СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ДИСБИОЗА ПОЛОСТИ РТА У ПАЦИЕНТОВ С БОЛЕЗНЬЮ КРОНА ИЛИ ЯЗВЕННЫМ КОЛИТОМ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 G01N33/50 G01N21/80 A61B5/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к терапевтической стоматологии и лабораторной диагностике и может быть использовано для дифференциального подхода к диагностике дисбиоза полости рта у пациентов с болезнью Крона (БК) или язвенным колитом (ЯК). Дисбиоз полости рта представляет собой изменение антагонизма соотношения нормальной микробиоты, которое проявляется в ускоренном росте дрожжевых грибов рода Candida на фоне других микроорганизмов. Полость рта считается первичным резервуаром для представителей Грам+ и Грам- факультативных анаэробов, Грам+ и Грам- анаэробов и дрожжевых грибов рода Candida.

Дисбиоз может приводить к численному росту некоторых потенциально патогенных комменсальных видов бактерий. Их последующее доминирование в нише приводит к возникновению нездорового состояния. Дисбиоз микробов полости рта - это нарушение, которое может наблюдаться не только при заболеваниях полости рта, но и при системных заболеваниях [Sudhakara Р, Gupta A, Bhardwaj A, Wilson A. Oral Dysbiotic Communities and Their Implications in Systemic Diseases. Dent J (Basel). 2018:6(2): 10. https://doi.org:/10.3390/dj6020010, Abdelbary M.M.H., Hatting M., Bott A., Dahlhausen A., Keller D., Trautwein C, Conrads G. The oral-gut axis: Salivary and fecal microbiome dysbiosis in patients with inflammatory bowel disease. Front Cell Infect Microbiol. 2022 Oct 7:12:1010853. doi: 10.3389/fcimb.2022.1010853].

Патогенез дисбиоза полости рта имеет прямую зависимость от свойств факультативных Грам+ и Грам-, особенно Enterococcus spp.со способностью закисления рН ротовой жидкости до значений 4,2-4,6, вследствие чего происходит значительный рост дрожжевых грибов рода Candida и изменение окислительного стресса в ротовой жидкости. Проявления нарушения видового состава микробиоты кишечника зависят от наличия БК или ЯК, при этом внекишечные проявления имеют свои особенности. БК и ЯК являются хроническими заболеваниями желудочно-кишечного тракта и характеризуются рецидивирующим и ремиттирующим течением. Распространенность БК в России ориентировочно составляет 5,6 на 100 тыс. населения, прирост - 13,7%, соответственно ЯК 16,6 на 100 тыс.населения, ежегодный регистрируемый прирост - 11,3% [Князев О.В., Шкурко Т.В., Каграманова А.В., Веселов А.В., Никонов Е.Л. Эпидемиология воспалительных заболеваний кишечника (обзор литературы). Доказательная гастроэнтерология. 2020;9(1):80-7. doi: 10.17116/dokgastro2020901180, Болотова Е.В., Юмукян К.А., Дудникова А.В. Современные представления о механизмах развития и предикторах тяжести язвенного колита. Доктор.Ру. 2022; 21(2): 34-39. DOI: 10.31550/1727-2378-2022-21-2-34-39]. Основными объективными признаками нарушения микробиоты полости рта при БК и ЯК являются наличие отечности слизистой оболочки, неприятного запаха, проявлений симптома сухости и жжения в полости рта на фоне диспепсии.

Наличие у пациентов БК и ЯК зачастую является фактором для создания оптимальных условий для активного роста не только видового, но и количественного состава Грам+ и Грам- факультативных анаэробов, Грам+ и Грам- анаэробов и дрожжевых грибов рода Candida. Анализ данных литературы, свидетельствует о том, что в норме среднее количество стафилококков, энтерококков, лактобактерий, дрожжевых грибов рода Candida в полости рта не превышает концентрацию 10²-10³ КОЕ/мл [Крюков А.И., Кунельская Н.Л., Гуров А.В., Изотова Г.Н., Старостина А.Е., Лапченко А.С. Клинико-микробиологическая характеристика дисбиотических изменений слизистой оболочки полости рта и ротоглотки. Медицинский Совет. 2016;(6):32-35 https://doi.org/10.21518/2079-701X-2016-6-32-351].

Патогенетическим звеном развития дисбиоза полости рта является окислительный стресс, развитие которого обусловлено нарушением баланса между антиоксидантной и прооксидантной системами. Основную роль в этом процессе играют активные формы кислорода (АФК), тем самым инициируются реакции свободнорадикального окисления (СРО), в том числе перекисное окисление липидов - (ПОЛ), приводящие к химической модификации и разрушению биомолекул, нарушению тканевого дыхания во внутренней мембране митохондрий и процессов гидроксилирования в микросомах. Избыточная продукция АФК и (или) нарушения нормального функционирования систем антиоксидантной защиты вызывают усиленное окислительное повреждение биомолекул, что приводит к развитию дисфункции клеток и тканей организма (окислительный стресс). В результате этого клетки, обладающие фагоцитарной активностью, тоже вырабатывают радикалы кислорода, которые обеспечивают их микробицидность. При хроническом воспалении в полости рта увеличивается количество свободных радикалов, образование активного фактора хемотаксиса, миграция нейтрофилов к месту воспаления, увеличивается проницаемость капилляров, инициируются процессы ПОЛ, нарушаются тканевое дыхание в митохондриях и процессы гидроксилирования в микросомах с выходом лизосомальных ферментов и окислительным повреждением тканей. При снижении функциональной активности в ротовой жидкости происходит либо увеличение, либо снижение Грам+ и Грам-факультативных анаэробных, Грам+ и Грам- анаэробных микроорганизмов, дрожжевых грибов рода Candida, что является фактором развития дисбиоза полости рта у пациентов на фоне БК или ЯК. Анализ значений уровня рН, состояния свободно-радикального окисления ротовой жидкости, состава микробиоты полости рта в виде присутствия Грам+ и Грам- факультативных анаэробов, Грам+ и Грам- анаэробов и дрожжевых грибов рода Candida является дифференцированным подходом к диагностике проявлений дисбиоза полости рта у пациентов с болезнью Крона или язвенным колитом.

Известен способ оценки особенностей микробиоты кишечника у пациентов с болезнью Крона (БК) в зависимости от наличия или отсутствия синдрома избыточного бактериального роста (СИБР) в тонкой кишке на основании метода 16S секвенирования в ЦКП «Геномика» (ИХБФМ СО РАН), также был проведен водородный дыхательный тест (ВДТ) для верификации СИБР на аппарате Gastro+ с использованием лактулозы. Положительный результат ВДТ свидетельствовал о наличии СИБР [Кулыгина Ю.А., Осипенко М.Ф., Аликина Т.Ю. Особенности микробиоты у пациентов с болезнью Крона в зависимости от наличия синдрома избыточного бактериального роста. РМЖ. Медицинское обозрение. 2022;6(5):221-226. DOI: 10.32364/2587-6821-2022-6-5-221-226]. Недостаток метода состоит в определении особенностей состава микробиоты проведением ВДТ с использованием лактулозы, позволяющего верифицировать СИБР в микробиоте кишечника только у пациентов с болезнью Крона, не учитывает язвенный колит. При этом метод секвенирования является более дорогим методом микробиологического исследования и требует специального оснащения микробиологической лаборатории, по сравнению с традиционным микробиологическим методом. Однако известный способ не позволяет проводить дифференцированный подход в диагностике проявлений дисбиоза полости рта, поскольку не выявляет взаимосвязи уровня рН, состояния свободно-радикального окисления ротовой жидкости, наличия Грам+ и Грам- факультативных анаэробов, Грам+ и Грам- анаэробов и дрожжевых грибов рода Candida у пациентов с Болезнью Крона или язвенным колитом.

Наиболее близким аналогом изобретения является способ оценки состояния микробиоты пищеварительного тракта у подростков 14-18 лет по микрофлоре ротовой жидкости, заключающийся в том, что проводят скрининговое бактериологическое исследование ротовой жидкости с выделением представителей нормальной и условно-патогенной микрофлоры и определяют варианты нормомикробиоценоза на этапе донозологической диагностики при проведении диспансеризации с последующим формированием групп риска и прогнозируют развитие дисбиотических состояний. Первый вариант характеризуют присутствием Streptococcus spp., не обладающих гемолитической активностью, в количестве 5 lg КОЕ/мл, Lactobacillus spp. 3-4 lg КОЕ/мл и отсутствием условно-патогенной микрофлоры, при втором варианте происходит увеличение количества негемолитических Streptococcus spp.до 6 lg КОЕ/мл, снижение Lactobacillus spp. до 2 lg КОЕ/мл и появление условно-патогенной микрофлоры, такой как Staphylococcus spp., Candida spp., Bacillus spp. в количестве 1-2 lg КОЕ/мл, у лиц с третьим вариантом микробиоценоза полости рта наблюдают увеличение негемолитических Streptococcus spp. до 7 lg КОЕ/мл, более выраженное снижение Lactobacillus spp. до 1 lg КОЕ/мл или их полное отсутствие, повышение уровня условно-патогенной микрофлоры в Staphylococcus spp., Candida spp., Bacillus spp., коррелирующей с патогенностью в количестве до 4-5 lg КОЕ/мл, выявление первого и второго вариантов является прогностически благоприятными, а при выявлении третьего варианта микро биоценоза подростка относят в группу повышенного риска формирования у него дисбиотических изменений пищеварительного тракта [патент RU 2602697, 2016]. Недостатком прототипа является его использование в качестве скрининг-теста для определения микробиоты пищеварительного тракта лиц в возрасте 14-18 лет, при этом не дифференцируется состав микробиоты полости рта при болезни Крона и язвенном колите.

Задачей изобретения является разработка способа дифференциальной диагностики проявлений дисбиоза полости рта у пациентов с болезнью Крона или язвенным колитом на основании анализа значений уровня рН, состояния свободно-радикального окисления ротовой жидкости, наличия в составе микробиоты полости рта наличия Грам+ и Грам- факультативных анаэробов, Грам+ и Грам- анаэробов и дрожжевых грибов рода Candida.

Технический результат при использовании изобретения - повышение точности диагностики проявлений дисбиоза полости рта у пациентов с болезнью Крона или язвенным колитом.

Предлагаемый способ дифференциальной диагностики дисбиоза полости рта у пациентов с БК или ЯК осуществляется следующим образом. Проводят анализ в пробах ротовой жидкости уровня рН и состояния свободно-радикального окисления, в составе микробиоты полости рта определяют наличие Грам+ и Грам- факультативных анаэробов, Грам+ и Грам- анаэробов и дрожжевых грибов рода Candida.

В пробах ротовой жидкости, сбор которой проводят натощак в течение 15 минут без предварительного полоскания полости рта, определяют:

уровень рН с использованием лакмусовых бумажек;

свободно-радикальное окисление методом хемилюминесценции (ХЛ) на приборе ХЛ-003 [Фархутдинов P.P. Прибор для регистрации хемилюминесценции (Хемилюминомер - ХЛ-003). / Р.Р. Фархутдинов, В.А. Лиховских // Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения, М., 2005, 155-172]. В качестве наиболее информативного показателя ХЛ определяют светосумму свечения S в у/е за 5 минут исследования. Весь процесс измерения ХЛ и обработку результатов проводят в автоматическом режиме, что позволяет повысить точность и объективность получаемой информации.

Комплексное микробиологическое исследование включает бактериологический посев мазков с полости рта на дифференциально-диагностические среды серии HiCrome. Данное исследование включает выделение присутствующих грамположительных (Грам+), грамотрицательных (Грам-) факультативных анаэробов,

грамположительных (Грам+), грамотрицательных (Грам-) анаэробов и дрожжевых грибов рода Candida spp.в lg КОЕ/ед. Кроме того, готовят мазки на предметных стеклах и окрашивают их по Грамму с дальнейшим культуральным и микроскопическим исследованием и определением количества и вида микробиоты. Исследование микробиоты полости рта выполняют с соблюдением Санитарных правил СП 1.2.731-99.

При значениях в пробах ротовой жидкости уровня рН 4,7, светосуммы свечения 10,85 у/е, в составе микробиоты полости рта количества Грам+ факультативных анаэробов Staphylococcus spp. 10⁵ Кое/ед., Enterococcus spp. 10² КОЕ/ед., Lactobacillus spp. 10⁵ Кое/ед., Грам+ анаэробных бактерий Bifidobacterium spp. 10⁵ Кое/ед., Грам-факультативных анаэробов Enterobacteriaceae spp. 10⁵ Кое/ед., Грам-анаэробных бактерий Fusobacteria spp. 10⁵ Кое/ед., и дрожжевых грибов рода Candida в мицелиальной форме в количестве 10^4-5 КОЕ/ед. диагностируют дисбиоз полости рта на фоне болезни Крона. При значениях в пробах ротовой жидкости уровня рН 4,9, светосуммы свечения 9,76 у/е, в составе микробиоты полости рта количества Грам+ факультативных анаэробов Staphylococcus spp. 10⁴ Кое/ед., Enterococcus spp. 10² КОЕ/ед., Lactobacillus spp. 10⁴ Кое/ед., Грам+анаэробных бактерий Bifidobacterium spp. 10^б Кое/ед., Грам- факультативных анаэробов Enterobacteriaceae spp. 10⁴ Кое/ед., Грам-анаэробных бактерий Fusobacteria spp.10⁴ Кое/ед., и дрожжевых грибов рода Candida в дрожжевой форме в количестве 10^3-4 КОЕ/ед. диагностируют дисбиоз полости рта на фоне язвенного колита.

Достоинствами предлагаемого способа дифференциальной диагностики дисбиоза полости рта являются воспроизводимость при высокой степени значимости и достоверности полученных результатов. В доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружен тождественный способ неинвазивной дифференциальной диагностики дисбиоза полости рта у пациентов с болезнью Крона или язвенным колитом в условиях клинико-лабораторного исследования и стоматологического осмотра, обеспечивающий доступность и воспроизводимость при высокой степени значимости и достоверности полученных результатов. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна». Исследованиями авторов впервые было доказано, что установленные значения в пробах ротовой жидкости уровня рН в кислую сторону, дисбаланс состояния свободно-радикального окисления, наличие присутствия в микробиоте полости рта Грам+ и Грам-факультативных анаэробов, Грам+ и Грам- анаэробов и дрожжевых грибов рода Candida spp.в мицелиальной или дрожжевой формах являются достоверными маркерами дисбиоза полости рта. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Нами было обследовано 70 пациентов с болезнью Крона и язвенным колитом. Лабораторными методами проведен анализ проб ротовой жидкости и анализ данных микробиоты полости рта на основании подписанного информированного согласия (таблица).

Предлагаемый способ поясняется следующими клиническими примерами.

Пример 1.

Пациент Б., 34 лет. Профилактический осмотр стоматолога: Жалобы на наличие проявлений сухости, жжения в полости рта, неприятного запаха изо рта. Объективно: слизистая оболочка щек отечна, бледно-розового цвета. На слизистой оболочке преддверия полости рта определяются очаги гиперемии. На дорсальной поверхности языка, на фоне бело-серого налета, легко снимающегося, наблюдаются очаги гиперемии. Ротовая жидкость пенистая, повышенной вязкости.

Сопутствующий диагноз - болезнь Крона.

Неинвазивное исследование проб ротовой жидкости:

рН 4,7

S -10,85 у.е.

В исследуемой микробиоте полости рта

Грам+ факультативные анаэробы:

Staphylococcus spp. 10⁵ Кое/ед

Enterococcus spp. 10² КОЕ/ед

Lactobacillus spp. 10⁵ Кое/ед

Грам+ анаэроб:

Bifidobacterium spp.10⁵ Кое/ед

Грам- факультативный анаэроб:

Enterobacteriaceae spp.10⁵ Кое/ед

Грам- анаэроб:

Fusobacteria spp.10⁵ Кое/ед

Дрожжевые грибы рода Candida в мицелиальной форме - 10^4-5 КОЕ/ед.

Окончательный диагноз: Дисбиоз в сторону кандидоза на фоне болезни Крона. Кандидоз полости рта средней степени тяжести.

Пример 2.

Пациент Б., 35 лет. Профилактический осмотр стоматолога: Жалобы на наличие незначительной сухости, неприятного запаха изо рта. Объективно: слизистая оболочка щек отечна, бледно-розового цвета. На дорсальной поверхности языка, на фоне бело-серого налета, легко снимающегося, наблюдаются очаги гиперемии. Ротовая жидкость незначительно пенистая.

Сопутствующий диагноз - язвенный колит.

Неинвазивное исследование проб ротовой жидкости:

рН 4,9

S -9,76 у.е.

В исследуемой микробиоте полости рта:

Грам+ факультативные анаэробы:

Staphylococcus spp.10⁴ Кое/ед

Enterococcus spp.10 КОЕ/ед

Lactobacillus spp.10⁴Кое/ед

Грам+ анаэроб:

Bifidobacterium spp.10⁶ Кое/ед

Грам- факультативный анаэроб:

Enterobacteriaceae spp.10⁴ Кое/ед

Грам- анаэроб:

Fusobacteria spp.10⁴ Кое/ед

Дрожжевые грибы рода Candida в дрожжевой форме - 10^3-4 КОЕ/ед.

Окончательный диагноз: Дисбиоз в сторону кандидоза на фоне язвенного колита. Кандидоз полости рта легкой степени тяжести. Таким образом, у лиц, в зависимости от воспалительных заболеваний кишечника в виде болезни Крона или язвенного колита при определении значений рН и свободно-радикального окисления в пробах ротовой жидкости, в составе микробиоты полости рта наличия Грам+ и Грам-факультативных анаэробов Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Lactobacillus spp., Грам+ анаэробных бактерий Bifidobacterium spp., Грам-факультативных анаэробов Enterobacteriaceae spp., Грам- анаэробных бактерий Fusobacteria spp.и дрожжевых грибов рода Candida диагностируют проявления дисбиоза в сторону кандидоза. Применение предлагаемого способа позволяет сократить время и повысить точность дифференцированного подхода к диагностике проявлений дисбиоза у пациентов с болезнью Крона или язвенным колитом на основании изучения в пробах ротовой жидкости значений рН и состояния свободно-радикального окисления, в составе микробиоты полости рта наличия Грам+ и Грам- факультативных анаэробов Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Lactobacillus spp., Грам+ анаэробных бактерий Bifidobacterium spp., Грам- факультативных анаэробов Enterobacteriaceae spp., Грам- анаэробных бактерий Fusobacteria spp.и дрожжевых грибов рода Candida.

Предлагаемый способ легко воспроизводим в условиях клинической лаборатории, и при его использовании достигается указанный технический результат. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость».

Изобретение относится к медицине, а именно к терапевтической стоматологии и лабораторной диагностике, и может быть использовано для дифференциального подхода к диагностике дисбиоза полости рта у пациентов с болезнью Крона (БК) или язвенным колитом (ЯК). В ротовой жидкости определяют уровень рН и состояние свободно-радикального окисления, в составе микробиоты полости рта определяют наличие грамположительных и грамотрицательных факультативных анаэробов, грамположительных и грамотрицательных анаэробов и дрожжевых грибов рода Candida. При значениях уровня рН 4,7, светосуммы свечения 10,85 у/е, количества Staphylococcus spp. 10⁵ Кое/ед., Enterococcus spp. 10² КОЕ/ед., Lactobacillus spp. 10⁵ Кое/ед., Bifidobacterium spp. 10⁵ Кое/ед., Enterobacteriaceae spp. 10⁵ Кое/ед., Fusobacteria spp. 10⁵ Кое/ед. и дрожжевых грибов рода Candida в мицелиальной форме в количестве 10^4-5 КОЕ/ед. диагностируют дисбиоз полости рта на фоне БК. При значениях уровня рН 4,9, светосуммы свечения 9,76 у/е, количества Staphylococcus spp. 10⁴ Кое/ед., Enterococcus spp. 10² КОЕ/ед., Lactobacillus spp. 10⁴ Кое/ед., Bifidobacterium spp. 10⁶ Кое/ед., Enterobacteriaceae spp. 10⁴ Кое/ед., Fusobacteria spp. 10⁴ Кое/ед. и дрожжевых грибов рода Candida в дрожжевой форме в количестве 10^3-4 КОЕ/ед. диагностируют дисбиоз полости рта на фоне ЯК. Использование изобретения повышает точность дифференциальной диагностики. 1 табл., 2 пр.

Способ дифференциальной диагностики дисбиоза полости рта у пациентов с болезнью Крона или язвенным колитом, включающий бактериологическое исследование с определением Lactobacillus spp., Staphylococcus spp., Candida spp., отличающийся тем, что дополнительно определяют уровень рН и светосумму свечения при хемилюминесценции ротовой жидкости, в мазках с полости рта определяют количество грамположительных и грамотрицательных факультативных анаэробов, грамположительных и грамотрицательных анаэробов; и при значении уровня рН 4,7, светосуммы свечения 10,85 у/е, количества Staphylococcus spp. 10⁵ Кое/ед., Lactobacillus spp. 10⁵ Кое/ед., Enterococcus spp. 10² КОЕ/ед., Bifidobacterium spp. 10⁵ Кое/ед., Enterobacteriaceae spp. 10⁵ Кое/ед., Fusobacteria spp. 10⁵ Кое/ед. и дрожжевых грибов рода Candida в мицелиальной форме в количестве 10^4-5 КОЕ/ед. диагностируют дисбиоз полости рта на фоне болезни Крона; при значении уровня рН 4,9, светосуммы свечения 9,76 у/е, количества Staphylococcus spp. 10⁴ Кое/ед., Lactobacillus spp. 10⁴ Кое/ед., Enterococcus spp. 10² КОЕ/ед., Bifidobacterium spp. 10⁶ Кое/ед., Enterobacteriaceae spp. 10⁴ Кое/ед., Fusobacteria spp. 10⁴ Кое/ед. и дрожжевых грибов рода Candida в дрожжевой форме в количестве 10^3-4 КОЕ/ед. диагностируют дисбиоз полости рта на фоне язвенного колита.