СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ДИСБИОЗА ПОЛОСТИ РТА У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМ БИЛИАРНОЗАВИСИМЫМ ПАНКРЕАТИТОМ С РАЗЛИЧНОЙ ЭКССЕКРЕТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 G01N33/52 G01N33/84 A61B5/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к терапевтической стоматологии и лабораторной диагностике, и может быть использовано для дифференциального подхода к диагностике дисбиоза полости рта у пациентов с хроническим билиарнозависимым панкреатитом с различной экссекреторной активностью.

Дисбиоз полости рта представляет собой изменение антагонизма соотношения нормальной микробиоты, которое проявляется в ускоренном росте условно-патогенного гриба рода Candida на фоне других микроорганизмов. Полость рта считается первичным резервуаром для представителей Грам+ факультативно-анаэробных кокков (стафилококков), Грам- и Грам+ факультативно-анаэробных палочек (энтеробактерий и лактобактерий), дрожжеподобных грибов рода Candida. Патогенез дисбиоза полости рта имеет прямую зависимость от свойств уреазопозитивной и условно-патогенной микрофлоры, состояния рН (5,8-6,5) и свободно-радикального окисления ротовой жидкости. Проявления дисбиоза полости рта от 5% до 10% случаев наблюдаются при хроническом панкреатите. Заболевания поджелудочной железы, включая хронический панкреатит, не только оказывают огромное негативное влияние на здоровье человека в связи с выраженной заболеваемостью и смертностью, но и являются тяжелым бременем для общества во всем мире. Панкреатит является одним из наиболее распространенных заболеваний желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), наблюдаемых в больницах США, занимая третье место после кровотечений в ЖКТ и заболеваний желчного пузыря [Peery A.F., Crockett S.D., Murphy С.С., Lund J.L., Dellon E.S. et al. Burden and Cost of Gastrointestinal, Liver, and Pancreatic Diseases in the United States: Update 2018. Gastroenterology. 2019;156(1):254-272.e11 https://doi.org/10.1053/j.gastro.2018.08.063 Xiao A.Y., Tan M.L., Wu L.M., Asrani V.M., Windsor J.A., Yadav D., Petrov M.S. Global incidence and mortality of pancreatic diseases: a systematic review, meta-analysis and meta-regression of population-based cohort studies. Lancet Gastroenterol Hepatol. 2016;1(1):45-55 https://doi.org/10.1016/S2468-1253(16)30004-8 Frost F., Kacprowski Т., Rühlemann M., Bülow R., Kühn J.P., Franke A. et al. Impaired Exocrine Pancreatic Function Associates With Changes in Intestinal Microbiota Composition and Diversity. Gastroenterology. 2019;156(4): 1010-1015. https://doi.org/10.1053/j.gastro.2018.10.0471.

Объективно при развитии дисбиоза полости рта наблюдаются признаки отека и воспаления слизистой оболочки рта, при сборе жалоб пациенты указывают на наличие неприятного запа (галитоз), ксеростомического синдрома или гипосаливации, происходит уменьшение секреции ротовой жидкости (слюны).

Наличие у пациентов проявлений нарушений функции поджелудочной железы в виде хронического панкреатита с различной экссекреторной активностью является фактором для создания оптимальных условий активного роста видового и количественного состава представителей уреазопозитивной (Staphylococcus spp. и Enterobacteriaceae spp.) и условно-патогенной (Candida spp.) микробиоты полости рта. По данным литературы, в норме среднее количество стафилококков, энтерококков, лактобактерий, дрожжеподобных грибов рода Candida в полости рта не превышает концентрацию 10²-10³ КОЕ/мл [Крюков А.И., Кунельская Н.Л., Гуров А.В., Изотова Г.Н., Старостина А.Е., Лапченко А.С. Клинико-микробиологическая характеристика дисбиотических изменений слизистой оболочки полости рта и ротоглотки. Медицинский Совет. 2016;(6):32-35 https://doi.org/10.21518/2079-701X-2016-6-32-35]. Патогенетическим звеном развития дисбиоза полости рта является окислительный стресс, развитие которого обусловлено нарушением баланса между антиоксидантной и прооксидантной системами. Основную роль в этом процессе играют активные формы кислорода (АФК), тем самым инициируются реакции свободнорадикального окисления (СРО), в том числе перекисное окисление липидов - (ПОЛ), приводящие к химической модификации и разрушению биомолекул, нарушению тканевого дыхания во внутренней мембране митохондрий и процессов гидроксилирования в микросомах. Избыточная продукция АФК и (или) нарушения нормального функционирования систем антиоксидантной защиты вызывают усиленное окислительное повреждение биомолекул, что приводит к развитию дисфункции клеток и тканей организма (окислительный стресс). В результате этого клетки, обладающие фагоцитарной активностью, тоже вырабатывают радикалы кислорода, которые обеспечивают их микробицидность. При хроническом воспалении в полости рта, увеличивается количество свободных радикалов, происходит деполимеризация гиалуроновой кислоты и образование активного фактора хемотаксиса, миграция нейтрофилов к месту воспаления, увеличивается проницаемость капилляров, инициируются процессы ПОЛ, нарушаются тканевое дыхание в митохондриях и процессы гидроксилирования в микросомах с выходом лизосомальных ферментов и окислительным повреждением тканей.

При снижении функциональной активности ротовой жидкости увеличивается количество уреазопозитивной микрофлоры и условно-патогенной микрофлоры, что является фактором развития дисбиоза полости рта. Уреаза в ротовой жидкости имеет микробное происхождение, следовательно, повышенная концентрация уреазы в ротовой жидкости является следствием обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой (актиномицеты, стафилококки, протеи, клебсиеллы и другие).

Наличие у пациента нарушения функции поджелудочной железы в виде хронического панкреатита с различной экссекреторной активностью значительно повышает вероятность развития дисбиоза полости рта. Анализ уреазной активности, концентрации аммиака, уровня рН, свободно-радикального окисления ротовой жидкости, концентрацин уреазопозитивной и условно-патогенной микрофлоры является дифференцированным подходом к диагностике дисбиоза полости рта у данной категории пациентов.

Известен способ экспресс-диагностики днсбактериоза полости рта, заключающийся в том, что по отношению интегральных оценок спектров поглощения газовыделений мазка с миндалин и выдыхаемого воздуха в диапазоне длин волн 933-954 см^-1 судят о наличии днсбактериоза в ротовой полости, а именно при значении соотношения интегральных оценок поглощения газовыделений мазка с миндалин н выдыхаемого воздуха, в интервале 1,0±0,015 диагностируют норму, при отклонении от этих значений диагностируют дисбактериоз [RU 2433400 от 10.11.2011]. Недостатком способа является выявление днсбактериоза на основании изучения биологических свойств кокковой флоры - гемолитической активности, плазмокоагулазы, лецитиназы у пациентов с раком молочной железы с поверхности миндалин, а не из полости рта. Известен способ определения уреазной активности, основанный на измерении количества образующегося аммиака с помощью реактива Несслера [Руководство по клиническим лабораторным исследованиям / Под ред. Л.Г. Смирновой и Е.А. Кост. - М.: Медгиз, 1960. - 963 с.]. Недостатком способа является наличие в реактиве Несслера двуйодистой или металлической ртути, что в связи с ее токсичностью ограничивает применение этой реакции в практическом здравоохранении. Наиболее близким аналогом изобретения является способ определения уреазной активности ротовой жидкости для скрининга обсемененности полости рта уреазопозитивной микробиотой, заключающийся в том, что в одну из лунок микропланшета вносят водный раствор мочевины с фосфатным буфером, в две другие вносят водные растворы мочевины с фосфатным буфером, содержащие уреазу с известной концентрацией 5 и 10 Ед/л соответственно, а в остальные лунки вносят водный раствор мочевины с фосфатным буфером и образцами ротовой жидкости, затем во все лунки вносят фенол/нитропруссидный реагент и гипохлорит, после чего измеряют оптическую плотность на микропланшетном ридере при длине волны 546 нм и рассчитывают концентрацию уреазы в образцах ротовой жидкости в Ед/л, при значении уреазной активности выше 15,85±2,11 Ед/л регистрируют обсемененность полости рта уреазопозитивной микробиотой [RU 2597777 от 20.09.2016]. Однако известный способ не позволяет проводить дифференцированный подход в диагностике дисбиоза полости рта, поскольку не выявляет взаимосвязи уреазной активности, концентрации аммиака, уровня рН, свободно-радикального окисления ротовой жидкости, уреазопозитивной и условно-патогенной микрофлоры у пациентов с проявлениями нарушений функции поджелудочной железы виде хронического панкреатита с различной экссекреторной активностью.

Задачей изобретения является разработка способа дифференциальной диагностики проявлений дисбиоза полости рта у пациентов с нарушением функции поджелудочной железы в виде хронического билиарнозависимого панкреатита с различной экссекреторной активностью на основании анализа уреазной активности, концентрации аммиака, уровня рН, свободно-радикального окисления ротовой жидкости, концентрации уреазопозитивной и условно-патогенной микробиоты полости рта.

Технический результат при использовании изобретения - повышение точности диагностики проявлений дисбиоза полости рта.

Предлагаемый способ дифференциальной диагностики дисбиоза полости рта у пациентов с нарушением функции поджелудочной железы в виде хронического билиарнозависимого панкреатита с различной экссекреторной активностью осуществляется следующим образом. Проводят анализ в пробах ротовой жидкости уреазной активности, концентрации аммиака, уровня рН, свободно-радикального окисления, в мазках с полости рта определяют концентрации уреазопозитивной и условно-патогенной микробиоты.

В ротовой жидкости, сбор которой проводят натощак в течение 15 минут без предварительного полоскания полости рта, определяют уреазную активность по количеству аммиака (мМоль), образовавшегося в результате работы фермента. Для определения аммиака 2 мл супернатанта смешивают с 250 μл реактива Несслера, оптическую плотность определяют на спектрофотометре при длине волны 500 нм. Концентрацию аммиака, выделяющегося в результате стехиометрической реакции гидролиза мочевины, катализируемой ферментом, определяют колориметрически по реакции Несслера [Vinod K., Anisha N., Kharish В., Pallavi A. et al. Urease activity in saliva and plaque as endogenous protection against Dental caries in institutionalized blind children. Journal of Natural Science Biology and Medicine. 2021; 12(1): 109. https://doi.org/10.4103/jnsbm.JNSBM 90 20].

Для построения калибровочного графика готовят растворы сульфата аммония, полученные путем разведения стандартного раствора (20 мг на 100 мл дистиллированной воды). К 3 мл разведений аликвот стандартного раствора добавляют 1 мл реактива Несслера и определяют оптическую плотность образцов при длине волны 500 нм. На основании полученных данных строят калибровочный график.

Определение уреазной активности (μмоль⋅ мин^-1 на мг белка) в пробах ротовой жидкости проводят следующим образом: к 0,5 мл слюны добавляют 3 мл 3% раствора мочевины, 1 мл 0,2 м фосфатного буфера и инкубируют пробы при 55°С в течение 15 мин. По истечении времени инкубации реакцию останавливают помещением проб в лед и добавлением 0,66 N раствора серной кислоты и 1 мл 10% раствора вольфрамата натрия, после чего пробы центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин.

Для определения аммиака 2 мл супернатанта смешивают с 250 μл реактива Несслера, оптическую плотность определяют на спектрофотометре при длине волны 500 нм. Концентрацию аммиака выражают в нмоль аммиака/мин на мг белка.

Содержание белка в образцах слюны определяют по Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. №1. P. 265-275].

Хемилюминесценцию (ХЛ) ротовой жидкости регистрируют на приборе ХЛ-003 [Фархутдинов P.P. Прибор для регистрации хемилюминесценции (Хемилюминомер - ХЛ-003). / Р.Р. Фархутдинов, В.А. Лиховских // Методы оценки антиоксидантной активности биологически активных веществ лечебного и профилактического назначения, М., 2005, 155-172]. В качестве наиболее информативного показателя ХЛ определяют светосумму S в у/е за 5 минут исследования. Весь процесс измерения ХЛ и обработку результатов проводят в автоматическом режиме, что позволяет повысить точность и объективность получаемой информации.

Уровень рН ротовой жидкости определяют лакмусовыми бумажками.

Комплексное микробиологическое исследование включает бактериологический посев мазков с полости рта на дифференциально-диагностические среды серии HiCrome. Данное исследование включает выделение присутствующих Грам+, Грам- факультативно анаэробных и условно-патогенных микроорганизмов, в том числе дрожжеподобных грибов рода Candida spp. в 1g КОЕ/ед. Кроме того, готовят мазки на предметных стеклах и окрашивают их по Грамму с дальнейшим культуральным и микроскопическим исследованием и определением количества и вида микробиоты. Исследование микробиоты полости рта выполняют с соблюдением Санитарных правил СП 1.2.731-99.

При значении в ротовой жидкости уреазной активности 0,778 μмоль⋅ мин^-1 на мг белка, уровня аммиака 0,031 мМоль, рН 5,6, светосуммы свечения 22,5 у/е, в микробиоте полости рта уреазопозитивных Staphylococcus spp. и Enterobacteriaceae spp. в количестве 10⁵ КОЕ/ед, грамположительных факультативно-анаэробных палочек Lactobacillus spp. в количестве 10⁵ КОЕ/ед, и условно-патогенных дрожжеподобных грибов рода Candida в мицелиальной форме в количестве 10^4-5 КОЕ/ед диагностируют дисбиоз полости рта на фоне хронического билиарнозависимого панкреатита с симптомами гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ).

При значении в ротовой жидкости уреазной активности 0,663 μмоль⋅ мин^-1 на мг белка, уровня аммиака 0,089 мМоль, рН 5,3, светосуммы свечения 20,3 у/е, в микробиоте полости рта уреазопозитивных Staphylococcus spp. и Enterobacteriaceae spp. в количестве 10⁴ КОЕ/ед, грамположительных факультативно-анаэробных палочек Lactobacillus spp. в количестве 10⁴ КОЕ/ед, и условно-патогенных дрожжеподобных грибов рода Candida в дрожжевой форме в количестве 10^3-4 КОЕ/ед диагностируют дисбиоз полости рта на фоне хронического билиарнозависимого панкреатита.

Достоинствами предлагаемого способа дифференциальной диагностики дисбиоза полости рта являются воспроизводимость при высокой степени значимости и достоверности полученных результатов. В доступной научно-медицинской и патентной литературе не обнаружен тождественный способ неинвазивной дифференциальной диагностики дисбиоза полости рта у пациентов с нарушением функции поджелудочной железы в виде хронического панкреатита с различной экссекреторной активностью в условиях клинико-лабораторного исследования и стоматологического осмотра, обеспечивающий доступность и воспроизводимость при высокой степени значимости и достоверности полученных результатов. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «новизна». Исследованиями авторов впервые было доказано, что установленные значения уреазной активности и концентрации аммиака в ротовой жидкости, количества уреазопозитивных Staphylococcus spp. и Enterobacteriaceae spp., грамположительных факультативно-анаэробных палочек Lactobacillus spp., дрожжеподобных грибов рода Candida в дрожжевой или мицелиальной форме, дисбаланс состояния оксидативного стресса и сдвиг рН ротовой жидкости в кислую сторону являются достоверными маркерами дисбиоза полости рта. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «изобретательский уровень».

Нами было обследовано 70 пациентов с хроническим билиарнозависимым панкреатитом с различной эксекреторной активностью. Лабораторными методами проведен анализ проб ротовой жидкости и анализ данных микробиоты полости рта на основании подписанного информированного согласия (таблица).

Предлагаемый способ поясняется следующими клиническими примерами.

Пример 1

Пациент Б., 39 лет. Профилактический осмотр стоматолога: жалобы на наличие проявлений сухости, жжения в полости рта, неприятный запах изо рта. Объективно: на фоне бледно-розовой слизистой оболочки щек, ретромолярной области и дорсальной поверхности языка, преддверия полости рта определяются очаги гиперемии. Ротовая жидкость пенистая, повышенной вязкости.

Сопутствующий диагноз - хронический билиарнозависимый панкреатит с симптомами ГЭРБ.

Неинвазивное исследование проб ротовой жидкости:

уреаза ротовой жидкости 0,778 μмоль⋅ мин^-1 на мг белка

аммиак ротовой жидкости 0,031 мМоль

рН 5,6

S -22,5 у.е.

В исследуемой микробиоте полости рта:

уреазопозитивная микрофлора - Staphylococcus spp. и Enterobacteriaceae spp. 10⁵ Кое/ед

молочно-кислые микроорганизмы Lactobacillus spp. 10⁵ Кое/ед.

Условно-патогенные дрожжеподобные грибы рода Candida в мицелиальной форме - 10^4-5 КОЕ/ед.

Окончательный диагноз: Дисбиоз в сторону кандидоза на фоне хронического билиарно-зависимого панкреатита с симптомами ГЭРБ. Кандидоз полости рта средней степени тяжести.

Пример 2

Пациент Б., 42 лет. Профилактический осмотр стоматолога: жалобы на наличие незначительной сухости, неприятный запах изо рта. Объективно: на фоне бледно-розовой слизистой оболочки щек и дорсальной поверхности языка определяются очаги гиперемии. Ротовая жидкость незначительно пенистая.

Сопутствующий диагноз - хронический билиарнозависимый панкреатит.

Неинвазивное исследование проб ротовой жидкости (таблица):

уреаза ротовой жидкости 0,663 μмоль⋅ мин^-1 на мг белка

аммиак ротовой жидкости 0,089 мМоль

рН 5,3

S -20,3 у.е.

В исследуемой микробиоте полости рта:

уреазопозитивная микрофлора - Staphylococcus spp. и Enterobacteriaceae spp. 10⁴ Кое/ед

молочно-кислые микроорганизмы Lactobacillus spp. 10⁴ Кое/ед.

Условно-патогенные дрожжеподобные грибы рода Candida в дрожжевой форме - 10^3-4 КОЕ/ед.

Окончательный диагноз: Дисбиоз в сторону кандидоза на фоне хронического билиарнозависимого панкреатита. Кандидоз полости рта легкой степени тяжести.

Таким образом, у лиц, в зависимости от проявлений нарушений функции поджелудочной железы в виде хронического панкреатита с различной эксcекреторной активностью на основании анализа в пробах ротовой жидкости уреазной активности, концентрации аммиака, состояния рН и свободно-радикального окисления, наличия уреазопозитивной и условно-патогенной микрофлоры в составе микробиоты полости рта диагностируют дисбиоз в сторону кандидоза.

Применение предлагаемого способа позволяет сократить время и повысить точность дифференцированного подхода к диагностике дисбиоза у пациентов с нарушением функции поджелудочной железы в виде хронического билиарнозависимого панкреатита с различной эксcекреторной активностью на основании изучения в пробах ротовой жидкости уреазной активности, концентрации аммиака, состояния рН и свободно-радикального окисления, в составе микробиоты полости рта наличия уреазопозитивной и условно-патогенной микрофлоры.

Предлагаемый способ легко воспроизводим в условиях клинической лаборатории, и при его использовании достигается указанный технический результат. Таким образом, заявляемое изобретение соответствует критерию «промышленная применимость».

Изобретение относится к медицине, а именно к терапевтической стоматологии и лабораторной диагностике, и может быть использовано для дифференцированного подхода к диагностике дисбиоза полости рта. В ротовой жидкости определяют уреазную активность, концентрацию аммиака, уровень рН, светосумму свечения при хемилюминесценции, в мазках с полости рта определяют концентрации уреазопозитивной и условно-патогенной микробиоты. При значении уреазной активности 0,663 μмоль⋅мин^-1 на мг белка, уровня аммиака 0,089 мМоль, рН 5,3, светосуммы свечения 20,3 у/е, уреазопозитивных Staphylococcus spp. и Enterobacteriaceae spp. в количестве 10⁴ КОЕ/ед., грамположительных факультативно-анаэробных палочек Lactobacillus spp. в количестве 10⁴ КОЕ/ед. и условно-патогенных дрожжеподобных грибов рода Candida в дрожжевой форме в количестве 10^3-4 КОЕ/ед. диагностируют дисбиоз полости рта на фоне хронического билиарнозависимого панкреатита. При значении уреазной активности 0,778 μмоль⋅мин^-1 на мг белка, уровня аммиака 0,031 мМоль, рН 5,6, светосуммы свечения 22,5 у/е, уреазопозитивных Staphylococcus spp. и Enterobacteriaceae spp. в количестве 10⁵ КОЕ/ед., грамположительных факультативно-анаэробных палочек Lactobacillus spp. в количестве 10⁵ КОЕ/ед. и условно-патогенных дрожжеподобных грибов рода Candida в мицелиальной форме в количестве 10^4-5 КОЕ/ед. диагностируют дисбиоз полости рта на фоне хронического билиарнозависимого панкреатита с симптомами гастроэзофагеальной рефлюксной болезни. Использование изобретения обеспечивает повышение точности диагностики. 1 табл., 2 пр.

Способ дифференциальной диагностики дисбиоза полости рта у пациентов с хроническим билиарнозависимым панкреатитом с различной экссекреторной активностью, включающий определение уреазной активности ротовой жидкости, отличающийся тем, что в ротовой жидкости дополнительно определяют концентрацию аммиака колориметрически по реакции Несслера, уровень рН, светосумму свечения при хемилюминесценции, в мазках с полости рта определяют концентрацию уреазопозитивной и условно-патогенной микрофлоры и при значении уреазной активности 0,663 µмоль·мин^-1 на мг белка, уровня аммиака 0,089 мМоль, рН 5,3, светосуммы свечения 20,3 у/е, уреазопозитивных Staphylococcus spp. и Enterobacteriaceae spp. в количестве 10⁴ КОЕ/ед., грамположительных факультативно-анаэробных палочек Lactobacillus spp. в количестве 10⁴ КОЕ/ед. и условно-патогенных дрожжеподобных грибов рода Candida в дрожжевой форме в количестве 10^3-4 КОЕ/ед. диагностируют дисбиоз полости рта на фоне хронического билиарнозависимого панкреатита; при значении уреазной активности 0,778 µмоль·мин^-1 на мг белка, уровня аммиака 0,031 мМоль, рН 5,6, светосуммы свечения 22,5 у/е, уреазопозитивных Staphylococcus spp. и Enterobacteriaceae spp. в количестве 10⁵ КОЕ/ед., грамположительных факультативно-анаэробных палочек Lactobacillus spp. в количестве 10⁵ КОЕ/ед. и условно-патогенных дрожжеподобных грибов рода Candida в мицелиальной форме в количестве 10^4-5 КОЕ/ед. диагностируют дисбиоз полости рта на фоне хронического билиарнозависимого панкреатита с симптомами гастроэзофагеальной рефлюксной болезни.