Способ получения ранозаживляющего геля, содержащего трипсин, для наружного применения Российский патент 2022 года по МПК A61K38/45 A61K38/47 A61K38/48 A61K47/10 A61K47/36 A61K47/42 A61P17/02 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, а именно эмульсионным лечебно-профилактическим средствам наружного применения при кожных ранах (в том числе гнойных), и представляет собой ранозаживляющий гель для наружного применения, содержащий желатин, альгинат натрия и трипсин, сшитые ферментом трансглутаминазы, а также глицерин, фузидин, может быть использовано в химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, косметике.

Актуальность разработки таких препаратов вызвана тем, что в настоящее время частота поражений кожи имеет тенденцию к росту. Проблема борьбы с раневыми дефектами крайне важна как для гражданской, так и для военно-полевой медицины. Развитие сложных промышленных производств, наличие на вооружении большинства армий зажигательных смесей, все возрастающее количество природных катаклизмов и техногенных катастроф требует повышение эффективности терапии раневых дефектов при большей доступности и оперативности применения лекарственных препаратов. Раневые дефекты различной степени тяжести сопровождаются нарушением кислотно-щелочного равновесия и синтеза белков, совокупностью ферментных реакций распада сложных высокомолекулярных и биоорганических соединений, что приводит к некрозу тканей, экссудативным реакциям, образованию грануляционной ткани, бактериальной обсемененности раневой поверхности.

В качестве ранозаживляющих препаратов в настоящее время используется большое количество лекарственных средств, среди которых особое место занимают препараты на основе неорганических и металлоорганических соединений, содержащих ферменты и другие биологически активные соединения. Несмотря на высокую эффективность использования ферментных препаратов имеются проблемы, ограничивающие их широкое применение. К ним относятся: нестабильность их структур в условиях, отличных от оптимальных, иногда аллергические реакции, вызванные попаданием свободных ферментов в биологические жидкости. Кроме того, в отличие от обычных гетерогенных химических катализаторов, большинство ферментов работают только в растворенном состоянии - в системах гомогенного катализа, поэтому они загрязняют продукт и, как правило, не могут быть восстановлены в активной форме из реакционных смесей для повторного использования. Существует несколько подходов, чтобы преодолеть эти ограничения. Одним из них является иммобилизация ферментов. Иммобилизация достигается путем фиксации белковой глобулы на поверхности или внутри нерастворимых носителей, в результате чего получаются гетерогенные ферментные системы. По сравнению со свободными энзимами в растворе иммобилизованные ферменты более стабильны, и практически исключается их мгновенная и нежелательная эмиссия. Иммобилизацию ферментов можно проводить на природных и синтетических носителях, как за счет слабых взаимодействий, так и ковалентных связей. Причем в последнем случае можно использовать как химические, так и биологические (ферментативные) сшивки.

Главная роль в осуществлении перечисленных функций перевязочного средства принадлежит полимерной матрице, на которой фиксируют методами иммобилизации медикаментозные средства. Применение синтетических носителей и химических сшивок ограничено тем, что они часто не биосовместимы и могут вызвать аллергические реакции и даже токсикозы. Способ иммобилизации фермента и выбор полимера - носителя в первую очередь должны определяться особенностями эксплуатации раневых покрытий.

В связи с доступностью и дешевизной в качестве матрицы многие исследователи продолжают использовать текстильные ткани и прежде всего медицинскую марлю (RU 2268751, МПК A61L 15/38, A61L 15/32, опубл. 27.01.2006; RU 2323748, МПК A61L 15/16, A61L 15/32, A61L 15/38, A61L 15/40, опубл. 19.05.2008; RU 2380117, МПК A61L 15/28, A61K 38/36, A61L 15/32, A61K 31/197, A61L 15/38, A61P 7/04, A61K 47/38, опубл. 27.01.2010; RU 2203684, МПК A61L 15/48, A61L 15/20, опубл. 10.05.2003).

Однако известные решения имеют ряд недостатков, таких как высокая степень адгезии к ране, болезненность при снятии, образование благоприятной среды для развития гнойных процессов требует создания нового поколения полимерных и нанокомпозиционных материалов.

Раневые покрытия, содержащие ферменты, широко известны. Например, в заявке GB 2240040 описывается медицинская повязка из частично окисленного целлюлозосодержащего материала в форме марли, к которому химическими связями присоединены ферменты, обладающие протеолитической, коллагенолитической и/или бактериолитической активностью.

Известен способ получения повязки, который заключается в смешении раствора коллагена с комплексом протеолитических ферментов, выделяемых из гепатопанкреаса камчатского краба и обладающих коллагенолитической активностью, с последующим воздействием газообразным формальдегидом (RU 2127128, МПК A61L 15/32, опубл. 10.03.1999).

Данные решения обладают такими недостаткам, как высокая степень адгезии к ране, болезненность при снятии, образование благоприятной среды для развития гнойных процессов требует создания нового поколения полимерных и нанокомпозиционных материалов.

Известен также способ получения гетерогенного препарата иммобилизованных протеолитических ферментов путем пришивки к альдегидным группам окисленной целлюлозы (хлопковой марли) (RU 2323748, МПК A61L 15/16, A61L 15/32, A61L 15/38, A61L 15/40, опубл. 19.05.2008).

Недостатки такого способа - адгезия к ране и отсутствие антисептических свойств. В этом плане наиболее перспективны эмульсионно лечебно-профилактические средства наружного применения при кожных ранах.

Известен ранозаживляющий гель для наружного применения, содержащий хитозан, салициловую кислоту, биорегулятор, выделенный из сыворотки крови крупного рогатого скота, представляющий собой фракцию кислых белков в интервале значений рН<3,0, и воду, взятые в определенном соотношении (RU 2468814, МПК A61K 38/14, A61K 31/19, A61K 31/722, A61K 35/16, A61P 17/02, опубл. 10.12.2012).

К недостаткам аналога следует отсутствие в его составе протеолитических ферментов, очищающих рану и ферментов, останавливающих кровотечение.

Известен способ получения средства для наружного применения «Полимед», содержащее фенол медицинский, резорцин, борную кислоту, дистиллированную воду, хитозан, диметилсульфоксид, йодистый калий, уксусную кислоту ледяную, глицерин и анестетик (RU 2140264, МПК А61К 31/00, A61K 31/18, A61K 38/02, опубл. 27.10.1999).

К недостаткам следует отнести наличие в известном составе токсических и канцерогенных веществ, таких как фенол, борная кислота, диметилсульфоксид, которые могут вызывать аллергические реакции со стороны организма при попадании на кожу и оказывать токсическое действие при попадании в кровь. Кроме этого, препарат недостаточно эффективен из-за отсутствия в его составе активного морфогенетического вещества.

Наиболее близкими по технической сущности к заявленному изобретению является способ получения биокомпозита с регенерационными свойствами на основе гидрогеля бактериальной целлюлозы, который заключается в получении гель-пленки бактериальной целлюлозы путем культивирования штамма бактерий Gluconacetobacter sucrofermentans в статических условиях на среде с мелассой, отделении полученной гель-пленки бактериальной целлюлозы от культуральной среды и ее очищении, механическом измельчении очищенной гель-пленки бактериальной целлюлозы в течение 10 мин с получением гидромодуля с соотношением 1:3, получении гидрогеля бактериальная целлюлоза-хитозан в соотношениях 50:50 путем смешения 2%-го раствора хитозана в 1%-ой уксусной кислоте, гидрогеля бактериальной целлюлозы, 25%-го глутарового альдегида, а также получении гидрогеля бактериальная целлюлоза: хитозан :желатин:трансглютаминаза в соотношении 5:5:15:5 соответственно и добавлением фузидина натрия, эффективного при наружном применении, физиологически активных соединений полифенольной природы в виде дегидрокварцетина или ресвератрола, ферментов в виде трипсина, химотрипсина или лизоцима, низкомолекулярных пептидов (RU 2733137, МПК C12N 1/20, A61L 15/36, опубл. 29.09.2020).

Среди недостатков прототипа можно выделить: глутаровый диальдегид является высокотоксичным и его применение в медицинских целях, даже наружно, нежелательно; не совсем ясно, что из себя представляет биокомпозит, в каком виде его можно использовать, каким образом в биокомпозиты включены ферменты, и какая протеолитическая активность; процесс получения биокомпозита очень трудоемкий и включает в себя дорогую бактериальную целлюлозу; не проведены испытания биокомпозита и поэтому очень сложно судить о его эффективности.

Технический результат, при использовании заявленного изобретения, заключается в ускорении процесса заживления кожных ран за счет кровоостанавливающего, ранозаживляющего и антисептического действия ранозаживляющего геля, которое наступает без образования рубцов, а также низкой адгезии к ране, сокращении времени регенерации ткани, при этом не вызывая болезненности при снятии и легко смываясь теплой водой.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе получения ранозаживляющего геля, содержащего трипсин, для наружного применения осуществляют перемешивание 16,6%-ного водного раствора желатина, разогретого при температуре 60°C, 2%-ного водного раствора альгината натрия, разогретого при температуре 80°C. После охлаждения до температуры 30°C при постоянном перемешивании добавляют 16,6%-ный водный раствор фермента трансглутаминазы, трипсин, глицерин и фузидин, получают гелеобразующую смесь. Ранозаживляющий гель получают при следующем соотношении компонентов, мас.%:

водный раствор желатина 30,5 - 32,5, водный раствор альгината натрия 32,5 - 34,5, водный раствор фермента трансглутаминазы 30,5 - 32,5, глицерин 0,9 - 1,1, трипсин 1,0 - 1,3, фузидин 0,1 - 0,2.

Ранозаживляющий гель получают следующим образом.

Осуществляют перемешивание в термостатируемой емкости 16,6%-ного водного раствора желатина, разогретого при температуре 60°C, 2 %-ного водного раствора альгината натрия, разогретого при температуре 80°C. После охлаждения до температуры 30°C при постоянном перемешивании добавляют 16,6%-ный водный раствор фермента трансглутаминазы жидкий компании FloraBondTG, трипсин, глицерин и фузидин, получают гелеобразующую смесь. Ранозаживляющий гель получают при следующем соотношении компонентов, мас.%:

водный раствор желатина 30,5 - 32,5, водный раствор альгината натрия 32,5 - 34,5, водный раствор фермента трансглутаминазы 30,5 - 32,5, глицерин 0,9 - 1,1, трипсин 1,0 - 1,3, фузидин 0,1 - 0,2.

Желатин, являясь продуктом переработки коллагена, распространенного в природе белкового вещества, образует главную составную часть соединительной ткани позвоночных, особенно в коже, оссеине костей и в сухожилиях. По аминокислотному и элементарному составу желатин близок к коллагену. Желатин набухает в воде и при нагревании от 30 до 60°С растворяется; при охлаждении раствор желатина образует студень (гель), который при нагревании опять переходит в раствор. Оптимальные пропорции растворения желатина в воде находятся в пределах 1:10 - 1:50. Температура застудневания и прочность студня зависят от концентрации раствора и качества желатина. Основными критериями качества желатина являются вязкость раствора, прочность студня, температура его плавления и застудневания, измеренные при определенных условиях (Артеменко А.И. Справочное руководство по химии / А.И. Артеменко, В.А. Малеванный, И.В. Тикунова. - М.: Высшая школа, 1990. - 124 c.). Благодаря функции гелеобразователя возможно его использование в получении биоразлагаемых полимеров. При недостатке желатина прочность пленок уменьшается.

Альгинат натрия представляет собой полисахарид, состоящий из остатков D-маннуроновых и L-гулуроновой кислот, соединенных между собой. В карбоксильных группах водород замещен на натрий. Соотношение полимерных цепей и определяет свойства альгината. При добавлении в воду альгинатыобладают уникальными гелеобразующими свойствами. На способности образовывать гели, т.е. работать как загустители, желирующие вещества основано их применение (Подкорытова А.В. О составе и физико-химических свойствах альгиновой кислоты и альгинатов из бурых водорослей // Труды ТИНРО. Исследования по технологии рыбных продуктов. - Владивосток, 1973. - Вып. 4. - С. 86-89). Альгинатный гель термически необратим, выдерживает охлаждение, замораживание и сохраняет свои свойства при оттаивании. При образовании геля сначала полисахаридные цепочки соединяются между собой при помощи водородных мостиков, а потом эти цепочки, связываясь с ионами металлов формируют ячеистую структуру. В середине каждой ячейки - ион металла (Кирьянов А.Т., Иванников А.Т. Альгинат-содержащие добавки с сорбционными свойствами // Второй международный симпозиум «Питание и здоровье: биологически активные добавки к пище»: Сб. тезисов. - М., 25-27 апреля 1996). Такая структура способствует образованию прочных связей при получении пленочных композиционных смесей.

Фермент трансглютаминазы обладает уникальными свойствами - связывает простые и сложные белки, образует ковалентные связи между свободными аминогруппами (свободных, либо из боковых цепей лизина) и гамма-карбоксамидными группами глутамина, способствуя внутри- и межмолекулярному перекрестному сшиванию белковых молекул. Ковалентные связи трансглютаминазы устойчивы к протеолизу.

Глицерин отвечает за пластичность и вязкость геля.

Трипсин кристаллический - ферментный препарат протеолитического действия, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого скота. Трипсин обладает выраженными противовоспалительными и противоотечными свойствами, способен расщеплять омертвевшие участки тканей, фибринозные образования, вязкие секреты и экссудаты. По отношению к здоровым тканям фермент неактивен и безопасен в связи с наличием в них ингибиторов трипсина (специфических и неспецифических). Не влияет на систему гемостаза.

Фузидин оказывает антибактериальное и антисептическое действие. Фузидовая кислота относится к группе фузидинов, антимикробных соединений, механизм действия которых связан с нарушением синтеза белка в бактериальной клетке. К фузидовой кислоте чувствительны грамположительные бактерии и грамотрицательные кокки, например, Staphylococcusaureus, Staphylococcusepidermidis (включая метициллинрезистентные штаммы), Nocardiaasteroides, Corynebacteriumminutissimum, Streptococcuspyogenes, Pseudomonasspp, Clostridiumspp, Neisseriameningitidis, Neisseriagonorrhoeae.

В полученном геле определяют вязкость и протеолитическую активность. Вязкость определяют на вискозиметре Brookfield. Она должна быть в пределах 5 - 7 Па×с. Активность определяют по гидролизу казеина и образовании тирозина. Расчет активности проводят в соответствии с ГОСТ 20264.2-88. В ранозаживляющем геле активность составила 19,25 - 22,1 Е/г.

Способ применения ранозаживляющего геля.

Нанесенный на поверхность кожи или раны гель в течение 5-10 мин образует влажную пленку, которую можно смыть теплой водой.

Таким образом, благодаря получению препарата трипсина, иммобилизованного на природных гелеобразующих носителях - альгинате, желатине, сшитых ферментом трансглутаминазы, и содержащих глицерин, фузидин возможно проводить ферментативные реакции в растворах и на твердых поверхностях, а фермент при этом становится более стабильным и обладает пролонгированным действием. Трипсин участвует в очищении ран, трансглутаминаза препятствует кровотечению, а фузидин оказывает антисептическое действие.

Апробация способа

Испытание полученного ранозаживляющего геля проводили на 40 крысах (самцах и самках), разделенных случайным образом, на две группы по 20 животных. Всем животным наносили порезы на дорсальной поверхности хвоста в области его основания. Порезы, длиной 2,0-2,5 см наносили специально подготовленным ножом, имеющим «зуб» высотой 3 мм, который ограничивал глубину пореза.

Животным второй группы рану, сразу после нанесения пореза, смачивали гомогенатом фекалий крыс для индуцирования воспалительного процесса. Гомогенат готовили из расчета: 1 часть фекалий к 2 частям изотонического раствора хлорида натрия (по объему). У животных первой группы не стимулировали воспаление, и они составили «условно интактную» группу.

В обеих группах крыс распределили на четыре экспериментальные серии по 5 особей в каждой. Информация о кодировании животных, в зависимости от принадлежности к различным экспериментальным сериям представлена в табл. 1.

Всем животным серий 1 и 4 начиная с первого дня после нанесения пореза (в течение двух недель ежедневно) наносили на его область компоненты испытуемого лекарственного комплекса, не содержащего трипсин.

Животные серий 2 и 4 составили основную опытную группу. Они в течение двух недель ежедневно получали терапию испытуемым лекарственным комплексом полного состава.

Крысам серий 3 и 6 на область раны закапывали 0,1%-ный раствор кристаллического трипсина, приготовленного на стерильном изотоническом растворе хлорида натрия. Местное воздействие также осуществляли две недели ежедневно.

Животные 7 и 8 серий были контрольными и не получали никаких фармакологических воздействий.

Все фармакологические средства на область раны наносили в одно и тоже время суток - в вечернее время (17-19 ч). Животные содержались поодиночке в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище. Состояние ран подвергалось фотофиксации с интервалом в 2 сут.

Раны на дорсальной поверхности хвоста у контрольных животных первой группы (серия 7) не подвергались значительному воспалительному повреждению. Процесс прогрессивного заживления порезов завершался в течение 3-4 недель. Компоненты лекарственного комплекса при раздельном применении (серии 1 и 3) не оказывали заметного влияния на процесс регенерации кожи. Следует отметить, что у животных серии 1 отмечался заметный противовоспалительный эффект. Края ран не содержали фрагментов запекшейся крови или участков нагноения. Внешний вид ран у животных, получавших местную терапию трипсином, не имел отличий от ран у животных контрольной серии 7. Животные серии 2, получавшие терапию лекарственным комплексом полного состава к концу уже второй недели имели прогрессивно заживающие раневые поверхности. При этом раны не имели внешних признаков воспаления, были истончены и существенно короче в своей протяженности.

Закономерности заживления экспериментальных порезов у крыс второй группы в принципе воспроизводил основные закономерности регенерации, характерные для животных первой группы, но существенную роль при этом играл фактор индукции воспаления. В контрольной серии опытов раны подвергались существенной инфекции, были воспалены и их заживление существенно тормозилось. В области раны к концу второй недели эксперимента наблюдались участки нагноения. Ширина рубца приближалась к своему изначальному размеру. У животных серии 4 отмечался заметный противовоспалительный эффект, раны выглядели намного чище, чем у животных контрольной серии. Недостатком терапии лекарственного комплекса, не содержащего трипсин, явились проблемы с контракцией раны. Края ран на значительном ее протяжении заметно разведены, что существенно замедляет процесс заживления. У животных получавших терапию трипсином (серия 6) состояние обратное. Проблемы с контракцией ран отсутствуют, но сохраняются очаги воспалительного повреждения. Животные опытной серии (серия 5) демонстрируют сочетание основных достоинств двух раздельных компонентов испытуемого лекарственного комплекса. Состояние ран явно отражает высокий прогресс регенерации компонентов дермы и эпидермиса. Отсутствуют участки воспаления на всем протяжении ран. Процесс контракции ран осуществляется в оптимальном режиме.

По сравнению с известным решением заявленный ранозаживляющий гель не содержит токсичных компонентов, обладает низкой адгезией к ране и коже, не вызывают болезненность при снятии, при необходимости смываются теплой водой и оказывает ранозаживляющее и кровоостанавливающе действие.

Таблица 1

Условия
эксперимента Группа 1
Без индукции воспаления
(нумерация животных) Группа 2
С индукцией воспаления
(нумерация животных) Компоненты комплекса без трипсина 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5 Все компоненты
комплекса 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5 Трипсин 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5 Контроль 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5

Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к способу получения ранозаживляющего геля, содержащего трипсин, для наружного применения, заключающемуся в перемешивании 16,6%-ного водного раствора желатина, разогретого при температуре 60°C, 2%-ного водного раствора альгината натрия, разогретого при температуре 80°C, после охлаждения до температуры 30°C при постоянном перемешивании добавляют 16,6%-ный водный раствор фермента трансглутаминазы, глицерин, трипсин и фузидин, получают гелеобразующую смесь, при следующем соотношении компонентов, мас.%: водный раствор желатина 30,5 – 32,5, водный раствор альгината натрия 32,5 – 34,5, водный раствор фермента трансглутаминазы 30,5 – 32,5, глицерин 0,9 – 1,1, трипсин 1,0 – 1,3, фузидин 0,1 – 0,2. Настоящее изобретение обеспечивает ускорении процесса заживления кожных ран за счет кровоостанавливающего, ранозаживляющего и антисептического действия ранозаживляющего геля, которое наступает без образования рубцов, а также низкой адгезии к ране, сокращении времени регенерации ткани, при этом не вызывая болезненности при снятии и легко смываясь теплой водой. 1 табл.

Способ получения ранозаживляющего геля, содержащего трипсин, для наружного применения, заключающийся в перемешивании 16,6%-ного водного раствора желатина, разогретого при температуре 60°C, 2%-ного водного раствора альгината натрия, разогретого при температуре 80°C, после охлаждения до температуры 30°C при постоянном перемешивании добавляют 16,6%-ный водный раствор фермента трансглутаминазы, глицерин, трипсин и фузидин, получают гелеобразующую смесь, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

водный раствор желатина 30,5 – 32,5 водный раствор альгината натрия 32,5 – 34,5 водный раствор фермента трансглутаминазы 30,5 – 32,5 глицерин 0,9 – 1,1 трипсин 1,0 – 1,3 фузидин 0,1 – 0,2