ЖИДКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ АНТИТЕЛО К АЛЬФА-РЕЦЕПТОРУ ИНТЕРЛЕЙКИНА-4 ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2024 года по МПК A61K39/395 A61K47/02 A61K47/22 A61K47/26 A61K9/08 A61P29/00 A61P37/08 

Настоящая заявка испрашивает преимущество приоритета по заявке на патент Китая № 201910187179.9, поданной 13 марта 2019 г., которая настоящим включена посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области биофармацевтического состава. В частности, настоящее изобретение относится к стабильному жидкому составу, содержащему антитело в высокой концентрации.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Известно, что рецептор интерлейкина-4 человека представляет растворимую форму белка (shIL-4Rα), который ингибирует пролиферацию клеток, опосредованную активацией IL-4 и IL-5, опосредованной Т-клетками. Две формы рецептора ассоциированы с аллергической реакцией, которая проявляется в виде таких заболеваний, как аллергический ринит, синусит, астма, экзема и т. п. Следовательно, блокирующее антитело, нацеленное на белок, помогает в лечении и облегчении таких заболеваний.

В настоящее время в стадию клинических испытаний вступили лекарственные препараты на основе моноклональных антител, нацеленные на hIL-4R, такие как дупилумаб, который показал высокую эффективность в клинических испытаниях фазы II для лечения атопического дерматита. Однако для лекарственных препаратов на основе антител наилучшим способом введения является подкожная инъекция, и для проявления их эффекта требуются относительно высокие дозы, и, соответственно, обычно требуется получение составов на основе антител с высокой концентрацией. Как известно из предшествующего уровня техники, получение и применение состава на основе антител с высокой концентрацией обычно сопряжено со многими трудностями. Например, высокая вязкость такого состава может затруднять набор и введение с помощью шприца, приводить к большим отклонениям в дозе введения из-за большого остатка лекарственного средства в контейнере или картридже, содержащем состав, приводить к появлению боли в месте инъекции и т. п. Кроме того, высокая вязкость состава может создавать серьезные технологические проблемы при получении. Например, во время стадий концентрирования и фильтрации может потребоваться чрезвычайно высокое давление, или даже состав вообще не возможно пропустить через фильтрующую мембрану. Или антитело с высокой концентрацией в таком составе предрасположено к агрегированию и образованию нерастворимых частиц, что приводит к нестабильности состава, повышенной иммуногенности и большему количеству побочных эффектов лекарственного средства и т.д.

Следовательно, в данной области остается потребность в разработке нового состава на основе антитела, нацеленного на рецептор интерлейкина-4 человека, который может отвечать требованиям получения и клинического применения, среди прочего, в отношении высокой концентрации антитела, долговременной стабильности, отсутствия агрегации и низкой вязкости.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является предоставление жидкой композиции, содержащей антитело к альфа-рецептору интерлейкина-4 человека, и состава на ее основе, и такая жидкая композиция и состав на ее основе могут обеспечивать возможность стабильного присутствия антитела в высокой концентрации и обладать низкой вязкостью.

Технические решения, предусмотренные настоящим изобретением, заключаются в следующем.

В одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрена жидкая композиция, содержащая антитело к альфа-рецептору интерлейкина-4 человека, где жидкая композиция содержит антитело в концентрации 50-200 мг/мл и буфер, защитное средство и поверхностно-активное вещество и т.п., которые служат в качестве вспомогательных веществ, и при этом жидкая композиция характеризуется pH, составляющим 5,4-6,4.

В жидкой композиции антитело содержит вариабельную область легкой цепи (VL) и вариабельную область тяжелой цепи (VH), где вариабельная область легкой цепи содержит CDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 1, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 2, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 3, а вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR1, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 5, CDR2, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 6, и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 7.

Предпочтительно антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 4, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 8.

В соответствии с конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения антитело содержит константную область легкой каппа-цепи (CL) и константную область тяжелой гамма-цепи (CH). Еще более предпочтительно антитело содержит константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 9, и константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 10. Более предпочтительно антитело представляет собой моноклональное антитело, содержащее две легкие цепи и две тяжелые цепи.

SEQ ID NO: 1 (LCDR1): RASQSVSSSYLA;

SEQ ID NO: 2 (LCDR2): GASSRAT;

SEQ ID NO: 3 (LCDR3): QQYDHSAGWT;

SEQ ID NO: 4 (VL):

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDHSAGWTFGQGTKVEIK.

SEQ ID NO: 5 (HCDR1): RNAMF;

SEQ ID NO: 6 (HCDR2): GIGTGGATSYADSVKGR;

SEQ ID NO: 7 (HCDR3): GRYYFDY;

SEQ ID NO: 8 (VH):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNAMFWVRQAPGKGLEWVSGIGTGGATSYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRYYFDYWGQGTLVTVSS.

SEQ ID NO: 9 (CL):

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

SEQ ID NO: 10 (CH):

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG.

SEQ ID NO: 11 (L):

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDHSAGWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC.

SEQ ID NO: 12 (H):

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRNAMFWVRQAPGKGLEWVSGIGTGGATSYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGRYYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG.

Предпочтительно антитело присутствует в концентрации 100-200 мг/мл, более предпочтительно в концентрации 130-165 мг/мл и еще более предпочтительно в концентрации 150 ± 5 мг/мл.

В жидкой композиции буфер представляет собой один или более буферов, выбранных из группы, состоящей из ацетатного буфера, фосфатного буфера и аминокислотного буфера, и буфер присутствует в концентрации 5-50 ммоль/л; предпочтительно буфер представляет собой аминокислотный буфер в концентрации 5-50 ммоль/л.

Предпочтительно ацетатный буфер представляет собой натрий-ацетатный буфер, фосфатный буфер представляет собой натрий-дигидрофосфатный буфер или аминокислотный буфер представляет собой гистидин-гидрохлоридный буфер.

Предпочтительно буфер присутствует в концентрации 5-20 ммоль/л.

Предпочтительно буфер представляет собой гистидин-гидрохлоридный буфер в концентрации 5-20 ммоль/л, более предпочтительно гистидин-гидрохлоридный буфер в концентрации 10 ммоль/л.

В жидкой композиции защитное средство представляет собой одно или более защитных средств, выбранных из группы, состоящей из сахара, спирта, аминокислоты и хлоридной соли, и при этом защитное средство присутствует в концентрации 40-220 ммоль/л.

Предпочтительно защитное средство представляет собой одно или более защитных средств, выбранных из группы, состоящей из сахара, спирта и аминокислоты, и защитное средство присутствует в концентрации 40-220 ммоль/л, и/или защитное средство представляет собой хлоридную соль, и при этом защитное средство присутствует в концентрации 40-150 ммоль/л.

Предпочтительно сахар представляет собой трегалозу и/или сахарозу в концентрации 40-150 ммоль/л, более предпочтительно в концентрации 60-150 ммоль/л; спирт представляет собой маннит в концентрации 40-220 ммоль/л, более предпочтительно в концентрации 110-150 ммоль/л; аминокислота представляет собой одну или более аминокислот, выбранных из группы, состоящей из пролина, аргинина гидрохлорида и глицина, в концентрации 40-220 ммоль/л, более предпочтительно в концентрации 120-220 ммоль/л; или хлоридная соль представляет собой хлорид натрия в концентрации 40-150 ммоль/л, более предпочтительно в концентрации 80-120 ммоль/л.

Более предпочтительно защитное средство представляет собой комбинацию трегалозы и хлорида натрия; еще более предпочтительно защитное средство представляет собой комбинацию трегалозы в концентрации 40-150 ммоль/л и хлорида натрия в концентрации 40-150 ммоль/л; еще более предпочтительно защитное средство в жидкой композиции представляет собой комбинацию трегалозы в концентрации 60-150 ммоль/л и хлорида натрия в концентрации 80-120 ммоль/л, более предпочтительно комбинацию трегалозы в концентрации 60 ммоль/л и хлорида натрия в концентрации 100 ммоль/л.

В жидкой композиции поверхностно-активное вещество может представлять собой неионогенный полимер, например, один или более неионогенных полимеров, выбранных из группы, состоящей из Tween 80, Tween 20, полоксамера и полиэтиленгликоля, и поверхностно-активное вещество присутствует в концентрации 0,01-0,2%.

Предпочтительно поверхностно-активное вещество представляет собой Tween 80 в концентрации 0,01-0,03%, более предпочтительно Tween 80 в концентрации 0,02%.

Фармацевтическая композиция, предусмотренная в настоящем изобретении, представляет собой прозрачный стерильный раствор от бесцветного до бледно-желтого цвета с легкой опалесценцией. Как обнаружено, жидкая композиция, предусмотренная настоящим изобретением, характеризуется осмотическим давлением, составляющим 230-330 мОсмоль/кг, вязкостью, составляющей <30 сП, и pH, составляющим 6,2 ± 0,2.

В соответствии с конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения жидкая композиция представляет собой состав для инъекции, и предпочтительно для подкожной или внутривенной инъекции; и предпочтительно жидкая композиция представляет собой состав для подкожной или внутривенной инъекции.

Предпочтительно жидкая композиция содержит

130-165 мг/мл, предпочтительно 150±5 мг/мл антитела к альфа-рецептору интерлейкина-4 человека;

10 ммоль/л гистидина гидрохлорида;

60 ммоль/л трегалозы;

100 ммоль/л натрия хлорида;

0,02% Tween 80; и

жидкая композиция характеризуется pH, составляющим 6,2±0,2, предпочтительно 6,2 ± 0,05.

Состав, предусмотренный в настоящем изобретении, представляет собой прозрачный стерильный раствор от бесцветного до бледно-желтого цвета, который характеризуется благоприятной долгосрочной стабильностью (он может храниться в течение 2 лет при температуре 2-8°C и удовлетворять стандартам качества) и отсутствием агрегатов (≤ 10,0%). Состав по настоящему изобретению обладает низкой вязкостью (< 30 сП) и характеризуется pH и осмотическим давлением (290-310 мОсмоль/кг), требуемыми для подкожной инъекции. См. подробные сведения об этом в таблице 14 ниже.

Все упомянутые выше концентрации основаны на общем объеме или общей массе жидкой композиции или жидкого состава. В данном контексте термины «жидкий состав» и «жидкая композиция» могут использоваться взаимозаменяемо.

В соответствии с конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения жидкая композиция представляет собой состав для подкожной инъекции и дополнительно содержит стерильную воду для инъекций.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусмотрено применение жидкой композиции для получения лекарственного препарата для лечения воспаления или аллергического заболевания; предпочтительно воспаление или аллергическое заболевание включает аутоиммунное заболевание, такое как аллергический дерматит, астма, эозинофильный эзофагит, экзема, аллергический ринит, назальный полип, ревматоидный артрит и т.п.

В еще одном аспекте в настоящем изобретении также предусмотрены другие продукты, относящиеся к жидкой композиции.

В настоящем изобретении предусмотрен контейнер, содержащий жидкую композицию по настоящему изобретению. Например, контейнер может представлять собой флакон для инъекций объемом 2 мл, выполненный из трубки из нейтрального боросиликатного стекла, в которой объем наполнения жидкой композиции превышает 1 мл на флакон.

В настоящем изобретении предусмотрен набор, содержащий контейнер, предусмотренный в настоящем изобретении; и дополнительно содержащий инструкцию.

В еще одном аспекте в настоящем изобретении предусмотрен способ предотвращения, лечения или уменьшения интенсивности воспаления или аллергического заболевания, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, жидкой композиции по настоящему изобретению. Предпочтительно субъектом является млекопитающее, более предпочтительно человек.

Предпочтительно воспаление или аллергическое заболевание включает аутоиммунное заболевание, такое как аллергический дерматит, астма, эозинофильный эзофагит, экзема, аллергический ринит, назальный полип, ревматоидный артрит и т.п.

Жидкую композицию, предусмотренную в настоящем изобретении, можно вводить субъекту путем инъекции, например, путем подкожной инъекции или внутривенной инъекции.

Другие лекарственные препараты можно применять в комбинации с жидкой композицией для предотвращения, лечения или уменьшения интенсивности воспаления или аллергического заболевания. Например, способ дополнительно включает введение субъекту по меньшей мере одного лекарственного препарата, выбранного из группы, состоящей из противоастматического средства, такого как альбутерол и т.д., антигистаминного средства, такого как лоратадин и т.д., иммунодепрессивного средства, такого как такролимус и пимекролимус и т.д., блокатора М-рецепторов, такого как ипратропия бромид и т. д., блокатора лейкотриеновых рецепторов, такого как монтелукаст и т.д., ингибитора фосфодиэстеразы, такого как теофиллин и т.д., нестероидного противовоспалительного лекарственного средства, такого как 5-аминосалициловая кислота и т.д., и гормона, такого как беклометазон и будесонид, и т.д. Предпочтительно лекарственный препарат(лекарственные препараты) и жидкую композицию по настоящему изобретению вводят одновременно или последовательно.

Авторы настоящего изобретения успешно разработали новую жидкую композицию на основе антитела к альфа-рецептору интерлейкина-4 человека, которая обеспечивает основу для получения лекарственного препарата. Жидкая композиция, предусмотренная в настоящем изобретении, содержит высокую концентрацию антитела к альфа-рецептору интерлейкина-4 человека, и при ее подкожном или внутривенном введении можно удовлетворить потребности в лекарственных средствах и улучшить терапевтические эффекты за счет предоставления высокой дозы антитела. Между тем, даже при содержании антитела в высокой концентрации настоящая жидкая композиция не демонстрирует агрегации антитела и при этом обладает довольно низкой вязкостью, что позволяет легко доставлять композицию через тонкую иглу и игольную трубку и тем самым минимизировать дискомфорт пациентов. Жидкая композиция по настоящему изобретению также обладает преимуществами в виде простоты получения и хранения. В дополнение, жидкая композиция обладает достаточной физической и химической стабильностью, при которой содержание нерастворимых частиц находится в пределах диапазонов, предписанных Китайской фармакопеей (количество нерастворимых частиц с размером ≥ 10 мкм составляет ≤ 6000/флакон, и количество нерастворимых частиц с размером ≥ 25 мкм составляет ≤ 600/флакон). Жидкую композицию также можно многократно подвергать замораживанию и оттаиванию, она устойчива к встряхиванию, характеризуется хорошей термостабильностью и отвечает требованиям в отношении получения лекарственного препарата.

Жидкую композицию, предусмотренную в настоящем изобретении, оценивали в отношении способности к связыванию с альфа-рецептором интерлейкина-4 человека и биологической активности в отношении блокирования передачи сигнала STAT-6. Результаты показывают, что жидкая композиция, предусмотренная в данном изобретении, может стабильно и эффективно связываться с антигеном IL-4Rα и эффективно блокировать передачу сигнала STAT-6.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Варианты осуществления настоящего изобретения подробно описаны далее в данном документе в комбинации с прилагаемыми графическими материалами, на которых показано следующее.

На фигурах 1 и 2 показаны результаты определения с помощью SEC чистоты составов, исследованных во время скрининга pH.

На фигурах 3 и 4 показаны результаты определения с помощью nrCE-SDS чистоты составов, исследованных во время скрининга pH.

На фигурах 5 и 6 показаны результаты определения с помощью rCE-SDS чистоты составов, исследованных во время скрининга pH.

На фигурах 7 и 8 показаны результаты определения изменений нейтрального пика CEX для составов, исследованных во время скрининга pH, соответственно.

На фигурах 9 и 10 показаны результаты определения с помощью SEC чистоты составов, исследованных во время скрининга защитного средства, соответственно.

На фигурах 11 и 12 показаны результаты определения с помощью nrCE-SDS чистоты составов, исследованных во время скрининга защитного средства, соответственно.

На фигурах 13 и 14 показаны результаты определения с помощью rCE-SDS чистоты составов, исследованных во время скрининга защитного средства, соответственно.

На фигурах 15 и 16 показаны результаты определения изменений нейтрального пика CEX для составов, исследованных во время скрининга защитного средства, соответственно.

На фигуре 17 показаны результаты сравнения вязкости составов, исследованных во время скрининга защитного средства.

На фигуре 18 показаны результаты измерения вязкости составов при различных концентрациях, исследованных без защитного средства.

На фигуре 19 показаны результаты определения биологической активности CBP-201.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Настоящее изобретение будет дополнительно подробно описано в комбинации с конкретными вариантами осуществления. Специалистам в данной области техники будет понятно, что предусмотренные варианты осуществления используются только для иллюстрации настоящего изобретения, но не для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.

Если конкретно не указано иное, все способы проведения экспериментов в следующих примерах являются стандартными способами. Все исходные материалы и реагенты, используемые в следующих примерах, являются коммерчески доступными, если конкретно не указано иное.

Антитело, обозначенное как «CBP-201» в следующих примерах, представляет собой моноклональное антитело, содержащее вариабельную область легкой цепи, которая указана под SEQ ID NO: 4, и вариабельную область тяжелой цепи, которая указана под SEQ ID NO: 8; константную область легкой цепи, которая указана под SEQ ID NO: 9, и константную область тяжелой цепи, которая указана под SEQ ID NO: 10; или легкую цепь, которая указана под SEQ ID NO: 11, и тяжелую цепь, которая указана под SEQ ID NO: 12. В данном контексте термины «CBP-201» и «белок» могут использоваться взаимозаменяемо. Кроме того, термины «состав на основе CBP-201» и «жидкая композиция на основе CBP-201» также могут использоваться взаимозаменяемо.

Общие способы, используемые в следующих примерах, включают следующее.

(1) Определение значения pH.

Определение значения pH проводят на основании способа измерения pH, описанного в Общем правиле 0631, тома IV, Фармакопеи Китайской Народной Республики (издание 2015 г.).

(2) Испытание стабильности с ускоренной деградацией при 40°C.

Исследование стабильности проводят путем хранения испытываемого образца состава, осуществляемого при высокой температуре и высокой влажности (40°C±2°C/75±5% RH) в течение 2 недель или 4 недель для проверки стабильности состава.

(3) Определение концентрации белка.

Концентрацию белка определяют с помощью УФ-спектрофотометра с применением коэффициента экстинкции (ε). В соответствии с законом Ламберта-Бера значение поглощения для образца рассчитывают по формуле: A=ε ⋅ C ⋅ L/N, в которой «C» представляет собой концентрацию белка в образце, мг/мл; «L» представляет собой оптический путь, который составляет 1 см; «A» представляет собой значение поглощения; «ε» представляет собой коэффициент экстинкции; и «N» представляет собой коэффициент разбавления образца. В связи с этим концентрацию белка в образце рассчитывают по формуле: C=A/ε×N.

Теоретический коэффициент экстинкции белка (антитела) можно рассчитать по следующей формуле: массовый коэффициент экстинкции ε = (5500nw + 1490ny + 125nc) ⋅M^-1⋅см^-1, в которой «nw» представляет собой количество Trp в аминокислотной последовательности белка; «ny» представляет собой количество Tyr в аминокислотной последовательности белка; «nc» представляет собой количество Cys в аминокислотной последовательности белка; «M» представляет собой молекулярную массу белка, и «см» представляет собой оптическое расстояние.

В соответствии с последовательностями антитела CBP-201 рассчитанный массовый коэффициент экстинкции ε составляет 1,46. Значение поглощения A образца при 280 нм измеряют с помощью УФ-спектрофотометра, и соответственно рассчитывают концентрацию антитела.

(4) Определение чистоты с помощью SEC.

Применяют эксклюзионную хроматографию по размеру (SEC-HPLC) со следующими условиями хроматографирования.

Колонка: колонка TSKgel G3000SW_XL 7,8*300 мм;

Температура колонки: комнатная температура;

Детектор: детектор DAD;

Длина волны детектирования: 280 нм;

Скорость потока: 0,7 мл/мин;

Разбавление образца: разбавлен ультрачистой водой до 5,0 мг/мл;

Объем вводимого образца: 10 мкл;

Подвижная фаза: 25 мМ фосфата (pH 6,8 ± 0,1) и 0,3 М хлорида натрия;

Режим элюирования: градиентное элюирование

Определение: способ нормализации площадей пиков используют для расчета процентной доли площади пика основного пика и пиков HMW и LMW компонентов.

(5) Определение чистоты с помощью nrCE-SDS.

Чистоту CBP-201 количественно определяют на основе молекулярных масс в невосстанавливающих условиях.

Определение: в соответствии со способом нормализации площадей чистоту основного пика рассчитывают как процентную долю скорректированной площади пика основного пика IgG от суммы всех скорректированных площадей пиков.

(6) Определение чистоты с помощью rCE-SDS.

Чистоту CBP-201 количественно определяют на основе молекулярных масс в восстанавливающих условиях.

Определение: в соответствии со способом нормализации площадей чистоту каждого из LC, NGHC и HC (т. е. CAP) рассчитывают соответственно как процентную долю скорректированной площади пика каждого из LC, NGHC и HC от суммы всех скорректированных площадей пиков. Чистота образца представляет собой сумму чистоты LC и чистоты HC.

(7) Определение гетерогенности заряда (нейтральный пик CEX).

Определение проводят на основании ионной хроматографии, описанной в Общем правиле 0514, тома III, Фармакопеи Китайской Народной Республики (издание 2015 г.). Применяемая колонка представляет собой колонку BiomAb NP5, PK, 4,6×250 мм, которую можно приобрести у Agilent; результаты интегрирования хроматографических пиков оценивают относительно эталона, и наиболее высокий пик является основным пиком, пики, интегрированные раньше, чем время удерживания основного пика, определяются как кислотные пики, а пики, интегрированные позже, чем время удерживания основного пика, определяются как щелочные пики.

(8) Определение с помощью DSC.

Термический анализ с помощью DSC, также называемого дифференциальным сканирующим калориметром, представляет собой методику регистрации эндотермического или экзотермического показателя образца с помощью дифференциального сканирующего калориметра и с использованием значений теплового потока dH/dt (в миллиджоулях/секунду) в качестве ординаты и температуры T или времени t в качестве абсциссы с целью измерения температуры фазового перехода образца, и далее можно оценивать стабильность образца.

(9) Определение вязкости.

Определение проводят с использованием вискозиметра DV2T, который можно приобрести у Brook Field и на основании способа определения вязкости - третьего способа (ротационного способа измерения вязкости), описанного в Общем правиле 0633, тома IV, Фармакопеи Китайской Народной Республики (издание 2015 г.).

(10) Определение видимых посторонних включений.

Определение проводят на основании способа исследования видимых посторонних включений - первого способа (лампового испытания), описанного в Общем правиле 0904, тома IV, Фармакопеи Китайской Народной Республики (издание 2015 г.).

(11) Определение размера частиц.

Определение проводят на основании способа контроля нерастворимых частиц - первого способа (оптического затенения), описанного в Общем правиле 0903, тома IV, Фармакопеи Китайской Народной Республики (издание 2015 г.).

Пример 1. PH и буфер

В данном примере шесть значений pH, т.е. 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2 и 6,4, и буфер, выбранный из ацетата натрия, гидрохлорида гистидина и дигидрофосфата натрия, использовали для изучения диапазонов pH и буферов для состава на основе CBP-201. В каждый образец дополнительно добавляли хлорид натрия. В частности, в испытании с ускоренной деградацией при 40°C исследовали следующие белковые растворы, содержащие 133,6 мг/мл CBP-201, для определения требуемого диапазона pH и буфера (см. таблицу 1).

Таблица 1. Растворы для скрининга pH и буфера

В ходе испытания стабильности с ускоренной деградацией при 40°C белковые растворы исследовали в отношении внешнего вида, концентрации белка, чистоты согласно SEC, чистоты согласно CE-SDS, гетерогенности заряда, исследовали с помощью DSC и в отношении вязкости.

Результаты проверки внешнего вида. Все белковые растворы являлись беловатыми по виду, и никаких видимых посторонних включений не наблюдали.

Результаты определения концентрации белка. Все концентрации белка в белковых растворах находились в диапазоне 133,6±5% мг/мл, и явного увеличения или уменьшения концентрации не наблюдали.

Кроме того, после ускоренной деградации при 40°C в течение 2 недель получали следующие результаты для белковых растворов при различных значениях pH.

1. Результаты определения чистоты согласно SEC показаны на фигурах 1-2. Через 2 недели ускоренной деградации абсолютные значения чистоты согласно SEC испытываемых растворов расположили следующим образом: раствор с pH 6,2 > раствор с pH 6,4 > раствор с pH 6,0 > раствор с pH 5,8 > раствор с pH 5,6 > раствор с pH 5,4 (фигура 1). Кроме того, степени снижения чистоты согласно SEC испытываемых растворов (по сравнению с чистотой в 0 ч. соответственно) расположили следующим образом: раствор с pH 5,4 > раствор с pH 5,6 > раствор с pH 5,8 > раствор с pH 6,0 > раствор с pH 6,2 > раствор с pH 6,4 (фигура 2).

2. Результаты nrCE-SDS показаны на фигурах 3-4. Через 2 недели ускоренной деградации абсолютные значения чистоты согласно nrCE-SDS испытываемых растворов расположили следующим образом: раствор с pH 6,4 > раствор с pH 6,2> раствор с pH 5,8 > раствор с pH 6,0 > раствор с pH 5,6 > раствор с pH 5,4 (фигура 3). Кроме того, степени снижения чистоты согласно nrCE-SDS испытываемых растворов (по сравнению с чистотой в 0 ч. соответственно) расположили следующим образом: раствор с pH 5,4 > раствор с pH 5,6 > раствор с pH 6,0 > раствор с pH 5,8 > раствор с pH 6,2 > раствор с pH 6,4 (фигура 4). Дополнительно, чистота согласно nrCE-SDS раствора с pH 6,0 составляла 97,5% через 2 недели хранения с ускоренной деградацией, что является довольно высокой чистотой. Чистота согласно nrCE-SDS растворов с pH 6,2 и 6,4 являлась более высокой, чем с pH 6,0.

3. Результаты rCE-SDS показаны на фигурах 5-6. Через 2 недели ускоренной деградации абсолютные значения чистоты согласно rCE-SDS испытываемых растворов расположили следующим образом: раствор с pH 6,4 > раствор с pH 6,2 > раствор с pH 6,0 > раствор с pH 5,8 > раствор с pH 5,6 = раствор с pH 5,4 (фигура 5). Кроме того, степени снижения чистоты согласно rCE-SDS испытываемых растворов расположили следующим образом: раствор с pH 5,4 = раствор с pH 5,6 > раствор с pH 5,8 > раствор с pH 6,0 > раствор с pH 6,2 > раствор с pH 6,4 (фигура 6).

4. Результаты определения изменений нейтрального пика CEX показаны на фигурах 7-8. Через 2 недели ускоренной деградации доли нейтрального пика CEX испытываемых растворов расположили следующим образом: раствор с pH 6,4 > раствор с pH 6,2 > раствор с pH 5,6 > раствор с pH 6,0 > раствор с pH 5,8 > раствор с pH 5,4 (фигура 7). Кроме того, степени изменения (уменьшения) доли нейтрального пика CEX в испытываемых растворах (по сравнению с таковой в 0 ч. соответственно) через 2 недели хранения с ускоренной деградацией расположили следующим образом: раствор с pH 5,8 > раствор с pH 5,6 > раствор с pH 5,4 > раствор с pH 6,0 > раствор с pH 6,2 > раствор с pH 6,4 (фигура 8).

5. Результаты анализа с помощью DSC.

Все белки в 6 растворах с разными значениями pH и буферами, как показано в таблице 1, являлись стабильными и характеризовались отсутствием значительной разницы между ними.

6. Результаты определения вязкости.

Сравнение вязкости испытываемых белковых растворов с разными буферами показало, что существует небольшая разница в вязкости между растворами, содержащими буферную систему His-HCl, и раствором, содержащим фосфатную буферную систему, и вязкость всех данных растворов являлась более низкой, чем вязкость раствора, содержащего ацетатную буферную систему. Для растворов, содержащих буферную систему His-HCl, их вязкость находилась в диапазоне 8,7 ± 0,8 сП, что было ниже ожидаемых 20 сП, и раствор, характеризующийся более высоким pH, показал более низкую вязкость.

На основании результатов, полученных при определении с помощью SEC, nrCE-SDS, rCE-SDS, CEX, DSC и определении вязкости, как указано выше, можно сделать вывод, что более высокий pH оказывает лучший стабилизирующий эффект на белок, и в соответствии с их стабилизирующими эффектами значения pH можно расположить следующим образом: pH 6,4 > pH 6,2 > pH 6,0. То есть белок можно значительно стабилизировать в кислотно-основных условиях pH 6,2 ± 0,2.

Пример 2. Защитные средства

В данном примере изучали защитные средства, подходящие для состава на основе CBP-201. Получали белковые растворы с pH 6,0 и добавлением трегалозы, сахарозы, маннита, пролина, гидрохлорида аргинина, глицина или хлорида натрия, при этом раствор с добавлением хлорида натрия использовали в качестве контроля. В частности, в испытании стабильности с ускоренной деградацией при 40°C исследовали следующие белковые растворы, содержащие 133,6 мг/мл CBP-201, для определения пригодного защитного средства (см. таблицу 2).

Таблица 2. Защитные средства

В ходе испытания стабильности с ускоренной деградацией при 40°C белковые растворы исследовали на внешний вид, концентрацию белка, чистоту согласно SEC, чистоту согласно CE-SDS, гетерогенность заряда, вязкость и исследовали с помощью DSC.

Результаты проверки внешнего вида: все белковые растворы являлись беловатыми по виду.

Результаты определения концентрации белка: все концентрации белка в белковых растворах находились в диапазоне 133,6±5% мг/мл.

В дополнение, после ускоренной деградации при 40°C в течение 2 недель получали следующие результаты для белковых растворов с различными защитными средствами.

1. Результаты определения чистоты согласно SEC показаны на фигурах 9-10. Через 2 недели ускоренной деградации абсолютные значения чистоты согласно SEC испытываемых растворов расположили следующим образом: раствор с Pro > раствор с Gly > раствор с Tre > раствор с Suc > раствор с Man > раствор с Arg > раствор с NaCl, при этом белковый раствор с NaCl в качестве защитного средства характеризовался наименьшей чистотой согласно SEC, составляющей 95,3%, что, однако, являлось приемлемым (фигура 9). Кроме того, степени снижения чистоты согласно SEC испытываемых растворов (по сравнению с чистотой в 0 ч. соответственно) расположили следующим образом: раствор с Arg > раствор с NaCl > раствор с Suc > раствор с Tre > раствор с Gly > раствор с Pro > раствор с Man. Даже при том, что раствор белка с Arg в качестве защитного средства характеризовался наибольшей степенью снижения чистоты согласно SEC, т.е. 3,04%, он все еще характеризовался приемлемой чистотой согласно SEC, составляющей 95,4% через 2 недели хранения с ускоренной деградацией (фигура 10).

2. Результаты nrCE-SDS показаны на фигурах 11-12. Через 2 недели ускоренной деградации значения чистоты согласно nrCE-SDS испытываемых растворов расположили следующим образом: раствор с Tre > раствор с NaCl > раствор с Suc > раствор с Gly > раствор с Man > раствор с Pro > раствор с Arg (фигура 11). Кроме того, степени снижения чистоты согласно nrCE-SDS испытываемых растворов (по сравнению с чистотой в 0 ч. соответственно) расположили следующим образом: раствор с Arg > раствор с Pro > раствор с Man > раствор с Gly > раствор с Suc > раствор с NaCl > раствор с Tre (фигура 12). Можно видеть, что значения чистоты согласно nrCE-SDS, которые демонстрировали небольшую степень снижения по сравнению с чистотой в 0 ч. соответственно, и сохранялись на относительно высоком уровне после 2 недель ускоренной деградации при 40°C, расположили следующим образом: раствор с Tre > раствор с NaCl > раствор с Suc > раствор с Gly > раствор с Man > раствор с Pro > раствор с Arg.

3. Результаты rCE-SDS показаны на фигурах 13-14. Через 2 недели ускоренной деградации абсолютные значения чистоты согласно rCE-SDS испытываемых растворов расположили следующим образом: раствор с Suc > раствор с Man = раствор с Tre > раствор с Pro > раствор с NaCl > раствор с Gly > раствор с Arg (фигура 13). Кроме того, по сравнению с чистотой в 0 ч. соответственно, степени снижения чистоты согласно rCE-SDS испытываемых растворов расположили следующим образом: раствор с Arg > раствор с Gly > раствор с NaCl > раствор с Pro > раствор с Tre = раствор с Man > раствор с Suc (фигура 14). Можно видеть, что значения чистоты согласно rCE-SDS, которые демонстрировали небольшую степень снижения по сравнению с чистотой в 0 ч. соответственно, и сохранялись на относительно высоком уровне через 2 недели ускоренной деградации при 40°C, расположили следующим образом: раствор с Suc > раствор с Man = раствор с Tre > раствор с Pro > раствор с NaCl > раствор с Gly > раствор с Arg.

4. Результаты определения изменений нейтрального пика CEX показаны на фигурах 15-16. Через 2 недели ускоренной деградации доли нейтрального пика CEX испытываемых растворов расположили следующим образом: раствор с Tre > раствор с Pro > раствор с Suc > раствор с Man > раствор с Arg > раствор с NaCl > раствор с Gly (фигура 15). Кроме того, степени изменения (уменьшения) доли нейтрального пика CEX в испытываемых растворах (по сравнению с 0 ч. соответственно) через 2 недели хранения с ускоренной деградацией расположили следующим образом: раствор с Gly > раствор с Man > раствор с Arg > раствор с NaCl > раствор с Pro > раствор с Suc (увеличение) > Tre (увеличение) (фигура 16). Исходя из результатов можно сделать вывод, что Tre занимает первое место в отношении сохранения стабильности зарядов, Suc следует вторым, за ним последовательно располагаются Pro, Man, Arg, NaCl, Gly.

5. Результаты определения вязкости показаны на фигуре 17. После добавления различных защитных средств значения вязкости белковых растворов расположили следующим образом: раствор с Suc > раствор с Pro > раствор с Tre > раствор с Man > раствор с Gly > раствор с NaCl > раствор с Arg.

6. Результаты анализа с помощью DSC: для растворов, содержащих 7 защитных агентов соответственно, все значения Tm1 и Tm2 являлись приемлемыми, а белки в них являлись структурно стабильными, и между ними отсутствовала значительная разница.

Пример 3. Оценка вязкости белковых растворов, содержащих только буфер

Данный пример осуществляли для изучения изменения вязкости при изменении концентрации составов на основе CBP-201, содержащих только буфер (10 ммоль/л His-HCl, pH 6,0) (без добавления защитного средства), для оценки влияния защитного средства на снижение вязкости составов. Получали состав с максимальной концентрацией и измерили вязкость для обеспечения основы для выбора концентрации белка в составе. В данном примере составы получали без NaCl и сравнивали с составом, содержащим NaCl, из приведенного выше примера.

Белок диализовали в буфере для диализа (10 ммоль/л His-HCl, pH 6,0) и диализованный белок концентрировали до достижения концентраций 71,23 мг/мл, 89,04 мг/мл, 106,85 мг/мл, 133,56 мг/мл и >151,37 мг/мл соответственно (определенная концентрация белка), а затем составы фильтровали. Определяли внешний вид и вязкость. Полученные результаты показаны в таблице 3 и на фигуре 18.

Таблица 3. Результаты определения внешнего вида и вязкости составов на основе CBP-201

Результаты показали, что вязкость белкового раствора увеличивается с увеличением концентрации белка. Вязкость белкового раствора, характеризующегося целевой концентрацией 133,6 мг/мл (фактическая концентрация составляла 137,94 мг/мл), составляла 50,33 сП, и только белковый раствор, содержащий Suc, при скрининге пригодного защитного средства в примере 2 обладал вязкостью (68,75 сП), превышающей данное значение. Другими словами, среди семи альтернативных защитных средств только Suc увеличивал вязкость белкового раствора, а другие защитные средства снижали вязкость белкового раствора до различных уровней. Следовательно, защитные средства, выбранные преимущественно на основании влияния на снижение вязкости состава, можно расположить следующим образом: Arg, NaCl, Gly, Man, Tre и Pro.

Пример 4. Комбинация компонентов в составе

На основании результатов, полученных при скрининговых испытаниях, проводили исследование комбинации компонентов в составе на основе CBP-201. Исследуемые композиции белковых растворов показаны в таблице 4.

Таблица 4. Комбинации компонентов

Белковые растворы содержали CBP-201 в концентрации 133,6 мг/мл и их исследовали в ходе испытания стабильности с ускоренной деградацией при 4°C и 40°C. В ходе испытания стабильности с ускоренной деградацией при 4°C и 40°C в растворах определяли видимые посторонние включения, размер частиц (MFI/FLOWCAM), концентрацию белка, чистоту согласно SEC, анализировали с помощью DSC, определяли осмотическое давление, вязкость, анализировали с помощью CE-SDS и CEX, и полученные результаты представляли в таблицах 5-11.

Таблица 5. Результаты проверки внешнего вида

Таблица 6. Результаты определения концентрации белка

Результаты определения внешнего вида и концентрации белка показали, что после хранения при 4°C в течение 2 недель и 40°C в течение 4 недель не наблюдали значительного снижения концентрации белка в белковых растворах, содержащих комбинации компонентов с номерами от 1 до 9, и все белковые растворы являлись беловатыми по внешнему виду, что связано с высокими концентрациями белка в растворах и свойством белка per se. В этом отношении все комбинации компонентов с номерами от 1 до 9 являлись приемлемыми на основании результатов определения внешнего вида и концентраций белка.

Таблица 7. Чистота согласно SEC

Данные, представленные в таблице 7, показывают, что белковый раствор, содержащий комбинацию компонентов под номером 2, характеризовался самой низкой, но приемлемой чистотой согласно SEC, составляющей 96,8% после хранения при 4°C в течение 2 недель. Кроме того, по сравнению с чистотой согласно SEC в 0 ч., наибольшую степень снижения чистоты согласно SEC наблюдали для белкового раствора, содержащего комбинацию компонентов под номером 4, и степень снижения составляла 1,44%, но сниженная чистота согласно SEC (97,1%). все же являлась приемлемой. В этом отношении все растворы, содержащие комбинации компонентов, с номерами от 1 до 9, характеризовались приемлемой чистотой согласно SEC после хранения в течение двух недель при 4°C.

После хранения при 40°C в течение 4 недель белковые растворы, содержащие комбинации компонентов под номерами 5 и 8, показали значительное снижение чистоты согласно SEC (по сравнению с чистотой в 0 ч. соответственно) и, таким образом, характеризовались низкой чистотой согласно SEC, которая являлась неприемлемой. Значения чистоты согласно SEC белковых растворов, содержащих другие различные комбинации компонентов, после хранения при 40°C в течение 4 недель, для значений SEC-чистоты которых можно установить последовательность, расположили следующим образом: белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 6, > белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 9, > белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 1, > белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 3, > белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 4, > белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 2, > белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 7. В отношении степени снижения чистоты согласно SEC белковый раствор, содержащий комбинацию компонентов под номером 6, показал сравнительно меньшую степень снижения, в то время как все белковые растворы, содержащие другие комбинации компонентов, показали сходные степени снижения (сохраняющиеся на уровне приблизительно 1,5%), которые все же являлись приемлемыми.

Таблица 8. Чистота согласно CE-SDS

Данные в таблице 8 показывают, что среди белковых растворов, содержащих 9 комбинаций компонентов соответственно, которые хранились при 4°C в течение 2 недель, самое низкое значение чистоты согласно nrCE-SDS составляло 99,7%. Другими словами, все белковые растворы, содержащие 9 комбинаций компонентов, сохраняли белок в них стабильным при 4°C в течение 2 недель. В дополнение, значения HC+LC (rCE-SDS) после хранения при 4°C в течение 2 недель несущественно изменились по сравнению со значениями в 0 ч. соответственно, а именно, все белковые растворы, содержащие комбинации компонентов с номерами от 1 до 9, являлись относительно стабильными при 4°C.

После хранения при 40°C в течение 4 недель белковые растворы, содержащие комбинации компонентов под номерами 7 и 8, показали значительное снижение чистоты согласно nrCE-SDS (по сравнению с чистотой в 0 ч. соответственно) и, таким образом, характеризовались низкой чистотой согласно nrCE-SDS, которая являлась неприемлемой. Дополнительно, за исключением белкового раствора, содержащего комбинацию компонентов под номером 1, который характеризовался чистотой согласно nrCE-SDS, составляющей 92,4%, все другие белковые растворы характеризовались чистотой согласно nrCE-SDS, составляющей более 94,0%, и демонстрировали степень снижения (по сравнению с чистотой в 0 ч. соответственно) приблизительно 5%, что являлось приемлемым.

Между тем, после хранения при 40°C в течение 4 недель значения чистоты согласно rCE-SDS белковых растворов, содержащих различные комбинации компонентов, расположили следующим образом: белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 9, > белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 3, > белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 2, = белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 4, > белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 1, > белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 6, = белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 5, > белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 7, = белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 8. Можно видеть, что белковые растворы, содержащие комбинации компонентов под номерами 7 и 8, продемонстрировали самую низкую чистоту, т.е. 96,6%, и каждый из них показал степень снижения, составляющую приблизительно 3% (по сравнению с чистотой в 0 ч. соответственно), при этом она являлась большей, чем у белковых растворов, содержащих другие комбинации компонентов. Чистота согласно rCE-SDS всех белковых растворов, содержащих комбинации компонентов с номерами от 1 до 9, после хранения при 40°C в течение 4 недель являлась приемлемой.

Таблица 9. Гетерогенность заряда

Данные, представленные в таблице 9, показывают, что белковые растворы, содержащие комбинации компонентов с номерами от 1 до 9, демонстрировали разную степень уменьшения и увеличения доли нейтрального пика CEX (по сравнению с пиком в 0 ч. соответственно) после хранения при 4°C в течение 2 недель. Среди белковых растворов, которые показали снижение, комбинация компонентов под номером 1 продемонстрировала наибольшее снижение на 1%, и уменьшенная доля нейтрального пика CEX все же составляла 89,0%, что являлось приемлемым. С другой стороны, даже белковый раствор, содержащий комбинацию компонентов под номером 5, продемонстрировал самую низкую долю нейтрального пика CEX, составляющую 88,5%, после хранения при 4°C в течение 2 недель, при этом доля нейтрального пика CEX была увеличена по сравнению с таковой в 0 ч., и все же являлась приемлемой.

Доли нейтрального пика CEX во всех 9 белковых растворах, содержащих комбинации компонентов, значительно уменьшились после хранения при 40°C в течение 4 недель, и уменьшенные доли являлись в основном одинаковыми, и большинство из них сохранялось в диапазоне 70% ± 2%, при этом их расположили следующим образом: белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 2, > белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 3, = белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 6, > белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 1, = белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 5, > белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 8, > белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 4, > белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 9. Наибольшую степень уменьшения наблюдали для белкового раствора, содержащего комбинацию компонентов под номером 9, и при сравнении долей нейтрального пика CEX после хранения процентный показатель степени уменьшения для белкового раствора, содержащего комбинацию компонентов под номером 9, составлял 39,7%, а соответствующие процентные показатели для белковых растворов, содержащих другие комбинации компонентов, сохранялись в диапазоне 30%±5%.

Таблица 10. DSC

Данные, представленные в таблице 10 показывают, что, за исключением белкового раствора, содержащего комбинацию компонентов под номером 7, который характеризовался только одним полученным значением Tm (не обладающим существенным отличием по сравнению с другими 8 белковыми растворами), для других белковых растворов все значения Tm1 и Tm2 являлись приемлемыми, и между ними отсутствовала значительная разница.

Таблица 11. Вязкость и осмотическое давление (0 ч.)

Данные, представленные в таблице 11, показывают различную степень снижения вязкости всех белковых растворов, содержащих комбинации компонентов с номерами от 1 до 9, при этом значения вязкости растворов расположили следующим образом: белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 1, < белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 2, < белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 8, < белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 6, < белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 5, < белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 7, < белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 4, < белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 9, < белковый раствор, содержащий комбинацию под номером 3. Дополнительно, сравнение белковых растворов, содержащих комбинации компонентов под номерами 3, 4 и 5, показало, что Tween 80 может снижать вязкость белковых растворов, но степень снижения не является линейно пропорциональной концентрации Tween 80. Например, белковый раствор, содержащий 0,2% Tween 80, продемонстрировал вязкость, приблизительно на 0,94 сП (6,2%) более низкую, чем вязкость белкового раствора, содержащего 0,02% Tween 80. Сравнение белковых растворов, содержащих комбинации компонентов под номерами 4, 7 и 9 показало, что белковые растворы, содержащие комбинации компонентов под номерами 4 и 7, обладали сходной вязкостью, а белковый раствор, содержащий комбинацию компонентов под номером 9, обладал вязкостью на 2,27 сП (на 13,0%) более высокой, чем вязкость белкового раствора, содержащего комбинацию компонентов под номером 7, и на 2,20 сП (12,6%) более высокой, чем вязкость белкового раствора, содержащего комбинацию компонентов под номером 4, что указывает на то, что при значении pH 6,0 и pH 6,2 вязкость белкового раствора снижалась лучше, чем при значении pH 6,4, и значение pH 6,2 являлось целесообразным. Сравнение белковых растворов, содержащих комбинации компонентов под номерами 1, 2 и 4 показало, что белковый раствор, содержащий комбинацию компонентов под номером 4, обладал вязкостью на 29,7% более высокой, чем вязкость белкового раствора, содержащего комбинацию компонентов под номером 2, и вязкостью на 48,8% более высокой, чем вязкость белкового раствора, содержащего комбинацию компонентов под номером 1, что указывает на то, что NaCl лучше влиял на снижение вязкости белкового раствора, чем Tre. Кроме того, стабилизация белка в белковом растворе, который содержал только NaCl в качестве защитного средства, являлась затруднительной, и, следовательно, требуется комбинация NaCl и Tre в соответствующем соотношении.

Пример 5. Влияние трегалозы на вязкость состава

Испытание состава на вязкость (1).

Получали белковый раствор, содержащий антитело CBP-201 в концентрации 102,8 мг/мл, буфер His-HCl в концентрации 10 ммоль/л (pH 6,2) и NaCl в концентрации 40 ммоль/л, и без трегалозы, а затем концентрировали его с помощью ультрацентрифужного фильтра до концентраций белка 133,6 мг/мл, 151,4 мг/мл и > 151,4 мг/мл соответственно. Проверили вязкость сконцентрированных белковых растворов , а затем сравнили с вязкостью белкового раствора, содержащего Tre. Результаты показаны в таблице 12.

Таблица 12. Результаты определения вязкости

Данные, представленные в таблице 12, показывают, что вязкость увеличивается с увеличением концентрации белка, и следует заранее обращать внимание на степень переконцентрации, если белковый раствор является переконцентрированным. Сравнение белкового раствора с концентрацией 137,23 мг/мл, который обладал вязкостью 19,71 сП (24,5°C), с белковым раствором, содержащим комбинацию компонентов под номером 3 из примера 4 (который в отличие от белкового раствора в данном примере дополнительно содержал Tre и обладал вязкостью 25,64 сП (25,1°C)), указывает на то, что Tre может увеличивать вязкость белкового раствора, содержащего указанную композицию.

Испытание состава на вязкость (2).

Получали белковый раствор, содержащий антитело CBP-201, а затем его подвергли диализу в буфере для диализа (10 ммоль/л His-HCl, pH 6,2, 40 ммоль/л NaCl) с добавлением 150 ммоль/л трегалозы (1×) посредством тангенциального потока и концентрировали. Определяли чистоту согласно SEC и вязкость, а результаты представили в таблице 13.

Таблица 13. Результаты определения вязкости

Результаты определения чистоты согласно SEC показали, что чистота согласно SEC существенно не снизилась во время диализа и концентрирования, что указывает на то, что способ и ход диализа и концентрирования не влияли на чистоту белка согласно SEC.

Результаты определения вязкости показали, что вязкость белкового раствора с концентрацией белка 133,37 мг/мл составляла 23,18 сП (25,0°C), что в основном соответствовало результатам, полученным для белкового раствора, содержащего комбинацию компонентов под номером 3 из примера 4 (который обладал вязкостью 25,64 сП (25,1°C)), что указывает на воспроизводимость настоящего технического решения по данному изобретению. Вязкость, составляющую 45,22 сП (24,9°C), наблюдали для белкового раствора с концентрацией белка 155,15 мг/мл, что на 49,0% превышает вязкость, наблюдаемую для белкового раствора с концентрацией белка 156,85 мг/мл в испытании на вязкость (1) (23,07 сП (24,9°C)). Очевидно, что добавление Tre увеличивало вязкость белкового раствора, и его следует добавлять надлежащим образом с целью обеспечения стабильности белка.

Пример 6. Получение состава на основе антитела CBP-201

Очистка путем фильтрации

Сначала удалили дебрис клеточной культуры в ходе этапа очистки путем фильтрации. В ходе очистки путем фильтрации фильтр Pod MD0HC и фильтр Pod MA1HC от Millipore Corporation применяли в комбинации. Фильтры установили и прикрепляли к держателям Pod фильтров, а затем промывали водой для инъекций и PBS соответственно. После завершения промывания жидкость на входе переключали на культуру клеток, и давление на входе устанавливали на 0-20 фунтов/кв. дюйм. Pod фильтры промывали с помощью PBS после завершения подачи и собирали всю прокачанную жидкость.

Аффинная хроматография

Хроматографическую колонку заполняли смолой MabSelect SuRe LX до достижения высоты колонки, составляющей 18-22 см, при этом обеспечивали коэффициент симметрии 0,8-1,0 и число теоретических тарелок ≥ 2000 N/м. Колонку уравновешивали с помощью 4-6 объемов колонки уравновешивающего буфера (0,025 моль/л Tris, 0,10 моль/л NaCl, pH 7,40 ± 0,20) для аффинной хроматографии, и в нее загрузили жидкость, собранную во время очистки фильтрацией. Колонку дополнительно уравновешивали с помощью 3-4 объемов колонки уравновешивающего буфера для аффинной хроматографии после загрузки. Затем колонку промывали с помощью 2-3 объемов колонки промывочного раствора 1 (0,025 моль/л Tris, 1,00 моль/л NaCl, pH7,40 ± 0,20) и промывочного раствора 2 (0,05 моль/л NaAc, pH 5,50 ± 0,10) соответственно. После завершения промывания белок элюировали с помощью элюента (0,10 моль/л NaAc-HAc, pH 3,60 ± 0,10) для аффинной хроматографии. Сбор белка начинали, когда значение УФ-поглощения повышалось до 0,1000-0,1500 единиц оптической плотности/5 мм, и прекращали, когда значение УФ-поглощения падало до 0,2000-0,3000 единицы оптической плотности/5 мм.

Инактивация вирусов при низком pH

Получали кислотный титрант (1,00 моль/л уксусной кислоты) и использовали его для доведения pH белкового раствора, элюированного посредством аффинной хроматографии, до 3,50-3,70, и полученный белковый раствор помещали при 20-25°C на 2-3 часа для инактивации вируса при низком pH. После этого pH белкового раствора доводили до 5,40-5,60 с помощью основного титранта (2,00 моль/л Tris) и определяли проводимость белкового раствора. Путем использования стерилизующего фильтра белковый раствор фильтровали в одноразовый контейнер для жидкости, а затем отбирали пробы для определения концентрации белка, pH, проводимости, бактериального эндотоксина, для SEC-HPLC, CEX-HPLC, CE-SDS и испытания в отношении микробиологической чистоты.

Катионообменная хроматография

Для катионообменной хроматографии использовали смолу Capto S ImpAct, высоту колонки, составляющую 18-22 см, коэффициент симметрии 0,8-1,8 и количество теоретических тарелок ≥ 2000 N/м. Колонку уравновешивал с помощью 4-6 объемов колонки уравновешивающего буфера (0,05 моль/л NaAc, 0,05 моль/л NaCl, pH 5,50 ± 0,05) для катионообменной хроматографии с последующей загрузкой в нее белкового раствора. Колонку дополнительно уравновешивал с помощью 2-4 объемов колонки уравновешивающего буфера для катионообменной хроматографии после загрузки. Затем колонку промывали с помощью 5-7 объемов колонки промывочного раствора (0,05 моль/л NaAc, 0,08 моль/л NaCl, pH 5,50 ± 0,05) для катионообменной хроматографии. После завершения промывания белок элюировали с помощью элюента (0,05 моль/л NaAc, 0,22 моль/л NaCl, pH 5,50 ± 0,05) для катионообменной хроматографии. Сбор белка начинали, когда значение УФ-поглощения повышалось до 0,2000-0,3000 единиц оптической плотности/5 мм, и прекращали, когда значение УФ-поглощения падало до 1,0000-1,5000 единицы оптической плотности/5 мм.

Анионообменная хроматография

Для анионообменной хроматографии использовали смолу POROS 50 HQ, высоту колонки, составляющую 18-22 см, коэффициент симметрии 0,8-1,8 и количество теоретических тарелок ≥ 2000 N/м. Перед загрузкой в колонку белкового раствора его pH доводили до 7,35-7,45, а затем определяли проводимость белкового раствора. Затем с помощью стерилизующего фильтра (допустимая нагрузка ≤ 3000 г/м²) белковый раствор фильтровали в одноразовый контейнер для жидкости.

Нанофильтрация

Собирали систему нанофильтрации и промывали мембрану предварительной фильтрации уравновешивающим буфером для анионообменной хроматографии. После завершения промывания мембраны стерилизующий фильтр соединяли с системой нанофильтрации и проводили нанофильтрацию белка под давлением, составляющим 28-32 фунта/кв.дюйм, в течение не более 4 ч.

Концентрирование путем диализа

Использовали кассету Sartocon 30 кДа. Сначала кассету объединяли с системой ультрафильтрации, и проверяли целостность и поток воды. При условии прохождения проверки мембрану в кассете затем промывали буфером для диализа (0,060 моль/л трегалозы, 0,010 моль/л гистидин-HCl, 0,10моль/л NaCl, pH 6,20 ± 0,05). После повышения отфильтрованный через наномембрану, полученный, как описано выше, белковый раствор перемешивали для тщательного смешивания, а затем загружали на мембрану и предварительно концентрировали до 40-60 мг/мл. После предварительного концентрирования диализ проводили с использованием буфера для диализа в объеме, в 10-12 раз превышающем объем предварительно концентрированного белкового раствора. Затем белковый раствор переконцентрировали с получением концентрации белка 170-190 мг/мл. Мембрану промывали буфером для диализа 2 раза и собирали жидкость, полученную при промывании. Объем буфера для диализа, каждый раз используемого для промывки мембраны, приблизительно в 1,5 раза превышал остаточный объем системы, а общий объем, использованный для промывки мембраны, приблизительно в 2-4 раза превышал остаточный объем системы. Наконец, концентрацию белка в растворе доводили до 140-180 мг/мл и определяли конечную концентрацию белка.

Получение исходного раствора (разбавление и добавление вспомогательных веществ)

Белковый раствор разбавляли исходным раствором Tween 80 (2% Tween (масса/объем)) и буфером для диализа (0,060 моль/л трегалозы, 0,010 моль/л гистидин-HCl, 0,10 моль/л NaCl, pH 6,20 ± 0,05) до 150 ± 5 мг/мл, а конечная концентрация Tween 80 в нем составляла 0,02%. Затем разбавленный белковый раствор фильтровали в одноразовый контейнер для жидкости, и полученный белковый раствор, который подвергали фильтрации, представлял собой исходный раствор. Полученный исходный раствор разделяли на флаконы из PETG и хранили при -80 ± 10°C.

Получение состава

Брали исходный раствор, размораживали при комнатной температуре, тщательно перемешивали и подвергали фильтрации. Резиновые пробки и алюминиевые крышки упаковали и стерилизовали, а флаконы, очищенные с удалением пирогенов, переносили в соответствующие места для наполнения. Наполненные флаконы, которые закрывали пробками, затем переносили в камеру для укупорки. После этого проводили визуальный осмотр флаконов по одному для удаления флаконов с такими дефектами, как неточный объем наполнения, смятие, видимые частицы, посторонние включения, сломанная крышка и пустые флаконы. Затем флаконы снабжали этикетками и упаковали в коробки, а затем наклеили картонные этикетки в центре верхних поверхностей коробок.

Критерии приемлемости и результаты определения представлены в таблице 14.

Таблица 14. Критерии приемлемости и результаты определения

Пример 7. Определение активности связывания состава на основе антитела CBP-201

Для определения способности настоящего состава связываться с антигеном sIL-4Rα использовали непрямой ELISA.

Наносили антиген (sIL-4Rα, экспрессируемый в соответствии с NM_000418.4), который абсорбировался на планшете с твердой фазой для ELISA, а затем планшет промывали, блокировали и снова промывали перед добавлением образцов, предназначенных для испытания в отношении связывания с антигеном. Образцы, предназначенные для испытания, представляли собой разведения состава, полученного в соответствии с примером 6 настоящего изобретения, и разведения получали путем разбавления состава с помощью 1% BSA до концентрации антитела 1000 нг/мл с последующим выполнением градиентного разбавления от начальной концентрации 1000 нг/мл до концентрации 0 нг/мл. Несвязавшееся антитело удаляли путем промывания после инкубации и добавляли меченное ферментом вторичное антитело для дальнейшей инкубации. После удаления несвязавшегося меченного ферментом вторичного антитела путем промывания добавляли субстрат ферментативной реакции для проявления окраски. Наконец, реакцию останавливали путем добавления останавливающего раствора, и значения поглощения считывали при 450 нм и 655 нм на считывающем устройстве для микропланшетов. В соответствии со значениями поглощения рассчитывали половинную эффективную концентрацию EC₅₀ путем аппроксимации кривой.

Результаты определения активности связывания состава на основе CBP-201 показаны в таблице 15.

Таблица 15. Результаты определения активности связывания

Пример 8. Определение биологической активности состава на основе антитела CBP-201

Клетки IL4/IL13 HEK Blue™ (которые можно приобрести в Invivogen) использовали для определения активности состава на основе CBP-201 в отношении блокирования передачи сигнала STAT-6.

Клетки IL4/IL13 HEK Blue™ высевали на 384-луночный планшет для культивирования клеток и добавляли туда образцы, предназначенные для испытания. Образцы, предназначенные для испытания, представляли собой разведения состава, полученного в соответствии с примером 6 настоящего изобретения, и разведения получали путем разбавления состава с помощью DMEM, содержащей 10% FBS, до концентрации антитела 5000 нг/мл с последующим выполнением градиентного разбавления от начальной концентрации 5000 нг/мл до концентрации 0 нг/мл. После этого в планшет добавляли IL4 (который можно приобрести в Invivogen) с получением конечной концентрации 0,5 нг/мл. После инкубации в клеточном инкубаторе в течение 22 часов супернатант собирали и добавляли к нему реагент Quanti-blue для проявления цвета, затем считывали значения поглощения при 650 нм на считывающем устройстве для микропланшетов. В соответствии со значениями поглощения рассчитали половинную ингибирующую концентрацию IC₅₀ путем аппроксимации кривой.

Результаты определения биологической активности состава на основе CBP-201 показаны в таблице 16 и на фигуре 19.

Таблица 16. Результаты определения биологической активности

Активность полученного состава на основе CBP-201 определяли с использованием клеток IL4/IL13 HEK Blue™, а средние значения IC50 для двух партий составляли 4,193 нг/мл и 4,513 нг/мл соответственно.

Приведенное выше описание вариантов осуществления настоящего изобретения не предназначено для ограничения настоящего изобретения, и специалисты в данной области техники могут вносить различные изменения и вариации в соответствии с настоящим изобретением, которые находятся в пределах объема правовой охраны формулы настоящего изобретения без отступления от его сущности.

--->

Перечень последовательностей

<110> СУЧЖОУ КОННЕКТ БАЙОФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ЛТД.

<120> ЖИДКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ АНТИТЕЛО К АЛЬФА-РЕЦЕПТОРУ

ИНТЕРЛЕЙКИНА-4 ЧЕЛОВЕКА

<130> LC20210001P

<150> CN201910187179.9

<151> 2019-03-13

<160> 12

<170> PatentIn версии 3.3

<210> 1

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 вариабельной области легкой цепи

<400> 1

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 вариабельной области легкой цепи

<400> 2

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 вариабельной области легкой цепи

<400> 3

Gln Gln Tyr Asp His Ser Ala Gly Trp Thr

1 5 10

<210> 4

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи

<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp His Ser Ala

85 90 95

Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 вариабельной области тяжелой цепи

<400> 5

Arg Asn Ala Met Phe

1 5

<210> 6

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 вариабельной области тяжелой цепи

<400> 6

Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

Arg

<210> 7

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 вариабельной области тяжелой цепи

<400> 7

Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 8

<211> 115

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn

20 25 30

Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константная область легкой цепи

<400> 9

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 10

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Константная область тяжелой цепи

<400> 10

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly

325

<210> 11

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Легкая цепь

<400> 11

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp His Ser Ala

85 90 95

Gly Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val

100 105 110

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

115 120 125

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

130 135 140

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

145 150 155 160

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

180 185 190

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

195 200 205

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 12

<211> 441

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Asn

20 25 30

Ala Met Phe Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Gly Thr Gly Gly Ala Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp

260 265 270

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

305 310 315 320

Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

325 330 335

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu

340 345 350

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

355 360 365

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

370 375 380

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

385 390 395 400

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn

405 410 415

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

420 425 430

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440

<---

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины. 1-й объект представляет собой жидкую композицию для предотвращения, лечения или уменьшения интенсивности воспаления или аллергического заболевания, содержащую антитело к альфа-рецептору интерлейкина-4 человека в концентрации 100-165 мг/мл, гистидин-гидрохлоридный буфер в концентрации 5-10 ммоль/л, защитное средство, представляющее собой комбинацию трегалозы в концентрации 60-150 ммоль/л и хлорида натрия в концентрации 80-120 ммоль/л, и поверхностно-активное вещество Твин 80 в концентрации 0,01-0,2%, при этом pH составляет 6,0-6,4. 2-й объект – применение жидкой композиции для получения лекарственного препарата для лечения воспаления или аллергического заболевания. 3-й и 4-й объекты – контейнер, содержащий жидкую композицию, и набор для предотвращения, лечения или уменьшения интенсивности воспаления или аллергического заболевания. 5-й объект – способ предотвращения, лечения или уменьшения интенсивности воспаления или аллергического заболевания, включающий введение жидкой композиции. Технический результат заключается в предоставлении стабильного жидкого состава, содержащего антитело в высокой концентрации. 5 н. и 19 з.п. ф-лы, 19 ил., 16 табл., 8 пр.

1. Жидкая композиция для предотвращения, лечения или уменьшения интенсивности воспаления или аллергического заболевания, содержащая антитело к альфа-рецептору интерлейкина-4 человека в концентрации 100-165 мг/мл и буфер, защитное средство и поверхностно-активное вещество, которые служат в качестве вспомогательных веществ, при этом антитело содержит вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 4, вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 8, константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 9, и константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 10, при этом буфер представляет собой гистидин-гидрохлоридный буфер в концентрации 5-10 ммоль/л, защитное средство представляет собой комбинацию трегалозы в концентрации 60-150 ммоль/л и хлорида натрия в концентрации 80-120 ммоль/л, а поверхностно-активное вещество представляет собой Твин 80 в концентрации 0,01-0,2%, и при этом жидкая композиция характеризуется pH, составляющим 6,0-6,4.

2. Жидкая композиция по п. 1, где в жидкой композиции антитело присутствует в концентрации 130-165 мг/мл.

3. Жидкая композиция по п. 1, где в жидкой композиции антитело присутствует в концентрации 145-155 мг/мл.

4. Жидкая композиция по п. 1, где буфер представляет собой гистидин-гидрохлоридный буфер в концентрации 10 ммоль/л.

5. Жидкая композиция по п. 1, где защитное средство представляет собой комбинацию трегалозы в концентрации 60 ммоль/л и хлорида натрия в концентрации 100 ммоль/л.

6. Жидкая композиция по п. 1, где поверхностно-активное вещество представляет собой Твин 80 в концентрации 0,01-0,03%.

7. Жидкая композиция по п. 1, где поверхностно-активное вещество представляет собой Твин 80 в концентрации 0,02%.

8. Жидкая композиция по любому из пп. 1-7, где жидкая композиция представляет собой состав для инъекции.

9. Жидкая композиция по любому из пп. 1-7, где жидкая композиция представляет собой состав для подкожной или внутривенной инъекции.

10. Жидкая композиция по любому из пп. 1-7, где жидкая композиция содержит:

130-165 мг/мл антитела;

10 ммоль/л гистидина гидрохлорида;

60 ммоль/л трегалозы;

100 ммоль/л натрия хлорида;

0,02% Твин 80; и

при этом жидкая композиция характеризуется pH, составляющим 6,0-6,4.

11. Жидкая композиция по п. 10, где в жидкой композиции антитело присутствует в концентрации 145-155 мг/мл.

12. Жидкая композиция по п. 11, где жидкая композиция характеризуется pH, составляющим 6,15-6,25.

13. Применение жидкой композиции по любому из пп. 1-12 для получения лекарственного препарата для лечения воспаления или аллергического заболевания.

14. Применение по п. 13, где воспаление или аллергическое заболевание включает аутоиммунное заболевание.

15. Применение по п. 13, где воспаление или аллергическое заболевание представляет собой аллергический дерматит, астму, эозинофильный эзофагит, экзему, аллергический ринит, назальный полип или ревматоидный артрит.

16. Контейнер для предотвращения, лечения или уменьшения интенсивности воспаления или аллергического заболевания, где контейнер содержит жидкую композицию по любому из пп. 1-12.

17. Набор для предотвращения, лечения или уменьшения интенсивности воспаления или аллергического заболевания, где набор содержит контейнер по п. 16 и инструкцию.

18. Способ предотвращения, лечения или уменьшения интенсивности воспаления или аллергического заболевания, где способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, жидкой композиции по любому из пп. 1-12.

19. Способ по п. 18, где субъектом является млекопитающее.

20. Способ по п. 18, где субъектом является человек.

21. Способ по любому из пп. 18-20, где воспаление или аллергическое заболевание включает аутоиммунное заболевание.

22. Способ по п. 21, где воспаление или аллергическое заболевание представляет собой аллергический дерматит, астму, эозинофильный эзофагит, экзему, аллергический ринит, назальный полип или ревматоидный артрит.

23. Способ по п. 21 или 22, где жидкую композицию вводят субъекту путем инъекции.

24. Способ по п. 23, где жидкую композицию вводят субъекту путем подкожной инъекции или внутривенной инъекции.