Способ диагностики метавоспаления у пациентов с ишемической болезнью сердца и сахарным диабетом 2 типа Российский патент 2024 года по МПК G01N33/49 G01N33/577 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, кардиологии и эндокринологии, и может быть использовано для диагностики метавоспаления у пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) и сахарным диабетом (СД) 2 типа.

В последнее время концепция патогенеза сахарного диабета 2 типа неразрывно связана с понятием метавоспаления. Этот термин был впервые введен Геканом Хотэмислигилом, и подразумевает развитие иммунологической дисфункции на фоне нарушения метаболического гомеостаза [1]. Инсулинорезистентность является отличительной чертой, как классического воспаления, так и метавоспаления. Однако, в отличие от классического воспаления, которое условно назвали «горячее воспаление», при метавоспалении, или «холодном воспалении», отсутствует патоген и его эрадикация, а индуктором является дисфункция метаболически активных тканей, которая сохраняется на протяжении длительного времени и способствует поддержанию провоспалительного фона, и, как следствие, системных метаболических нарушений [2].

Т-регуляторные лимфоциты представляют собой субпопуляцию CD4+ Т-лимфоцитов с противовоспалительной активностью [3]. По результатам проведенного ранее мета-анализа для пациентов с СД 2 типа характерно снижение содержания CD4+CD25+Foxp3+T-регуляторных лимфоцитов, и их ключевого цитокина IL-10 [3]. С другой стороны, в некоторых крупных исследованиях, содержание T-регуляторных лимфоцитов у пациентов с СД 2 типа не отличалось от такового у пациентов без СД 2 типа [4, 5]. Объяснением может служить увеличение продукции T-регуляторных лимфоцитов при СД 2 типа, наблюдаемое на начальном этапе заболевания, которое затем сменяется истощением иммунорегуляторного резерва и развитием дефицита T-регуляторных клеток. При этом образуются клетки с фенотипом CD4+CD25^lowFoxP3+ [6], определение содержания которых у пациентов с СД 2 типа в настоящее время не проводится.

Известен способ неинвазивной диагностики метавоспаления, заключающийся в определении содержания С-реактивного белка (СРБ) [7]. У пациентов с СД 2 типа содержание СРБ варьирует в пределах 4,49 – 16,48 мг/л [8].

Недостатком способа является то, что увеличение содержания СРБ является неспецифичным для метавоспаления [9]. Поэтому актуальным является поиск новых диагностических биомаркеров воспаления у пациентов с СД 2 типа в периферической крови.

В проанализированной патентной и научно-медицинской литературе адекватного прототипа не обнаружено.

Задачей изобретения является разработка способа диагностики метавоспаления у пациентов с сочетанием ИБС и СД 2 типа.

Поставленная задача решается путем определения относительного содержания CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов от всех CD4+ лимфоцитов в периферической крови, затем по данным абсолютного содержания лимфоцитов, полученным в ходе общего анализа крови на автоматическом гематологическом анализаторе, рассчитывают абсолютное содержание CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови, и при суммарном абсолютном содержании CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови равном 1,39×10⁷ клеток/л и более диагностируют метавоспаление.

Новым в предлагаемом способе является то, что для диагностики метавоспаления проводят оценку относительного содержания CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов от всех CD4+ лимфоцитов в периферической крови, и по данным общего анализа крови рассчитывают суммарное абсолютное содержание CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови. При содержании CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови равном 1,39×10⁷ клеток/л крови и более диагностируют метавоспаление у пациентов с ишемической болезнью сердца и сахарным диабетом 2 типа.

Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных к нему фигур. На фиг. 1 представлена ROC-кривая для оценки предсказательной мощности пограничных значений суммарного абсолютного содержания CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови у пациентов с сочетанием ишемической болезни сердца и сахарного диабета 2 типа.

Способ осуществляют следующим образом.

В исследование были включены 20 пациентов с ишемической болезнью сердца и 15 пациентов с сочетанием ишемической болезни сердца и СД 2 типа, госпитализированных в клиники Научно-исследовательского института кардиологии. Критериями включения являлись диагноз ИБС и СД 2 типа, соответственно, которые были выставлены в предыдущую госпитализацию на основании данных анамнеза, объективного обследования, инструментальных и лабораторных методов. Критерии исключения: наличие воспалительных процессов любой локализации. Пациенты не имели существенных различий по основным клиническим данным, все находились на регулярной кардиоактивной терапии. Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании после беседы и ответов на вопросы. Протокол исследования был одобрен комитетом по биомедицинской этике НИИ кардиологии (протокол №210 от 18.02.2021).

В утренние часы натощак осуществляли взятие крови из кубитальной вены в объеме 4 мл в пробирку с гепарином для получения фракции мононуклеарных лейкоцитов и в объеме 2 мл в пробирку с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) для проведения общего анализа крови. Полученные образцы крови при комнатной температуре доставляли в клинико-диагностическую лабораторию. Путем центрифугирования на градиенте плотности Histopaque 1077 (Sigma Aldrich, США) получали фракцию мононуклеарных лейкоцитов периферической крови. Клетки окрашивали моноклональными антителами к поверхностным антигенам, конъюгированными с флуорохромами: анти-CD4 FITC, анти-CD25 PE (BD Pharmingen, США), остаточные эритроциты лизировали, фиксировали клетки и пермеабилизировали с помощью специального набора буферов для окрашивания FoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в течение 30 минут (BD Pharmingen, США), а затем проводили окрашивание с помощью моноклональных антител к FoxP3, конъюгированных с флуорохромом AF647 (BD Pharmingen, США) в течение 40 минут, затем клетки отмывали от несвязавшегося флуорохрома двукратно отмывочным буфером (BD Pharmingen, США) и фиксировали с помощью буфера CellFix (BD Pharmingen, США). Клетки собирали на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с помощью программного обеспечения CellQuestPro (BD Biosciences, США). С помощью последовательного гейтирования выделяли регион лимфоцитов на гистограмме с параметрами «Прямое светорассеяние (FSC)» и «Боковое светорассеяние (SSC)», затем выделяли CD4+ Т-лимфоциты на гистограмме с параметрами «Боковое светорассеяние (SSC)» и «Интенсивность флуоресценции CD4», среди которых выделяли CD25^lowFoxP3+ клетки на гистограмме с параметрами «Интенсивность флуоресценции CD25» и «Интенсивность флуоресценции FoxP3». Результаты выражали в виде относительного содержания CD4+CD25^lowFoxP3+ клеток от всех CD4+ лимфоцитов. Используя результаты общего анализа крови (абсолютное содержание лимфоцитов), рассчитывали суммарное абсолютное содержание CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови.

При анализе данных определили, что пациенты с ИБС и с сочетанием ИБС и СД 2 типа статистически значимо различаются по суммарному абсолютному содержанию CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови (р=0,025). Для выявления пороговой величины суммарного абсолютного содержания CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови, свойственной для пациентов с сочетанием ИБС и СД 2 типа, построили ROC (Receiver Operating Characteristics)-кривую (фиг. 1). По данным ROC-анализа для пациентов с СД 2 типа оказалось свойственным увеличение суммарного абсолютного содержания CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови 1,39×10⁷ клеток/л и более (площадь под кривой: 0,763; чувствительность: 73,3%; специфичность: 70%) (Таблица 1). В связи с тем, что площадь под кривой была приближена к 80%, суммарное абсолютное содержание CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови можно рассматривать в качестве хорошего классификатора наличия метавоспаления у пациентов с сочетанием ИБС и СД 2 типа [10].

Таблица 1.

Координаты ROC-кривой для оценки предсказательной мощности пограничных значений суммарного абсолютного содержания CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови

Координаты кривой Тестовая переменная: CD4+CD25^lowFoxP3+_n Положительное
если больше или равно^a Чувствительность 1 - Специфичность -0,5552814400 1,000 1,000 0,5116264800 1,000 0,950 0,5877714500 1,000 0,900 0,6890840000 1,000 0,850 0,7957935000 1,000 0,800 0,8122700700 1,000 0,750 0,8420965200 1,000 0,700 0,8905818250 1,000 0,650 0,9169791400 1,000 0,600 0,9796415150 0,933 0,600 1,0430211500 0,933 0,550 1,1130405250 0,933 0,500 1,1786889650 0,867 0,500 1,2424750900 0,800 0,500 1,3093347400 0,800 0,450 1,3294870300 0,800 0,400 1,3496757600 0,733 0,400 1,3655914700 0,733 0,350 1,3914959000 0,733 0,300 1,4360123200 0,667 0,300 1,4661779200 0,667 0,250 1,5074832900 0,600 0,250 1,5519402900 0,533 0,250 1,6060213350 0,533 0,200 1,7297702100 0,467 0,200 1,8817014050 0,400 0,200 1,9651815300 0,400 0,150 2,0097389200 0,400 0,100 2,0998436400 0,333 0,100 2,1719702200 0,267 0,100 2,3276839700 0,267 0,050 2,4771101700 0,200 0,050 2,7059106200 0,133 0,050 3,0435316200 0,067 0,050 3,5145564400 0,067 0,000 4,8618274800 0,000 0,000 a. Наименьшим значением отсечения является минимальное значение тестовой переменной минус 1, и максимальным значением отсечения является максимальное значение тестовой переменной плюс 1. Все остальные значения отсечения являются средними двух последовательных упорядоченных значений тестовой переменной.

Ниже приводятся 3 клинических примера использования разработанного способа.

Пример 1.

Пациентка Ф., 57 лет, поступила в плановом порядке в отделение атеросклероза и хронической ИБС для проведения аорто-коронарного шунтирования по поводу многососудистого стенозирующего атеросклероза коронарных артерий.

Основное заболевание: ИБС: стенокардия напряжения, ФК III. Атеросклероз коронарных артерий: стеноз передней нисходящей артерии 75% в дистальной трети, стеноз ветви тупого края 75%

Фоновое заболевание: Гипертоническая болезнь III стадии, достигнутая степень артериальной гипертонии 2, риск 4. Гипертрофия левого желудочка. Дислипидемия. Сахарный диабет 2 типа с потребностью в инсулине, целевой гликированный гемоглобин менее 7,5%, достигнутый гликированный гемоглобин 12,4%. Диабетическая непролиферативная ретинопатия. Ожирение I ст.

Жалобы: ангинозные боли соответствуют III ФК.

Из анамнеза: давящие боли за грудиной при небольшой физической нагрузке.

Сахарный диабет 2 типа поставлен 12 лет назад. Отмечает увеличение гликемии до 17-20 ммоль/л постоянно натощак.

Объективно: общее состояние удовлетворительное, ИМТ 34,6 кг/м². Содержание глюкозы натощак 12,8 ммоль/л; содержание глюкозы через 2 часа после стандартной пищевой нагрузки 14,1 ммоль/л; содержание гликированного гемоглобина 11,26%; содержание общего холестерола 3,26 ммоль/л; содержание триглицеридов 1,26 ммоль/л; содержание холестерола липопротеинов высокой плотности 1,04 ммоль/л; содержание холестерола липопротеинов низкой плотности 1,66 ммоль/л; содержание высокочувствительного С-реактивного белка составило 6,95 мг/л.

Проведено исследование согласно предлагаемому способу:

Суммарное абсолютное содержание CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови составило 3,09×10⁷ клеток/л крови.

Таким образом, у пациентки выявлено наличие метавоспаления.

Пример 2.

Пациентка Л., 78 лет, поступила в плановом порядке в отделение атеросклероза и хронической ИБС для проведения аорто-коронарного шунтирования по поводу многососудистого стенозирующего атеросклероза коронарных артерий.

Основное заболевание: ИБС, стенокардия напряжения III ФК. Атеросклероз коронарных артерий (стеноз задне-боковой артерии 70%, проксимальный сегмент огибающей артерии 40%, изгиб ствола левой коронарной артерии 50%). Критический стеноз аортального клапана с трансклапанным градиентом 160/60 мм рт. ст.

Фоновое заболевание: Гипертоническая болезнь III стадия, достигнутый целевой уровень АД, риск 4. Гипертрофия левого желудочка. Атеросклероз сонных (слева в бифуркации общей сонной артерии 40%, в устье внутренней сонной артерии до 40%, в устье внутренней сонной артерии до 45%), бедренных артерий (справа по ходу подколенной артерии до 50%, слева по ходу общей бедренной артерии 20%, по ходу поверхностной бедренной артерии 20-23%). Хроническая ишемия головного мозга II ст. Дислипидемия. Сахарный диабет 2 типа, впервые выявленный.

Жалобы: увеличение артериального давления до 170-180/… мм рт. ст. (подташнивание, жар), больше в ночное время и под утро; одышка при ходьбе по ровному месту >100 м, >1 пролета лестницы; тупая ноющая боль в левой половине грудной клетки, появляется в покое, при физической нагрузке уменьшается и исчезает.

Из анамнеза: в 2015 году выявлен сложный аортальный порок (сейчас на УЗИ сердца критический аортальный стеноз с градиентом 150/86 мм рт. ст., аортальная регургитация 1 ст.). Не обследовалась, не наблюдалась. Сейчас при появлении болей в грудной клетке вновь обратилась к кардиологу, сделали УЗИ, направили на госпитализацию. В предыдущую госпитализацию проведено обследование. Консультирована кардиохирургом – показано оперативное лечение: протезирование аорты+аорто-коронарное шунтирование.

Объективно: общее состояние удовлетворительное. ИМТ 27,57 кг/м². Содержание глюкозы натощак 19,8 ммоль/л, содержание глюкозы через 2 часа после стандартной пищевой нагрузки 23,00 ммоль/л, содержание гликированного гемоглобина 8,4%, содержание общего холестерола 4,35 ммоль/л, содержание триглицеридов 1,04 ммоль/л, содержание холестерола липопротеинов высокой плотности 1,74 ммоль/л, содержание холестерола липопротеинов низкой плотности 2,13 ммоль/л; содержание высокочувствительного С-реактивного белка составило 0,54 мг/л.

Проведено исследование согласно предлагаемому способу:

Суммарное абсолютное содержание CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови составило 1,39×10⁷ клеток/л крови.

Таким образом, у пациентки выявлено наличие метавоспаления.

Пример 3.

Пациент К., 59 лет, поступил в плановом порядке в кардиохирургическое отделение №1 для обследования и определения тактики лечения.

Основное заболевание: ИБС: атеросклероз коронарных артерий (стеноз первой ветив диагональной артерии 80%). Гипертрофическая кардиомиопатия с обструкцией выводного отдела с градиентом 85 мм. рт. ст.

Фоновое заболевание: Гипертоническая болезнь III стадия, достигнута 1 степень, дислипидемия. Атеросклероз сонных артерий: стеноз внутренней сонной артерии с обеих сторон менее 25%. Атеросклероз сосудов нижних конечностей: стеноз общей бедренной артерии с обеих сторон до 30%, стеноз поверхностной бедренной артерии с обеих сторон до 50%. Риск 4.

Объективно: общее состояние удовлетворительное. ИМТ 20,3 кг/м². Содержание глюкозы натощак 5,15 ммоль/л; содержание глюкозы через 2 часа после стандартной пищевой нагрузки 5,7 ммоль/л; содержание гликированного гемоглобина 5,65%; содержание общего холестерола 3,28 ммоль/л; содержание триглицеридов 0,77 ммоль/л; содержание холестерола липопротеинов высокой плотности 1,18 ммоль/л; содержание холестерола липопротеинов низкой плотности 1,75 ммоль/л; содержание высокочувствительного С-реактивного белка составило 2,28 мг/л.

Проведено исследование согласно предлагаемому способу:

Суммарное абсолютное содержание CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови составило 0,44×10⁷ клеток/л крови.

Таким образом, у пациента метавоспаление отсутствует.

Предлагаемый в качестве изобретения способ апробирован на 35 больных, может быть использован в практическом здравоохранении для выявления наличия метавоспаления и повышает качество диагностики у пациентов с ишемической болезнью сердца и сахарным диабетом 2 типа.

Источники информации:

1. Hotamisligil G.S. Inflammation, metaflammation and immunometabolic disorders // Nature. 2017; 542(7640):177-185.

doi: 10.1038/nature21363

2. Calay E., Hotamisligil G. Turning off the inflammatory, but not the metabolic, flames // Nat Med. 2013; 19: 265–267

doi: 10.1038/nm.3114

3. Qiao Y.C., Shen J., He L., et al. Changes of Regulatory T Cells and of Proinflammatory and Immunosuppressive Cytokines in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus: A Systematic Review and Meta-Analysis // J Diabetes Res. 2016; 2016: 3694957.

doi: 10.1155/2016/3694957

4. Afzal N., Zaman S., Shahzad F., et al. Immune mechanisms in type-2 diabetic retinopathy // J Pak Med Assoc. 2015; 65(2): 159-63.

5. Rattik S., Engelbertsen D., Wigren M., et al. Elevated circulating effector memory T cells but similar levels of regulatory T cells in patients with type 2 diabetes mellitus and cardiovascular disease // Diab Vasc Dis Res. 2019;16(3): 270-280.

doi: 10.1177/1479164118817942

6. Ferreira R.C., Simons H.Z., Thompson W.S., et al. Cells with Treg-specific FOXP3 demethylation but low CD25 are prevalent in autoimmunity // J Autoimmun. 2017; 84: 75-86.

doi: 10.1016/j.jaut.2017.07.009

7. Tabassum R., Mia A.R., Reza-Ul-Haq K.M., et al. C-reactive Protein Level in Type-2 Diabetic Patients Attending Mymensingh Medical College Hospital, Mymensingh // Mymensingh Med J. 2017; 26(1): 56-60.

8. Stanimirovic J., Radovanovic J., Banjac K., et al. Role of C-Reactive Protein in Diabetic Inflammation // Mediators Inflamm. 2022; 2022: 3706508.

doi: 10.1155/2022/3706508

9. Lee C.C., Adler A.I., Sandhu M.S. et al. Association of C-reactive protein with type 2 diabetes: prospective analysis and meta-analysis // Diabetologia. 2009; 52: 1040–1047.

doi: 10.1007/s00125-009-1338-3

10. Carter J.V., Pan J., Rai S.N., Galandiuk S. ROC-ing along: Evaluation and interpretation of receiver operating characteristic curves // Surgery. 2016; 159(6): 1638-1645.

doi: 10.1016/j.surg.2015.12.029

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, кардиологии и эндокринологии, и может быть использовано для диагностики метавоспаления у пациентов с ишемической болезнью сердца и сахарным диабетом 2 типа. Проводят определение относительного содержания CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов от всех CD4+ лимфоцитов периферической крови. По данным абсолютного содержания лимфоцитов, полученным в ходе общего анализа крови, рассчитывают абсолютное содержание CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови. При суммарном абсолютном содержании CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови 1,39×10⁷ клеток/л и более диагностируют метавоспаление. Способ обеспечивает диагностику метавоспаления у пациентов с ишемической болезнью сердца и сахарным диабетом 2 типа за счет определения суммарного абсолютного содержания CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов 1,39×10⁷ клеток/л и более в периферической крови. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ диагностики метавоспаления у пациентов с ишемической болезнью сердца и сахарным диабетом 2 типа, характеризующийся тем, что у пациента проводят определение относительного содержания CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов от всех CD4+ лимфоцитов периферической крови, затем по данным абсолютного содержания лимфоцитов, полученным в ходе общего анализа крови, рассчитывают абсолютное содержание CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови, и при суммарном абсолютном содержании CD4+CD25^lowFoxP3+ Т-регуляторных лимфоцитов в периферической крови, равном 1,39×10⁷ клеток/л и более, диагностируют метавоспаление.