgaagtatt tatggtaagg

420

gataagtttt gttaagtatt tttattaggt tttttttatg taaattatgg agatgtagaa

480

ttttgttttg tagtttttat taggtaagga aataattatt ttcttttttc cttttagtat

540

aaaatagtta agtgatgtta attagtatga ttataataat atagttgtta taattgtgaa

600

aaaataattt ataaatatat tgtttacata aacaacatag taatgtaaaa aaatatgaca

660

agtgatgtgt aagacgaaga agataaaagt tgagagtaag tatattattt ttaatgaatt

720

tgatcgaaca tgtaagatga tatactagca ttaatatttg ttttaatcat aatagtaatt

780

ctagctggtt tgatgaatta aatatcaatg ataaaatact atagtaaaaa taagaataaa

840

taaattaaaa taatattttt ttatgattaa tagtttatta tataattaaa tatctatacc

900

attactaaat attttagttt aaaagttaat aaatattttg ttagaaattc caatctgctt

960

gtaatttatc aataaacaaa atattaaata acaagctaaa gtaacaaata atatcaaact

1020

aatagaaaca gtaatctaat gtaacaaaac ataatctaat gctaatataa caaagcgcaa

1080

gatctatcat tttatatagt attattttca atcaacattc ttattaattt ctaaataata

1140

cttgtagttt tattaacttc taaatggatt gactattaat taaatgaatt agtcgaacat

1200

gaataaacaa ggtaacatga tagatcatgt cattgtgtta tcattgatct tacatttgga

1260

ttgattacag ttgataagag ctgcaaagca agattctaca tctccgtgat ttacatgggg

1320

aaggcctggt agaggtgctt gacgaaactt atcccttgcc ataagtactt cgtgtggact

1380

taaagtttgt atatctctat ttagattaac cccaaagttt ttaagcctga ctgcatatgg

1440

acgtataaca tgaaacaggc gtttcgatac atcatctgca tcttgaccca agggaacctc

1500

gatgacttct aattttctgt cggggacata agggcaaaca tcatggtcac tctcatttcg

1560

atattcaagt gtggatatct gcaaattatc aatgataccc tggatggcct gtgtctttga

1620

tccaggagtt gcagtaagag ccagtattct cagctgtatc ggtaccgcca tcaactcacg

1680

aactacaaca caataagaat aattccctaa agctcgatgt gcctcgtcga tcaccaagca

1740

aaccaagtag ttagtaagac atgttcctga c

1771

<210> 100

<211> 1259

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на ген FANCM A. thaliana

<400> 100

gggacataag ggcaaacatc atggtcactc tcatttcgat attcaagtgt ggatatctgc

60

aaattatcaa tgataccctg gatggcctgt gtctttgatc caggagttgc agtaagagcc

120

agtattctca gctgtatcgg taccgccatc aactcacgaa ctacaacaca ataagaataa

180

ttccctaaag ctcgatgtgc ctcgtcgatc accaagcaaa ccaagtagtt agtaagacat

240

gttcctgact gtatatcctt ctctaacact tgtggagtga caaagaaaac ccgtttgctt

300

ttccacaaaa aagctctttt cgaaggacat gtctgacccg tcaagtcaat cgtccattct

360

tgtggtattc caacaatatg tcaggaacat gtcttactaa ctacttggtt tgcttggtga

420

tcgacgaggc acatcgagct ttagggaatt attcttattg tgttgtagtt cgtgagttga

480

tggcggtacc gatacagctg agaatactgg ctcttactgc aactcctgga tcaaagacac

540

aggccatcca gggtatcatt gataatttgc agatatccac acttgaatat cgaaatgaga

600

gtgaccatga tgtttgccct tatgtccccg acagaaaatt agaagtcatc gaggttccct

660

tgggtcaaga tgcagatgat gtatcgaaac gcctgtttca tgttatacgt ccatatgcag

720

tcaggcttaa aaactttggg gttaatctaa atagagatat acaaacttta agtccacacg

780

aagtacttat ggcaagggat aagtttcgtc aagcacctct accaggcctt ccccatgtaa

840

atcacggaga tgtagaatct tgctttgcag ctcttatcat tcgtcatcct aatatcttca

900

ttcttactca tcaacctagc aaatggccct tctttcaatt tctcttctag catctcatac

960

gctggtctta ttccatgact agaaaggagc ttacgaatat gataaagagt gataagagct

1020

gcaaagcaag attctacatc tccgtgattt acatggggaa ggcctggtag aggtgcttga

1080

cgaaacttat cccttgccat aagtacttcg tgtggactta aagtttgtat atctctattt

1140

agattaaccc caaagttttt aagcctgact gcatatggac gtataacatg aaacaggcgt

1200

ttcgatacat catctgcatc ttgacccaag ggaacctcga tgacttctaa ttttctgtc

1259

<210> 101

<211> 4228

<212> ДНК

<213> Brassica napus

<400> 101

tccaaaattg gttttgcccg ccaatgtggc ttcggcgagg gtttcttcca caaaacccca

60

ctcaacctaa aatctgattc ggcgagaaac gctgtctact tatctcacgc gaaaagaaag

120

gcgtagatcc accctaaact aaaacagagc atcaagtgaa atgggacccg agtttccgat

180

cgaactcgtt gaagaagaag atggattcga ttgggaagca gcagtcagag aaatcgactt

240

ggcttgcctc aaatccttaa acccttcttc ttcttcttcg acccatttca ccaacggcaa

300

tggcactaaa cctgctaaaa gacaatctac tcttgatcga ttcatcgcaa gagccgacca

360

caagcctcct cctccgtatc ctcctgttgt ttccgacccg agtttcgagt gtggtactaa

420

cgacaacact cccagcgtcg ggattgatcc tgagacagct aaaacttgga tttatccaat

480

gaacgttcct ctaagagatt atcagtttgc tataacgaag actgctttgt tttcaaacac

540

attagttgct ttaccaacag gccttggtaa aacgctcata gctgcagttg taatgtataa

600

ttacttcaga tggtttccac aaggtaaaat tgtctttgcc gcaccttcta ggcctcttgt

660

gatgcagcag attgaggcct gccataatat cgtggggata ccacaagaat ggacgattga

720

cttgacgggt cagacttgcc cttccaaaag agcttccttg tggaaaacca aaagggtttt

780

cttcgtcact ccacaagttc ttgagaagga tatacagtca ggaacgtgtg ttaccaactg

840

cttggtttgc ttggtgatcg acgaggcaca tcgagcttta gggaattatt cttattgtgt

900

tgtagttcgt gagttgatgg cagtaccagt gcagttgaga atattggctc ttactgcaac

960

tcctggatca aagacacagg ccatacaggg tatccttgat aatttgcaga tatcaacact

1020

tgaatatcga aacgagagtg accatgatgt ctgcccttat gtccacgaca gaaaagtaga

1080

actaatcgag gttcccttgg gtaaagatgc agatgaggta tctaaacgcc tattagatgt

1140

tatacgtcca tatgctgtca ggcttaaaaa tttcggggtc attctaagca gggattatca

1200

aactttgagt ccacacgaat tacttatggc aagggataag tttcgtgaag cacctgtacc

1260

aggcattccc catataagtc acggagatgt agaatcttgc tttgcagctc ttatcacgct

1320

ttatcacatt cgcaagcttc tttctagtca tggaataagg ccagcgtatg agatgcttga

1380

agaaaaactt caggaagggc catttgctag gttgatgagt aagaatgaag atattaggat

1440

gacgaagctt ttgatgcagc aaaggttgtc gaacggagca ccaagcccga aattgtccaa

1500

gatgttggag attctagttg atcactacaa aataaaagat ccgaggacat cacgggtcat

1560

tattttctcg aatttcagag gaagcgtaag agacataatg gacgcattaa gtaatattga

1620

agatgttgtc aaagcaactg agtttattgg tcaaagttca ggtaagacac tgaagggaca

1680

gtcgcaaaaa gttcagcaag ctgttctgga gaaatttaga tctggtgggt ttaatgttat

1740

tgttgcaaca tctatcggcg aagaaggctt ggatatcatg gaagtcgact tagttatatg

1800

ttttgatgct aatgtatccc ctctgaggat gatccaacgc atgggaagaa ctggaaggaa

1860

aaataatggc cgagttgtag ttcttgcttg tgaaggatct gaaaagaata gctatatgcg

1920

aaagaaagca aatggccaag ccattaaaaa acacatgcgg aatggaggaa tgaatagttt

1980

taattttcat cctagtccaa ggatgattcc ccatgtttat aagccagaag ttcagcatgt

2040

taagttttcg atcgagcaat tcattccacg tggaaagaag ctacaagatg agcctgccac

2100

tgagactcca gctttcaaga aaaagcttac accggaagag atggatatgc tcgccaagta

2160

tttcaaaccc aacgaggaaa agtggagagt ttccttgatt gctttccctc acttccaaac

2220

attgccatcc aaagtgcaca aagtaatgca ttcacgccaa acaagcatat taattgatgc

2280

tatgcagcat ctgcaagaga caactttgac agagcaaagt aaaagtttct tcattaagta

2340

tggagctcct ttggctgaaa gagatgagct tgacgcaggt ctgagggttg gtgatgatcc

2400

gaaaggtaaa tttagtctca atgatttgga tggcaacaca tcacagagaa aggcaaaaca

2460

aattttagaa tctcccacaa gcacattaga gactacagag aaggatttcg aagcatcttc

2520

acccacacac tgttatcttt tcagttcaga atgtgcgtcc gttgatactc tggggaaggt

2580

ctttgtattg ccggttcctc tctcattctc ttctaatgta ccagggtcag actgcgtggg

2640

aagagaaaaa gaactttctt ccccgaataa gtcccacact gacgttgttc cgatagatag

2700

ttcctcaaaa catcggcaag ataatatttc atgcaagtta aagcaaggat tcttgccaga

2760

ttgtgccaac gagactttgg agtcccaaag ccttttgaaa aggcactcca ccgatgtagg

2820

taaaggagat atagagaatt gtgctggaga aattatgata tcatcggatg aagaagacga

2880

ctgtgaggat ttggagctta gtccaaggct cactaacttc atcaagagtg gcgttgttcc

2940

agattcacct gtctatgacc aaggagttgc atacgaagca aacagagaag aagaccttga

3000

tcttccaccc acgagtttaa ctaatgaatt ggcagaagag ccatcgacac ctgagaaaaa

3060

ggttcacatt gcttctacgg ccaatgaatt cagaactcct cagaaggaag aagatttagc

3120

caacgaaaca gaaagcttcg ctgtttctcc aatgcctgag gagtggagaa ctcccttggc

3180

gaatatcacc aacgcaagca gcagcgctag caaagattgg cgcgtgagtt cgggagaaaa

3240

gtcagaaact cttcgacagc ctcgcaagtt gaagagactt cgtagacttg gagattgctc

3300

gagtgctgtg aaggagaata atcctggtat tgcaaagaca gaccatatca gatctcgttc

3360

tcgcagtgta aagaacataa gaggcaagaa gaagatacgc gcggataata atgctagaat

3420

cttcattgaa gcggaagctg aggtgtcttc ggaatcagaa atgtcggttg atgagaacgt

3480

agatttgacc agcgattcat ttgaagatag cttcatagat gacggtacaa tgcctacagc

3540

aaatactcaa gccgagtgtg ctaaagttga catgatggcc gtttacagac gttctctact

3600

cagccaatca ccattaccgg caagatttcg tgatgtagct gcatcaagtc cgagtcctta

3660

ttcttctggt ctcttgaaga caataaatga gagcagaagc gactcagata aatcattgtc

3720

ttctcttaga accccacaaa caacgaacaa cgagtcaaac aaggatgcag tggccacagg

3780

agactttttg gtagcacaaa tctcaacaga cagccggaaa aggaaattca gcttatgcaa

3840

ctcagcgaat gtcccagtga ttaacttgga aaacaagttt gaagctcatg cacaagccac

3900

ggagaaggaa agccatgaag gtccgagaag caatgcaggt gcatcacagt acaaggatga

3960

ggatgaagat gatgatgcat tctacgcgac actggacttt gatgccatgg aagcgcatgc

4020

gacattgcta ttgtcgaaac aaaggtcaga aacgaaaaca aaagaagatg catcggtgaa

4080

acctcatttg ggcaatcaga ggaatgatgg tttgccgaag gatgggccat cttttgatct

4140

tggtttgtgg tgattattct cctattaagt taaagtgtat aaaggttgac atttggatgt

4200

atgttttgtg tatttagttt gtgtcata

4228

<210> 102

<211> 1769

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая шпилечную конструкцию РНКи (шРНК),

направленно воздействующую на ген FANCM B. napus

<400> 102

gggagaaatt atgatatcat cggatgaaga agacgactgt gtggatttgg agcttagtcc

60

aaggctcact aacttcatca agagtggcgt tgttccagat tcacctgtct atgaccaagt

120

tgcatacgaa gcaaacagtg aagaagacct tgatcttcca cacacgagtt taactaatga

180

attggcagaa gagccatcga cacctgagaa aaaggttcac attgcttcta cggccaatga

240

attcagaacc ccaacgaagg aagaagattt agccaacgaa acagaaagct tcgctgtttc

300

tccaatgcct gaggagtgga gaactccctt ggcgaatatc accaacgcaa gcagcagcgc

360

tagcaaagat tggcgcgtga gttcgggaga aaagtcagaa actcttcgac agcctcgcaa

420

gttgaagaga cttcgtagac ttggagattg ctcgagtgct gtgaaggaga ataatcctgg

480

tattgcaaag acagaccata tcgtaaggaa ataattattt tcttttttcc ttttagtata

540

aaatagttaa gtgatgttaa ttagtatgat tataataata tagttgttat aattgtgaaa

600

aaataattta taaatatatt gtttacataa acaacatagt aatgtaaaaa aatatgacaa

660

gtgatgtgta agacgaagaa gataaaagtt gagagtaagt atattatttt taatgaattt

720

gatcgaacat gtaagatgat atactagcat taatatttgt tttaatcata atagtaattc

780

tagctggttt gatgaattaa atatcaatga taaaatacta tagtaaaaat aagaataaat

840

aaattaaaat aatatttttt tatgattaat agtttattat ataattaaat atctatacca

900

ttactaaata ttttagttta aaagttaata aatattttgt tagaaattcc aatctgcttg

960

taatttatca ataaacaaaa tattaaataa caagctaaag taacaaataa tatcaaacta

1020

atagaaacag taatctaatg taacaaaaca taatctaatg ctaatataac aaagcgcaag

1080

atctatcatt ttatatagta ttattttcaa tcaacattct tattaatttc taaataatac

1140

ttgtagtttt attaacttct aaatggattg actattaatt aaatgaatta gtcgaacatg

1200

aataaacaag gtaacatgat agatcatgtc attgtgttat cattgatctt acatttggat

1260

tgattacagg atatggtctg tctttgcaat accaggatta ttctccttca cagcactcga

1320

gcaatctcca agtctacgaa gtctcttcaa cttgcgaggc tgtcgaagag tttctgactt

1380

ttctcccgaa ctcacgcgcc aatctttgct agcgctgctg cttgcgttgg tgatattcgc

1440

caagggagtt ctccactcct caggcattgg agaaacagcg aagctttctg tttcgttggc

1500

taaatcttct tccttcgttg gggttctgaa ttcattggcc gtagaagcaa tgtgaacctt

1560

tttctcaggt gtcgatggct cttctgccaa ttcattagtt aaactcgtgt gtggaagatc

1620

aaggtcttct tctctgtttg cttcgtatgc aacttggtca tagacaggtg aatctggaac

1680

aacgccactc ttgatgaagt tagtgagcct tggactaagc tccaaatcct cacagtcgtc

1740

ttcttcatcc gatgatatca taatttctc

1769

<210> 103

<211> 1769

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая шпилечную конструкцию РНКи (шРНК) с

парами

оснований G:U, направленно воздействующую на ген FANCM B.

napus

<400> 103

gggagaaatt atgatattat tggatgaaga agatgattgt gtggatttgg agtttagttt

60

aaggtttatt aattttatta agagtggtgt tgttttagat ttatttgttt atgattaagt

120

tgtatatgaa gtaaatagtg aagaagattt tgatttttta tatatgagtt taattaatga

180

attggtagaa gagttattga tatttgagaa aaaggtttat attgttttta tggttaatga

240

atttagaatt ttaatgaagg aagaagattt agttaatgaa atagaaagtt ttgttgtttt

300

tttaatgttt gaggagtgga gaattttttt ggtgaatatt attaatgtaa gtagtagtgt

360

tagtaaagat tggtgtgtga gtttgggaga aaagttagaa attttttgat agttttgtaa

420

gttgaagaga ttttgtagat ttggagattg tttgagtgtt gtgaaggaga ataattttgg

480

tattgtaaag atagattata ttgtaaggaa ataattattt tcttttttcc ttttagtata

540

aaatagttaa gtgatgttaa ttagtatgat tataataata tagttgttat aattgtgaaa

600

aaataattta taaatatatt gtttacataa acaacatagt aatgtaaaaa aatatgacaa

660

gtgatgtgta agacgaagaa gataaaagtt gagagtaagt atattatttt taatgaattt

720

gatcgaacat gtaagatgat atactagcat taatatttgt tttaatcata atagtaattc

780

tagctggttt gatgaattaa atatcaatga taaaatacta tagtaaaaat aagaataaat

840

aaattaaaat aatatttttt tatgattaat agtttattat ataattaaat atctatacca

900

ttactaaata ttttagttta aaagttaata aatattttgt tagaaattcc aatctgcttg

960

taatttatca ataaacaaaa tattaaataa caagctaaag taacaaataa tatcaaacta

1020

atagaaacag taatctaatg taacaaaaca taatctaatg ctaatataac aaagcgcaag

1080

atctatcatt ttatatagta ttattttcaa tcaacattct tattaatttc taaataatac

1140

ttgtagtttt attaacttct aaatggattg actattaatt aaatgaatta gtcgaacatg

1200

aataaacaag gtaacatgat agatcatgtc attgtgttat cattgatctt acatttggat

1260

tgattacagg atatggtctg tctttgcaat accaggatta ttctccttca cagcactcga

1320

gcaatctcca agtctacgaa gtctcttcaa cttgcgaggc tgtcgaagag tttctgactt

1380

ttctcccgaa ctcacgcgcc aatctttgct agcgctgctg cttgcgttgg tgatattcgc

1440

caagggagtt ctccactcct caggcattgg agaaacagcg aagctttctg tttcgttggc

1500

taaatcttct tccttcgttg gggttctgaa ttcattggcc gtagaagcaa tgtgaacctt

1560

tttctcaggt gtcgatggct cttctgccaa ttcattagtt aaactcgtgt gtggaagatc

1620

aaggtcttct tctctgtttg cttcgtatgc aacttggtca tagacaggtg aatctggaac

1680

aacgccactc ttgatgaagt tagtgagcct tggactaagc tccaaatcct cacagtcgtc

1740

ttcttcatcc gatgatatca taatttctc

1769

<210> 104

<211> 1259

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на ген FANCM B. napus

<400> 104

gggttctgaa ttcattggcc gtagaagcaa tgtgaacctt tttctcaggt gtcgatggct

60

cttctgccaa ttcattagtt aaactcgtgt gtggaagatc aaggtcttct tctctgtttg

120

cttcgtatgc aacttggtca tagacaggtg aatctggaac aacgccactc ttgatgaagt

180

tagtgagcct tggactaagc tccaaatcct cacagtcgtc ttcttcatcc gatgatatca

240

taatttctcc agcacaattc tctatatctc ctttacctac atcggtggag tgccttttca

300

aaaggctttg ggactccaaa gtctcgttgg cacaatctgg caagaatcct tgctttaact

360

tgcatgaaat attatcttgg agaaattatg atatcatcgg atgaagaaga cgactgtgtg

420

gatttggagc ttagtccaag gctcactaac ttcatcaaga gtggcgttgt tccagattca

480

cctgtctatg accaagttgc atacgaagca aacagtgaag aagaccttga tcttccacac

540

acgagtttaa ctaatgaatt ggcagaagag ccatcgacac ctgagaaaaa ggttcacatt

600

gcttctacgg ccaatgaatt cagaacccca acgaaggaag aagatttagc caacgaaaca

660

gaaagcttcg ctgtttctcc aatgcctgag gagtggagaa ctcccttggc gaatatcacc

720

aacgcaagca gcagcgctag caaagattgg cgcgtgagtt cgggagaaaa gtcagaaact

780

cttcgacagc ctcgcaagtt gaagagactt cgtagacttg gagattgctc gagtgctgtg

840

aaggagaata atcctggtat tgcaaagaca gaccatatcc agcttccgct tcaatgaaga

900

ttctagcatt attatccgcg cgtatcttct tcttgccttg aacacagagc aaaaggaaat

960

acagaatcat tttacctctt atgttcttta cactgcgaga acgagatctg atatggtctg

1020

tctttgcaat accaggatta ttctccttca cagcactcga gcaatctcca agtctacgaa

1080

gtctcttcaa cttgcgaggc tgtcgaagag tttctgactt ttctcccgaa ctcacgcgcc

1140

aatctttgct agcgctgctg cttgcgttgg tgatattcgc caagggagtt ctccactcct

1200

caggcattgg agaaacagcg aagctttctg tttcgttggc taaatcttct tccttcgtt

1259

<210> 105

<211> 7074

<212> ДНК

<213> Nicotiana benthamiana

<400> 105

atgcgagctg tttttgaaac aaagcgtgat cgtgaaatct tggtccttgc tagtaaagtt

60

ctgggtcacc tagctagatc tggcggtgca atgactgcag atgaagtgga acgtcagata

120

aaagttgcac taggatggct tcgtggtgaa agaattgagt atcgtttctt tgctgctgtc

180

ttaatattga aggaaatggc ggaaaatgct tcaactgttt tcaatgttca tgtgccggac

240

tttgtggagg ttgtttgggt tgctctgaag gatccaacat tggctgttcg agagaaggct

300

gttgaggcat tgcgtgcctg ccttcgcgtt attgaaaagc gcgagacacg atggcgtgtt

360

cagtggtatt ataagatgtt tgaggctacc caagatggat tgaccagaac tgcgcctgtt

420

catagtatac atggctccct tctcgcagtg ggagagctgc taaggaatac aggagagttc

480

atgatgtcaa gatacaggga ggttgcagaa attgttataa gatacttgga gcaccgagat

540

cgcctagttc ggctcagcat aacttctcta cttcctcgaa ttgctcattt cctgcgtgat

600

cgatttgtga ctaactactt aacgatatgc atgaatcata tacttcatgt ccttaaaata

660

cctgcagaac gtgccagtgg gttcattgct cttggggaga tggctggtgc tctggatggt

720

gaactcatta actatttgcc gacaataacc tctcacttgc gtgatgcgat tgctccccgt

780

agaggcaggc cctcatttga ggctctggca tgtgttggaa atattgctaa agcaatggga

840

cctgcaatgg agcctcatgt tcgtggtctc ttggatgcta tgttttctgc tgggctttcc

900

ctgacactag tggaagcctt ggagcaaata actgaaagca ttccatcttt gttgccgacc

960

attcaagatc ggcttcttga atgtatttca gcaattctct ccagatctaa tcatgcactc

1020

tcaagacaat caactgctat gagtcgagga catattgcaa cagttacccc ccaagtacca

1080

gaactgagtg gtcctgcact agttcaactt gctttgcaga ctcttgctcg ttttaatttc

1140

aagggccatg atcttcttga gtttgcaagg gagtctgttg ttgtgtattt agaagatgag

1200

gatggagcta cacgaaaaga tgctgcgcta tgttgctgca aactagtagc aaattctttc

1260

ttggcgatat cttctaccca gtttagtcct agtagaatca atcgtgccag tggaaagcga

1320

cgtcgacttg ttgaagagat tgtgcaaaaa cttctcatcg ctgctgttgc cgacgctgat

1380

gttactgttc ggcattcaat tttttcttct ctgtatgctg atggaggatt cgatgagttt

1440

ctagctcagg ctgatagttt gacagctata tttgccactt taaatgatga ggattttgaa

1500

gttcgtgact atgcaatttc actagctggt agactatctg aaaagaatcc agcatatgtt

1560

cttccagcac ttcgtcgcca tcttattcag ctgttaactt acctagagca aagtgcagat

1620

aataaatgta aagaagagag tgcaaagtta ttgggttgct tgattcgcaa ttgtgaacga

1680

ttagttcttc catacattgc tcccatacac aaggctcttg ttgcgaaact ctgtgaaggc

1740

acaggagtca atgcgaatag tggcattatt agtggagttc tagtgactgt tggagatctt

1800

gccagagtgg gtggctttgc catgcggcag tatatttcag aacttatgcc attaatcgtt

1860

gaagctctac tggatggggc agctgccacc aaacgtgaag tggccgtttc aacacttggt

1920

caagttgtac agagtacagg atatgtcata actccataca atgagtatcc tcagttgctt

1980

ggtttactct tgaaactgct caatggtgaa ctggcttggt caaccagaag agaggttttg

2040

aaggttctcg gcatcatggg tgcattagat ccccatgtgc acaagcgcaa tcagcaaagc

2100

ttacccggat cccatggtga agttacccgg gtgactggtg atcctggtca acatatcaga

2160

tcaatggatg aattgcctat ggatctttgg ccctcctttg caacatctga agattattat

2220

tccactgttg ctatcaactc actcatgcgg atactcaggg atccatctct gtcaagttac

2280

caccagaaag tggttggatc tcttatgttt attttcaagt ccatgggcct tggctgtgtc

2340

ccttatttgc ctaaggtttt gcctgatctc tttcacattg tacgaacatg tgaggatggt

2400

ctaaaagaat ttataacatg gaagcttgga accttggtat ctattgtccg ccagcacatc

2460

cgtaagtatc tgccagagtt actctctctg atatcagaaa tatggtcatc tttcagcttg

2520

cctgttgcta acagacctgt tcacattgct cctattttgc atctcgtgga gcaactttgc

2580

ttggctctca acgatgaatt tagaaagtac cttgctgata tacttccctg ctgtattcaa

2640

gttcttactg atgcagagag gtttagtgac tacacatacg ttattcctat tctccacaca

2700

cttgaagttt ttggtgggac attagatgag catatgcatc tgcttcttcc tgcacttatt

2760

cggttgttta aattggatgc ttcagtagaa gtaagacgcg gtgcaatcaa aactctcaca

2820

agattgatac ctcgtgtgca ggtcactgga cacatatctt ctcttgtgca tcacttgaag

2880

cttgtcttgg acgggaacaa agaagagctc aggaaggatg ctgttgatgc actttgttgt

2940

ctagctcatg ctcttggaga ggacttcacc atttttattc attctattca caagcttatg

3000

gttaaacata ggctgcagca caaggaattt gaagaaatcc gaggacgact ggaaaaacgt

3060

gagccactga ttttggggag caccgcagct cagagattaa atcggcggtt cccagttgag

3120

gtcatcagtg atcctttgag tgatggagag aatgagcact acgaggttgg gacggacatg

3180

cataagcagc ttaaaagcca tcaggttaat gatggtagat tgcgtaccgc tggtgaggct

3240

tctcaacgaa gcactaaaga ggattgggca gagtggatga ggcatttcag cattgaactt

3300

ctgaaagaat cacctagtcc agcattgcga acttgtgcaa gactcgctca actgcagcct

3360

tttgttgggc gagagttgtt tgctgcaggt tttgttagct gctggtcaca acttaatgag

3420

gctagtcaaa ggcagctagt acgtagtcta gaaatggcat tttcgtctcc aaatatccct

3480

cctgaaattc ttgctacact tctgaacttg gcggagttta tggaacacga tgagagaccc

3540

cttcctattg atatccgtct gcttggtgct cttgcggaga agtgtcgagc atttgcaaag

3600

gccctacact acaaggaaat ggaatttgaa ggcgcacttt caaataggag ggatgcaaat

3660

cctgttgctg tagttgaagc tctaatccat ataaataatc aattacatca acatgaggca

3720

gctgttggaa tattaacata tgctcagcag catttggggg ttcaattgaa ggagtcatgg

3780

tacgagaaat tgcaacgctg ggatgatgct cttaaagcat acactgctaa ggcgtcacaa

3840

gcttcgagtc cacatcttgc tttggatgct actttagggc gtatgcgatg ccttgctgct

3900

ctagctcggt gggaggagct taacaatctt tgtaaggaat actggacacc agctgagcca

3960

gcagctcgac tggaaatggc accaatggct gctagtgcgg cctggaacat gggtgagtgg

4020

gatcagatgg cagagtatgt ttctcggctt gatgatggtg atgaaaccaa actgcgagtc

4080

ttgggaaata ccgctgccag tggcgatgga agtagtaatg gcaccttttt cagggctgtt

4140

cttctagttc ggcgagggaa gtacgatgaa gcacgtgaat atgttgaaag agcaaggaaa

4200

tgtttggcga ccgagctcgc tgcactggtt cttgagagct atgaacgtgc ttacagcaac

4260

atggtccgtg ttcagcagct ttctgaatta gaagaggtga ttgaatactg tactcttcct

4320

atgggaaacc ctgttgctga aggaagaaga gctcttgttc gcaatatgtg gaatgagcgc

4380

ataaagggta caaaaagaaa tgttgaggtt tggcaagtac ttttagctgt gagggcactt

4440

gtattgcctc ctacagaaga cattgaaaca tggatcaaat ttgcatcact ttgccggaag

4500

aatggcagaa ttagccaagc tagatctaca ttggttaaac ttttacagtt cgatccagaa

4560

tcaactcctg caactgtgcg gtatcatggt ccccctcagg tgatgctagc atacttaaag

4620

taccaatggt cacttggcga ggatcataag cgaaaggaag cctttgctag gttgcaggac

4680

cttgccatgg acctctcaag aacagcagct cttcaaccag tattgcagaa tggattagtt

4740

gcttcttctg gtgtgccact tgttgctcgt gtatatctca gactcggcac ttggaagtgg

4800

gcactttctc ctggtttgga tgatgattct attcaagaaa ttcttagtgc atttacaaat

4860

gctactcact gtgcaacgaa gtggggaaag gcatggcata cctgggcact tttcaatacc

4920

gcagtgatgt ctcattacac tctgagaggt tttgcgaata ttgcttcaca gtttgttgtt

4980

gctgccgtaa ctggttattt tcactctata gcatgcggag cacatgctaa gggtgttgat

5040

gatagtttac aggatattct tcgtcttctt actttgtggt tcaaccatgg agctacttcg

5100

gatgtccaaa tggcattgca gaaaggattc actcatgtta acatcaacac atggttggtt

5160

gttttacctc agattattgc acggatacat tcaaataacc atgctgtcag agaactgata

5220

caatccttgc tagtgcgaat tggacagagt catccacagg ctcttatgta tccgcttctt

5280

gtggcatgta agtcaattag caatttgcgc agagctgcgg ctcaagaagt ggttgataaa

5340

gttagacagc acagcggcgt actcgttgat caggcccaac ttgtctcaaa ggagcttatc

5400

agggttgcaa tactgtggca tgaaatgtgg catgaggcac tggaagaggc cagccgttta

5460

tattttggcg aacacaacat tgagggcatg ctgaaggtgt tagagcctct gcatgaaatg

5520

cttgaggaag gagcgatgag gaacaatacc actataaagg agaaagcatt catccaggca

5580

taccgtcttg agttgttgga ggcgtatgaa tgttgtatga agtatcggag aactggtaaa

5640

gatgctgaat taacgcaggc ttgggatctc tattatcatg tattcaggcg gatagataag

5700

cagcttcaaa cactcacaac cctggatttg cagtctgttt cccccgagtt actggagtgt

5760

cgaaatttgg agctagctgt tcctggaact tatatagcag atgcaccagt ggtgacaatt

5820

gcatcatttg caccccaact tgttgtaatt acatccaaac aacggcctcg aaaattgaca

5880

atccatggga gtgatggaga agactatgct tttttgctca aagggcacga agatctacgc

5940

caagatgaac gtgtcatgca gttgtttggt ctggttaata ctttgctcga gaattcaaga

6000

aagactgcag agaaagattt atcaattcaa cgatatgctg tcattccatt gtcccctaat

6060

agtggactga taggatgggt tccaaattgc gacaccttgc accagcttat tcgagaatat

6120

agggatgccc ggaagatcac cctaaatcaa gagcataaat tgatgctgag ttttgcaccg

6180

gattatgata atttgccact tattgctaag gtggaggtgt ttgaatatgc tttgcaaaat

6240

acagaaggga atgacttatc aagggttctt tggttaaaga gtcgtacttc tgaagtctgg

6300

ctggacagaa gaacaaatta tacaagaagt ttggctgtca tgagtatggt tggataccta

6360

cttggtctgg gtgatcgaca tcctagtaac ctcatgcttc accgatacag tgggaagatt

6420

ctgcatattg actttggaga ttgctttgaa gcttcaatga atcgggagaa gtttccagag

6480

aaggttccct ttcgactcac tagaatgctt gtaaaagcaa tggaggttag tggtatagag

6540

ggaaatttcc ggtcaacatg tgagaatgta atgcaagttc tccgactgca taaagatagt

6600

gttatggcta tgatggaggc ctttgttcac gatccactta taaattggcg tcttttcaac

6660

ttcaatgaag ttccgcaaat gtccgcactt gccagtgcac atgtccctcc tgttgtgaac

6720

agtgaggaat cttcttcaaa tagagagctt cttcagccac aaaggggtgc aagggagaga

6780

gaactgcttc aggcggtcaa tcaattaggt gatgccaatg aggttctaaa tgaacgtgct

6840

gtggctgtta tggctcgaat gagtaataaa ctcacaggac gtgattttgc tgctacttct

6900

acatctgcga gctctctaca acatgcactg gaccacagta cgttaatttc tggagagacg

6960

cgtgaagctg atcatggttt atcagtgaaa ctacaagtcc aaaaacttat tcaacaagcg

7020

tcgtctcatg aaaatctttg ccaaaattat gttgggtggt gtccattttg gtag

7074

<210> 106

<211> 1513

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на ген TOR N. benthamiana

<400> 106

tgaatttagg tgacactata gaacaaagaa gagctcagga aggatgctgt tgatgcactt

60

tgttgtctag ctcatgctct tggagaggac ttcaccattt ttattcattc tattcacaag

120

cttatggtta aacataggct gcagcacaag gaatttgaag aaatccgagg acgactggaa

180

aaacgtgagc cactgatttt ggggagcacc gcagctcaga gattaaatcg gcggttccca

240

gttgaggtca tcagtgatcc tttgagtgat ggagagaatg agcactacga ggttgggacg

300

gacatgcata agcagcttaa aagccatcag gttaatgatg gtagattgcg taccgctggt

360

gaggcttctc aacgaagcac taaagaggat tgggcagagt ggatgaggca tttcagcatt

420

gaacttctga aagaatcacc tagtccagca ttgcgaactt ttaagctgct tatgcatgtc

480

cgtcccaacc tcgtagtgct cattctctcc atcactcaaa ggatcactga tgacctcaac

540

tgggaaccgc cgatttaatc tctgagctgc ggtgctcccc aaaatcagtg gctcacgttt

600

ttccagtcgt cctcggattt cttcaaattc cttgtgctgc agcctatgtt taaccataag

660

cttgtgaata gaatgaataa aaatggtgaa gtcctctcca agagcatgag ctagacaaca

720

aagtgcatca acagcatcct tcctgagctc ttctttgttc ccgtccaaga caagcttcaa

780

gtgatgcaca agagaagata tgtgtccagt gacctgcaca cgaggtatca atcttgtgag

840

agttttgatt gcaccgcgtc ttacttctac tgaagcatcc aatttaaaca accgaataag

900

tgcaggaaga agcagatgca tatgctcatc taatgtccca ccaaaaactt caagtgtgtg

960

gagaatagga ataacgtatg tgtagtcact aaacctctct gcatcagtaa gaacttgaat

1020

acagcaggga agtatatcag caaggtactt tctaaattca cacatccgta agtatctgcc

1080

agagttactc tctctgatat cagaaatatg gtcatctttc agcttgcctg ttgctaacag

1140

acctgttcac attgctccta ttttgcatct cgtggagcaa ctttgcttgg ctctcaacga

1200

tgaatttaga aagtaccttg ctgatatact tccctgctgt attcaagttc ttactgatgc

1260

agagaggttt agtgactaca catacgttat tcctattctc cacacacttg aagtttttgg

1320

tgggacatta gatgagcata tgcatctgct tcttcctgca cttattcggt tgtttaaatt

1380

ggatgcttca gtagaagtaa gacgcggtgc aatcaaaact ctcacaagat tgatacctcg

1440

tgtgcaggtc actggacaca tatcttctct tgtgcatcac ttgaagcttg tcttggacgg

1500

cccgggactc gaa

1513

<210> 107

<211> 1941

<212> ДНК

<213> Hordeum vulgare

<400> 107

atggccgcag ccacctccgc cgccgtcgca ttctcgggcg ccgccgccgc cgccgcggcc

60

ttacccaagc ccgccctcca tcctctcccg cgccaccagc ccgcctcgcg ccgcgcgctc

120

cccgcccgcg tcgtcaggtg ctgcgccgcg tcccccgccg ccaccacggc cgcgcctccc

180

cccacctctc tccggccgtg ggggccctcc gagccccgca agggcgccga catcctcgtc

240

gaggcgctcg agcgctgcgg catcgtcgac gtcttcgcct accccggcgg cgcgtccatg

300

gagatccacc aggcgctcac gcgctcgccc gtcatcacca accacctctt ccgccacgag

360

cagggggagg cgttcgcagc gtccgggtac gcacgcgcgt ccggccgcgt cggcgtctgc

420

gtcgccacct ccggccccgg ggccaccaac ctcgtctccg cgctcgccga cgctctcctc

480

gactccatcc ccatggtcgc catcacgggc caggtcccac gccgcatgat cggcacggac

540

gcgttccagg agacgcccat agtggaggtc acgcgctcca tcaccaagca caactacctg

600

gtccttgacg tggaggacat cccccgcgtc atccaggaag ccttcttcct cgcgtcctct

660

ggccgcccgg ggcctgtgct ggttgatatc cccaaggaca tccagcagca gatggccgtg

720

cctgtttggg acacgccgat gagtttgcca gggtacatcg cccgcctgcc caagccacca

780

tctactgaat cgcttgagca ggtcctgcgc ctggttggcg aggcacggcg cccgattctg

840

tatgttggtg gcggctgcgc tgcatctggc gaggagttgc gccgctttgt tgagctcact

900

ggaattccag ttacaactac tctgatgggc cttggcaact tccccagtga cgacccactg

960

tcactgcgca tgcttgggat gcatggtacc gtgtatgcaa attatgcagt agataaggct

1020

gacctgttgc ttgcatttgg tgtgcggttt gatgatcgcg tgactgggaa aattgaggct

1080

tttgcaagca ggtccaagat tgtgcacatt gacattgatc cagctgagat tggcaagaac

1140

aagcagccac atgtctccat ttgtgcagat gttaagcttg ctttacaggg gttgaatggt

1200

ctattaagtg gcagcaaagc acaacagggt ctagattttg gtccatggca caaggagttg

1260

gatcagcaga agagggagtt tcctctagga tacaagactt ttggtgaggc aatcccaccg

1320

cagtatgcta tccaggtact ggatgagctg acaaaagggg aggcgattat tgccacaggt

1380

gttgggcagc atcagatgtg ggcggctcag tattacactt acaagcggcc acgtcagtgg

1440

ctgtcttcgt ctggtttggg ggcaatggga tttgggttgc cagctgcagc tggcgcttct

1500

gtggccaacc caggtgtcac agttgttgac attgatgggg atggtagttt cctcatgaac

1560

attcaggagt tggcgttgat ccgtattgag aacctcccag tgaaggtgat gatattgaac

1620

aaccagcacc tgggaatggt ggtgcagtgg gaggataggt tttacaaggc caaccgggcg

1680

cacacatacc ttggcaaccc agaaaatgag agtgagatat atccagattt tgtgacgatt

1740

gctaaaggat tcaacgttcc ggcagttcgt gtgacaaaga agagtgaagt cagtgcagct

1800

atcaagaaga tgcttgagac cccagggccg tacctgctgg atatcattgt cccgcatcag

1860

gagcacgtgc tgcctatgat cccaagcggt ggtgctttca aggacatgat catggagggt

1920

gatggcagga cctcgtatta a

1941

<210> 108

<211> 1505

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая кпРНК направленно воздействующую на

ген

ALS ячменя (H. vulgare)

<400> 108

agatttaggt gacactatag aatggtggtg cagtgggagg ataggtttta caaggccaac

60

cgggcgcaca cataccttgg caacccagaa aatgagagtg agatatatcc agattttgtg

120

acgattgcta aaggattcaa cgttccggca gttcgtgtga caaagaagag tgaagtcagt

180

gcagctatca agaagatgct tgagacccca gggccgtacc tgctggatat cattgtcccg

240

catcaggagc acgtgctgcc tatgatccca aacggtggtg ctttcaagga catgatcatg

300

gagggtgatg gcaggacctc gtattaatct gaatttcgac ctacaagacc tacaagtgtg

360

acatgcgcaa tcagcatgat gcctgcgtgt tgtatcaact actaggggtt cgactgtgaa

420

ccatgcgttt ttctagttta cttgtttcat tcatataaga ggtcctgcca tcaccctcca

480

tgatcatgtc cttgaaagca ccaccgtttg ggatcatagg cagcacgtgc tcctgatgcg

540

ggacaatgat atccagcagg tacggccctg gggtctcaag catcttcttg atagctgcac

600

tgacttcact cttctttgtc acacgaactg ccggaacgtt gaatccttta gcaatcgtca

660

caaaatctgg atatatctca ctctcatttt ctgggttgcc aaggtatgtg tgcgcccggt

720

tggccttgta aaacctatcc tcccactgca ccaccattcc caggtgctgg ttgttcaata

780

tcatcacctt cactgggagg ttctcaatac ggatcaacgc caactcctga atgttcatga

840

ggaaactacc atccccatca atgtcaacaa ctgtgacacc tgggttggcc acagaagcgc

900

cagctgcagc tggcaaccca aatcccattg cccccaaacc agacgaagac agccactgac

960

gtggccgctt gtaagtgtaa tactgagccg cccacatctg atgctgccca acacctgtgg

1020

caataatcgc ctcccctttt gtcagctcat ccagtacctg aatggtctat taagtggcag

1080

caaagcacaa cagggtctag attttggtcc atggcacaag gagttggatc agcagaagag

1140

ggagtttcct ctaggataca agacttttgg tgaggcaatc ccaccgcagt atgctatcca

1200

ggtactggat gagctgacaa aaggggaggc gattattgcc acaggtgttg ggcagcatca

1260

gatgtgggcg gctcagtatt acacttacaa gcggccacgt cagtggctgt cttcgtctgg

1320

tttgggggca atgggatttg ggttgccagc tgcagctggc gcttctgtgg ccaacccagg

1380

tgtcacagtt gttgacattg atggggatgg tagtttcctc atgaacattc aggagttggc

1440

gttgatccgt attgagaacc tcccagtgaa ggtgatgata ttgaacaacc agcacctggc

1500

ccggg

1505

<210> 109

<211> 1824

<212> ДНК

<213> Hordeum vulgare

<400> 109

atgcagactc tgtcggcgca gcccctcgcc tcctcctctt cgatacagcg ccaccatggg

60

cgccgacgcg gccccggctc cgtccggttc gctccccgcg cggccgccgc ggctgccgcc

120

acgtccacca gcacggcccg ctcgccggcg tacgtctcgt cgccgtccac gaggaaggtg

180

cccgggtacg agcagtcgtc gccgcctgcc attgcctcgc cgcagaagca ggggagcagc

240

ggcggcgagg gcgagcagag cctcaacttc ttccagcgcg cggcggccgc ggcgctcgac

300

gcgttcgagg aggggttcat caacaatgtc ctggagcggc cccacgcgct gccgcgcacg

360

gccgacccgg ccgtgcagat cgccggcaac ttcgcccccg tcggcgagca gccccccgtg

420

cgcgccctca cggtctccgg ccgcatcccg cccttcatca acggcgtcta cgcccgcaac

480

ggcgccaacc cctgcttcga gcccacggcc ggccaccacc tcttcgacgg cgacggcatg

540

gtccacgcca tccgcatccg aaacggcgcc gccgagtcct acgcctgccg cttcaccgag

600

accgcccgcc tctcccagga gcgcgccgcg gggaggcccg tcttccctaa gaccatcggc

660

gagctccacg gccactctgg catcgcgagg ctggccctct tctacgcgcg cggcgcctgc

720

ggcctcgtcg acccgtccca cggcactggt gttgccaacg ccggcctcgt ctacttcaac

780

ggccgcctcc tcgccatgtc cgaggacgac ctcccgtacc aggtccgcgt caccgccggt

840

ggcgacctcg agaccgtcgg ccgctacgac ttcgacggcc agctcgactg cgccatgatc

900

gcgcacccca agctcgaccc tgtctccggc gagctcttcg cgctcagcta cgatgtcatc

960

aagaagccgt acctcaagta cttctacttc cacgccgacg gcaccaagtc cgccgacgtc

1020

gagatcgagc tcgaccagcc caccatgatc cacgacttcg ccatcaccga gaacttcgtc

1080

gtcgtgcccg accaccagat ggtgttcaag ctcgccgaga tgttccgcgg cggctcgccg

1140

gtgatgctcg acaaggagaa gacctcccgc ttcggcgtcc tcccaaagta cgccaaggac

1200

tcgtcggaga tgatgtgggt ggacgtgccg gactgcttct gtttccacct ctggaactcg

1260

tgggaggagc cggagacgga cgaggtggtg gtgatcggct cctgcacgac ccccgcagac

1320

tccatcttca acgacacgga cgaccacctc gagagcgtgc tcaccgagat ccggctcaac

1380

acgcgcaccg gcgagtccac gcggcgggcc atcctgccgc tggagagcca ggtgaacctc

1440

gaggtcggca tggtgaaccg caacatgctg ggccggaaga cgaggtacgc ctacctggcc

1500

gtggccgagc cgtggcccaa ggtgtccggg ttcgccaagg tggacctggt gaccggcgag

1560

ctgaccaagt tcgagtacgg cgagggccgg ttcggcggcg agccgtgctt cgtgcccatg

1620

gacggcgagc acgcgcgccc cggcgccgag gacgacggct acgtgctctc cttcgtgcgc

1680

gacgaggacg ccggcacatc cgagctcctg gtcgtcaacg ccgccgacat gcggctcgag

1740

gccaccgtgc agctgccgtc ccgggtcccc tatggcttcc acggcacatt catcggcgac

1800

gccgacctcg acgcccagca ctaa

1824

<210> 110

<211> 1779

<212> ДНК

<213> Hordeum vulgare

<400> 110

atgcagacac tcacagcgtc cagctcggtc tcctccatac agcggcaccg gccgcacccc

60

gcgggccgcc ggtccagctc ggtcaccttc tccgcccgcg ccgtcagctc cgcgccgcgc

120

gcgccggcac cgtcccggtt cgtgcgcggc gccgacgcgg cgcccgccaa gcccctcatt

180

gccgtcccca agccgcccgc cgtggagagg caggagaaga agctcaactt cttccagcgc

240

gccgcggtca cggcgctcga cgcgttcgag gaaggatttg tggccaacgt gctcgagcgc

300

ccgcacggcc tctccaggac ggtcgacccc gcggtgcaga tcgccggcaa cttcgcgcct

360

gtcggggaga cacctcctgt gcaggcgctg cccgtgaccg accgcatccc cccgttcatc

420

aacggcgtgt acgcccgcaa cggcgccaac ccgcacttcg accccgtcgc cgggcaccac

480

ctgttcgacg gcgacggcat ggtgcacgct ctgcgcatcc gcaacggcgt cgccgagacc

540

tacgcctccc gcttcaccga gacggagcgc ctgcagcagg agcgcgcgct ggggcgcccg

600

atgttcccca aggccattgg tgagctccat ggccactctg ggatcgcgcg ccttgctctg

660

ttctacgcgc gcgcggcctg cggcctcatc gacccctcgc gcggcaccgg cgtggccaac

720

gccggcctgg tctacttcaa cggccacctc ctcgccatgt ccgaggacga catcccgtac

780

cacgtccgcg tcaccgacga cggcgacctc cagaccgtcg gccgctacga cttcgacggg

840

cagctcgagt gccccatgat cgcgcacccc aaactcgacc ccgccaccgg ggagctccac

900

gcgctcagct acgacgtcat caagaagcct tacctgaagt acttctactt cgcggccgac

960

ggcaccaagt cggccgacgt cgagatcccg ctggaccagc ccaccatgat ccacgacttc

1020

gccatcaccg agaattacgt ggtcgtgccc gaccaccagg tggtgttcaa gctgcaggag

1080

atgctgcgcg gcggctcgcc cgtggtgctc gacaaggaga agacgtcccg cttcggcgtg

1140

ctgcccaagt gcgccgccga cgcgtcggag atggtgtggg tggacgtgcc ggactgcttc

1200

tgcttccacc tctggaacgc gtgggaggag gaggagaccg acgaggtggt ggtgatcggc

1260

tcctgcatga cccccgccga ctccatcttc aacgagtcgg acgagtgcct cgagagcgtg

1320

ctcacggaga tccgcctcaa cacccgcacc ggcgagtcca cgcggcgccc catcctggcg

1380

ctgtcagagc aggtgaacct ggaggtcggc atggtgaact ccaacctgct gggccgcaag

1440

acgcggtacg cctacctggc cgtggccgag ccgtggccca aggtgtccgg cttcgccaag

1500

gtcgacctgg ccacgggcga gctcaccaaa ttcgagtacg gcgagggccg gttcggcggc

1560

gagccctgct tcgtgcccat ggacccggcc acgtcccgcg gcgaggacga cgggtacatt

1620

ctcaccttcg tgcacgacga ggccgccggc acgtcggagc tgctggtggt caatgccgcc

1680

gacatgcggc tggaggcgac catccagctg ccgtcccgcg tgccatacgg gttccacggc

1740

accttcatca ccggcaagga gctcgaatcc caggcctga

1779

<210> 111

<211> 1500

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на гены NCED1 ячменя Hordeum vulgare и пшеницы

Triticum aestivum

<400> 111

taatacgact cactataggg tcgacgaggc cgcaggcgcc gcgcgcgtag aagagggcca

60

gcctcgcgat gccagagtgg ccgtggagct cgccgatggt cttagggaag acgggcctcc

120

ccgcggcgcg ctcctgggag aggcgggcgg tctcggtgaa gcggcaggcg taggactcgg

180

cggcgccgtt tcggatgcgg atggcgtgga ccatgccgtc gccgtcgaag aggtggtggc

240

cggccgtggg ctcgaagcag gggttggcgc cgttgcgggc gtagacgccg ttgatgaagg

300

gcgggatgcg gccggagacc gtgagggcgc gcacgggggg ctgctcgccg acgggggcga

360

agttgccggc gatctgcacg gccgggtcgg ccgtgcgcgg cagcgcgtgg ggccgctcca

420

ggacattgtt gatgaacccc tcctcgaacg cgtcgagctc cggccgcatc ccgcccttca

480

tcaacggcgt ctacgcccgc aacggcgcca acccctgctt cgagcccacg gccggccacc

540

acctcttcga cggcgacggc atggtccacg ccatccgcat ccgaaacggc gccgccgagt

600

cctacgcctg ccgcttcacc gagaccgccc gcctctccca ggagcgcgcc gcggggaggc

660

ccgtcttccc taagaccatc ggcgagctcc acggccactc tggcatcgcg aggctggccc

720

tcttctacgc gcgcggcgcc tgcggcctcg tcgacccgta ccacggcact ggtgttgcca

780

acgccggcct cgtctacttc aacggccgcc tcctcgccat gtccgaggac gacctcccgt

840

accaggtccg cgtcaccgcc ggtggcgacc tcgagaccgt cggccgctac gacttcgacg

900

gccagctcga ctgcgccatg atcgcgcacc ccaagctcga ccctgtctcc ggcgagctct

960

tcgcgctcag ctacgatgtc atcaagaagc cgtacctcaa gtacttctac ttcacgcccg

1020

acggcaccaa gtccgccgac gtcgagatcg agctcgacga agcgggaggt cttctccttg

1080

tcgagcatca ccggcgagcc gccgcggaac atctcggcga gcttgaacac catctggtgg

1140

tcgggcacga cgacgaagtt ctcggtgatg gcgaagtcgt ggatcatggt gggctggtcg

1200

agctcgatct cgacgtcggc ggacttggtg ccgtcgggcg tgaagtagaa gtacttgagg

1260

tacggcttct tgatgacatc gtagctgagc gcgaagagct cgccggagac agggtcgagc

1320

ttggggtgcg cgatcatggc gcagtcgagc tggccgtcga agtcgtagcg gccgacggtc

1380

tcgaggtcgc caccggcggt gacgcggacc tggtacggga ggtcgtcctc ggacatggcg

1440

aggaggcggc cgttgaagta gacgaggccg gcgttggcaa caccagtgcc gtggtacgta

1500

<210> 112

<211> 1500

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на гены NCED2 ячменя Hordeum vulgare и пшеницы

Triticum aestivum

<400> 112

taatacgact cactataggg ttggcgccgt tgcgggcgta cacgccgttg atgaacgggg

60

ggatgcggtc ggtcacgggc agcgcctgca caggaggtgt ctccccgaca ggcgcgaagt

120

tgccggcgat ctgcaccgcg gggtcgaccg tcctggagag gccgtgcggg cgctcgagca

180

cgttggccac aaatccttcc tcgaacgcgt cgagcgccgt gaccgcggcg cgctggaaga

240

agttgagctt cttctcctgc ctctccacgg cgggcggctt ggggacggca atgaggggct

300

tggcgggcgc cgcgtcggcg ccgcgcacga accgggacgg tgccggcgcg cgcggcgcgg

360

agctgacggc gcgggcggag aaggtgaccg agctggaccg gcggcccgcg gggtgcggcc

420

ggtgccgctg tatggaggag accgagctgg acgctgtcga cgcggcgccc gccaagcccc

480

tcattgccgt ccccaagccg cccgccgtgg agaggcagga gaagaagctc aacttcttcc

540

agcgcgccgc ggtcacggcg ctcgacgcgt tcgaggaagg atttgtggcc aacgtgctcg

600

agcgcccgca cggcctctcc aggacggtcg accccgcggt gcagatcgcc ggcaacttcg

660

cgcctgtcgg ggagacacct cctgtgcagg cgctgcccgt gaccgaccgc atccccccgt

720

tcatcaacgg cgtgtacgcc cgcaacggcg ccaacccgta cttcgacccc gtcgccgggc

780

accacctgtt cgacggcgac ggcatggtgc acgctctgcg catccgcaac ggcgtcgccg

840

agacctacgc ctcccgcttc accgagacgg agcgcctgca gcaggagcgc gcgctggggc

900

gcccgatgtt ccccaaggcc attggtgagc tccatggcca ctctgggatc gcgcgccttg

960

ctctgttcta cgcgcgcgcg gcctgcggcc tcatcgaccc ctcgcgcggc accggcgtgg

1020

ccaacgccgg cctggtctac ttcaacggcc acctcctccc cggtggcggg gtcgagtttg

1080

gggtgcgcga tcatggggca ctcgagctgc ccgtcgaagt cgtagcggcc gacggtctgg

1140

aggtcgccgt cgtcggtgac gcggacgtgg tacgggatgt cgtcctcgga catggcgagg

1200

aggtggccgt tgaagtagac caggccggcg ttggccacgc cggtgccgcg cgaggggtcg

1260

atgaggccgc aggccgcgcg cgcgtagaac agagcaaggc gcgcgatccc agagtggcca

1320

tggagctcac caatggcctt ggggaacatc gggcgcccca gcgcgcgctc ctgctgcagg

1380

cgctccgtct cggtgaagcg ggaggcgtag gtctcggcga cgccgttgcg gatgcgcaga

1440

gcgtgcacca tgccgtcgcc gtcgaacagg tggtgcccgg cgacggggtc gaagtacgta

1500

<210> 113

<211> 1521

<212> ДНК

<213> Hordeum vulgare

<400> 113

atggccttct tcctcctcct gtgcatcctc gtctctgtgg ccatcgtgtc ctacgcccac

60

cacgcaatcc ggcggaggcg ccagggctgc gctcatggcc gtcatgagca ggccgccctc

120

aagctgcccc ccggctccat gggcctgcct tacgtcggcg agaccctgca gctctactcc

180

caggacccca gcgtcttcct ctcctccaag cagaagcggt acggcgagat cttcaagacg

240

cacctcctgg ggtgcccgtg cgtgatgctg gcgagcccgg aggcggcgcg cttcgtgctg

300

gtgtcgcggg cccacctctt caagccgacg tacccgcgga gcaaggagcg cctcatcggc

360

ccgtcggcgc tcttcttcca ccagggcgac taccacctcc gcctccgccg gctcgtccag

420

ggcccgctcg gccccgaggc cctgcgcaag ctcgtgccgg acatcgaggc cgccgttcgc

480

tccacgctcg ccgcctgggc ggacggcgac gtcgccagca ctttccacgc catgaagagg

540

ctctcgttcg acgtcggcat cgtgacgatc ttcggcgggc ggctggacga gcggcggaag

600

gaggagctca ggcggaacta cgccgtcgtg gagaaaggct acaactcctt ccccaacagc

660

ttccccggga cgctatacta caaggcgatc caggcgaggc ggcggctgaa cggcgtgctg

720

agcgacgtcg tgcacgagcg tagggagcgg ggcgagcacg gcgacgacct cctcggctgc

780

ctcatgcggt cgcgggccgg cggcgacgac gccgacgacg agggcgcgct gctgacggac

840

gagcaggtcg ccgacaacgt catcggcgtg ctgttcgcgg cgcaggacac gacggccagc

900

gtgctcacct ggatcgtcaa gtacctccac gaccgcccga agctgctcga ggccgtcagg

960

gcggagcacg cggcgatcca cgaggccaac gacggcggga ggcggccgct gacatgggcg

1020

cagacgagga gcatgacgct gacgcacagg gtgattttgg agagcctaag gatggccagc

1080

atcatctcct tcacgttcag ggaggccgtg gccgacgtgg agtacaaagg gtttcttatc

1140

cccaaggggt ggaaggtgat gccgctcttc aggaacatcc atcacagccc ggactacttc

1200

caggatccac acaagttcga cccttcgcga ttcaaggtgg cgccgcggcc gaacaccttc

1260

acsccgttcg ggagcggggt gcacgcgtgc ccggggaacg agctggccaa gctcgagatg

1320

ctggtgctca tccaccacct ggtcaccggc tacaggtggg aggttgttgg atcgagcgac

1380

gacgtcgagt acagcccatt ccccgttccc cgccatggcc tgctcgccag ggtacggcga

1440

gatgacggcg tctgcgcggg taggaagggg tgcccgactg atgaagatga caactacgac

1500

gacgacgaag tgatagtgtg a

1521

<210> 114

<211> 1506

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на гены ABA-OH-2 ячменя Hordeum vulgare и

пшеницы

Triticum aestivum

<400> 114

taatacgact cactataggg cggtcgtgga ggtacttgac gatccaggtg agcacgctgg

60

ccgtcgtgtc ctgcgccgcg aacagcacgc cgatgacgtt gtcggcgacc tgctcgtccg

120

tcagcagcgc gccctcgtcg tcggcgtcgt cgccgccggc ccgcgaccgc atgaggcagc

180

cgaggaggtc gtcgccgtgc tcgccccgct ccctacgctc gtgcacgacg tcgctcagca

240

cgccgttcag ccgccgcctc gcctggatcg ccttgtagta tagcgtcccg gggaagctgt

300

tggggaagga gttgtagcct ttctccacga cggcgtagtt ccgcctgagc tcctccttcc

360

gccgctcgtc cagccgcccg ccgaagatcg tcacgatgcc gacgtcgaac gagagcctct

420

tcatggcgtg gaaagtgctg gcgacgtcgc cgtccgccta caactccttc cccaacagct

480

tccccgggac gctatactac aaggcgatcc aggcgaggcg gcggctgaac ggcgtgctga

540

gcgacgtcgt gcacgagcgt agggagcggg gcgagcacgg cgacgacctc ctcggctgcc

600

tcatgcggtc gcgggccggc ggcgacgacg ccgacgacga gggcgcgctg ctgacggacg

660

agcaggtcgc cgacaacgtc atcggcgtgc tgttcgcggc gcaggacacg acggccagcg

720

tgctcacctg gatcgtcaag tacctccacg accgcccgta gctgctcgag gccgtcaggg

780

cggagcacgc ggcgatccac gaggccaacg acggcgggag gcggccgctg acatgggcgc

840

agacgaggag catgacgctg acgcacaggg tgattttgga gagcctaagg atggccagca

900

tcatctcctt cacgttcagg gaggccgtgg ccgacgtgga gtacaaaggg tttcttatcc

960

ccaaggggtg gaaggtgatg ccgctcttca ggaacatcca tcacagcccg gactacttcc

1020

aggatccaca caagttcgac ccttcgcgat tcaaggtcgc tcgatccaac aacctcccac

1080

ctgtagccgg tgaccaggtg gtggatgagc accagcatct cgagcttggc cagctcgttc

1140

cccgggcacg cgtgcacccc gctcccgaac ggagtgaagg tgttcggccg cggcgccacc

1200

ttgaatcgcg aagggtcgaa cttgtgtgga tcctggaagt agtccgggct gtgatggatg

1260

ttcctgaaga gcggcatcac cttccacccc ttggggataa gaaacccttt gtactccacg

1320

tcggccacgg cctccctgaa cgtgaaggag atgatgctgg ccatccttag gctctccaaa

1380

atcaccctgt gcgtcagcgt catgctcctc gtctgcgccc atgtcagcgg ccgcctcccg

1440

ccgtcgttgg cctcgtggat cgccgcgtgc tccgccctga cggcctcgag cagctacgta

1500

ggtacc

1506

<210> 115

<211> 3885

<212> ДНК

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 115

atggaagctg aaattgtgaa tgtgagacct cagctagggt ttatccagag aatggttcct

60

gctctacttc ctgtcctttt ggtttctgtc ggatatattg atcccgggaa atgggttgca

120

aatatcgaag gaggtgctcg tttcgggtat gacttggtgg caattactct gcttttcaat

180

tttgccgcca tcttatgcca atatgttgca gctcgcataa gcgttgtgac tggtaaacac

240

ttggctcaga tctgcaatga agaatatgac aagtggacgt gcatgttctt gggcattcag

300

gcggagttct cagcaattct gctcgacctt accatggttg tgggagttgc gcatgcactt

360

aaccttttgt ttggggtgga gttatccact ggagtgtttt tggccgccat ggatgcgttt

420

ttatttcctg ttttcgcctc tttccttgaa aatggtatgg caaatacagt atccatttac

480

tctgcaggcc tggtattact tctctatgta tctggcgtct tgctgagtca gtctgagatc

540

ccactctcta tgaatggagt gttaactcgg ttaaatggag agagcgcatt cgcactgatg

600

ggtcttcttg gcgcaagcat cgtccctcac aatttttata tccattctta ttttgctggg

660

gaaagtacat cttcgtctga tgtcgacaag agcagcttgt gtcaagacca tttgttcgcc

720

atctttggtg tcttcagcgg actgtcactt gtaaattatg tattgatgaa tgcagcagct

780

aatgtgtttc acagtactgg ccttgtggta ctgacttttc acgatgcctt gtcactaatg

840

gagcaggtat ttatgagtcc gctcattcca gtggtctttt tgatgctctt gttcttctct

900

agtcaaatta ccgcactagc ttgggctttc ggtggagagg tcgtcctgca tgacttcctg

960

aagatagaaa tacccgcttg gcttcatcgt gctacaatca gaattcttgc agttgctcct

1020

gcgctttatt gtgtatggac atctggtgca gacggaatat accagttact tatattcacc

1080

caggtcttgg tggcaatgat gcttccttgc tcggtaatac cgcttttccg cattgcttcg

1140

tcgagacaaa tcatgggtgt ccataaaatc cctcaggttg gcgagttcct cgcacttaca

1200

acgtttttgg gatttctggg gttgaatgtt gtttttgttg ttgagatggt atttgggagc

1260

agtgactggg ctggtggttt gagatggaat accgtgatgg gcacctcgat tcagtacacc

1320

actctgcttg tatcgtcatg tgcatcctta tgcctgatac tctggctggc agccacgccg

1380

ctgaaatctg cgagtaacag agcggaagct caaatatgga acatggatgc tcaaaatgct

1440

ttatcttatc catctgttca agaagaggaa attgaaagaa cagaaacaag gaggaacgaa

1500

gacgaatcaa tagtgcggtt ggaaagcagg gtaaaggatc agttggatac tacgtctgtt

1560

actagctcgg tctatgattt gccagagaac attctaatga cggatcaaga aatccgttcg

1620

agccctccag aggaaagaga gttggatgta aagtactcta cctctcaagt tagtagtctt

1680

aaggaagact ctgatgtaaa ggaacagtct gtattgcagt caacagtggt taatgaggtc

1740

agtgataagg atctgattgt tgaaacaaag atggcgaaaa ttgaaccaat gagtcctgtg

1800

gagaagattg ttagcatgga gaataacagc aagtttattg aaaaggatgt tgaaggggtt

1860

tcatgggaaa cagaagaagc taccaaagct gctcctacaa gcaactttac tgtcggatct

1920

gatggtcctc cttcattccg cagcttaagt ggggaagggg gaagtgggac tggaagcctt

1980

tcacggttgc aaggtttggg acgtgctgcc cggagacact tatctgcgat ccttgatgaa

2040

ttttggggac atttatatga ttttcatggg caattggttg ctgaagccag ggcaaagaaa

2100

ctagatcagc tgtttggcac tgatcaaaag tcagcctctt ctatgaaagc agattcgttt

2160

ggaaaagaca ttagcagtgg atattgcatg tcaccaactg cgaagggaat ggattcacag

2220

atgacttcaa gtttatatga ttcactgaag cagcagagga caccgggaag tatcgattcg

2280

ttgtatggat tacaaagagg ttcgtcaccg tcaccgttgg tcaaccgtat gcagatgttg

2340

ggtgcatatg gtaacaccac taataataat aatgcttacg aattgagtga gagaagatac

2400

tctagcctgc gtgctccatc atcttcagag ggttgggaac accaacaacc agctacagtt

2460

cacggatacc agatgaagtc atatgtagac aatttggcaa aagaaaggct tgaagcctta

2520

caatcccgtg gagagatccc gacatcgaga tctatggcgc ttggtacatt gagctataca

2580

cagcaacttg ctttagcctt gaaacagaag tcccagaatg gtctaacccc tggaccagct

2640

cctgggtttg agaattttgc tgggtctaga agcatatcgc gacaatctga aagatcttat

2700

tacggtgttc catcttctgg caatactgat actgttggcg cagcagtagc caatgagaaa

2760

aaatatagta gcatgccaga tatctcagga ttgtctatgt ccgcaaggaa catgcattta

2820

ccaaacaaca agagtggata ctgggatccg tcaagtggag gaggagggta tggtgcgtct

2880

tatggtcggt taagcaatga atcatcgtta tattctaatt tggggtcacg ggtgggagta

2940

ccctcgactt atgatgacat ttctcaatca agaggaggct acagagatgc ctacagtttg

3000

ccacagagtg caacaacagg gaccggatcg ctttggtcca gacagccctt tgagcagttt

3060

ggtgtagcgg agaggaatgg tgctgttggt gaggagctca ggaatagatc gaatccgatc

3120

aatatagaca acaacgcttc ttctaatgtt gatgcagagg ctaagcttct tcagtcgttc

3180

aggcactgta ttctaaagct tattaaactt gaaggatccg agtggttgtt tggacaaagc

3240

gatggagttg atgaagaact gattgaccgg gtagctgcac gagagaagtt tatctatgaa

3300

gctgaagctc gagaaataaa ccaggtgggt cacatggggg agccactaat ttcatcggtt

3360

cctaactgtg gagatggttg cgtttggaga gctgatttga ttgtgagctt tggagtttgg

3420

tgcattcacc gtgtccttga cttgtctctc atggagagtc ggcctgagct ttggggaaag

3480

tacacttacg ttctcaaccg cctacaggga gtgattgatc cggcgttctc aaagctgcgg

3540

acaccaatga caccgtgctt ttgccttcag attccagcga gccaccagag agcgagtccg

3600

acttcagcta acggaatgtt acctccggct gcaaaaccgg ctaaaggcaa atgcacaacc

3660

gcagtcacac ttcttgatct aatcaaagac gttgaaatgg caatctcttg tagaaaaggc

3720

cgaaccggta cagctgcagg tgatgtggct ttcccaaagg ggaaagagaa tttggcttcg

3780

gttttgaagc ggtataaacg tcggttatcg aataaaccag taggtatgaa tcaggatgga

3840

cccggttcaa gaaaaaacgt gactgcgtac ggatcattgg gttga

3885

<210> 116

<211> 1080

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на ген EIN2 A. thaliana

<400> 116

taatacgact cactataggg agctgcaaca tattggcata agatggcggc aaaattgaaa

60

agcagagtaa ttgccaccaa gtcatacccg aaacgagcac ctccttcgat atttgcaacc

120

catttcccgg gatcaatata tccgacagaa accaaaagga caggaagtag agcaggaacc

180

attctctgga taaaccctag ctgaggtctc acattcacaa tttcagcttc catcctaaat

240

ctatctgata atataattac tcagagtagg attcaaggta aactctacag tcgtggttca

300

ctaaaagcct cagttgagta aaattcacag atttgatcta aaacacctga atgtgagacc

360

tcagctaggg tttatccaga gaatggttcc tgctctactt cctgtccttt tggtttctgt

420

cggatatatt gatcccggga aatgggttgc aaatatcgaa ggaggtgctc gtttcgggta

480

tgacttggtg gcaattactc tgcttttcaa ttttgccgcc atcttatgcc aatatgttgc

540

agctcccaac agcgttgtga ctggtaaaca cttggctcag atctgcaatg aagaatatga

600

caagtggacg tgcatgttct tgggcattca ggcggagttc tcagcaattc tgctcgacct

660

taccatggtt gtgggagttg cgcatgcact taaccttttg tttggggtgg agttatccac

720

tggagtgttt ttggccgcca tggatgcgag tgggatctca gactgactca gcaagacgcc

780

agatacatag agaagtaata ccaggcctgc agagtaaatg gatactgtat ttgccatacc

840

attttcaagg aaagaggcga aaacaggaaa taaaaacgca tccatggcgg ccaaaaacac

900

tccagtggat aactccaccc caaacaaaag gttaagtgca tgcgcaactc ccacaaccat

960

ggtaaggtcg agcagaattg ctgagaactc cgcctgaatg cccaagaaca tgcacgtcca

1020

cttgtcatat tcttcattgc agatctgagc caagtgttta ccagtcacaa cgctgttgac

1080

<210> 117

<211> 1188

<212> ДНК

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 117

atggtgatgg ctggtgcttc ttctttggat gagatcagac aggctcagag agctgatgga

60

cctgcaggca tcttggctat tggcactgct aaccctgaga accatgtgct tcaggcggag

120

tatcctgact actacttccg catcaccaac agtgaacaca tgaccgacct caaggagaag

180

ttcaagcgca tgtgcgacaa gtcgacaatt cggaaacgtc acatgcatct gacggaggaa

240

ttcctcaagg aaaacccaca catgtgtgct tacatggctc cttctctgga caccagacag

300

gacatcgtgg tggtcgaagt ccctaagcta ggcaaagaag cggcagtgaa ggccatcaag

360

gagtggggcc agcccaagtc aaagatcact catgtcgtct tctgcactac ctccggcgtc

420

gacatgcctg gtgctgacta ccagctcacc aagcttcttg gtctccgtcc ttccgtcaag

480

cgtctcatga tgtaccagca aggttgcttc gccggcggta ctgtcctccg tatcgctaag

540

gatctcgccg agaacaatcg tggagcacgt gtcctcgttg tctgctctga gatcacagcc

600

gttaccttcc gtggtccctc tgacacccac cttgactccc tcgtcggtca ggctcttttc

660

agtgatggcg ccgccgcact cattgtgggg tcggaccctg acacatctgt cggagagaaa

720

cccatctttg agatggtgtc tgccgctcag accatccttc cagactctga tggtgccata

780

gacggacatt tgagggaagt tggtctcacc ttccatctcc tcaaggatgt tcccggcctc

840

atctccaaga acattgtgaa gagtctagac gaagcgttta aacctttggg gataagtgac

900

tggaactccc tcttctggat agcccaccct ggaggtccag cgatcctaga ccaggtggag

960

ataaagctag gactaaagga agagaagatg agggcgacac gtcacgtgtt gagcgagtat

1020

ggaaacatgt cgagcgcgtg cgttctcttc atactagacg agatgaggag gaagtcagct

1080

aaggatggtg tggccacgac aggagaaggg ttggagtggg gtgtcttgtt tggtttcgga

1140

ccaggtctca ctgttgagac agtcgtcttg cacagcgttc ctctctaa

1188

<210> 118

<211> 1080

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на ген CHS A. thaliana

<400> 118

taatacgact cactataggg gccacaccat ccttagctga cttcctcctc atctcgtcta

60

gtatgaagag aacgcacgcg ctcgacatgt ttccatactc gctcaacacg tgacgtgtcg

120

ccctcatctt ctcttccttt agtcctagct ttatctccac ctggtctagg atcgctggac

180

ctccagggtg ggctatccag aagagggagt tccagtcact tatccccaaa ggtttaaacg

240

cttcgtctag actcttcaca atgttcttgg agatgaggcc gggaacatcc ttgaggagat

300

ggaaggtgag accaacttcc ctcaaatgtc cgtctatggc accatcagac tggaactccc

360

tcttctggat agcccaccct ggaggtccag cgatcctaga ccaggtggag ataaagctag

420

gactaaagga agagaagatg agggcgacac gtcacgtgtt gagcgagtat ggaaacatgt

480

cgagcgcgtg cgttctcttc atactagacg agatgaggag gaagtcagct aaggatggtg

540

tggccccgac aggagaaggg ttggagtggg gtgtcttgtt tggtttcgga ccaggtctca

600

ctgttgagac agtcgtcttg cacagcgttc ctctctaaac agaacgcttg ccttctatct

660

gcctacctac ctacgcaaaa ctttaatcct gtcttatgtt ttatataata taatcattat

720

atgtttacgc aataattaag gaagaatgac atttccaaac aaagatttga tgtcattcaa

780

gacccataga tttaatattg taaaaagaca caaaaaagag agtacaaaaa cagtcgaata

840

gacctgtcca gcacatatca catatcacat caaatgcatt cttccttaat tattgcgtaa

900

acatataatg attatattat ataaaacata agacaggatt aaagttttgc gtaggtaggt

960

aggcagatag aaggcaagcg ttctgtttag agaggaacgc tgtgcaagac gactgtctca

1020

acagtgagac ctggtccgaa accaaacaag acaccccact ccaacccttc tcctgtcaac

1080

<210> 119

<211> 3456

<212> ДНК

<213> Lupinus angustifolius

<400> 119

atgttgactc ttcaacccac acatgagtca agtagtcaat accctcctca tacacttata

60

gctgagacct gtcactttga ttatctgtac tatactaatc aaagttctct aattatgtca

120

cttggagaat catccctgca atggaaatac catgttttct tgagttttag gggaggtgac

180

acccgcttaa gcttcactaa tcacttatat gctgcgttgg tgcgaaaagg aatcattact

240

ttccgagatg acaaacaact tcacaaagga gatgccattt ctcaacatct gcatcaatca

300

atccaacagt ctctagctgc cattgttgtt atctcggaga actatgcttc ttccacttgg

360

tgtttggatg agctaaaact aattcttgaa tcgagaatag atgtttttcc agtcttttat

420

ggtgtcactc cttctgatgt tcgataccag aaaaatagtt ttgctgaggc tttcaataaa

480

catgttgtaa gatttgaaca agatgaagag aaagtgcaaa aatggagaga ttgcttgaaa

540

gaagttgctg atttttctgg atgggagtcc aaggacatgg ctgaagcaga actcattgaa

600

gatgttattg aaaaggtatg gataaaacta caaccaaaat tgccatccta caatgaagga

660

gtggttggat ttgattcaag ggtgaagaaa atgatttcac ttttaagcat aggatcacaa

720

gatattcggt ttatcgggat atggggtatg gctggaactg gaaaaacaat tcttgctaga

780

gtaatctacg aaacaataag tagccaattt gagattaaat gtttccttct taatgttaga

840

gaggtttctc aaacatctga tggattggtt tccttacaaa gaaaacttct ttctaccctt

900

aagataagca acctagaaat tgatgatttg tatgatggaa agaagaaaat tatgaacctt

960

ttgtgcaaca aaagtgttct tcttgtcctt gatgacatta gtcatttaag tcagctagag

1020

aatttggcta aaactaaagg ttggtttggt ccatgcagca gagtgataat aacaaccaaa

1080

gatatgcact tactagtatc acatggtgcg tgtgagaagt atgagatgag aatcttaaat

1140

gaaagttctt cctttcaact cttcagccag aaagcattca gaagagataa acctccagag

1200

ggttatttag aaataactaa aagtatggtc aaatatgctg gaggtcttcc tttggcactt

1260

aaagtgttgg gttcttttgt ttgtggaaga agtctcagtc agtggaagga tgctttggat

1320

aagataaaac aagttctgcc gaaagacatt ttgaacacac taataatagg ttatgatgga

1380

ctagaagatg cagaaaagac tttgttttta gatattgctt tcttctttac aggacggtcg

1440

aaaattgaag tgatacaggt attggcagat tgtggcctta atccaacaat tggaataagt

1500

cttcttattg aaagatctct agtaagttgt tgtggaggaa ttttggaaat gcatgattta

1560

cttcaagaaa tgggtagaaa tattgtatat caagaatctc cggatgatgc aagcagacgc

1620

agtaggttat gctctttaga agatattaac cgagtattca gaaaaaacaa gggaaccaat

1680

atcattcaag gaatagttct gaaatcaagt gacccatgtg aagcatattg gcatcctgaa

1740

gccttctcaa aaatggataa tcttagagta ctcatcattt tgtgtgattt gcaccttccc

1800

ctcggcctca aatgtctctc tagttcatta aaacttcttg aatggaaggg atatcctttg

1860

gaatatctac catttggcct gcaactgcta gaacttgttc acttgaaaat gcattgcagc

1920

aaacttaaac aactttggaa tggaactcaa attttcagag agctaaaatc aattgatctc

1980

agtgattcca gagatctaat tcaaactcca gatatttctg aggttccatg tcttgagagt

2040

ttagttttga aaggttgtaa aaaccttgtt gaggttcatc aatctgttgc aaagcacaag

2100

aatgttgcta tactagacct ggaaggttgc atcagtctta agaccctgcc aagaaaattg

2160

gagatgaatg ctttggaaaa gttcattctc tccggctgct cacaaattaa aaaccttccc

2220

gaatttgggg agagtatgga atgtctatct atgcttaatt taagagattg cacaagtctt

2280

gtttctcttc cacagagtgt tcgaaacatg aaatccttta gagatctcaa tatccatggt

2340

tgctcaaaat tgtttaagct gacaaacaat tcaaatgaaa ataatgtcgt ggaagaaatt

2400

gatgagactg aaacaggtag gagagaagtg cattcatcat ggagcttttc tctccttact

2460

gagaaagtgt ttgatttcgt aaagtatcca gttagcatgg actcgaagtt gccttctctc

2520

tcaagtttcc ctcggttgaa gaaattagat atgggcaact gtaatctcag tgatggacca

2580

attatagatc atattggaca tttaacatca ctggaagtgt tatatttagc tgggaacaac

2640

tttgttgacc ttacagcaag cattggtaac ctttctcggc tacaacgcct tggtttatat

2700

aaatgccgaa gacttaggac attgcctgag cttccaccca gtgtatgcca gttacttatg

2760

aacgactgca ctcaactgga acctatgtta tttgacacac aaataatttt gaaaatattt

2820

gaggcaaata gatggagcct gacacgcgaa ttgtggttcc tgattccagg gagtgaaatc

2880

ccagcatggt ttgagcatca agattatttt agcctgaaac caagtttagc gcctttcgat

2940

tatcacgagg agtatgcttt tattgtttca acaatagtaa acatccctga ctattgcctt

3000

tcaagtgatt ggataggaat tattgtatgc tttttactgg aaagtggttt aaaggcagac

3060

ctacacagac atattcgtag aagtccggtc acgatcggat ggtcttttaa agatcccgat

3120

gcagaaacgg tttacccctt acgcttcact aaacgtcgtt ggacacattt caaaggcaat

3180

cacctattga ttactacttt tggaagtgat catagaatat acaagcacta cttaacttgt

3240

ggcaaaagca aagtgcaatt gatattttgt ggtgagaata tttgcaagtg cgggaagcta

3300

aagctgaaaa actgtgggat ccgtgtgatt tgtaaggaag atggtgtatc gcgtagaggc

3360

gaggaaacga gtgaagttga ggtgccttcc acttcagttg aatctgatgt tcacaaacaa

3420

tcacgaataa ctgaaattac agatgaatat gaataa

3456

<210> 120

<211> 1280

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на N-подобный ген L. angustifolius

<400> 120

taatacgact cactataggg tatcgaacat cagaaggagt gacaccataa aagactggaa

60

aaacatctat tctcgattca agaattagtt ttagctcatc caaacaccaa gtggaagagt

120

atttccattg cagggatgat tctccaagtg acataattag agaactttga ttagtatagt

180

acagataatc aaagtgacag gtctcagcta taagtgtatg aggagggtat tgactacttg

240

actcatgtgt gggttgaaga gtcaacatat agcttcacgg atcccacagt ttttcagctt

300

tagcttcccg cacttgcaaa tattctcacc acaaaatatc aattgcactt tgcttttgcc

360

acaagttaag tagtgcttgt atattctatg atcaccctgt tgactcttca acccacacat

420

gagtcaagta gtcaataccc tcctcataca cttatagctg agacctgtca ctttgattat

480

ctgtactata ctaatcaaag ttctctaatt atgtcacttg gagaatcatc cctgcaatgg

540

aaatactctt ccacttggtg tttggatgag ctaaaactaa ttcttgaatc gagaatagat

600

gtttttccag tcttttatgg tgtcactcct tctgatgttc gatacccgta gttttgctga

660

ggctttcaat aaacatgttg taagatttga acaagatgaa gagaaagtgc agtttgagca

720

tcaagattat tttagcctga aaccaagttt agcgcctttc gattatcacg aggagtatgc

780

ttttattgtt tcaacaatag taaacatccc tgactattgc ctttcaagtg attggatagg

840

aattattgta tgctttttac tggaaagtgg tttaaaggca gacctacaca gacatattcc

900

aaaagtagta atcaataggt gattgccttt gaaatgtgtc caacgacgtt tagtgaagcg

960

taaggggtaa accgtttctg catcgggatc tttaaaagac catccgatcg tgaccggact

1020

tctacgaata tgtctgtgta ggtctgcctt taaaccactt tccagtaaaa agcatacaat

1080

aattcctatc caatcacttg aaaggcaata gtcagggatg tttactattg ttgaaacaat

1140

aaaagcatac tcctcgtgat aatcgaaagg cgctaaactt ggtttcaggc taaaataatc

1200

ttgatgctca aactgcactt tctcttcatc ttgttcaaat cttacaacat gtttattgaa

1260

agcctcagca aaactacgta

1280

<210> 121

<211> 1527

<212> ДНК

<213> Vitis pseudoreticulata

<400> 121

atggctggcg acgaggagac gacgacgacg gcagcaacac ttgaaacaac gtccacttgg

60

gctgttgcct ctgtttgctt tattttgatt gcactctcca tacttattga gcatgccctc

120

catctcttag ccaagtactt caacaagaag cggaggaggt ctctcattca tgctcttaac

180

aacgtcaaat cggagttgat gctcttgggg ttcgtctctt tgttgctgac tgtgtgccaa

240

aagtatattg cgaagatttg tatcccaagg agcgtaggtg aaacttttct tccctgcaag

300

accttgacag aaagtgattc agaagaagaa accaaatgcg aagagcaggg aaagatgtct

360

ttgctgtcta gacaaggcgt ggaggaacta caatacttaa ttttcgtgct ggccttcttc

420

cattccctct actgcgtcct cacattcggt cttgggatgg ccaagatgaa gaaatgggag

480

tcctgggagg cagaaacaag aacactggaa tatcagttta caaatgatcc acggaggttc

540

aggctcatcc atcagacatc atttggaaag caacatctga gatattggag tgagcatcag

600

atacttcgtt ggccggcttg ttttattcgg cagttctatc catccgtctc caaagtggat

660

tacttgactc ttagacatgg gttcattatg gcccattttg cagaaggaag caactatgac

720

ttccaaaagt atataaaaag agctttggaa aaagactttg gagtggtggt gggaggaagt

780

ttctgggttt ggagtttctc catgcttttt gtgttcttca atgctcaagt attttacaac

840

tatttatggc taccctttat tccattggtg atgctgttgt tggttggaac aaagctacag

900

ggcattataa ctaagatgtg cttagatagc catgataaag ctctcgttgt tagaggaact

960

ttgcttgtca ggcccagtga tcacttcttc tggtttggaa aaccggaatt gctcctacat

1020

cttatgcact ttatattgtt tcagaactct tttcaactgg cgttctttac atggacttgg

1080

tacaaatttg gattcagatc atgcttccat gatacaactg aggatatcgt cataaggctt

1140

gtcatgggtg tgttagtaca actcctttgt ggctacgtga cactgcctct gtatgccctg

1200

gtcacgcaga tggggacatc aatgaggaca attgtcttta ctgagggagt cgttgaaggt

1260

ctgaacagat ggagaaggaa agccaagaaa aacatagcac gcaggaacaa ccactcagct

1320

cgtccctccc tggatgcttc actcgacaat tcaccttctt ttaacactct ggatacttct

1380

ttctctgtag acctcgatca gccatcatca gatgctggtt atttgactgt tgaaatatca

1440

gatgaagaga cggtcgctac taaacggcca gaaccgcgtc agaagttggg atcttttgag

1500

ggtttcgact cgtgcaaaac atcataa

1527

<210> 122

<211> 1480

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая первую конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на ген Vitis MLO

<400> 122

taatacgact cactataggg tagccataaa tagttgtaaa atacttgagc attgaagaac

60

acaaaaagca tggagaaact ccaaacccag aaacttcctc ccaccaccac tccaaagtct

120

ttttccaaag ctctttttat atacttttgg aagtcatagt tgcttccttc tgcaaaatgg

180

gccataatga acccatgtct aagagtcaag taatccactt tggagacgga tggatagaac

240

tgctgaataa aacaaaccgg ccaacgaagt atccgatgct cactccaata tctcagatgt

300

tgctttccaa atgatgtctg atggatgagc gtgaacctcc gtggatcatt tgtaaactga

360

tattccagtg ttcttgtttc tgcctcccag gactcccatt tcttcatctt ggccatccca

420

agaccgaatg tgaggacgca gtagagcaca tcatttggaa agcaacatct gagatattgg

480

agtgagcatc ggatacttcg ttggccggtt tgttttattc agcagttcta tccatccgtc

540

tccaaagtgg attacttgac tcttagacat gggttcatta tggcccattt tgcagaagga

600

agcaactatg acttccaaaa gtatataaaa agagctttgg aaaaagactt tggagtggtg

660

gtgggaggaa gtttctgggt ttggagtttc tccatgcttt ttgtgttctt caatgctcaa

720

gtattttaca actatttatg gctacccgta attccattgg tgatgctgtt gttggttgga

780

acaaagctac agggcattat aactaagatg tgcctagata gccatgataa agctctcgtt

840

gttagaggaa ctttgcttgt caggcccagt gatcacttct tctggtttgg aaaaccggaa

900

ttgctcctac atcttatgca ctttatattg tttcagaact cttttcaact ggcgttcttt

960

acatggactt ggtacaaatt tggattcaga tcatgcttcc atgatacaac tgaggatatc

1020

gtcataaggc ttgtcatggg tgtgttatgg ctttccttct ccatctgttc agaccttcaa

1080

cgactccctc agtaaagaca attgtcctca ttgatgtccc catctgcgtg accagggcat

1140

acagaggcag tgtcacgtag ccacaaagga gttgtactaa cacacccatg acaagcctta

1200

tgacgatatc ctcagttgta tcatggaagc atgatctgaa tccaaatttg taccaagtcc

1260

atgtaaagaa cgccagttga aaagagttct gaaacaatat aaagtgcata agatgtagga

1320

gcaattccgg ttttccaaac cagaagaagt gatcactggg cctgacaagc aaagttcctc

1380

taacaacgag agctttatca tggctatcta ggcacatctt agttataatg ccctgtagct

1440

ttgttccaac caacaacagc atcaccaatg gaattacgta

1480

<210> 123

<211> 894

<212> ДНК

<213> Myzus persicae

<400> 123

atgttcaaac acttgtgcaa taccgtttca caaagtataa aacctagtag ttttttatca

60

aaagtttgtt caaacaaata tctcgtcgtg ccgtaccgga tagcgatttt taacaacatg

120

ggaagttaca aattgtacct ggccgtcatg gcaatagctg tcatagctgc agttcaggaa

180

attagttgca aggttcagac ttccgaacag gacgatgatc aggaaggata ttacgatgat

240

gagggaggag tgaacgataa tcagggagaa gagaacgata atcagggaga agagaacgat

300

aatcagggag aagagaacga taatcaggga gaagagaagg aagaagtttc cgaaccagag

360

atggagcacc atcagtgcga agaatacaaa tcgaagatct ggaacgatgc atttagcaac

420

ccgaaggcta tgaacctgat gaaactgacg tttaatacag ctaaggaatt gggctccaac

480

gaagtgtgct cggacacgac ccgggcctta tttaacttcg tcgatgtgat ggccaccagc

540

ccgtacgccc acttctcgct aggtatgttt aacaagatgg tggcgtttat tttgagggag

600

gtggacacga catcggacaa atttaaagag acgaagcagg tggtcgaccg tatctcgaaa

660

actccagaga tccgtgacta tatcaggaac tcggccgcca agaccgtcga cttgctcaag

720

gaacccaaga ttagagcacg actgttcaga gtgatgaaag ccttcgagag tctgataaaa

780

ccaaacgaaa acgaagcatt aatcaaacag aagattaagg ggttaaccaa tgctcccgtc

840

aagttagcca agggtgccat gaaaacggtt ggacgtttct ttagacattt ttaa

894

<210> 124

<211> 960

<212> ДНК

<213> Myzus persicae

<400> 124

atgactgaga caatgcaact ccgtggtacc cttcgtgggc ataatggttg ggttacgcag

60

atcgccacca atccgatcca cactgacatg attctgtctt gttcacgaga caagaccttg

120

attgtttggg atctgacacg tgatgagctc aactatggta tccccaagaa acgtttgtac

180

ggacattcgc acttcgtcag cgacgtcgtt ctttcatcag atggtaacta cgctctttcc

240

ggttcttggg ataagactct tcgtctgtgg gatttggctg ctggacgtac cactcgtcgt

300

tttgaagacc acaccaagga tgtattgagc gttgccttct ctgctgacaa ccgtcaaatc

360

gtttctggaa gtcgggacaa gactatcaag ttgtggaata ctttggctga gtgcaaatac

420

actattcagg atgatggaca tagcgattgg gtatcatgtg tacggttctc tcctaatatc

480

cataacccaa tcattgtgag tgctggttgg gacaaggttg tcaaggtatg gaacttaact

540

aactgccgca tcaagaccaa ccattatgga cacactggat accttaacac cgttactgtt

600

tcacctgatg gttctttgtg tgcttcagga ggaaaagatt gcaaagctat gttatgggat

660

cttaatgacg gcaaacactt gcacacactg gaccataacg atatcattga agctttgtgc

720

tttagcccca accgttactg gttgtgcgct gcatttggac catcaatcaa aatttgggat

780

ttggaaagca aagaaatggt tgaggaactt cgcccagaag ttgtatctca atcacagaat

840

agcaataccg aaccacccag atgtctgtca cttgcatggt caactgatgg acaaacattg

900

tttgctggat actcagacaa taacattaga gtttggcaag tgtctgtcag tgctcgttaa

960

<210> 125

<211> 1401

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная конструкция, кодирующая кпРНК, направленно

воздействующую

на ген C002 M.persicae

<400> 125

gaattctaat acgactcact atagggtgct ccatctctgg ttcggaaact tcttccttct

60

cttctccctg attatcgttc tcttctccct gattatcgtt ctcttctccc tgattatcgt

120

tctcttctcc ctgattatcg ttcactcctc cctcatcatc gtaatatcct tcctgatcat

180

cgtcctgttc ggaagtctga accttgcaac taatttcctg aactgcagct atgacagcta

240

ttgccatgac ggccaggtac aatttgtaac ttcccatgtt gttaaaaatc gctatccggt

300

acggcacgac gagatatttg tttgaacaaa cttttgataa aaaactacta ggttttatac

360

tttgtgaaac ggtattgcac aagtgtttga acataagaga gttggaagtt acaaattgta

420

cctggccgtc atggcaatag ctgtcatagc tgcagttcag gaaattagtt gcaaggttca

480

gacttccgaa caggacgatg atcaggaagg atattacgat gatgagggag gagtgaacga

540

taatcaggga gaagagaacg ataatcaggg agaagagaac gataatcagg gagaagagaa

600

cgataatcag ggagaagaga aggaagaagt ttccgaacca gagatggagc acccaacagt

660

gcgaagaata caaatcgaag atctggaacg atgcatttag caacccgaag gctatgaacc

720

tgatgaaact gacgtttaat acagctaagg aattgggctc caacgaagtg tgctcggaca

780

cgacccgggc cttatttaac ttcgtcgatg tgatggccac cagcccgtac gcccacttct

840

cgctaggtat gtttaacaag atggtggcgt ttattttgag ggaggtggac acgacatcgg

900

acaatctgaa cagtcgtgct ctaatcttgg gttccttgag caagtggacg gtcttggcgg

960

ccgagttcct gatatagtca cggatctctg gagttttcga gatacgggcg accacctgct

1020

tcgtctcttt aaatttgtcc gatgtcgtgt ccacctccct caaaataaac gccaccatct

1080

tgttaaacat acctagcgag aagtgggcgt acgggctggt ggccatcaca tcgacgaagt

1140

taaataaggc ccgggtcgtg tccgagcaca cttcgttgga gcccaattcc ttagctgtat

1200

taaacgtcag tttcatcagg ttcatagcct tcgggttgct aaatgcatcg ttccagatct

1260

tcgatttgta ttcttcgcac tgttaacaag cttagcatat ccatgatatc tgttagtttt

1320

tttcctgaaa gagcggccgc cctagcataa ccccgcgggg cctcttcggg ggtctcgcgg

1380

ggttttttgc tgaaaggatc c

1401

<210> 126

<211> 1401

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная конструкция, кодирующая кпРНК, направленно

воздействующую

на ген Rack-1 M.persicae

<400> 126

gaattctaat acgactcact atagggttat ggatattagg agagaaccgt acacatgata

60

cccaatcgct atgtccatca tcctgaatag tgtatttgca ctcagccaaa gtattccaca

120

acttgatagt cttgtcccga cttccagaaa cgatttgacg gttgtcagca gagaaggcaa

180

cgctcaatac atccttggtg tggtcttcaa aacgacgagt ggtacgtcca gcagccaaat

240

cccacagacg aagagtctta tcccaagaac cggaaagagc gtagttacca tctgatgaaa

300

gaacgacgtc gctgacgaag tgcgaatgtc cgtacaaacg tttcttgggg ataccatagt

360

tgagctcatc acgtgtcaga tcccaaacaa tcaaggtctt gtcccggttc ttgggataag

420

actcttcgtc tgtgggattt ggctgctgga cgtaccactc gtcgttttga agaccacacc

480

aaggatgtat tgagcgttgc cttctctgct gacaaccgtc aaatcgtttc tggaagtcgg

540

gacaagacta tcaagttgtg gaatactttg gctgagtgca aatacactat tcaggatgat

600

ggacatagcg attgggtatc atgtgtacgg ttctctccta atatccataa cccaaccatt

660

gtgagtgctg gttgggacaa ggttgtcaag gtatggaact taactaactg ccgcatcaag

720

accaaccatt atggacacac tggatacctt aacaccgtta ctgtttcacc tgatggttct

780

ttgtgtgctt caggaggaaa agattgcaaa gctatgttat gggatcttaa tgacggcaaa

840

cacttgcaca cactggacca taacgatatc attgaagctt tgtgctttag ccccaaccgt

900

tacacagaca tctgggtggt tcggtattgc tattctgtga ttgagataca acttctgggc

960

gaagttcctc aaccatttct ttgctttcca aatcccaaat tttgattgat ggtccaaatg

1020

cagcgcacaa ccagtaacgg ttggggctaa agcacaaagc ttcaatgata tcgttatggt

1080

ccagtgtgtg caagtgtttg ccgtcattaa gatcccataa catagctttg caatcttttc

1140

ctcctgaagc acacaaagaa ccatcaggtg aaacagtaac ggtgttaagg tatccagtgt

1200

gtccataatg gttggtcttg atgcggcagt tagttaagtt ccataccttg acaaccttgt

1260

cccaaccagc actcacaatg gttaacccgg gtagcatatc catgatatct gttagttttt

1320

ttcctgaaag agcggccgcc ctagcataac cccgcggggc ctcttcgggg gtctcgcggg

1380

gttttttgct gaaaggatcc c

1401

<210> 127

<211> 2396

<212> ДНК

<213> Helicoverpa armigera

<400> 127

agacattgat tagtgagctc caaactccgt acgtacgttc ttagtttagt ttgttcgttc

60

gtattgtcgc agtcacatcg ctccggtgcc cgcttcgaca tttcccgcca aaagtgacgt

120

aacatatccg tgatctgtgt gaatatgtca gtgacttttt taaattaatt ttttaatagc

180

aaaattgtga tcgaaggaat ttttacaaga tgacggctgg gaatgaagag catgagcctc

240

taattacatc gtctgtcgac aatcagcgtg tggcctacag taattcacca ccggatgacc

300

gcacaccaga atcttcttcc ccacgcggca gtggcggaga agtaacgcta gccataccat

360

cacaccgcaa ctatggagcc atcggaggcg tggagaaggt cacatacacc tgggcagaca

420

tcaatgcctt tgctactgaa tccaggtcta ggtcccgaag gatttggaac ttctggaagc

480

cctccgccag tggcatgttc cagcaaagga aacagttgtt gaggaatgta aatggagccg

540

cctacccagg cgaactgctc gccatcatgg gatcctccgg tgccgggaag accacactcc

600

tcaacactct gaccttccgc actccaagcg gggtgctgtc cagtggcact cgagcactga

660

acggccagcc tgctacccct gaggcgttat cagcactgtc tgcgtatgtt cagcagcagg

720

atctgttcat tggcacgctg actgtgaagg agcatttagt attccaggct atggtgcgga

780

tggaccgaca tataccgtat gcgcagcgca tgaggagagt tcaagaggtt attactgagt

840

tggcgctaac aaaatgccag aacacagtga taggcatccc tgggcggctg aagggtatct

900

ccggcgggga gatgaagagg ctgtccttcg ccagcgaggt gctcacggat ccaccgctca

960

tgttctgcga tgaacccacc tctggactcg attcttttat ggcgcagaat gttatacagg

1020

tactgaaagg tctcgcacaa aaaggcaaga cagtcgtatg cacgatccac cagccgtctt

1080

cggagctgta cgcgatgttc gataagctgc tcatcatggc agacgggaag gtcgccttcc

1140

tcggctcccc tgatcaggct aatgatttct ttaaagacct aggagcagcg tgtcctccta

1200

actacaaccc agcggaccac ttcatccaac tcctggcggg agtgccgggc agggaggaga

1260

ccacgcgcac cactatcgat actgtctgca cggcattcgc gcgctctgag gtcggctgca

1320

agattgctgc agaagctgaa aatgcactct actttgagcg caagatatcg cagggctggg

1380

cggacccggc gtggtctgaa gccacggcta tccgcgcgcg ccgctcgccg tacaaggcgt

1440

cgtggtgcgc gcagttccgc gcggtgctgt ggcgctcgtg gctgtccgtc actaaggagc

1500

ccatgctcat caaagtgcgc ttcctacaga ctattatggt atcgatcctg atcggcgtga

1560

tctacttcgg gcagcacctg gaccaggacg gcgtgatgaa catcaacggc gccatcttca

1620

tgttcctcac caacatgacc ttccagaaca tcttcgctgt tattaacgta ttctgctcag

1680

aactgccaat attcatacga gaacaccact ccgggatgta tcgagctgac gtgtacttcc

1740

tatcgaagac gttagccgaa gcacctgtgt tcgccaccat accacttgtg ttcaccacca

1800

tagcatacta catgataggg ctgaaccctg aacctaagcg gttctttata gcgtccggtt

1860

tggctgccct gattactaac gttgctacgt cgtttggcta cctgatatcg tgtgccagca

1920

acagcgtgag catggcagcg tcagtgggac ctcccatcat catccccttc atgttgttcg

1980

gaggcttctt cctcaacact ggctccgtac caccatacct gggctggata tcgtacctgt

2040

cctggttcca ctacggcaac gaagcgctgc tggtcaacca gtggtctgga gtggaaacca

2100

tcgcctgcac ccgggagaac ttcacctgtc ccgcctctgg gcaggtcgtc ttggatactc

2160

ttagcttttc tgaggatgac ttcacaatgg acgtggtgaa catgatccta cttttcatcg

2220

gcttcagatt tttggcgtat ctcgctctct tgtaccgcgc tcgccgaggc aagtgagtct

2280

taggtacaaa atgctgcgag aatgggccat atgaaggaag aatgttgaat aaatagtgta

2340

attatttagg atgtaaggag tcaatggaga tttgataaat aaaacaattt ataccg

2396

<210> 128

<211> 1480

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на ген ABC-переносчика white Helicoverpa

armigera

<400> 128

taatacgact cactataggg tatatgtcgg tccatccgca ccatagcctg gaatactaaa

60

tgctccttca cagtcagcgt gccaatgaac agatcctgct gctgaacata cgcagacagt

120

gctgataacg cctcaggggt agcaggctgg ccgttcagtg ctcgagtgcc actggacagc

180

accccgcttg gagtgcggaa ggtcagagtg ttgaggagtg tggtcttccc ggcaccggag

240

gatcccatga tggcgagcag ttcgcctggg taggcggctc catttacatt cctcaacaac

300

tgtttccttt gctggaacat gccactggcg gagggcttcc agaagttcca aatccttcgg

360

gacctagacc tggattcagt agcaaaggca ttgatgtctg cccaggtgta tgtgaccttc

420

tccacgcctc cgatggctcc atagttgttc cagcaaagga aacagttgtt gaggaatgta

480

aatggagccg cctacccagg cgaactgctc gccatcatgg gatcctccgg tgccgggaag

540

accacactcc tcaacactct gaccttccgc actccaagcg gggtgctgtc cagtggcact

600

cgagcactga acggccagcc tgctacccct gaggcgttat cagcactgtc tgcgtatgtt

660

cagcagcagg atctgttcat tggcacgctg actgtgaagg agcatttagt attccaggct

720

atggtgcgga tggaccgaca tatacccgta tgcgcagcgc atgaggagag ttcaagaggt

780

tattactgag ttggcgctaa caaaatgcca gaacacagtg ataggcatcc ctgggcggct

840

gaagggtatc tccggcgggg agatgaagag gctgtccttc gccagcgagg tgctcacgga

900

tccaccgctc atgttctgcg atgaacccac ctctggactc gattctttta tggcgcagaa

960

tgttatacag gtactgaaag gtctcgcaca aaaaggcaag acagtcgtat gcacgatcca

1020

ccagccgtct tcggagctgt acgcgatgat gaagtggtcc gctgggttgt agttaggagg

1080

acacgctgct cctaggtctt taaagaaatc attagcctga tcaggggagc cgaggaaggc

1140

gaccttcccg tctgccatga tgagcagctt atcgaacatc gcgtacagct ccgaagacgg

1200

ctggtggatc gtgcatacga ctgtcttgcc tttttgtgcg agacctttca gtacctgtat

1260

aacattctgc gccataaaag aatcgagtcc agaggtgggt tcatcgcaga acatgagcgg

1320

tggatccgtg agcacctcgc tggcgaagga cagcctcttc atctccccgc cggagatacc

1380

cttcagccgc ccagggatgc ctatcactgt gttctggcat tttgttagcg ccaactcagt

1440

aataacctct tgaactctcc tcatgcgctg cgcatacgta

1480

<210> 129

<211> 811

<212> ДНК

<213> Linepithema humile

<400> 129

agagagaacg atgaggacaa tgagatggaa aaaacaacaa cgtcccaacg tcccttcgac

60

gacgccattc caccagccct ataaaacccc gaggatcatc ggcgtcccaa cattactcgg

120

tcagagtctc gaggaacgcc gtgtccgaga tgatcatcac caggaaccgc atcaaccgcg

180

caactctaat ctgcgttctg gcgtcgtggc tttgcttggc gtctcgcgct tccgccgaat

240

acgaatcgcg ggagatgtcg aacggcggac cgggcgtcga cgcctcgtgc atcgagggca

300

agtgcatgaa gcgcaccgcc acgcaggatg ctaccgccag catgtggttc ggcccgcgtt

360

tgggaagacg gcgcagatcg gacgagaagc aggaagtgaa ttccgagata caggctctgg

420

cggaagcctt ggatagcggg cgtttggccc tatttgccat tccagctaac gacaagagac

480

aaccgactca atttacaccg cgactggggc gaggatcaga cgaggaccta tcctcctacg

540

gagacgcgat tgagaggaac gagatcgacg atcgtatatt acccgcgtta ttcgcgccgc

600

gtttaggacg acgaattcct tggtcaccgt cgccgagact tggacgccaa ttacgcagca

660

ttttgcgaaa aatgtaggcg ccgtcgaaag attattatca aaagttacaa atgaagagtg

720

atctcgtaga cctgcgcgtg aagatgaaat aacaactaaa attatagcac tattaagaca

780

taaagaaata aagtactgat gtttatttgt a

811

<210> 130

<211> 1360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на ген PBAN у аргентинских муравьев

<400> 130

taatacgact cactataggg aattcacttc ctgcttctcg tccgatctgc gccgtcttcc

60

caaacgcggg ccgaaccaca tgctggcggt agcatcctgc gtggcggtgc gcttcatgca

120

cttgccctcg atgcacgagg cgtcgacgcc cggtccgccg ttcgacatct cccgcgattc

180

gtattcggcg gaagcgcgag acgccaagca aagccacgac gccagaacgc agattagagt

240

tgcgcggttg atgcggttcc tggtgatgat catctcggac acggcgttcc tcgagactct

300

gaccgagtaa tgttgggacg ccgatgatcc tcggggtttt atagggctgg tggaatggcg

360

tcgtcgaagg gacgttggga cgttgttgtt ttttccatct cattgtcctc atcgttcacg

420

ccgtgtccga gatgatcatc accaggaacc gcatcaaccg cgcaactcta atctgcgttc

480

tggcgtcgtg gctttgcttg gcgtctcgcg cttccgccga atacgaatcg cgggagatgt

540

cgaacggcgg accgggcgtc gacgcctcgt gcatcgaggg caagtgcatg aagcgcaccg

600

ccacgcagga tgctaccgcc agcatgtggt tcggcccgcg tttgggaaga cggcgcagat

660

cggacgagaa gcaggaagtg aattcccgta atacaggctc tggcggaagc cttggatagc

720

gggcgtttgg ccctatttgc cattccagct aacgacaaga gacaaccgac tcaatttaca

780

ccgcgactgg ggcgaggatc agacgaggac ctatcctcct acggagacgc gattgagagg

840

aacgagatcg acgatcgtat attacccgcg ttattcgcgc cgcgtttagg acgacgaatt

900

ccttggtcac cgtcgccgag acttggacgc caattacgca gcattttgcg aaaaatgaaa

960

catcagtact ttatttcttt atgtcttaat agtgctataa ttttagttgt tatttcatct

1020

tcacgcgcag gtctacgaga tcactcttca tttgtaactt ttgataataa tctttcgacg

1080

gcgcctacat ttttcgcaaa atgctgcgta attggcgtcc aagtctcggc gacggtgacc

1140

aaggaattcg tcgtcctaaa cgcggcgcga ataacgcggg taatatacga tcgtcgatct

1200

cgttcctctc aatcgcgtct ccgtaggagg ataggtcctc gtctgatcct cgccccagtc

1260

gcggtgtaaa ttgagtcggt tgtctcttgt cgttagctgg aatggcaaat agggccaaac

1320

gcccgctatc caaggcttcc gccagagcct gtattacgta

1360

<210> 131

<211> 1480

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на ген, кодирующий каталитическую субъединицу A

протонной АТФазы V-типа L. cuprina

<400> 131

taatacgact cactataggg aagttcttgt catagaaatc atccaaagca cgcatgtatt

60

tggagtagga aatcaaccaa ttgatggagg ggaaatgttt acgttgggcc aatttcttgt

120

ccaaacccca gaacacttgt acgataccca aagtggcaga agtaacggga tcagagaaat

180

caccaccagg aggagataca gcaccgacaa tggaaacgga accttcacgt tcagggttac

240

ccaaacactt gacacgacca gcacgttcgt agaaggaggc caaacgggca cccaagtagg

300

ctgggtaacc ggaatcggca ggcatttcag ccaaacgacc agaaatttca cgaagagctt

360

cggcccaacg ggaggtagaa tcagccatca tagatacgtt gtaacccata tcacggaagt

420

attcagacaa ggtaataccg gtataaacga ttccggttac ccagcctact tgggtgcccg

480

tttggcctcc ttctacgaac gtgctggtcg tgtcaagtgt ttgggtaacc ctgaacgtga

540

aggttccgtt tccattgtcg gtgctgtatc tcctcctggt ggtgatttct ctgatcccgt

600

tacttctgcc actttgggta tcgtacaagt gttctggggt ttggacaaga aattggccca

660

acgtaaacat ttcccctcca tcaattggtt gatttcctac tccaaataca tgcgtgcttt

720

ggatgatttc tatgacaaga acttcccgta attcgtacca ttgcgtacca aggtcaagga

780

aatcttgcaa gaagaagaag atttgtccga aattgtacaa ttggtcggta aggcttcatt

840

ggccgaaact gacaagatca ccttggaagt cgccaaattg cttaaggacg atttcttgca

900

acagaactcc tactcatcat acgacagatt ctgccccttc tacaagagtg tgggtatgtt

960

gaagaacatc attgccttct acgacttggc tcgtcactcc gtcgaatcca ccgctcaatc

1020

tgaaaacaaa atcacctgga atgtcattct gaaagcctgt tgtaaatctt cgtgtaattg

1080

ttcaaagtca gccttgatct tggcttcacc gtccttaacg ggatccttga atttcatgga

1140

agacaattgg tacataatgt tacccatagc ttcacggatg acattccagg tgattttgtt

1200

ttcagattga gcggtggatt cgacggagtg acgagccaag tcgtagaagg caatgatgtt

1260

cttcaacata cccacactct tgtagaaggg gcagaatctg tcgtatgatg agtaggagtt

1320

ctgttgcaag aaatcgtcct taagcaattt ggcgacttcc aaggtgatct tgtcagtttc

1380

ggccaatgaa gccttaccga ccaattgtac aatttcggac aaatcttctt cttcttgcaa

1440

gatttccttg accttggtac gcaatggtac gaattacgta

1480

<210> 132

<211> 1480

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на ген, кодирующий РНКазу 1/2 L. cuprina

<400> 132

taatacgact cactataggg aataatttgt ggtagacata gcgggttact tcctcatgtt

60

cgttaaagca gacctggtat tgtctcatga aacgggaaga tgacaattca aaaccaacat

120

tgacgagagt agtgccacca ttgcagctgc tgcccgactt cttagctaca aaagcaggcc

180

aactggtgca aacaagactg ggcagggagt gctgaacacc attgacttta aaagtggtgc

240

cactaacaca ggtagcgata tgggtcttgc ctgataaagg atgagcaaag ccactggtac

300

aatggatctc aatattcttg ccagcagcca catcaattct tccagtatca gaaaaagggt

360

agagttcagt agtgccaggt ttgatataca agggttgttt agccttaaga ccaccgcgaa

420

tgggtatgga acaaccacca ctgcgtggaa tattgagatc cattgtacca gtggctttgc

480

tcatccttta tcaggcaaga cccatatcgc tacctgtgtt agtggcacca cttttaaagt

540

caatggtgtt cagcactccc tgcccagtct tgtttgcacc agttggcctg cttttgtagc

600

taagaagtcg ggcagcagct gcaatggtgg cactactctc gtcaatgttg gttttgaatt

660

gtcatcttcc cgtttcatga gacaatacca ggtctgcttt aacgaacatg aggaagtaac

720

ccgctatgtc taccacaaat tattcccgta cccaacagcg tgccactttc ctattcatta

780

atgcagctcc ccagtggcaa gttttcaatg ccggtaattg ggctcgtgta gaggatggtg

840

tacgcgcctg ggtgtccaaa aataaaatca atgttcgatg ctataccggt gtttatggtg

900

tcaccactct acccaacaaa gagggacgtg agactcctct atatttgtct cgtgatgcca

960

ataataatgg tttgattcct gttcccaaat tatacttccg tgtggttata caacctgcca

1020

ccaataaggg tattgttttc gttggtgtca caggcataag aataaccagc agtgatatca

1080

gttttcttcc aactaatata gttaacctta tcactgacat ctttgcaaat aatatagtcc

1140

tttttgattt gttccaaagt caaatgggga ttgttgacac caacgaaaac aataccctta

1200

ttggtggcag gttgtataac cacacggaag tataatttgg gaacaggaat caaaccatta

1260

ttattggcat cacgagacaa atatagagga gtctcacgtc cctctttgtt gggtagagtg

1320

gtgacaccat aaacaccggt atagcatcga acattgattt tatttttgga cacccaggcg

1380

cgtacaccat cctctacacg agcccaatta ccggcattga aaacttgcca ctggggagct

1440

gcattaatga ataggaaagt ggcacgctgt tgggtacgta

1480

<210> 133

<211> 1480

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на ген, кодирующий хитинсинтазу L. cuprina

<400> 133

taatacgact cactataggg tggcttgatt tttatattaa caccatacac ctcaaatgca

60

gctttttcaa tgctggtaat caatattttt acatattcat tgagaggagg atttttcgga

120

ttctccacat atttttcatc cagtataaag gcatcatcaa agaaaatatt agctaaaatg

180

taaaaaaaag aaaacttaat tgatagatac tcttcattcc aatccacaat tcgtctattt

240

aatgttatac attgttcaac caaaaaacca caataccacg gacaaatgaa cagtttttcg

300

gtgggtaaat ttttatcatt ttttggacgc catatatgat ttgttatcca caattgtgac

360

agccaccaca acaaccatat ccaaagataa tctttagcga ccacattaaa aaaactccat

420

gtatcgtgac cgaagcccag tgacgttgat aaaaatttac ccaccgaaaa actgttcatt

480

tgtccgtggt attgtggttt tttggttgaa caatgtataa cattaaatag acgaattgtg

540

gattggaatg aagagtatct atcaattaag ttttcttttt tttacatttt agctaatatt

600

ttctttgatg atgcctttat actggatgaa aaatatgtgg agaatccgaa aaatcctcct

660

ctcaatgaat atgtaaaaat attgattacc agcattgaaa aagctgcatt tgaggtgtat

720

ggtgttaata taaaaatcaa gccacccgta aaaattgaaa caccttatgg cggtcgtttg

780

gtgtggacac tgcctggtcg ctcaaagatg attgcccatt taaaaaacaa agataaaata

840

cgacataaga aacgctggtc acaggttatg tacatgtact atttgttggg ttttcgtata

900

atggaattgg aatcagtatc ggccaagcgt aaggcagtga tagcagaaaa tacatttttg

960

ctggctcttg atggtgatat tgactttcaa ccgcaggcag tgcaactgtt aatagaccgt

1020

atgaaggcca tagatgaatt aggtgctagc caggactaca taaaacacaa ccaataacat

1080

gctctgttgc tttttgcaac caatgaccta tagcgtattc gaagatttga taccaaacca

1140

tagggcctct accaactgga tgaatacgac cacaggcagc acctaattca tctatggcct

1200

tcatacggtc tattaacagt tgcactgcct gcggttgaaa gtcaatatca ccatcaagag

1260

ccagcaaaaa tgtattttct gctatcactg ccttacgctt ggccgatact gattccaatt

1320

ccattatacg aaaacccaac aaatagtaca tgtacataac ctgtgaccag cgtttcttat

1380

gtcgtatttt atctttgttt tttaaatggg caatcatctt tgagcgacca ggcagtgtcc

1440

acaccaaacg accgccataa ggtgtttcaa tttttacgta

1480

<210> 134

<211> 1481

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на ген, кодирующий экдизоновый рецептор (EcR)

L. cuprina

<400> 134

taatacgact cactataggg tgaaagatca tcacgacctg atgatatgga attagctgat

60

tcagatctgg gtgtatgatg catcatacta ctgttattca tatgatgatg gtgatgatga

120

tttaatccat tactgatgat actgtgaatg ccaatattgg catgaataac ttggccattt

180

tgtgaggcct gtaacgagtt taactgttgg gcattgctaa cgatattggg accattaata

240

ttgaccgata agccaccacc accgccgcca atacccatgt ggccatttgt gtggtgggaa

300

ctgctattac tgtgattact gttgctgttg tggtgtaaat gattgtggct gtgattgtga

360

ttattcactt gactgccacc accaccaccc agaccattga gtgaagtcat accgggtaca

420

ccaccaccac ctccacctcc tccaacaaat cacagtaata gcagttccca ccacacaaat

480

ggccacatgg gtattggcgg cggtggtggt ggcttatcgg tcaatattaa tggtcccaat

540

atcgttagca atgcccaaca gttaaactcg ttacaggcct cacaaaatgg ccaagttatt

600

catgccaata ttggcattca cagtatcatc agtaatggat taaatcatca tcaccatcat

660

catatgaata acagtagtat gatgcatcat acacccagat ctgaatcagc taattccata

720

tcatcaggtc gtgatgatct ttcacccgta tccaccaaat caccccctta gtggttcgaa

780

acacttgtgt tccatttgtg gagaccgcgc cagtggaaaa cattatgggg tctacagttg

840

tgagggttgt aaagggttct tcaaacgtac cgtacgcaag gacttgacat atgcttgtcg

900

tgaggacaga aattgcatta tagataaacg acaaagaaat cgttgccagt attgtcgtta

960

tcaaaagtgt ttagcttgtg gcatgaaacg cgaagcggtc caagaggaac gacaacgtgg

1020

tactcgtgct gctaacgcta gagctgcctt ttgctcggct tcaatgatgc gttctatagt

1080

gagatcacgt aatgaactgc tgggtttaaa gtcttctccg ccagcaccaa ccacattgct

1140

taccccacca ccacctcctc caccaccgcc agcaccagca gctctagcgt tagcagcacg

1200

agtaccacgt tgtcgttcct cttggaccgc ttcgcgtttc atgccacaag ctaaacactt

1260

ttgataacga caatactggc aacgatttct ttgtcgttta tctataatgc aatttctgtc

1320

ctcacgacaa gcatatgtca agtccttgcg tacggtacgt ttgaagaacc ctttacaacc

1380

ctcacaactg tagaccccat aatgttttcc actggcgcgg tctccacaaa tggaacacaa

1440

gtgtttcgaa ccactaaggg ggtgatttgg tggatacgta g

1481

<210> 135

<211> 1481

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на ген, кодирующий гамма-тубулин 1/1-подобный

L. cuprina

<400> 135

taatacgact cactataggg aaaacgctgt aggtttgtat aagtttctta ggaaaacgat

60

cagacaaacg ttccataata taagagccca tgccggaacc agtaccaccg gctatagaat

120

ggcatagaac aaatccctcc aaggaatcac tgccatctgc ctcacgatca ataatgtcaa

180

aaatttcctc ttgtaatttt tcaccttgac tatagccgga agcccaattg ttgccggcac

240

caccaccatg tttagacaag taaacatttt cgggattata taacttggca tagggtgaac

300

tcataatggt gtgtataact cgcggctcca aatccaaaag tacggcacgt ggtatatagt

360

gatcatcgtc agcctgataa aagaatacat ccttgcgatc tactccatct gtagcaaaat

420

cctctaacac tccactaggt gaaatgctat acacaccatt atgagttcac cctatgccaa

480

gttatataat cccgaaaatg tttacttgtc taaacatggt ggtggtgccg gcaacaattg

540

ggcttccggc tatagtcaag gtgaaaaatt acaagaggaa atttttgaca ttattgatcg

600

tgaggcagat ggcagtgatt ccttggaggg atttgttcta tgccattcta tagccggtgg

660

tactggttcc ggcatgggct cttatattat ggaacgtttg tctgatcgtt ttcctaagaa

720

acttatacaa acctacagcg ttttcccgta ccacaaccct acgttatcct tcatatatga

780

ataataattt gataggattg acggcacctt tgatacctac cccccaatta cattttctaa

840

tgaccggtta tactcctcta actacagata gtgatcccaa tttgaatata cgcaaaacta

900

cggtactaga tgttatgaga cgtttattgc aacccaaaaa tatgatggtt tcatcgggtc

960

cggataaagc aaatattcat tgttatattt ccatattaaa tattatacag ggtgaagtag

1020

atcccactca agtccacaaa tctctactga ttggccatca ttaggcccga aactttatga

1080

ttactttgta tatatggaga acttctggac aaggctactt gtatactggc cggaccccag

1140

ggtatgaatt gagctaattt gcgttcacgt atacgttgta gagatttgtg gacttgagtg

1200

ggatctactt caccctgtat aatatttaat atggaaatat aacaatgaat atttgcttta

1260

tccggacccg atgaaaccat catatttttg ggttgcaata aacgtctcat aacatctagt

1320

accgtagttt tgcgtatatt caaattggga tcactatctg tagttagagg agtataaccg

1380

gtcattagaa aatgtaattg gggggtaggt atcaaaggtg ccgtcaatcc tatcaaatta

1440

ttattcatat atgaaggata acgtagggtt gtggtacgta g

1481

<210> 136

<211> 1605

<212> ДНК

<213> Triticum aestivum

<400> 136

atggcaaagg acgacgggta ccccccggcg cggacgctgc cggagacgcc gtcctgggcg

60

gtggcgctgg tcttcgccgt catgatcatc gtctccgtcc tcctggagca cgcgctccac

120

aagctcggcc attggttcca caagcggcac aagaacgcgc tggcggaggc gctggagaag

180

atgaaggcgg agctgatgct ggtgggattc atctcgctgc tgctcgccgt cacgcaggac

240

ccaatctccg ggatatgcat ctcccagaag gccgccagca tcatgcgccc ctgcaaggtg

300

gaacccggtt ccgtcaagag caagtacaag gactactact gcgccaaaga gggcaaggtg

360

gcgctcatgt ccacgggcag cctgcaccag ctccacatat tcatcttcgt gctagccgtc

420

ttccatgtca cctacagcgt catcatcatg gctctaagcc gtctcaagat gagaacatgg

480

aagaaatggg agacagagac cgcctccttg gaataccagt tcgcaaatga tcctgcgcgg

540

ttccgcttca cgcaccagac gtcgttcgtg aagcggcacc tgggcctgtc cagcaccccc

600

ggcgtcagat gggtggtggc cttcttcagg cagttcttca ggtcggtcac caaggtggac

660

tacctcatct tgagggcagg cttcatcaac gcgcacttgt cgcagaacag caagttcgac

720

ttccacaagt acatcaagag gtccatggag gacgacttca aagtcgtcgt tggcatcagc

780

ctcccgctgt gggctgtggc gatcctcacc ctcttccttg atatcgacgg gatcggcaca

840

ctcacctggg tttctttcat ccctctcatc atcctcttgt gtgttggaac caagctagag

900

atgatcatca tggagatggc cctggagatc caggaccggt cgagcgtcat caagggggca

960

cccgtggtcg agcccagcaa caagttcttc tggttccacc gccccgactg ggtcctcttc

1020

ttcatacacc tgacgctgtt ccagaacgcg tttcagatgg cacatttcgt gtggacagtg

1080

gccacgcccg gcttgaagga ctgcttccat atgaacatcg ggctgagcat catgaaggtc

1140

gtgctggggc tggctctcca gttcctgtgc agctacatca ccttccccct ctacgcgcta

1200

gtcacacaga tgggatcaaa catgaagagg tccatctttg acgagcagac agccaaggcg

1260

ctgaccaact ggcggaacac ggccaaggag aagaagaagg tccgagacac ggacatgctg

1320

atggcgcaga tgatcggcga cgcaacaccc agccgaggca cgtccccgat gcctagccgg

1380

ggctcatcgc cggtgcacct gcttcagaag ggcatgggac ggtctgacga tccccagagc

1440

gcaccgacct cgccaaggac catggaggag gctagggaca tgtacccggt tgtggtggcg

1500

catcctgtac acagactaaa tcctgctgac aggcggaggt cggtctcttc atcagccctc

1560

gatgccgaca tccccagcgc agatttttcc ttcagccagg gatga

1605

<210> 137

<211> 1277

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная ДНК, кодирующая конструкцию кпРНК, направленно

воздействующую на Mlo из Triticum aestivum

<400> 137

taatacgact cactataggg tgcccccttg atgacgctcg accggtcctg gatctccagg

60

gccatctcca tgatgatcat ctctagcttg gttccaacac acaagaggat gatgagaggg

120

atgaaagaaa cccaggtgag tgtgccgatc ccgtcgatat caaggaagag ggtgaggatc

180

gccacagccc acagcgggag gctgatgcca acgacgactt tgaagtcgtc ctccatggac

240

ctcttgatgt acttgtggaa gtcgaacttg ctgttatgcg acaaatgcgc gttgatgaag

300

cctgccctca aggtgaggta gtccaccttg gtgaccgacc tgaagaactg cctgaagaag

360

gccaccaccc atctgacgcc gggggtgctg gagaggggtt cgacttccac aagtacatca

420

agaggtccat ggaggacgac ttcaaagtcg tcgttggcat cagcctcccg ctgtgggctg

480

tggcgatcct caccctcttc cttgatatcg acgggatcgg cacactcacc tgggtttctt

540

tcatccctct catcatcctc ttgtgtgttg gaaccaagct agagatgatc atcatggaga

600

tggccctgga gatccaggac cggtcgagcg tcatcaaggg ggcacccgac gtcgagccca

660

gcaacaagtt cttctggttc caccgccccg actgggtcct cttcttcata cacctgacgc

720

tgttccagaa gtcacacaga tgggatcaaa catgaagagg tccatcttcg acgagcagac

780

agccaaggcg ctgaccaact ggcggaacac ggccaaggag aagaagaagg tccgagacac

840

ggacatgctg atggcgcaga tgatcggcga cgcgacgccc agccgaggca cgtcccccac

900

cacaaccggg tacatgtccc tagcctcctc catggtcctt ggcgaggtcg gtgcgctctg

960

gggatcgtca gaccgtccca tgcccttctg aagcaggtgc accggcgatg agccccggct

1020

aggcatcggg gacgtgcctc ggctgggcgt cgcgtcgccg atcatctgcg ccatcagcat

1080

gtccgtgtct cggaccttct tcttctcctt ggccgtgttc cgccagttgg tcagcgcctt

1140

ggctgtctgc tcgtcgaaga tggacctctt catgtttgat cccatctgtg tgacttctgg

1200

aacagcgtca ggtgtatgaa gaagaggacc cagtcggggc ggtggaacca gaagaacttg

1260

ttgctgggct cgacgtc

1277

<210> 138

<211> 1527

<212> ДНК

<213> Vitis pseudoreticulata

<400> 138

atggctggcg acgaggagac gacgacgacg gcagcaacac ttgaaacaac gtccacttgg

60

gctgttgcct ctgtttgctt tattttgatt gcactctcca tacttattga gcatgccctc

120

catctcttag ccaagtactt caacaagaag cggaggaggt ctctcattca tgctcttaac

180

aacgtcaaat cggagttgat gctcttgggg ttcgtctctt tgttgctgac tgtgtgccaa

240

aagtatattg cgaagatttg tatcccaagg agcgtaggtg aaacttttct tccctgcaag

300

accttgacag aaagtgattc agaagaagaa accaaatgcg aagagcaggg aaagatgtct

360

ttgctgtcta gacaaggcgt ggaggaacta caatacttaa ttttcgtgct ggccttcttc

420

cattccctct actgcgtcct cacattcggt cttgggatgg ccaagatgaa gaaatgggag

480

tcctgggagg cagaaacaag aacactggaa tatcagttta caaatgatcc acggaggttc

540

aggctcatcc atcagacatc atttggaaag caacatctga gatattggag tgagcatcag

600

atacttcgtt ggccggcttg ttttattcgg cagttctatc catccgtctc caaagtggat

660

tacttgactc ttagacatgg gttcattatg gcccattttg cagaaggaag caactatgac

720

ttccaaaagt atataaaaag agctttggaa aaagactttg gagtggtggt gggaggaagt

780

ttctgggttt ggagtttctc catgcttttt gtgttcttca atgctcaagt attttacaac

840

tatttatggc taccctttat tccattggtg atgctgttgt tggttggaac aaagctacag

900

ggcattataa ctaagatgtg cttagatagc catgataaag ctctcgttgt tagaggaact

960

ttgcttgtca ggcccagtga tcacttcttc tggtttggaa aaccggaatt gctcctacat

1020

cttatgcact ttatattgtt tcagaactct tttcaactgg cgttctttac atggacttgg