ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится в основном к составам терапевтических антител, и их применению в лечении различных расстройств.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Антитела могут несколько отличаться по аминокислотной последовательности своих константных доменов или по их каркасным последовательностям в вариабельных доменах, но обычно они наиболее сильно различаются по последовательностям CDR. Даже антитела, связывающиеся с одним и тем же белком, одним и тем же полипептидом или даже потенциально одним и тем же эпитопом, могут содержать совершенно разные последовательности CDR. Терапевтические антитела для применения на людях также можно получить из последовательности антитела зародышевой линии человека или из последовательностей антител зародышевой линии, не относящейся к человеку (например, грызунов), таких как гуманизированные антитела, что приводит к еще большему разнообразию потенциальных последовательностей. Данные различия в последовательностях могут привести к потенциально разной стабильности в растворе и разной реакции на параметры раствора. Кроме того, небольшие изменения в расположении аминокислот или изменения в одном или нескольких аминокислотных остатках могут привести к резко различающейся стабильности антител и восприимчивости антител к путям деградации, специфическим к последовательностям. Как следствие, в настоящее время невозможно предсказать условия раствора, необходимые для оптимизации стабильности антител. Каждое антитело необходимо изучать индивидуально, чтобы определить оптимальный состав раствора. Bhambhani et al. (2012) J. Pharm. Sci. 101: 1120.

Антитела также представляют собой довольно крупные белки (~150000 Да), например, по сравнению с другими терапевтическими белками, такими как гормоны и цитокины. Лекарственные препараты на основе антител должны быть стабильными во время хранения, чтобы гарантировать эффективность и постоянное дозирование, поэтому очень важно, чтобы любой выбранный состав поддерживал требуемые свойства, такие как высокая концентрация, прозрачность и приемлемая вязкость, и также сохранял данные свойства и эффективность лекарственного средства в течение приемлемо длительного срок годности при стандартных условиях хранения.

LAG3 (CD223) представляет собой молекулу клеточной поверхности, экспрессируемую на активированных Т-клетках (Huard et al. Immunogenetics 39: 213-217, 1994), NK-клетках (Triebel et al. J Exp Med 171: 1393-1405, 1990), B-клетках (Kisielow et al. Eur J Immunol 35: 2081-2088, 2005), и плазмацитоидных дендритных клетках (Workman et al. J Immunol 182: 1885-1891, 2009), которые играют важную роль в функции данной субпопуляций лимфоцитов. Кроме того, взаимодействие между LAG3 и его основным лигандом, MHC класса II, как полагают, играет роль в модуляции функции дендритных клеток (Andreae et al. J Immunol 168: 3874-3880, 2002). Недавние доклинические исследования документально подтвердили роль LAG-3 в истощении CD8 Т-лимфоцитов (Blackburn et al. Nat Immunol 10: 29-37, 2009).

Как и в случае хронической вирусной инфекции, опухолевые антиген-специфические CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетки проявляют нарушенную эффекторную функцию и истощенный фенотип, характеризующийся сниженной продукцией провоспалительных цитокинов и гипореактивностью к антигенной повторной стимуляции. Это опосредуется внешними клеточными механизмами, такими как регуляторные Т-клетки (Treg), и внутренними клеточными механизмами, такими как ингибирующие молекулы, которые активируются на истощенных, инфильтрирующих опухоль лимфоцитах (TIL). Данные ингибирующие механизмы представляют собой серьезный барьер для эффективного противоопухолевого иммунитета.

LAG-экспрессируется на толеризованных TIL, что позволяет предположить, что они вносят вклад в опосредованное опухолью подавление иммунитета. Ингибирование LAG3 может привести к усиленной активации антиген-специфических Т-клеток, от которых может быть получен терапевтический эффект.

PD-1 признан важной молекулой в иммунной регуляции и поддержании периферической толерантности. PD-1 умеренно экспрессируется на наивных T, B и NKT-клетках и активируется с помощью передачи сигналов рецептора T/B лимфоцитов, моноцитов и миелоидных клеток. Два известных лиганда для PD-1, PD-L1 (B7-H1) и PD-L2 (B7-DC), экспрессируются при раковых заболеваниях человека, возникающих в различных тканях. В больших выборках, например, при раке яичников, почек, колоректальном раке, поджелудочной железы, печени и меланоме, было показано, что экспрессия PD-L1 коррелирует с плохим прогнозом и снижает общую выживаемость независимо от последующего лечения. Аналогично, было обнаружено, что экспрессия PD-1 на лимфоцитах, инфильтрирующих опухоль, маркирует дисфункциональные Т-клетки при раке груди и меланоме и коррелирует с плохим прогнозом при раке почек. Таким образом, было высказано предположение, что опухолевые клетки, экспрессирующие PD-L1, взаимодействуют с экспрессирующими PD-1 Т-клетками для ослабления активации Т-клеток и уклонения от иммунного надзора, тем самым способствуя нарушенному иммунному ответу против опухоли.

Несколько моноклональных антител, которые ингибируют взаимодействие между PD-1 и одним или обоими его лигандами, PD-L1 и PD-L2, одобрены FDA для лечения рака. Было высказано предположение, что эффективность данных антител можно увеличить, если их вводить в сочетании с другими одобренными или экспериментальными способами лечения рака, например, облучением, хирургическим вмешательством, химиотерапевтическими средствами, таргетной терапией, агентами, которые ингибируют другие сигнальные пути, которые регулируются в опухолях с нарушениями, и другие агенты, повышающие иммунитет.

Как следствие, существует потребность в стабильных совместных составах анти-LAG3антител и анти-PD-1 антител. Данные стабильные составы предпочтительно будут демонстрировать стабильность от месяцев до лет в условиях, типичных для хранения лекарственных средств для самостоятельного введения, т.е. при температуре холодильника в шприце, что обеспечивает длительный срок хранения соответствующего лекарственного препарата.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к совместным составам анти-LAG3 антител или их антигенсвязывающих фрагментов и анти-PD-1 антител или их антигенсвязывающие фрагменты. В одном варианте осуществления, состав содержит: приблизительно 16-22 мг/мл анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; приблизительно 3-7 мг/мл анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; приблизительно 30-120 мг/мл невосстанавливающего дисахарида; приблизительно 0,02-2,0 мг/мл полисорбата 80 или полисорбата 20; буфер при pH приблизительно 4,5-6,5; и приблизительно 40-150 мМ L-аргинина или его фармацевтически приемлемой соли, где анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDRL1 SEQ ID NO:39, CDRL2 SEQ ID NO:40 и CDRL3 SEQ ID NO:41, и вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDRH1 SEQ ID NO:42, CDRH2 SEQ ID NO:59 и CDRH3 SEQ ID NO:44, и анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDRL1 SEQ ID NO:1, CDRL2 SEQ ID NO:2 и CDRL3 SEQ ID NO:3, и вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDRH1 SEQ ID NO:6, CDRH2 SEQ ID NO:7 и CDRH3 SEQ ID NO:8. В одном варианте осуществления, состав дополнительно содержит приблизительно 5-15 или приблизительно 5-10 мМ L-метионина. Неожиданно, анти-LAG3/анти-PD-1 совместные составы обладают лучшей стабильностью, чем составы отдельных антител. Составы можно лиофилизировать для растворения, или они могут быть в жидкой форме.

В другом аспекте настоящего изобретения, состав содержит: приблизительно 3-300 мг/мл анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и приблизительно 3-300 мг/мл анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента при молярном соотношении 4:1-5:1 (анти-LAG3 антитело к анти-PD-1 антителу, или их антигенсвязывающие фрагменты), одно или более вспомогательных веществ, выбранные из группы, состоящей из гистидина, аспартата, глютамина, глицина, пролина, метионина, аргинина или их фармацевтически приемлемой соли, NaCl, KCl, LiCl, CaCl₂, MgCl₂, ZnCl₂ и FeCl₂, при суммарной концентрации вспомогательных веществ приблизительно 10-1000 мМ, и буфер при pH приблизительно 5-8.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака или инфекции, включающему введение растворенного или жидкого состава (состава в растворе) нуждающемуся субъекту. В дополнительных вариантах осуществления состав применяют в лечении хронической инфекции. Также предполагается применение раствора или лиофилизированного состава в производстве лекарственного средства для лечения рака или инфекции.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фигура 1: кислые варианты Ab6 по данным стабильности HP-IEX в условиях хранения при 5°C, 25°C и 40°C для Ab6A лекарственного продукта.

Фигура 2: основные типы Ab6 по данным стабильности HP-IEX в условиях хранения при 5°C, 25°C и 40°C для Ab6A лекарственного продукта.

Фигура 3: основные варианты Ab6 по данным стабильности HP-IEX в условиях хранения при 5°C, 25°C и 40°C для Ab6A лекарственного продукта.

Фигура 4: кислые варианты MK-3475 по данным стабильности HP-IEX в условиях хранения при 5°C, 25°C и 40°C для Ab6A лекарственного продукта

Фигура 5: основные типы MK-3475 по данным стабильности HP-IEX в условиях хранения при 5°C, 25°C и 40°C для Ab6A лекарственного продукта.

Фигура 6: основные варианты MK-3475 по данным стабильности HP-IEX в условиях хранения при 5°C, 25°C и 40°C для Ab6A лекарственного продукта.

Фигура 7: Высокомолекулярные соединения по данным стабильности UP-SEC в условиях хранения при 5°C, 25°C и 40°C для Ab6A лекарственного продукта.

Фигура 8: Мономер по данным стабильности UP-SEC в условиях хранения при 5°C, 25°C и 40°C для Ab6A лекарственного продукта.

Фигура 9: Интактный IgG по данным о стабильности невосстанавливающим CE-SDS в условиях хранения при 5°C, 25°C и 40°C для Ab6A лекарственного продукта.

Фигура 10: Суммарные низкомолекулярные соединения по данным о стабильности невосстанавливающим CE-SDS в условиях хранения при 5°C, 25°C и 40°C для Ab6A лекарственного продукта.

Фигура 11: Гомологическая модель анти-LAG3 антитела Ab6, показывающая воздействие на триптофан на поверхности. Поверхность Trp102 подвергается воздействию, как измерено по доступной площади поверхности (85,25 Å²), рассчитанной, применяя модель гомологии.

Фигура 12: Снижение самовзаимодействия (KD) и улучшение коллоидной стабильности (OD350) и относительной растворимости (% PEGmid-point) Анти-LAG3 антитела Ab6 в присутствии соли (50 мМ NaCl) и в присутствии гидрохлорида L-аргинина (40 мМ) в 10 мМ гистидиновом буфере pH 5,6.

Фигура 13: влияние гидрохлорида L-аргинина на параметр диффузионного взаимодействия (KD) и мутность (OD350 при 50 мг/мл) анти-LAG3 антитела Ab6 в 10 мМ гистидиновом буфере при pH 5,8 и pH 6,0.

Фигура 14: Исследования диапазона pH анти-LAG3 антитела Ab6 (5,3-6,4).

Фигура 15: Параметр диффузионного взаимодействия (kD) анти-LAG3 антитела Ab6 (25 мг/мл в 10 мМ L-гистидине pH 5,8) в присутствии L-аргинина, L-гистидина или хлорида натрия.

Фигура 16: Относительная растворимость анти-LAG3 антитела Ab6 (25 мг/мл в 10 мМ L-гистидине pH 5,8) в присутствии L-аргинина, L-гистидина или хлорида натрия.

Фигура 17: Изменение в процентах заряженных частиц анти-LAG3 антитела Ab6 (25 мг/мл в 10 мМ L-гистидине pH 5,8) в присутствии L-аргинина, L-гистидина или хлорида натрия.

Фигура 18: Оптимизация 25 мг/мл состава анти-LAG3 антитела Ab6 в 10 мМ L-гистидиновом pH 5,8 буфере L-аргинином, хлоридом натрия или их смесью, применяя измерение второго вириального коэффициента (B₂₂) .

Фигура 19: Коллоидная стабильность (OD350) 25 мг/мл состава анти-LAG3 антитела Ab6 в 10 мМ L-гистидиновом pH 5,8 буфере в присутствии L-аргинина, хлорида натрия или их смеси.

Фигура 20: Вязкость анти-LAG3 антитела Ab6 (60 мг/мл) в 10 мМ L-гистидиновом pH 5,8 буфере в присутствии одного из L-аргинина и хлорида натрия или их смеси.

Фигура 21: Осмолярность анти-LAG3 антитела Ab6 (25 мг/мл) в 10 мМ L-гистидиновом pH 5,8 буфере в присутствии одного из L-аргинина и хлорида натрия или их смеси.

Фигура 22: Анализ мутности составов анти-LAG3 антитела Ab6 (F1-F6) с течением времени в условиях хранения при 40°C и 25°C.

Фигура 23: Хроматографический анализ со смешанным режимом составов анти-LAG3 антитела Ab6 (F1-F6) с течением времени в условиях хранения при 40°C. Изменение количества мономера в процентах для каждого mAb (анти-LAG3 и анти-PD-1) наносили на график с течением времени для составов F1-F6.

Фигура 24: Изменение в процентах высокомолекулярных (HMW) частиц, мономера и низкомолекулярных (LMW) соединений 25 мг/мл состава анти-LAG3 антитела Ab6 (10 мМ L-гистидиновый pH 5,8 буфер) в присутствии 70 мМ гидрохлорида L-аргинина с 2,5%-9% стабилизаторов или 70 мМ хлорида натрия с 2,5%-9,0% стабилизаторов.

Фигура 25: Изменение в процентах заряженных частиц 25 мг/мл состава анти-LAG3 антитела Ab6 (10 мМ L-гистидиновый pH 5,8 буфер) в присутствии 70 мМ гидрохлорида L-аргинина с 2,5% -9% стабилизаторов или 70 мМ хлорида натрия с 2,5%-9,0% стабилизаторов.

Фигура 26: Tm1, Tm2 и Tonset 25 мг/мл состава анти-LAG3 антитела Ab6 (10 мМ L-гистидин pH 5,8) в присутствии 70 мМ L-аргинина с 2,5%-9% стабилизаторов или 70 мМ хлорида натрия с 2,5%-9% стабилизаторов.

Фигура 27: Коллоидная стабильность (OD350) 25 мг/мл состава анти-LAG3 антитела Ab6 (10 мМ L-гистидин, 70 мМ L-аргинин, 5% вес/об сахароза, pH 5,8) в присутствии различных концентраций полисорбата 80 при стрессе, вызываемом перемешиванием.

Фигура 28: Изменение в процентах высокомолекулярных (HMW) частиц, мономера и низкомолекулярных (LMW) соединений 25 мг/мл состава анти-LAG3 антитела Ab6 (10 мМ L-гистидиновый pH 5,8 буфер, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, 5% вес/об сахароза) в присутствии различных концентраций полисорбата 80 при стрессе, вызываемом перемешиванием.

Фигура 29: Изменение в процентах заряженных частиц 25 мг/мл состава анти-LAG3 антитела Ab6 (10 мМ L-гистидин, 70 мМ L-аргинин, 5% вес/об сахароза, pH 5,8) в присутствии различных концентраций полисорбата 80 при стрессе, вызываемом перемешиванием.

Фигура 30: Коллоидная стабильность (OD350) 25 мг/мл состава анти-LAG3 антитела Ab6 (10 мМ L-гистидин, 70 мМ L-аргинин, 5% вес/об сахароза, pH 5,8) отдельно и в присутствии повышающихся концентраций L-метионина.

Фигура 31: Изменение в процентах высокомолекулярных (HMW) соединений и мономера 25 мг/мл состава анти-LAG3 антитела Ab6 (10 мМ L-гистидин, 70 мМ L-аргинин, 5% вес/об сахароза, pH 5,8) отдельно и в присутствии повышающихся концентраций L-метионина.

Фигура 32: Изменение в процентах заряженных частиц 25 мг/мл состава анти-LAG3 антитела Ab6 (10 мМ L-гистидин, 70 мМ L-аргинин, 5% вес/об сахароза, pH 5,8) отдельно и в присутствии повышающихся концентраций L-метионина.

Фигура 33: Изменение в процентах окисления 25 мг/мл состава анти-LAG3 антитела Ab6 (10 мМ L-гистидин, 70 мМ L-аргинин, 5% вес/об сахароза, pH 5,8) отдельно и в присутствии повышающихся концентраций L-метионина.

Фигура 34: Изменение в процентах мутности (OD350) 200 мг/мл анти-LAG3 антитела Ab6 в присутствии 10 мМ буфера с 70 мМ гидрохлоридом L-аргинина, pH 5,8 отдельно и в присутствии различных стабилизаторов.

Фигура 35: Изменение в процентах высокомолекулярных (HMW) соединений, мономера и низкомолекулярных (LMW) соединений 200 мг/мл анти-LAG3 антитела Ab6 в присутствии 10 мМ буфера с 70 мМ гидрохлоридом L-аргинина, pH 5,8 отдельно и в присутствии различных стабилизаторов.

Фигура 36: Изменение в процентах заряженных частиц 200 мг/мл анти-LAG3 антитела Ab6 в присутствии 10 мМ буфера с 70 мМ гидрохлорида L-аргинина, pH 5,8 отдельно и в присутствии различных стабилизаторов.

Фигура 37: Изменение в процентах мутности (OD₃₅₀) 25 мг/мл анти-LAG3 антитела Ab6 в присутствии 40-70 мМ соли (хлорида натрия) и 20-70 мМ аминокислот отдельно и в некоторых комбинациях.

Фигура 38: Изменение в процентах высокомолекулярных (HMW) соединений, мономера и низкомолекулярных (LMW) соединений 25 мг/мл анти-LAG3 антитела Ab6 в присутствии 40-70 мМ соли (хлорида натрия) и 20-70 мМ аминокислот отдельно и в некоторых комбинациях.

Фигура 39: Изменение в процентах заряженных частиц 25 мг/мл анти-LAG3 антитела Ab6 в присутствии 40-70 мМ соли (хлорида натрия) и 20-70 мМ аминокислот отдельно и в некоторых комбинациях.

Фигура 40: Изменение в процентах гидродинамического диаметра 25 мг/мл анти-LAG3 антитела Ab6 в присутствии 40-70 мМ соли (хлорида натрия) и 20-70 мМ аминокислот отдельно и в некоторых комбинациях.

Фигура 41: 10-дневное (10D) скрининговое исследование агрегации совместного состава анти-LAG3 антитела Ab6 и анти-PD-1 антитела MK-3475 на % высокомолекулярные частицы (HMW) при 5°C, 40°C или 50°C.

Фигура 42: 10-дневное (10D) скрининговое исследование агрегации совместного состава анти-LAG3 антитела Ab6 и анти-PD-1 антитела MK-3475 на % основной пик (мономер) при 5°C, 40°C или 50°C.

Фигура 43: тяжелая цепь+легкая цепь по данным о стабильности восстановленным CE-SDS в условиях хранения при 5°C, 25°C и 40°C для Ab6A лекарственного продукта.

Фигура 44: суммарное количество примесей по данным о стабильности восстановленным CE-SDS в условиях хранения при 5°C, 25°C и 40°C для Ab6A лекарственного продукта.

Фигура 45: MK-3475 общие предварительные пики по данным о стабильности HIC в условиях хранения при 5°C, 25°C и 40°C для Ab6A лекарственного продукта.

Фигура 46: данные о стабильности по мутности A350 в условиях хранения при 5°C, 25°C и 40°C для Ab6A лекарственного продукта.

Фигура 47: Репрезентативная хроматограмма профиля заряда, полученная для Ab6A лекарственного продукта, полная шкала (вверху) и увеличенная шкала (внизу).

Фигура 48: Сигналы флуоресценции, полученные после окисления и флуорогенного мечения продуктов ДОФА. Растворы отдельных компонентов и совместные состава инкубируют при комнатной температуре в течение 72 часов перед тем, как подвергнуть их реакциям окисления AAPH и введения метки ABS.

Фигура 49: Пример измерения FRET для растворов совместного состава MK-3475 и Ab6 в присутствии и отсутствии аргинина и PS80. Экспериментальные данные (кружки). Нелинейная аппроксимация фитинг (линии).

Фигура 50: Сравнение уровней окисления M105 с помощью анализа HIC-SEC в образцах состава Ab6A и MK-3475, подвергнутых термической нагрузке при 25°C в той же матрице состава.

Фигура 51: Сравнение уровней окисления M105 с помощью анализа HIC-SEC в образцах состава Ab6A и MK-3475, подвергнутых термической нагрузке при 40°C в той же матрице состава.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Как применяют в настоящем изобретении, включая прилагаемую формулу изобретения, формы единственного числа включают соответствующие ссылки во множественном числе, если из контекста явно не следует иное. Если не указано иное, белки и субъекты, упомянутые в настоящем изобретении, являются человеческими белками и людьми, а не другими видами.

Определения

Как применяют в настоящем изобретении, если не указано иначе, "антигенсвязывающий фрагмент" относится к антигенсвязывающим фрагментам антител, т.е. фрагментам антител, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном, связывающимся с полноразмерным антителом, например фрагменты, которые сохраняют одну или несколько областей CDR. Примеры связывающих фрагментов антител включают, но не ограничиваются, фрагменты Fab, Fab', F (ab')2 и Fv.

"Fab фрагмент" состоит из одной легкой цепи и CH1 и вариабельных участков одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы Fab не может образовывать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи. «Fab-фрагмент» может быть продуктом расщепления папаином антитела.

"Fc" область содержит два фрагмента тяжелой цепи, содержащие CH3 и CH2 домены антитела. Два фрагмента тяжелой цепи удерживаются вместе двумя или более дисульфидными связями и гидрофобными взаимодействиями доменов CH3.

"Fab' фрагмент" содержит одну легкую цепь и часть или фрагмент одной тяжелой цепи, которая содержит VH домен и CH1 домен и также обрасть между CH1 и CH2 доменами, так что межцепочечная дисульфидная связь может быть образована между двумя тяжелыми цепями двух фрагментов Fab' с образованием молекулы F(ab')2.

"F(ab')2 фрагмент" содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи, содержащие часть константной области между доменами CH1 и CH2, так что между двумя тяжелыми цепями образуется межцепочечная дисульфидная связь. Таким образом, фрагмент F (ab')2 состоит из двух фрагментов Fab', которые удерживаются вместе дисульфидной связью между двумя тяжелыми цепями. «Фрагмент F(ab')2» может быть продуктом расщепления пепсином антитела.

"Fv область" содержит вариабельные участки, как из тяжелой, так и из легкой цепи, но не содержит константных областей.

Как применяют в настоящем изобретении, термин "гипервариабельный участок" относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельный участок содержит аминокислотные остатки из "области, определяющей комплементарность" или "CDR" (например остатки 24-34 (CDRL1), 50-56 (CDRL2) и 89-97 (CDRL3) в вариабельном домене легкой цепи и остатки 31-35 (CDRH1), 50-65 (CDRH2) и 95-102 (CDRH3) в вариабельном домене тяжелой цепи (Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) и/или остатки из"гипервариабельной петли" (т.е., остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи (Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). Как применяют в настоящем изобретении, термин "каркасные" или "FR" остатки относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков гипервариабельного участка, определенных в настоящем изобретении как CDR остатки. Указанная выше нумерация остатков относится к системе нумерации Кабата и не обязательно в деталях соответствует порядковой нумерации в прилагаемом перечне последовательностей.

“Пролиферативная активность” включает активность, которая является необходимой для, или которая специфически связана, например, с нормальным делением клеток, а также с раком, опухолями, дисплазией, трансформацией клеток, метастазированием и ангиогенезом.

Термины “рак”, “опухоль”, “раковый” и “злокачественный” относятся к или описывают физиологическое состояние млекопитающих, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают, но не ограничиваются, карциному, включая аденокарциному, лимфому, бластому, меланому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры данных видов рака включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, рак желудочно-кишечного тракта, лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому, рак поджелудочной железы, глиобластому, глиому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, такой как карцинома печени и гепатома, рак мочевого пузыря, рак груди, рак толстой кишки, колоректальный рак, карциному эндометрия, миелому (например, множественную миелому), карциномуслюнных желез, рак почек, такой как почечно-клеточная карцинома и опухоли Вильмса, базальноклеточную карциному, меланому, рак простаты, рак вульвы, рак щитовидной железы, рак яичек, рак пищевода и различные виды рака головы и шеи.

По мере того, как раковые клетки растут и размножаются, они образуют массу раковой ткани, которая представляет собой опухоль, которая проникает и разрушает нормальные соседние ткани. Злокачественные опухоли представляют собой рак. Злокачественные опухоли обычно можно удалить, но они могут вырасти снова. Клетки злокачественных опухолей могут проникать и повреждать близлежащие ткани и органы. Кроме того, раковые клетки могут оторваться от злокачественной опухоли и попасть в кровоток или лимфатическую систему, что представляет собой путь распространения раковых клеток из первичной опухоли (т.е., первоначального рака) с образованием новых опухолей в других органах. Распространение рака в организме называется метастазированием (What You Need to Know About Cancer- an Overview, NIH Publication No. 00-1566; posted Sept. 26, 2000, updated Sept. 16, 2002 (2002)).

Как применяют в настоящем изобретении, термин «солидная опухоль» относится к аномальному разрастанию или массе ткани, которая обычно не содержит кист или жидких участков. Солидные опухоли могут быть доброкачественными (не злокачественными) или злокачественными (раковыми). Различные типы солидных опухолей названы по типу клеток, которые их образуют. Примерами солидных опухолей являются саркомы, карциномы и лимфомы. Лейкемии (рак крови) обычно не образуют солидных опухолей (National Cancer Institute, Dictionary of Cancer Terms).

Как применяют в настоящем изобретении, термин «карциномы» относятся к ракам эпителиальных клеток, которые представляют собой клетки, которые покрывают поверхность тела, вырабатывают гормоны и составляют железы. Примерами карцином являются рак кожи, легких, толстой кишки, желудка, груди, простаты и щитовидной железы.

Определения фармацевтических композиций

Как применяют в настоящем изобретении, "водная" фармацевтическая композиция представляет собой композицию, пригодную для фармацевтического применения, где водный носитель представляет собой стерильную воду для инъекции. Композиция, пригодная для фармацевтического применения, может быть стерильной, гомогенной и/или изотонической. В некоторых вариантах осуществления, водные фармацевтические композиции настоящего изобретения являются пригодными для парентерального введения человеку. В конкретном варианте осуществления, водные фармацевтические композиции настоящего изобретения являются пригодными для внутривенного и/или подкожного введения.

Термин "приблизительно", при изменении количества (например, мМ, или M) вещества или композиции, процентного содержания (об/об или вес/об) компонента состав, pH раствора/состава или значения параметра, характеризующего стадию в способе или подобное, относится к изменению числового количества, которое может происходить, например, посредством стандартных процедур измерения, обработки и отбора проб, задействованных в получении, характеристике и/или применении вещества или композиции; из-за инструментальной ошибки в данных процедурах; из-за различий в производстве, источнике или чистоте ингредиентов, применяемых для изготовления или применения композиций или выполнения процедур; и подобных. В некоторых вариантах осуществления «приблизительно» может обозначать изменение в пределах ± 0,1%, 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5% или 10%.

Как применяют в настоящем изобретении, “x% (вес/об)” является эквивалентным x г/100 мл (например, 5% вес/об равно 50 мг/мл ).

Термин "буфер" включает агенты, которые поддерживают раствор pH в приемлемом диапазоне в жидком составе до лиофилизации и/или после растворения, и они могут включать, но не ограничиваясь ими, сукцинат (натрия или калия), гистидин, ацетат, фосфат (натрия или калия), трис (трис(гидроксиметил)аминометан), диэтаноламин, цитрат (натрия) и подобные.

“Сформулированный совместно” или “совместный состав”, как применяют в настоящем изобретении, относится к, по меньшей мере, двум различным антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, которые формулируются вместе и хранят в виде комбинированного продукта в одном флаконе или сосуде (например, инъекционном устройстве), а не формулируют и хранят индивидуально, и затем смешивают перед введением или вводят отдельно. В одном варианте осуществления совместный состав содержит два различных антитела или их антигенсвязывающие фрагменты.

“Гликоль” относится к алкилу с двумя гидроксильными группами.

“Сахарный спирт” относится к полиолам, полученным из сахара, и имеют общую формула HOCH₂(CHOH)_nCH₂OH, n =1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Примеры включают, но не ограничиваются, маннит, сорбит, эритритол, ксилитол и глицерин.

Как применяют в настоящем изобретении “полиол” включает глицерин и сахарный спирт.

Термины «лиофилизация» и «лиофилизированный» и «сублимационо высушенный» относятся к способу, при котором высушиваемый материал сначала замораживают, и затем лед или замороженный растворитель удаляется сублимацией в вакууме. Наполнитель может быть включен в предварительно лиофилизированные составы для повышения стабильности лиофилизированного продукта при хранении.

«Невосстанавливающий сахар» представляет собой сахар, не способный действовать как восстанавливающий агент, потому что он не содержит или не может быть превращен в свободную альдегидную группу или свободную кетоновую группу. Примеры невосстанавливающих сахаров включают, но не ограничиваются, диссахарриды, такие как сахароза и трегалоза.

Термин "фармацевтическая состав" относится к препаратам, которые находятся в такой форме, которая позволяет активным ингредиентам быть эффективными, и которые не содержат дополнительных компонентов, которые являются токсичными для субъектов, которым будет назначен состав.

"Фармацевтически приемлемые" вспомогательные вещества (среды, добавки) представляют собой вспомогательные вещества, которые можно разумно вводить млекопитающему для обеспечения эффективной дозы применяемого активного ингредиента.

«Время растворения» представляет собой время, необходимое для регидратации лиофилизированного состава раствором до осветленного раствора без частиц.

"Стабильный" состав представляет собой состав, в котором белок в нем по существу сохраняет свою физическую стабильность, и/или химическую стабильность, и/или биологическую активность при хранении. В данной области доступны различные аналитические способы измерения стабильности белков, которые рассматриваются в Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) и Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90 (1993). Стабильность можно измерить при выбранной температуре в течение выбранного периода времени. Например, в одном варианте осуществления стабильный состав представляет собой состав без значительных изменений, наблюдаемых при температуре охлаждения (2-8°C) в течение, по меньшей мере, 12 месяцев. В другом варианте осуществления стабильный состав представляет собой состав без значительных изменений, наблюдаемых при температуре охлаждения (2-8°C) в течение, по меньшей мере, 18 месяцев. В другом варианте осуществления стабильный состав представляет собой состав без значительных изменений, наблюдаемых при комнатной температуре (23-27°C) в течение, по меньшей мере, 3 месяцев. В другом варианте осуществления стабильный состав представляет собой состав без значительных изменений, наблюдаемых при комнатной температуре (23-27°C) в течение, по меньшей мере, 6 месяцев. В другом варианте осуществления, стабильный состав представляет собой состав без значительных изменений, наблюдаемых при комнатной температуре (23-27°C) в течение, по меньшей мере, 12 месяцев. В другом варианте осуществления стабильный состав представляет собой состав без значительных изменений, наблюдаемых при комнатной температуре (23-27°C) в течение, по меньшей мере, 18 месяцев. Критерии стабильности состава антитела следующие. Как правило, разлагается не более 10%, предпочтительно 5% мономера антитела, как измерено SEC-HPLC. Обычно состав является бесцветным или прозрачным или слегка опалесцирующим при визуальном анализе. Как правило, изменении концентрации, pH и осмолярности состава составляет не более +/- 10%. Эффективность обычно находится в пределах 60-140%, предпочтительно 80-120% от контрольного или эталонного. Обычно наблюдают не более 10%, предпочтительно 5% разрезания антитела, т.е., % низкомолекулярных соединений, как определено, например, HP-SEC. Обычно образуется не более 10%, предпочтительно 5% агрегатов антитела, т.е. % высокомолекулярных соединений, как определено, например, HP-SEC.

“Поверхностно-активное соединение” представляет собой поверхностно-активное соединение, которое является амфипатическим по свойствам.

Антитело «сохраняет свою физическую стабильность» в фармацевтическом составе, если оно не показывает значительного увеличения агрегации, осаждения и/или денатурации при визуальном исследовании цвета и/или прозрачности, или при измерении с помощью рассеяния УФ-света, эксклюзионной хроматографии (SEC) и динамической рассеяние света. Изменения конформации белка можно оценить с помощью флуоресцентной спектроскопии, которая определяет третичную структуру белка, и с помощью FTIR-спектроскопии, которая определяет вторичную структуру белка.

Антитело «сохраняет свою химическую стабильность» в фармацевтическом составе, если оно не показывает значительных химических изменений. Химическую стабильность можно оценить путем обнаружения и количественного определения химически измененных форм белка. Процессы деградации, которые часто изменяют химическую структуру белка, включают гидролиз или разрезание (оценивают способами, такими как эксклюзионная хроматография и SDS-PAGE), окисление (оценивают способами, такими как картирование пептидов в сочетании с масс-спектроскопией или MALDI/TOF/MS), дезамидирование (оценивают способами, такими как ионообменная хроматография, капиллярное изоэлектрическое фокусирование, картирование пептидов, измерение изоаспарагиновой кислоты), и изомеризацию (оценивают путем измерения содержания изоаспарагиновой кислоты, картированием пептидов и т.д.).

Антитело «сохраняет свою биологическую активность» в фармацевтическом составе, если биологическая активность антитела в заданный период времени находится в заранее определенном диапазоне биологической активности, проявляемой на момент приготовления состава. Биологическую активность антитела можно определить, например, с помощью анализа связывания антигена. В одном варианте осуществления биологическая активность стабильного антитела состава в течение 12 месяцев находится в пределах 60-140% от эталона.

Термин "изотонический" обозначает то, что интересующий состав имеет по существу такое же осмотическое давление, как кровь человека. Изотонические составы обычно имеют осмотическое давление примерно 270-328 мОсм. Слегка гипотоническое давление представляет собой 250-269, и слабогипертоническое давление представляет собой 328-350 мОсм. Осмотическое давление можно измерить, например, с помощью осмометра давления пара или осмометра по точке замерзания.

"Растворенный" состав представляет собой состав, который был получен растворением лиофилизированного белка в разбавителе таким образом, чтобы белок диспергировался в растворенном составе. Растворенный состав является пригодным для введения (например, парентерального введения) и может необязательно является пригодным для подкожного введения.

“Суммарная концентрация вспомогательных веществ” относится к сумме молярных концентраций указанных ионизируемых вспомогательных веществ (например, гистидина, аспартата, глютамина, глицина, пролина, метионина, аргинина или их фармацевтически приемлемых солей, NaCl, KCl, LiCl, CaCl₂, MgCl₂, ZnCl₂ и FeCl₂), без учета концентраций вспомогательных веществ, указанных в качестве буферных.

Когда указывают диапазон значений pH, такой как «pH между 5,0 и 6,0», предполагается, что данный диапазон включает указанные значения. PH обычно измеряют при 25°C с помощью стандартного pH-метра со стеклянной колбой. Как применяется в настоящем изобретении, раствор, содержащий «гистидиновый буфер при pH X», относится к раствору при pH X и содержащему гистидиновый буфер, т.е. pH предназначен для обозначения pH раствора.

Аналитические способы

Аналитические способы, подходящие для оценки стабильности продукта, включают эксклюзионную хроматографию (SEC), тест на динамическое светорассеяние (DLS), дифференциальную сканирующую калориметрию (ДСК), количественное определение изо-asp, активность, УФ при 350 нм, УФ-спектроскопию и FTIR. SEC (J. Pharm. Scien., 83:1645-1650, (1994); Pharm. Res., 11:485 (1994); J. Pharm. Bio. Anal., 15:1928 (1997); J. Pharm. Bio. Anal., 14:1133-1140 (1986)) измеряет процент мономера в продукте и дает информацию о количестве растворимых агрегатов. ДСК (Pharm. Res., 15:200 (1998); Pharm. Res., 9:109 (1982)) дает информацию о температуре денатурации белка и температуре стеклования. DLS (American Lab., November (1991)) измеряет средний коэффициент диффузии и дает информацию о количестве растворимых и нерастворимых агрегатов. УФ при 340 нм измеряет интенсивность рассеянного света при 340 нм и дает информацию о количестве растворимых и нерастворимых агрегатов. УФ-спектроскопия измеряет оптическую плотность при 278 нм и дает информацию о концентрации белка. FTIR (Eur. J. Pharm. Biopharm., 45: 231 (1998); Pharm. Res., 12: 1250 (1995); J. Pharm. Scien., 85: 1290 (1996); J. Pharm. Scien. , 87: 1069 (1998)) измеряет ИК-спектр в амидной области и дает информацию о вторичной структуре белка.

Содержание изо-asp в образцах измеряют, применяя систему обнаружения изоаспартата Isoquant (Promega). В наборе применяют фермент белковую изоаспартил метилтрасферазу (PIMT) для специфического обнаружения присутствия остатков изоаспарагиновой кислоты в целевом белке. PIMT катализирует перенос метильной группы от S-аденозил-L-метионина к изоаспарагиновой кислоте в α-карбоксильном положении, образуя в процессе S-аденозил-L-гомоцистеин (SAH). Она представляет собой относительно небольшую молекулу, и ее обычно можно выделить и количественно оценить с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ, применяя SAH HPLC стандарты, поставляемых в наборе.

Эффективность или биоидентичность антитела можно измерить по его способности связываться с его антигеном. Специфическое связывание антитела с его антигеном может быть определено количественно любым способом, известным специалистам в данной области техники, например, иммуноанализом, таким как ELISA (иммуноферментный анализ).

Анти-LAG3 антитела

CDR аминокислотные остатки являются высоко вариабельными между различными антителами и могут происходить из последовательностей зародышевой линии человека (в случае полностью человеческих антител) или из последовательностей зародышевой линии, не относящейся к человеку (например, грызунов). Каркасные области также могут значительно отличаться от антитела к антителу. Константные области будут различаться в зависимости от того, имеет ли выбранное антитело легкую цепь лямбда (λ) или каппа (κ), и в зависимости от класса (или изотипа) антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) и подкласса (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4).

Приведенные ниже примеры LAG3 антител имеют последовательности CDR, полученные из последовательностей зародышевой линии, не относящейся к человеку (в данном случае мыши), или последовательностей зародышевой линии человека. Последовательности зародышевой линии включают репертуар последовательностей, из которых получают последовательности CDR антитела, помимо изменений, происходящих от соматической гипермутации, и, как следствие, можно ожидать, что CDR, полученные, начиная с зародышевой линии мыши, будут систематически отличаться от CDR, полученных из зародышевой линии человека. Применение последовательностей зародышевой линии человека часто оправдывается тем, что последовательности CDR из зародышевых линий человека будут менее иммуногенными для человека, чем последовательности, полученные из других видов, что отражает лежащее в основе убеждение, что CDR будут систематически различаться в зависимости от их видового происхождения. Хотя увеличение разнообразия CDR увеличивает вероятность обнаружения антитела с желаемыми свойствами, такими как высокое сродство, оно еще больше усугубляет трудности в разработке стабильного состава в растворе полученного антитела.

Даже антитела, которые связываются с одним и тем же антигеном, могут резко отличаться по последовательности, и необязательно являются более близкими по последовательности, чем антитела, к полностью отдельным антигенам. Основываясь на низком сходстве последовательностей, нельзя предполагать, что химические свойства антител и, следовательно, их склонность к деградации схожи, несмотря на их общую мишень.

Как обсуждается выше, антитела представляют собой большие, очень сложные полипептидные комплексы, подверженные различным формам разложения и нестабильности в растворе. Разнообразие последовательности и, следовательно, структуры антитела обусловливает широкий спектр химических свойств. Помимо очевидных специфических по последовательности различий в специфичности связывания антигена, антитела проявляют различную чувствительность к различным путям деградации, агрегации и преципитации. Боковые цепи аминокислот различаются по наличию или отсутствию реакционноспособных групп, таких как карбокси- (D, E), амино- (K), амид- (N, Q), гидрокси- (S, T, Y), сульфгидрил- (C), тиоэфир- (M) группы, а также потенциально химически реакционноспособных сайтов в остатках гистидина, фенилаланина и пролина. Боковые цепи аминокислот, непосредственно участвующие во взаимодействиях по связыванию антигена, являются очевидными кандидатами на инактивацию путем модификации боковой цепи, но деградация в других положениях также может влиять на такие факторы, как стерическая ориентация CDR (например, изменения каркасных остатков), эффекторная функция (например, изменения Fc область - смотри, например, Liu et al. (2008) Biochemistry 47:5088) или самоассоциация/агрегация.

Антитела подвержены любому количеству потенциальных путей деградации. Окисление остатков метионина в антителах, особенно в CDR, может быть проблемой, если оно нарушает связывание антигена. Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116: 731; Lam et al. (1997) J. Pharm. Sci. 86:1250. Другие потенциальные пути деградации включают дезамидирование аспарагина (Harris et al. (2001) Chromatogr., B 752:233; Vlasak et al. (2009) Anal. Biochem. 392:145) окисление триптофана (Wei et al. (2007) Anal. Chem. 79:2797), цистеинилирование (Banks et al. (2008) J. Pharm. Sci. 97:775), гликацию (Brady et al. (2007) Anal. Chem. 79:9403), образование пироглютамата (Yu et al. (2006) J. Pharm. Biomed. Anal. 42:455), дисульфидную перестановку (Liu et al. (2008) J. Biol. Chem. 283:29266) и гидролиз (Davagnino et al. (1995) J. Immunol. Methods 185:177). Обсуждают в Ionescu & Vlasak (2010) Anal. Chem. 82:3198. Смотри также Liu et al. (2008) J. Pharm. Sci. 97:2426. Некоторые потенциальные пути деградации зависят не только от наличия определенного аминокислотного остатка, но и от окружающей последовательности. Дезамидирование и образование изоаспартата могут возникать в результате спонтанной внутримолекулярной перестройки пептидной связи после (C-концевых к) N или D остатков, причем последовательности N-G и D-G являются особенно чувствительными Reissner & Aswad (2003) CMLS Cell. Mol. Life Sci. 60:1281.

Антитела также подвержены зависимой от последовательности неферментативной фрагментации во время хранения. lasak & Ionescu (2011) mAbs 3:253. Присутствие реакционноспособных боковых цепей, таких как D, G, S, T, C или N, может привести к реакциям внутримолекулярного расщепления, которые разрывают основную цепь полипептида. Данные реакции гидролиза, специфичные для последовательности, обычно зависят от pH, там же. Антитела также может подвергаться агрегации, зависящей от последовательности, например, когда CDR содержат большое количество гидрофобных остатков. Perchiacca et al. (2012) Prot. Eng. Des. Selection 25:591. Агрегация особенно проблематична для антител, которые необходимо формулировать при высоких концентрациях для подкожного введения, и даже приводит к тому, что некоторые модифицируют последовательность антитела добавлением заряженных остатков для повышения растворимости, там же.

Отражая разнообразие потенциальных проблем со стабильностью, специфической по последовательностям, антител, потенциальные составы антител также разнообразны. Вариабельность последовательности антитела приводит к химической гетерогенности получаемого антитела, что приводит к широкому спектру потенциальных путей деградации. Составы могут варьироваться, например, по концентрации антитела, буферу, pH, наличию или отсутствию поверхностно-активного соединения, наличию или отсутствию тонических агентов (ионных или неионных), наличию или отсутствие агента для фазового исключения. Коммерчески доступные терапевтические антитела продаются в широком диапазоне составов в растворе, в фосфатном буфере (например, адалимумаб), фосфатном/глициновом буфере (например, базиликсумаб), трис-буфере (например, ипилимумаб), гистидиновом буфере (например, устекинумаб), цитрате натрия (например, ритуксимаб); и от pH 4,7 (например, цертолизумаб) и pH 5,2 (например, адалимумаб) до pH 7,0-7,4 (например, цетуксимаб). Они также доступны в составах, необязательно содержащих эдетат динатрия (например, алемтузумаб), маннит (например, ипилимумаб), сорбит (например, голимумаб), сахарозу (например, устекинумаб), хлорид натрия (например, ритуксимаб), хлорид калия (например, алемтузумаб), трегалозу (например, ранибизумаб); все с полисорбатом-80 и без него, в диапазоне от 0,001% (например, абциксмаб) до 0,1% (например, адалимумаб).

Биологическая активность гуманизированных анти-LAG3 и анти-PD-1 антител

Составы настоящего изобретения содержит анти-LAG3 антитела и их фрагменты и анти-PD-1 антитела и их фрагменты, которые являются биологически активными при растворении или в жидком составе.

Примеры анти-LAG3 антител представлены ниже (описаны в WO 2016/028672, включенном в настоящее изобретение с помощью ссылки во всей своей полноте):

Ab1: легкая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO:35); и

тяжелая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNNGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(SEQ ID NO:36); или

вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность: DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO:37 (CDR подчеркнуты)); и

вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNNGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSS

(SEQ ID NO:38 (CDR подчеркнуты));

Или содержащий CDR:

CDR-L1: KASQSLDYEGDSDMN (SEQ ID NO:39);

CDR-L2: GASNLES (SEQ ID NO:40);

CDR-L3: QQSTEDPRT (SEQ ID NO:41);

CDR-H1: DYNVD (SEQ ID NO:42);

CDR-H2: DINPNNGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO:43); и

CDR-H3: NYRWFGAMDH (SEQ ID NO:44)

Ab2: легкая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO:35); и

тяжелая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNSGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(SEQ ID NO:45); или

вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность:

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO:37 (CDR подчеркнуты)); и

вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNSGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSS

(SEQ ID NO:46 (CDR подчеркнуты));

или содержащий CDR:

CDR-L1: KASQSLDYEGDSDMN (SEQ ID NO:39);

CDR-L2: GASNLES (SEQ ID NO:40);

CDR-L3: QQSTEDPRT (SEQ ID NO:41);

CDR-H1: DYNVD (SEQ ID NO:42);

CDR-H2: DINPNSGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO:47); и

CDR-H3: NYRWFGAMDH (SEQ ID NO:44)

Ab3: легкая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO:35)

тяжелая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNDGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(SEQ ID NO:48); или

вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность: DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO:37 (CDR подчеркнуты)); и

вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNDGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSS

(SEQ ID NO:49 (CDR подчеркнуты))

; или содержащий CDR:

CDR-L1: KASQSLDYEGDSDMN (SEQ ID NO:39);

CDR-L2: GASNLES (SEQ ID NO:40);

CDR-L3: QQSTEDPRT (SEQ ID NO:41);

CDR-H1: DYNVD (SEQ ID NO:42);

CDR-H2: DINPNDGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO:50); и

CDR-H3: NYRWFGAMDH (SEQ ID NO:44)

Ab4: легкая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO:35); и

тяжелая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNQGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(SEQ ID NO:51); или

вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность: DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO:37 (CDR подчеркнуты)); и

вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNQGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSS

(SEQ ID NO:52 (CDR подчеркнуты));

или содержащий CDR:

CDR-L1: KASQSLDYEGDSDMN (SEQ ID NO:39);

CDR-L2: GASNLES (SEQ ID NO:40);

CDR-L3: QQSTEDPRT (SEQ ID NO:41);

CDR-H1: DYNVD (SEQ ID NO:42);

CDR-H2: DINPNQGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO:53); и

CDR-H3: NYRWFGAMDH (SEQ ID NO:44)

Ab5: легкая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO:35); и

тяжелая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNNGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO:54); или

вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность: DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO:37 (CDR подчеркнуты)); и

вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNNGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSS

(SEQ ID NO:55 (CDR подчеркнуты));

или содержащий CDR:

CDR-L1: KASQSLDYEGDSDMN (SEQ ID NO:39);

CDR-L2: GASNLES (SEQ ID NO:40);

CDR-L3: QQSTEDPRT (SEQ ID NO:41);

CDR-H1: DYNVD (SEQ ID NO:42);

CDR-H2: DINPNNGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO:56); и

CDR-H3: NYRWFGAMDH (SEQ ID NO:44)

Ab6: легкая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO:35); и

тяжелая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNDGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO:57); или

вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность: DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO:37 (CDR подчеркнуты)); и

вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNDGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSS

(SEQ ID NO:58 (CDR подчеркнуты));

или содержащий CDR:

CDR-L1: KASQSLDYEGDSDMN (SEQ ID NO:39);

CDR-L2: GASNLES (SEQ ID NO:40);

CDR-L3: QQSTEDPRT (SEQ ID NO:41);

CDR-H1: DYNVD (SEQ ID NO:42);

CDR-H2: DINPNDGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO:59); и

CDR-H3: NYRWFGAMDH (SEQ ID NO:44)

Ab7: легкая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO:35); и

тяжелая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNSGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO:60); или

вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность: DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO:37 (CDR подчеркнуты)); и

вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNSGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSS

(SEQ ID NO:61 (CDR подчеркнуты));

или содержащий CDR:

CDR-L1: KASQSLDYEGDSDMN (SEQ ID NO:39);

CDR-L2: GASNLES (SEQ ID NO:40);

CDR-L3: QQSTEDPRT (SEQ ID NO:41);

CDR-H1: DYNVD (SEQ ID NO:42);

CDR-H2: DINPNSGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO:62); и

CDR-H3: NYRWFGAMDH (SEQ ID NO:44)

Ab8: легкая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO:35); и

тяжелая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNQGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO:63); или

вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность: DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO:37 (CDR подчеркнуты)); и

вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNQGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSS

(SEQ ID NO:64 (CDR подчеркнуты));

или содержащий CDR:

CDR-L1: KASQSLDYEGDSDMN (SEQ ID NO:39);

CDR-L2: GASNLES (SEQ ID NO:40);

CDR-L3: QQSTEDPRT (SEQ ID NO:41);

CDR-H1: DYNVD (SEQ ID NO:42);

CDR-H2: DINPNQGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO:65); и

CDR-H3: NYRWFGAMDH (SEQ ID NO:44)

Ab9: легкая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

(SEQ ID NO:35); и

тяжелая цепь иммуноглобулина, содержащая аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNGGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

(SEQ ID NO:66); или

вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность: DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKASQSLDYEGDSDMNWYLQKPGQPPQLLIYGASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCQQSTEDPRTFGGGTKVEIK

(SEQ ID NO:37 (CDR подчеркнуты)); и

вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина, содержащий аминокислотную последовательность:

QMQLVQSGPEVKKPGTSVKVSCKASGYTFTDYNVDWVRQARGQRLEWIGDINPNGGGTIYAQKFQERVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARNYRWFGAMDHWGQGTTVTVSS

(SEQ ID NO:67 (CDR подчеркнуты));

или содержащий CDR:

CDR-L1: KASQSLDYEGDSDMN (SEQ ID NO:39);

CDR-L2: GASNLES (SEQ ID NO:40);

CDR-L3: QQSTEDPRT (SEQ ID NO:41);

CDR-H1: DYNVD (SEQ ID NO:42);

CDR-H2: DINPNGGGTIYAQKFQE (SEQ ID NO:68); и

CDR-H3: NYRWFGAMDH (SEQ ID NO:44)

Как применяют в настоящем изобретении, “Ab6 вариант” обозначает моноклональное антитело, которое содержит последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, которые являются по существу идентичными последовательностям в Ab6 (как описано ниже и в WO2016028672, включенном с помощью ссылки во всей своей полноте), за исключением наличия трех, двух или одной консервативной аминокислотной замены в положениях, которые расположены за пределами CDR легкой цепи и шести, пяти, четырех, трех, двух или одной консервативной аминокислотной замены, которая расположена вне CDR тяжелой цепи, например, положения вариантов расположены в областях FR или константной области, и необязательно имеет делецию С-концевого остатка лизина тяжелой цепи. Другими словами, Ab6 и вариант Ab6 содержат идентичные последовательности CDR, но отличаются друг от друга из-за наличия консервативной аминокислотной замены не более чем в трех или шести других положениях в их полноразмерных последовательностях легкой и тяжелой цепи, соответственно. Вариант Ab6 по существу аналогичен Ab6 в отношении следующих свойств: аффинность связывания с человеческим LAG3 и способность блокировать связывание человеческого LAG3 с человеческим MHC класса II.

Настоящее изобретение относится к составам анти-LAG3 антител, которые содержит две идентичные легкие цепи с последовательностью SEQ ID NO:35 и две идентичные тяжелые цепи с последовательностью SEQ ID NO:36, 45, 48, 51, 54, 57, 60, 63 или 66. Настоящее изобретение также относится к составам анти-LAG3 антител, которые содержит две идентичные легкие цепи с последовательностью SEQ ID NO:35 и две идентичные тяжелые цепи с последовательностью SEQ ID NO:57.

Настоящее изобретение относится к составам анти-LAG3 антитела или антигенсвязывающего фрагмента, который содержит последовательность вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO:37 и последовательность вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO:38, 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 или 67. Настоящее изобретение также относится к составам анти-LAG3 антитела или антигенсвязывающего фрагмента, который содержит последовательность вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO:37 и последовательность вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO:58. Настоящее изобретение также относится к составам анти-LAG3 антитела или антигенсвязывающего фрагмента, содержащим последовательность вариабельного участка легкой цепи CDRL1 SEQ ID NO:39, CDRL2 последовательность SEQ ID NO:40 и CDRL3 последовательность SEQ ID NO:41, и последовательность вариабельного участка тяжелой цепи CDRH1 SEQ ID NO:42, CDRH2 последовательность SEQ ID NO:43, 47, 50, 53, 56, 59, 62, 65 или 68, и CDRH3 последовательность SEQ ID NO:44. Настоящее изобретение также относится к составам анти-LAG3 антитела или антигенсвязывающего фрагмента, содержащим последовательность вариабельного участка легкой цепи CDRL1 SEQ ID NO:39, CDRL2 последовательность SEQ ID NO:40 и CDRL3 последовательность SEQ ID NO:41, и последовательность вариабельного участка тяжелой цепи CDRH1 SEQ ID NO:42, CDRH2 последовательность SEQ ID NO:59 и CDRH3 последовательность SEQ ID NO:44.

Другие анти-LAG3 антитела, которые можно включать в состав, включают BMS-986016, описанное в WO2014008218; IMP731, и IMP701. Следовательно, настоящее изобретение относится к составам анти-LAG3 антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которые содержит последовательность вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO:69 и последовательность вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO:70. Настоящее изобретение также относится к составам анти-LAG3 антитела или антигенсвязывающего фрагмента, содержащим последовательность вариабельного участка легкой цепи CDRL1 SEQ ID NO:71, CDRL2 последовательность SEQ ID NO:72 и CDRL3 последовательность SEQ ID NO:73, и последовательность вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO:74, CDRH2 последовательность SEQ ID NO:75 и CDRH3 последовательность SEQ ID NO:76.

Состав дополнительно содержит анти-PD-1 антитело или антигенсвязывающий фрагмент, как приведено ниже в качестве примера.

Таблица 1. Примерные последовательности PD-1 антитела

Признак антитела Аминокислотная последовательность SEQ ID NO. Пембролизумаб легкая цепь CDR1 RASKGVSTSGYSYLH 1 CDR2 LASYLES 2 CDR3 QHSRDLPLT 3 Вариабельный участок EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIK 4 Легкая цепь EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASKGVSTSGYSYLHWYQQKPGQAPRLLIYLASYLESGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQHSRDLPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 5 Пембролизумаб тяжелая цепь CDR1 NYYMY 6 CDR2 GINPSNGGTNFNEKFKN 7 CDR3 RDYRFDMGFDY 8 Вариабельный участок QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSS 9 Тяжелая цепь QVQLVQSGVEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMYWVRQAPGQGLEWMGGINPSNGGTNFNEKFKNRVTLTTDSSTTTAYMELKSLQFDDTAVYYCARRDYRFDMGFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 10 Ниволумаб легкая цепь CDR1 RASQSVSSYLA 11 CDR2 DASNRAT 12 CDR3 QQSSNWPRT 13 Вариабельный участок EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIK 14 Легкая цепь EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 15 Ниволумаб тяжелая цепь CDR1 NSGMH 16 CDR2 VIWYDGSKRYYADSVKG 17 CDR3 NDDY 18 Вариабельный участок QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSS 19 Тяжелая цепь QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 20

Таблица 2. Дополнительные анти-PD-1 антитела и антигенсвязывающие фрагменты, пригодные в составах, способах и применениях настоящего изобретения.

A. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, содержащие CDR легкой и тяжелой цепи hPD-1,08A в WO2008/156712 (включенном в настоящее изобретение с помощью ссылки во всей своей полноте) CDRL1 SEQ ID NO:21 CDRL2 SEQ ID NO:22 CDRL3 SEQ ID NO:23 CDRH1 SEQ ID NO:24 CDRH2 SEQ ID NO:25 CDRH3 SEQ ID NO:26 C. Антитела и антигенсвязывающие фрагмент, содержащие зрелый вариабельный участок тяжелой цепи h109A и один из зрелых вариабельных участков легкой цепи K09A в WO 2008/156712 Тяжелая цепь VR SEQ ID NO:27 Легкая цепь VR SEQ ID NO:28 или SEQ ID NO:29 или SEQ ID NO:30 D. Антитела и антигенсвязывающие фрагменты, содержащие зрелую тяжелую цепь 409 и одну из зрелых легких цепей K09A в WO 2008/156712 Тяжелая цепь SEQ ID NO:31 Легкая цепь SEQ ID NO:32 или SEQ ID NO:33 или SEQ ID NO:34

Как применяют в настоящем изобретении, “вариант пембролизумаба” обозначает моноклональное антитело, которое содержит последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, которые практически идентичны последовательностям в пембролизумабе, за исключением наличия трех, двух или одной консервативных аминокислотных замен в положениях, которые расположены за пределами CDR легкой цепи, и шести, пяти, четырех, трех, двух или одной консервативных аминокислотных замен, которые расположены за пределами CDR тяжелой цепи, например, положения вариантов расположены в областях FR или константной области, и необязательно имеет делецию С-концевого остатка лизина тяжелой цепи. Другими словами, пембролизумаб и вариант пембролизумаба содержат идентичные последовательности CDR, но отличаются друг от друга из-за наличия консервативной аминокислотной замены не более чем в трех или шести других положениях в их полноразмерных последовательностях легкой и тяжелой цепи, соответственно. Вариант пембролизумаба по существу аналогичен пембролизумабу в отношении следующих свойств: аффинность связывания с PD-1 и способность блокировать связывание каждого из PD-L1 и PD-L2 с PD-1.

В другом аспекте настоящего изобретения, состав содержит анти-LAG3 антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий последовательность вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO:37 и последовательность вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO:58; и анти-PD-1 антитело или антигенсвязывающий фрагмент, содержащий последовательность вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO:4 и последовательность вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO:9. В другом варианте осуществления, состав содержит анти-LAG3 антитело, содержащее последовательность легкой цепи SEQ ID NO:35 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:57; и анти-PD-1 антитело, содержащее последовательность легкой цепи SEQ ID NO:5 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:10. Настоящее изобретение также относится к составам анти-LAG3 антител или их антигенсвязывающих фрагментов, содержащих последовательность легкой цепи CDRL1 SEQ ID NO:39, CDRL2 последовательность SEQ ID NO:40 и CDRL3 последовательность SEQ ID NO:41, и последовательность тяжелой цепи CDRH1 SEQ ID NO:42, CDRH2 последовательность SEQ ID NO:59, и CDRH3 последовательность SEQ ID NO:44; и анти-PD-1 антитела, содержащего последовательность легкой цепи CDRL1 SEQ ID NO:1, CDRL2 последовательность SEQ ID NO:2, и CDRL3 последовательность SEQ ID NO:3, и последовательность тяжелой цепи CDRH1 SEQ ID NO:6, CDRH2 последовательность SEQ ID NO:7, и CDRH3 последовательность SEQ ID NO:8. В некоторых составах настоящего изобретения, анти-LAG3 антитело представляет собой Ab6 или Ab6 вариант.

В следующем аспекте настоящего изобретения, составы содержат анти-LAG3 антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который содержит последовательность вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO:69 и последовательность вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO:70, и анти-PD-1 антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который содержит последовательность вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO:14 и последовательность вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO:19. Настоящее изобретение также относится к составам анти-LAG3 антитела или антигенсвязывающего фрагмента, содержащего последовательность вариабельного участка легкой цепи CDRL1 SEQ ID NO:71, CDRL2 последовательность SEQ ID NO:72, и CDRL3 последовательность SEQ ID NO:73, и последовательность вариабельного участка тяжелой цепи CDRH1 SEQ ID NO:74, CDRH2 последовательность SEQ ID NO:75 и CDRH3 последовательность SEQ ID NO:76, и анти-PD-1 антитела или антигенсвязывающего фрагмента, содержащего последовательность вариабельного участка легкой цепи CDRL1 SEQ ID NO:11, CDRL2 последовательность SEQ ID NO:12, и CDRL3 последовательность SEQ ID NO:13, и последовательность вариабельного участка тяжелой цепи CDRH1 SEQ ID NO:16, CDRH2 последовательность SEQ ID NO:17, и CDRH3 последовательность SEQ ID NO:18.

Антитело или антигенсвязывающие фрагменты состава могут содержать вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления, вариабельный участок легкой цепи содержит SEQ ID NO:4 или вариант SEQ ID NO:4, и вариабельный участок тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:9 или вариант SEQ ID NO:9. В следующих вариантах осуществления, вариабельный участок легкой цепи содержит SEQ ID NO:14 или вариант SEQ ID NO:14, и вариабельный участок тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:19 или вариант SEQ ID NO:19. В следующих вариантах осуществления, вариабельный участок тяжелой цепи содержит SEQ ID NO:27 или вариант SEQ ID NO:27 и вариабельный участок легкой цепи содержит SEQ ID NO:28 или вариант SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 или вариант SEQ ID NO:29, или SEQ ID NO:30 или вариант SEQ ID NO:30. В данных вариантах осуществления, последовательность вариабельного участка легкой цепи или тяжелой цепи варианта является идентичной контрольной последовательности, за исключением одной, двух, трех, четырех или пяти аминокислотных замен. В некоторых вариантах осуществления замены находятся в каркасной области (т.е., вне CDR). В некоторых вариантах осуществления одна, две, три, четыре или пять аминокислотных замен являются консервативными.

В другом варианте осуществления, составы настоящего изобретения содержат антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который содержит V_Lдомен и/или V_H домен, по меньшей мере, с 95%, 90%, 85%, 80%, 75% или 50% гомологией по последовательности с одним из VL доменов или VH доменов, описанных выше, и проявляет специфическое связывание с PD-1 или LAG3. В другом варианте осуществления, антитело или антигенсвязывающий фрагмент составов настоящего изобретения содержит V_L- и V_H домены, содержащие вплоть до 1, 2, 3, 4 или 5 или более аминокислотных замен, и проявляет специфическое связывание с PD-1 или LAG3.

В вариантах осуществления настоящего изобретения, антитело представляет собой анти-PD-1 антитело, содержащее легкую цепь, содержащую или состоящая из аминокислотной последовательности, как приведено в SEQ ID NO:5, и тяжелую цепь, содержащую или состоящая из аминокислотной последовательности, как приведено в SEQ ID NO:10. В альтернативных вариантах осуществления, антитело представляет собой анти-PD-1 антитело, содержащее легкую цепь, содержащую или состоящая из аминокислотной последовательности, как приведено в SEQ ID NO:15, и тяжелую цепь, содержащую или состоящая из аминокислотной последовательности, как приведено в SEQ ID NO:20. В следующих вариантах осуществления, антитело представляет собой анти-PD-1 антитело, содержащее легкую цепь, содержащую или состоящая из аминокислотной последовательности, как приведено в SEQ ID NO:32, и тяжелую цепь, содержащую или состоящая из аминокислотной последовательности, как приведено в SEQ ID NO:31. В дополнительных вариантах осуществления, антитело представляет собой анти-PD-1 антитело, содержащее легкую цепь, содержащую или состоящая из аминокислотной последовательности, как приведено в SEQ ID NO:33, и тяжелую цепь, содержащую или состоящая из аминокислотной последовательности, как приведено в SEQ ID NO:31. В еще дополнительных вариантах осуществления, антитело представляет собой анти-PD-1 антитело содержащее легкую цепь, содержащую или состоящая из аминокислотной последовательности, как приведено в SEQ ID NO:34, и тяжелую цепь, содержащую или состоящая из аминокислотной последовательности, как приведено в SEQ ID NO:31. В некоторых составах настоящего изобретения, анти-PD-1 антитело представляет собой пембролизумаб или вариант пембролизумаба.

Обычно, варианты аминокислотной последовательности анти-PD-1 или анти-LAG3 антитела и антигенсвязывающих фрагментов настоящего изобретения будет содержать аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 75% идентичность по аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью эталонного антитела или антигенсвязывающего фрагмента (например, тяжелая цепь, легкая цепь, V_H, V_L, каркас или гуманизировання последовательность), более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, более предпочтительно, по меньшей мере, 85%, более предпочтительно, по меньшей мере, 90%, и самое предпочтительное, по меньшей мере, 95, 98 или 99%. Идентичность или гомология в отношении последовательности определяют в настоящем изобретении как процент аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые идентичны остаткам анти-PD-1 или анти-LAG3, после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если необходимо, для достижения максимального процента идентичности по последовательности, и без учета консервативных замен как части идентичности по последовательности. Ни одно из N-концевых, C-концевых или внутренних удлинений, делеций или вставок в последовательность антитела не должно рассматриваться как влияющее на идентичность или гомологию последовательности.

В одном варианте осуществления, отношение анти-LAG3 антитела к анти-PD-1 антителу в составе составляет 1:1, 1:2 или 1:3. В другом варианте осуществления, молярное отношение анти-LAG3 антитела к анти-PD-1 антителу в составе составляет 1:1, 2:1, 3:1, 3,5:1, 4:1, 5:1 или 6:1. В одном варианте осуществления, молярное отношение анти-LAG3 антитела к анти-PD-1 антителу в составе составляет 4:1. В другом варианте осуществления, молярное отношение анти-LAG3 антитела к анти-PD-1 антителу в составе составляет 5:1.

Составы

В некоторых аспектах настоящего изобретения, составы настоящего изобретения сводят к минимуму образование агрегатов антител (высокомолекулярные соединения) и частиц, увеличивают коллоидную стабильность, снижают до минимума фрагментацию (низкомолекулярные соединения), или обеспечивают то, чтобы антитело сохраняло его биологическую активность с течением времени. В одном аспекте, состав содержит: приблизительно 3-300 мг/мл анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и приблизительно 3-300 мг/мл анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента при молярном соотношении 4:1-5:1 (анти-LAG3 антитело к анти-PD-1 антителу, или их антигенсвязывающие фрагменты), одно или более из вспомогательных веществ, выбранных из группы, состоящей из гистидина, аспартата, глютамина, глицина, пролина, метионина, аргинина или их фармацевтически приемлемой соли, NaCl, KCl, LiCl, CaCl₂, MgCl₂, ZnCl₂ и FeCl₂, при суммарной концентрации вспомогательных веществ приблизительно 10-1000 мМ, и буфер при pH приблизительно 5-8. В одном варианте осуществления, анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеют молярное отношение 4:1 (анти-LAG3 антитело к анти-PD-1 антителу, или их антигенсвязывающие фрагменты). В другом варианте осуществления, анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеют молярное отношение 5:1 (анти-LAG3 антитело к анти-PD-1 антителу, или их антигенсвязывающие фрагменты). В другом аспекте, состав содержит: приблизительно 4-200 мг/мл анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и приблизительно 4-200 мг/мл анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В одном варианте осуществления, один или более вспомогательных веществ, выбранные из группы, состоящей из гистидина, аспартата, глютамина, глицина, пролина, метионина, аргинина или их фармацевтически приемлемой соли, NaCl, KCl, LiCl, CaCl₂, MgCl₂, ZnCl₂ и FeCl₂, присутствуют при суммарной концентрации вспомогательных веществ приблизительно 25-250 мМ. В другом варианте осуществления, одно или более вспомогательных веществ, выбранных из группы, состоящей из гистидина, аспартата, глютамина, глицина, пролина, метионина, аргинина или их фармацевтически приемлемой соли, NaCl, KCl, LiCl, CaCl₂, MgCl₂, ZnCl₂ и FeCl₂, присутствуют при суммарной концентрации вспомогательных веществ приблизительно 40-250 мМ.

В одном аспекте, вспомогательное вещество представляет собой аргинин или его фармацевтически приемлемую соль при концентрации приблизительно 15-250 мМ. В одном аспекте, вспомогательное вещество представляет собой аргинин или его фармацевтически приемлемую соль при концентрации приблизительно 25-250 мМ. В другом варианте осуществления, вспомогательное вещество представляет собой аргинин или его фармацевтически приемлемую соль при концентрации приблизительно 40-150 мМ. В другом варианте осуществления, вспомогательное вещество представляет собой аргинин или его фармацевтически приемлемую соль при концентрации приблизительно 40-100 мМ. В другом варианте осуществления, вспомогательное вещество представляет собой L-аргинин или его фармацевтически приемлемую соль при концентрации приблизительно 70 мМ. В другом варианте осуществления, вспомогательное вещество представляет собой аргинин или его фармацевтически приемлемую соль при концентрации приблизительно 70-150 мМ. Примеры фармацевтически приемлемой соли аргинина (L или D формы) включают, но не ограничиваются, гидрохлорид L-аргинина и сукцинат L-аргинина. В других аспектах вариантов осуществления выше, состав дополнительно содержит неионное поверхностно-активное соединение, сахар или полиол, или глютамин, глицин, пролин или метионин.

В другом аспекте, вспомогательные вещества представляют собой NaCl и аргинин или его фармацевтически приемлемую соль с суммарной концентрацией вспомогательных веществ приблизительно 25-250 мМ. В следующем варианте осуществления, вспомогательные вещества представляет собой NaCl и аргинин или его фармацевтически приемлемую соль с суммарной концентрацией вспомогательных веществ приблизительно 70-100 мМ. В одном варианте осуществления, соотношение концентраций NaCl к аргинин составляет 1:1. В другом варианте осуществления, NaCl концентрация составляет приблизительно 35 мМ, и концентрация аргинина составляет приблизительно 35 мМ. В другом варианте осуществления, концентрация NaCl составляет приблизительно 50 мМ, и концентрация аргинина составляет приблизительно 50 мМ.

В следующем аспекте, вспомогательное вещество представляет собой NaCl, KCl или LiCl при приблизительно 40-150 мМ. В следующем варианте осуществления, вспомогательное вещество представляет собой NaCl, KCl или LiCl при приблизительно 40-100 мМ. В следующем варианте осуществления, вспомогательное вещество представляет собой NaCl, KCl или LiCl при приблизительно 70-130 мМ. В следующем варианте осуществления, вспомогательное вещество представляет собой NaCl, KCl или LiCl при приблизительно 70-100 мМ. В следующем варианте осуществления, вспомогательное вещество представляет собой NaCl при приблизительно 70 мМ. В других аспектах вариантов осуществления выше, состав дополнительно содержит неионное поверхностно-активное соединение.

В следующем аспекте, вспомогательное вещество представляет собой L-гистидин при приблизительно 25-200 мМ. В следующем варианте осуществления, L-гистидин присутствуют при приблизительно 50-200 мМ. В еще следующем варианте осуществления, L-гистидин присутствует при приблизительно 40-100 мМ.

В следующем аспекте, вспомогательное вещество представляет собой L-глютамин, L-глицин, L-пролин или L-метионин, или их комбинацию при приблизительно 25-200 мМ. В следующем варианте осуществления, вспомогательное вещество присутствуют при приблизительно 50-200 мМ. В еще следующем варианте осуществления, вспомогательное вещество присутствуют при приблизительно 40-100 мМ. В еще следующем варианте осуществления, вспомогательное вещество присутствуют при приблизительно 70 мМ.

В одном варианте осуществления, вспомогательное вещество представляет собой L-глютамин, L-глицин, L-аспартат, или их комбинацию при приблизительно 25-200 мМ. В другом варианте осуществления, вспомогательное вещество присутствуют при приблизительно 20-50 мМ. В следующем варианте осуществления, вспомогательное вещество присутствует при приблизительно 20 мМ. В еще следующем варианте осуществления, вспомогательное вещество присутствует при приблизительно 40-100 мМ. В еще следующем варианте осуществления, вспомогательное вещество присутствует при приблизительно 70 мМ. В другом варианте осуществления, вспомогательные вещества представляют собой приблизительно 20 мМ L-аспартат и приблизительно 50 мМ L-глицин. В другом варианте осуществления, the вспомогательные вещества представляют собой приблизительно 20 мМ L-глютамин и приблизительно 50 мМ L-глицин.

В одном варианте осуществления, совместно сформулированная композиция содержит буфер, имеющий нейтральный или слегка кислый pH (pH 4,5-8), и аргинин или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления, буфер pH приблизительно 5,5-6,5 применяют в композиции. В одном варианте осуществления, буфер pH приблизительно 4,5-6,5 применяют в композиции. В другом варианте осуществления, буфер pH приблизительно 5,5-6,0 применяют в композиции. В следующем варианте осуществления, буфер pH приблизительно 5,0-6,0 применяют в композиции. Буфер может иметь концентрацию приблизительно 5-1000 мМ. В другом варианте осуществления, буфер может иметь концентрацию приблизительно 5-150 мМ. В следующем варианте осуществления, буфер может иметь концентрацию приблизительно 5-300 мМ. В следующем варианте осуществления, буфер имеет концентрацию приблизительно 1-300 мМ. В другом варианте осуществления, буфер может иметь концентрацию приблизительно 1-30 мМ. В еще следующем варианте осуществления, буфер может иметь концентрацию 5-30 мМ. В еще следующем варианте осуществления, буфер может иметь концентрацию приблизительно 5-20 мМ. В еще следующем варианте осуществления, буфер может иметь концентрацию приблизительно 8-12 мМ. В одном варианте осуществления, буфер представляет собой гистидиновый, ацетатный или цитратный буфер. Предпочтительный буфер содержит приблизительно 10 мМ гистидина, ацетата или цитрата.

В одном варианте осуществления, состав содержит приблизительно 3-300 мг/мл анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и 3-300 мг/мл анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента при молярном соотношении 4:1-5:1 (анти-LAG3 антитело к анти-PD-1 антителу, или их антигенсвязывающие фрагменты), сахар или полиол; неионное поверхностно-активное соединение, гистидиновый буфер или ацетатный буфер при pH приблизительно 4,5-8, приблизительно 10-1000 мМ аргинина или его фармацевтически приемлемой соли и необязательно метионин (L или D форму), EDTA, DTPA, триптофан (L или D форму) или пиридоксин. В другом варианте осуществления, состав содержит приблизительно 4-250 мг/мл анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и приблизительно 4-250 мг/мл анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента при молярном соотношении 4:1-5:1 (анти-LAG3 антитело к анти-PD-1 антителу, или их антигенсвязывающие фрагменты), сахар или полиол; неионное поверхностно-активное соединение, приблизительно 50-500 мМ гистидиновый буфер при pH приблизительно 5-8, приблизительно 10-1000 мМ соль моновалентных катионов, выбранных из NaCl, KCl и LiCl или соль поливалентных катионов, выбранных из CaCl₂, MgCl₂, ZnCl₂, FeCl₂ и FeCl₃, необязательно приблизительно 10-1000 мМ аргинин или его фармацевтически приемлемую соль и необязательно метионин (D или L форму), EDTA, DTPA, триптофан и пиридоксин. В другом аспекте, состав содержит: приблизительно 4-200 мг/мл анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и приблизительно 4-200 мг/мл анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В одном варианте осуществления, анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеют молярное отношение 4:1 (анти-LAG3 антитело к анти-PD-1 антителу, или их антигенсвязывающие фрагменты). В другом варианте осуществления, анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент и анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеют молярное отношение 5:1 (анти-LAG3 антитело к анти-PD-1 антителу, или их антигенсвязывающие фрагменты).

Состав может содержать приблизительно 1-100 мкМ, приблизительно 1-30 мкМ, приблизительно 1-20 мкМ, приблизительно 10 мкМ-30 мкМ DTPA или EDTA. Состав может также содержать приблизительно 1-30 мМ L-метионин. В одном варианте осуществления, состав может также содержать приблизительно 1-20 мМ L-метионин. Состав может также содержать приблизительно 5-15 мМ L-метионин. Состав может также содержать приблизительно 5-15 мМ L-метионин. Состав может также содержать приблизительно 5-20 мМ L-метионин. Состав может также содержать приблизительно 10 мМ, или, по меньшей мере, приблизительно 10 мМ L-метионин. Иногда верхний слой азота (покрытие, например, только 5% или 10% остаточного O₂ при введении верхнего слоя азота) применяют на этапах получения и/или перед закрытием флакона, чтобы стабилизировать антитело против окисления.

В другом аспекте настоящего изобретения, состав дополнительно содержит сахар, полиол или неионное поверхностно-активное соединение, или их комбинацию. В одном варианте осуществления, сахар выбран из группы, состоящей из глюкозы, сахарозы, трегалозы и лактозы или их комбинации. В одном варианте осуществления, сахар представляет собой дисахарид, такой как сахароза, трегалоза и мальтоза. В одном варианте осуществления, сахар представляет собой невосстанавливающийся сахар. В другом варианте осуществления, сахар представляет собой невосстанавливающий дисахарид, такой как сахароза или трегалоза, или их комбинацию. В одном варианте осуществления, сахар присутствует при концентрации приблизительно 10-200 мг/мл. В другом варианте осуществления, сахар присутствует при концентрации приблизительно 30-120 мг/мл. В другом варианте осуществления, сахар присутствует при концентрации приблизительно 30-80 мг/мл. В следующем варианте осуществления, сахар присутствует при концентрации приблизительно 50-90 мг/мл.

В одном варианте осуществления, полиол выбран из группы, состоящей из маннита, сорбита, глицерина и полиэтиленгликоля. В другом варианте осуществления, полиол представляет собой сахарный спирт. В одном варианте осуществления, сахар и полиол выбраны из группы, состоящей из сахарозы, трегалозы, сорбита, глицерина и полиэтиленгликоля. В следующем варианте осуществления, полиол представляет собой гликоль. В одном варианте осуществления, гликоль выбран из группы, состоящей из этиленгликоля, пропиленгликоля и полиэтиленгликоля. В одном варианте осуществления, полиол присутствует при концентрации приблизительно 10-200 мг/мл. В другом варианте осуществления, полиол присутствует при концентрации приблизительно 10-50 мг/мл. В следующем варианте осуществления, полиол присутствует при концентрации приблизительно 5-30 мг/мл.

В одном варианте осуществления, состав содержит приблизительно 10-250 мг/мл сахарозы или трегалозы. В другом варианте осуществления, состав содержит приблизительно 20-200 мг/мл сахарозы или трегалозы. В следующем варианте осуществления, состав содержит приблизительно 50-80 мг/мл сахарозы или трегалозы. В следующем варианте осуществления, состав содержит приблизительно 30-80 мг/мл сахарозы или трегалозы. В другом варианте осуществления, состав содержит приблизительно 50-90 мг/мл сахарозы или трегалозы. В еще следующем варианте осуществления, состав содержит приблизительно 70-80 мг/мл сахарозы или трегалозы. В еще следующем варианте осуществления, состав содержит, по меньшей мере, приблизительно 50 мг/мл сахарозы или трегалозы. В другом варианте осуществления, состав содержит приблизительно 20-200 мг/мл сорбита, PEG400 или глицерина. В следующем варианте осуществления, состав содержит приблизительно 20-50 мг/мл сорбита, PEG400 или глицерина.

В одном варианте осуществления, неионное поверхностно-активное соединение выбрано из группы, состоящей из полисорбата и полоксамера. В еще другом варианте осуществления, поверхностно-активное соединение выбрано из группы, состоящей из Tween80® (полисорбат 80), Tween20® (полисорбат 20), PluronicF88®, Pluoronic F-127®, PluronicF68®, Triton X-100®. В предпочтительном варианте осуществления, поверхностно-активное соединение представляет собой полисорбат 20 или полисорбат 80, и сахар представляет собой сахарозу или трегалозу. Поверхностно-активное соединение полисорбат 80 или полисорбат 20 может присутствовать в составе в количестве от приблизительно 0,005 до приблизительно 1 мг/мл. Поверхностно-активное соединение полисорбат 80 или полисорбат 20 может присутствовать в составе в количестве от приблизительно 0,02 до приблизительно 2 мг/мл. Поверхностно-активное соединение полисорбат 80 или полисорбат 20 может присутствовать в составе в количестве от приблизительно 0,05 до приблизительно 1 мг/мл. Поверхностно-активное соединение полисорбат 80 или полисорбат 20 может присутствовать в составе в количестве от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5 мг/мл. В другом варианте осуществления, поверхностно-активное соединение полисорбат 80 или полисорбат 20 может присутствовать в составе в количестве от, по меньшей мере, приблизительно 0,005 мг/мл. Поверхностно-активное соединение полисорбат 80 или полисорбат 20 может также присутствовать в составе в количестве от, по меньшей мере, приблизительно 0,1 мг/мл. Поверхностно-активное соединение полисорбат 80 может присутствовать в составе в количестве от приблизительно 0,2 мг/мл.

В других аспектах составов выше, при 50 °C, % высокомолекулярных соединений (HMW) является меньшим чем 5% в совместно сформулированном составе анти-LAG3 антителе и анти-PD-1 антителе через 10 дней, как измерено эксклюзионной хроматографией.

Настоящее изобретение относится к следующим вариантам осуществления:

1. Состав, содержащий:

приблизительно 16-22 мг/мл анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; приблизительно 3-7 мг/мл анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; приблизительно 30-120 мг/мл невосстанавливающего дисахарида; приблизительно 0,02-2,0 мг/мл полисорбата 80 или полисорбата 20; буфер при pH приблизительно 4,5-6,5; и приблизительно 40-150 мМ L-аргинина или его фармацевтически приемлемой соли, где анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDRL1 SEQ ID NO:39, CDRL2 SEQ ID NO:40 и CDRL3 SEQ ID NO:41, и вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDRH1 SEQ ID NO:42, CDRH2 SEQ ID NO:59 и CDRH3 SEQ ID NO:44, и анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDRL1 SEQ ID NO:1, CDRL2 SEQ ID NO:2, и CDRL3 SEQ ID NO:3, и вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDRH1 SEQ ID NO:6, CDRH2 SEQ ID NO:7, и CDRH3 SEQ ID NO:8.

2. Состав варианта осуществления 1, содержащий приблизительно 18-22 мг/мл анти-LAG3 антитела; приблизительно 4-7 мг/мл анти-PD-1 антитела; приблизительно 50-90 мг/мл сахарозы или трегалозы; приблизительно 0,05-1,0 мг/мл полисорбата 80 или полисорбата 20; приблизительно 3-30 мМ гистидиновый буфер при pH приблизительно 5,0-6,5; и приблизительно 40-100 мМ L-аргинин или его фармацевтически приемлемую соль.

3. Состав варианта осуществления 1, содержащий приблизительно 18-20 мг/мл анти-LAG3 антитела; приблизительно 4-7 мг/мл анти-PD-1 антитела; приблизительно 50-60 мг/мл сахарозы или трегалозы; приблизительно 0,05-1,0 мг/мл полисорбата 80 или полисорбата 20; приблизительно 8-12 мМ гистидиновый буфер при pH приблизительно 5,0-6,5; и приблизительно 40-70 мМ L-аргинин или его фармацевтически приемлемую соль.

4. Состав любого из вариантов осуществления 1-3, дополнительно содержащий приблизительно 5-15 мМ L-метионин.

5. Состав любого из вариантов осуществления 1-3, дополнительно содержащий приблизительно 5-10 мМ L-метионин.

6. Состав варианта осуществления 1, содержащий приблизительно 18,75 мг/мл анти-LAG3 антитела; приблизительно 6,25 мг/мл анти-PD-1 антитела; приблизительно 55 мг/мл сахарозы; приблизительно 0,2 мг/мл полисорбата 80; приблизительно 10 мМ гистидиновый буфер при pH приблизительно 5,8; и приблизительно 52,5 мМ L-аргинин или его фармацевтически приемлемую соль; и дополнительно содержащий приблизительно 7,5 мМ L-метионин.

7. Состав варианта осуществления 1, содержащий приблизительно 20 мг/мл анти-LAG3 антитела; приблизительно 5 мг/мл анти-PD-1 антитела; приблизительно 54 мг/мл сахарозы; приблизительно 0,2 мг/мл полисорбата 80; приблизительно 10 мМ гистидиновый буфер при pH приблизительно 5,8; и приблизительно 56 мМ L-аргинин или его фармацевтически приемлемую соль; и дополнительно содержащий приблизительно 8 мМ L-метионин.

8. Состав варианта осуществления 1, содержащий приблизительно 20,83 мг/мл анти-LAG3 антитела; приблизительно 4,17 мг/мл анти-PD-1 антитела; приблизительно 53 мг/мл сахарозы; приблизительно 0,2 мг/мл полисорбата 80; приблизительно 10 мМ гистидиновый буфер при pH приблизительно 5,8; и приблизительно 58,3 мМ L-аргинин или его фармацевтически приемлемую соль; и дополнительно содержащий приблизительно 8,3 мМ L-метионин.

9. Состав варианта осуществления 1, содержащий приблизительно 18,02 мг/мл анти-LAG3 антитела; приблизительно 4,505 мг/мл анти-PD-1 антитела; приблизительно 50 мг/мл сахарозы; приблизительно 0,2 мг/мл полисорбата 80; приблизительно 10 мМ гистидиновый буфер при pH приблизительно 5,8; и приблизительно 70 мМ L-аргинин или его фармацевтически приемлемую соль; и дополнительно содержащий приблизительно 10 мМ L-метионин.

Следующие варианты осуществления также представляют собой аспекты настоящего изобретения:

1. Состав, содержащий: приблизительно 3-300 мг/мл анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и приблизительно 3-300 мг/мл анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента при молярном соотношении 4:1-5:1 (анти-LAG3 антитело к анти-PD-1 антителу, или их антигенсвязывающие фрагменты), один или более из вспомогательных веществ, выбранных из группы, состоящей из гистидина, аспартата, глютамина, глицина, пролина, метионина, аргинина или их фармацевтически приемлемой соли, NaCl, KCl, LiCl, CaCl₂, MgCl₂, ZnCl₂ и FeCl_2, при суммарной концентрации вспомогательных веществ приблизительно 10-1000 мМ, и буфер при pH приблизительно 4,5-8.

2. Состав варианта осуществления 1, содержащий: приблизительно 10-200 мг/мл анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDRL1 SEQ ID NO:39, CDRL2 SEQ ID NO:40, и CDRL3 SEQ ID NO:41, и вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDRH1 SEQ ID NO:42, CDRH2 SEQ ID NO:59 и CDRH3 SEQ ID NO:44, и приблизительно 4-200 мг/мл анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащего вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDRL1 SEQ ID NO:1, CDRL2 SEQ ID NO:2 и CDRL3 SEQ ID NO:3, и вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDRH1 SEQ ID NO:6, CDRH2 SEQ ID NO:7, и CDRH3 SEQ ID NO:8, один или более из вспомогательных веществ, выбранных из группы, состоящей из гистидина, аспартата, глютамина, глицина, пролина, метионина, аргинина или их фармацевтически приемлемой соли, NaCl, KCl, LiCl, CaCl₂, MgCl₂, ZnCl₂ и FeCl_2, при концентрации приблизительно 25-250 мМ, и буфер при pH приблизительно 5-8.

3. Состав варианта осуществления 1 или 2, где вспомогательное вещество представляет собой L-аргинин или его фармацевтически приемлемую соль при концентрации приблизительно 25-250 мМ.

4. Состав варианта осуществления 1 или 2, где вспомогательное вещество представляет собой L-аргинин или его фармацевтически приемлемую соль при концентрации приблизительно 40-100 мМ.

5. Состав варианта осуществления 1 или 2, где вспомогательные вещества представляют собой комбинацию NaCl и L-аргинина или его фармацевтически приемлемой соли с концентрацией приблизительно 25-250 мМ.

6. Состав варианта осуществления 5, где отношение концентрации NaCl к L-аргинину составляет 1:1.

7. Состав варианта осуществления 6, где концентрация NaCl составляет приблизительно 35 мМ, и концентрация L-аргинина составляет приблизительно 35 мМ.

8. Состав варианта осуществления 6, где концентрация NaCl составляет приблизительно 50 мМ, и концентрация L-аргинин составляет приблизительно 50 мМ.

9. Состав варианта осуществления 1 или 2, где e вспомогательные вещества представляют собой NaCl, KCl и/или LiCl при приблизительно 40-150 мМ.

10. Состав варианта осуществления 1 или 2, где вспомогательное вещество представляет собой L-гистидин при приблизительно 25-200 мМ.

11. Состав варианта осуществления 10, где L-гистидин присутствует при приблизительно 40-100 мМ.

12. Состав любого из вариантов осуществления 1-11, где буфер представляет собой L-гистидиновый, ацетатный или цитратный буфер.

13. Состав варианта осуществления 12, где буфер имеет концентрацию приблизительно 1-300 мМ.

14. Состав любого из вариантов осуществления 1-13, дополнительно содержащий сахар, полиол или неионное поверхностно-активное соединение, или их комбинацию.

15. Состав варианта осуществления 14, где сахар представляет собой невосстанавливающий дисахарид.

16. Состав варианта осуществления 15, где сахар представляет собой трегалозу или сахарозу, или их комбинацию.

17. Состав вариантов осуществления 15 или 16, где сахар присутствует при концентрации приблизительно 10-200 мг/мл.

18. Состав варианта осуществления 14, где полиол представляет собой сахарный спирт.

19. Состав варианта осуществления 14, где полиол выбран из группы, состоящей из маннита, сорбита, глицерина и полиэтиленгликоля.

20. Состав вариантов осуществления 18 или 19, где полиол присутствует при концентрации приблизительно 10-200 мг/мл.

21. Состав варианта осуществления 14, где неионное поверхностно-активное соединение выбрано из группы, состоящей из полисорбата и полоксамера.

22. Состав варианта осуществления 14, где неионное поверхностно-активное соединение выбрано из группы, состоящей из Tween80®, Tween20®, PluronicF88®, Pluoronic F-127®, PluronicF68® и Triton X-100®.

23. Состав варианта осуществления 14, где неионное поверхностно-активное соединение представляет собой полисорбат 80 или полисорбат 20.

24. Состав любого из вариантов осуществления 1-13, дополнительно содержащий поверхностно-активное соединение полисорбат 20 или полисорбат 80, и сахар сахарозу или трегалозу, или их комбинацию.

25. Состав любого из вариантов осуществления 1-11, дополнительно содержащий приблизительно 10-250 мг/мл сахарозы, трегалозы, маннита, сорбита, полиэтиленгликоля или глицерина; приблизительно 0,005-2,0 мг/мл полисорбата 80 или полисорбата 20; и приблизительно 3-300 мМ L-гистидиновый, ацетатный или цитратный буфер при pH приблизительно 5,0-6,5.

26. Состав любого из вариантов осуществления 1-11, дополнительно содержащий приблизительно 30-120 мг/мл сахарозы или трегалозы; приблизительно 0,05-1,5 мг/мл полисорбата 80 или полисорбата 20; приблизительно 3-150 мМ L-гистидиновый, ацетатный или цитратный буфер при pH приблизительно 5,0-6,5.

27. Состав любого из вариантов осуществления 1-11, дополнительно содержащий приблизительно 50-90 мг/мл сахарозы или трегалозы; приблизительно 0,05-1,0 мг/мл полисорбата 80; приблизительно 5-30 мМ L-гистидиновый, ацетатный или цитратный буфер при pH приблизительно 5,0-6,5.

28. Состав варианта осуществления 1 или 2, содержащий приблизительно 20-220 мг/мл анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; приблизительно 50-90 мг/мл сахарозы или трегалозы; приблизительно 0,05-1,0 мг/мл полисорбата 80 или полисорбата 20; приблизительно 5-20 мМ L-гистидиновый, ацетатный или цитратный буфер при pH приблизительно 5,0-6,5; и приблизительно 40-150 мМ L-аргинин или его фармацевтически приемлемую соль.

29. Состав варианта осуществления 1 или 2, содержащий приблизительно 20-220 мг/мл анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; приблизительно 20-200 мг/мл глицерина, сорбита или PEG400; приблизительно 0,05-1,0 мг/мл полисорбата 80 или полисорбата 20; приблизительно 3-150 мМ L-гистидиновый, ацетатный или цитратный буфер при pH приблизительно 5,0-6,5; и приблизительно 40-150 мМ L-аргинин или его фармацевтически приемлемую соль.

30. Состав варианта осуществления 1 или 2, содержащий приблизительно 20-220 мг/мл анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; приблизительно 40-150 мМ L-глютамина, L-глицина, L-пролина или L-метионина; приблизительно 0,05-1,0 мг/мл полисорбата 80 или полисорбата 20; приблизительно 3-150 мМ L-гистидиновый, ацетатный или цитратный буфер при pH приблизительно 5,0-6,5; и приблизительно 40-150 мМ L-аргинин или его фармацевтически приемлемую соль.

31. Состав варианта осуществления 1 или 2, содержащий приблизительно 20-220 мг/мл анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; приблизительно 0,05-1,0 мг/мл полисорбата 80 или полисорбата 20; приблизительно 3-150 мМ L-гистидиновый, ацетатный или цитратный буфер при pH приблизительно 5,0-6,5; и приблизительно 40-150 мМ NaCl или его фармацевтически приемлемую соль.

32. Состав любого из вариантов осуществления 1-31, дополнительно содержащий приблизительно 3-150 мМ L-метионин.

33. Состав любого из вариантов осуществления 1-31, дополнительно содержащий приблизительно 5-70 мМ L-метионин.

34. Состав варианта осуществления 1 или 2, содержащий приблизительно 25 мг/мл анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; приблизительно 50 мг/мл сахарозы; приблизительно 0,2 мг/мл полисорбата 80; приблизительно 10 мМ L-гистидиновый буфер при pH приблизительно 5,8; приблизительно 70 мМ L-аргинин или его фармацевтически приемлемую соль; и приблизительно 10 мМ L-метионин.

35. Состав варианта осуществления 1 или 2, содержащий: приблизительно 3-250 мг/мл анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, сахар, полиол, неионное поверхностно-активное соединение, гистидиновый или ацетатный буфер при pH приблизительно 5-8, и приблизительно 10-1000 мМ L-аргинин или его фармацевтически приемлемую соль.

36. Состав варианта осуществления 1 или 2, содержащий приблизительно 20 мг/мл анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; приблизительно 50 мг/мл сахарозы; приблизительно 0,2 мг/мл полисорбата 80; приблизительно 10 мМ L-гистидиновый буфер при pH приблизительно 5,8-6,0; и приблизительно 70 мМ L-аргинин или L-аргинин-HCl.

37. Состав, содержащий: приблизительно 10 мг/мл анти-LAG3 антитела или антигенсвязывающего фрагмента; приблизительно 10 мг/мл анти-PD-1 антитела или антигенсвязывающего фрагмента; приблизительно 50 мг/мл сахарозы; приблизительно 0,2 мг/мл полисорбата 80; приблизительно 10 мМ гистидиновый буфер при pH приблизительно 5,8; приблизительно 70 мМ L-аргинин или его фармацевтически приемлемой соли; и приблизительно 10 мМ L-метионин; где анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDRL1 SEQ ID NO:39, CDRL2 SEQ ID NO:40 и CDRL3 SEQ ID NO:41, и вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDRH1 SEQ ID NO:42, CDRH2 SEQ ID NO:59, и CDRH3 SEQ ID NO:44, и анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок легкой цепи, содержащий CDRL1 SEQ ID NO:1, CDRL2 SEQ ID NO:2 и CDRL3 SEQ ID NO:3, и вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий CDRH1 SEQ ID NO:6, CDRH2 SEQ ID NO:7 и CDRH3 SEQ ID NO:8.

38. Состав любого из вариантов осуществления 1-37, который представляет собой жидкий состав.

39. Состав любого из вариантов осуществления 1-37, который замораживают, по меньшей мере, ниже -70°C.

40. Состав любого из вариантов осуществления 1-37, который представляет собой восстановленный раствор из лиофилизированного состава.

41. Состав любого из вариантов осуществления 1-40, где при 50 °C, % высокомолекулярных соединений (HMW) составляет меньше чем 5% через 10 дней, как измерено эксклюзионной хроматографией.

42. Состав любого из вариантов осуществления 1-41, где при 5 °C, % мономера анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет ≥99,5% через 3 месяца, как измерено эксклюзионной хроматографией.

43. Состав любого из вариантов осуществления 1-41, где при 40 °C, % мономера анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет ≥98% через 3 месяца, как измерено эксклюзионной хроматографией.

44. Состав любого из вариантов осуществления 1-43, где при 5 °C, % кислых вариантов анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет меньше чем 15% через 3 месяца, как измерено ионообменной хроматографией, % кислых вариантов анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет меньше чем 20% через 3 месяца, как измерено ионообменной хроматографией.

45. Состав любого из вариантов осуществления 1-43, где при 25 °C/60% относительной влажности (RH), обратной, % кислого варианта анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет меньше чем 20% через 3 месяца, как измерено ионообменной хроматографией, % кислого варианта анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет меньше чем 25% через 3 месяца, как измерено ионообменной хроматографией.

46. Состав любого из вариантов осуществления 1-43, где при 40 °C/75% RH обратной, % кислого варианта анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет меньше чем 50% через 3 месяца, как измерено ионообменной хроматографией, % кислого варианта анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет меньше чем 53% через 3 месяца, как измерено ионообменной хроматографией.

47. Состав любого из вариантов осуществления 1-46, где анти-LAG3 антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит: последовательность вариабельного участка легкой цепи SEQ ID NO:37 и последовательность вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID NO:58.

48. Состав любого из вариантов осуществления 1-46, где анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO:35 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:57.

49. Состав любого из вариантов осуществления 1-46, где анти-LAG3 Антитело представляет собой Ab6 или Ab6 вариант.

50. Состав варианта осуществления 47, где анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельный участок тяжелой цепи SEQ ID NO:9 и вариабельный участок легкой цепи SEQ ID NO:4.

51. Состав варианта осуществления 48, где анти-PD-1 антитело содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:10 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO:5.

52. Состав варианта осуществления 49, где анти-PD-1 антитело представляет собой пембролизумаб или вариант пембролизумаба.

Лиофилизированные составы

Лиофилизированные составы терапевтических белков обеспечивает несколько преимуществ. Лиофилизированные составы в целом обладают лучшей химической стабильностью, чем составы в растворе, и, таким образом, увеличивают срок хранения. Лиофилизированный состав можно также восстанавливать при различных концентрациях в зависимости от клинических факторов, таких как путь введения или дозирование. Например, лиофилизированный состав можно восстанавливать при высокой концентрации (т.е., в небольшом объеме), при необходимости, для подкожного введения, или при низкой концентрации при введении внутривенно. Высокие концентрации также могут быть необходимы, если для конкретного субъекта требуется высокая дозировка, особенно при подкожном введении, когда объем инъекции должен быть минимизирован. Подкожное введение лекарственных средств на основе антител дает возможность самостоятельного введения. Самостоятельное введение позволяет избежать затрат времени и средств, связанных с посещением медицинского учреждения для введения, например, внутривенно. Подкожное введение ограничено объемом раствора, который может быть практически доставлен в место инъекции за одну инъекцию, который обычно составляет приблизительно 1-1,5 мл. Данное ограничение часто требует раствора относительно высокой концентрации для доставки требуемого количества лекарственного средства. Подкожное самостоятельное введение обычно осуществляют, применяя предварительно заполненный шприц или автоинжектор, заполненного жидким раствором состава лекарственного средства, а не лиофилизированной формой, чтобы пациенту не приходилось повторно суспендировать лекарственное средство перед инъекцией.

Обычно лиофилизированный состав получают перед восстановлением при высокой концентрации лекарственного продукта (DP), т.е., перед восстановлением в объеме жидкости. Последующее разбавление водой или изотоническим буфером можно легко применять для разбавления DP до более низкой концентрации. Обычно вспомогательные вещества включают в лиофилизированный состав настоящего изобретения в количествах, которые будут приводить к примерно изотоническому составу при восстановлении при высокой концентрации DP, например, для подкожного введения. Разведение в большем объеме воды для получения более низкой концентрации DP с необходимостью обязательно снизит тоничность восстановленного раствора, но данное снижение может иметь незначительное значение при неподкожном введении в виде смеси с изотоническим раствором (0,9% хлорида натрия, USP или 5% раствор декстрозы, USP). Если изотоничность желательна при более низкой концентрации DP, лиофилизированный порошок можно восстанавливать в стандартном небольшом объеме воды и затем дополнительно разбавить изотоническим разбавителем, таким как 0,9% хлорид натрия.

Лиофилизированные составы настоящего изобретения получают лиофилизацией (сублимационной сушкой) раствора для лиофилизации. Сублимационную сушку осуществляют замораживанием состава и последующей сублимацией воды при температуре, подходящей для первичной сушки. В данных условиях температура продукта ниже точки эвтектики или температуры разрушения состава. Обычно температура полки для первичной сушки будет находиться в диапазоне от примерно -30 до -25 ° C (при условии, что продукт остается замороженным во время первичной сушки) при подходящем давлении, обычно в диапазоне примерно от 50 до 250 мТорр. Состав, размер и тип контейнера, в котором находится образец (например, стеклянный флакон), и объем состава, который можно лиофилизировать, будет определять время, необходимое для сушки, которое может варьироваться от нескольких часов до нескольких дней (40-60 часов). Вторичную сушку можно проводить при приблизительно 0-40 ° C, в зависимости, прежде всего, от типа и размера контейнера и типа применяемого белка. Продолжительность вторичной сушки диктуется требуемым уровнем остаточной влажности в продукте и обычно занимает, по меньшей мере, приблизительно 5 часов. Обычно содержание влаги лиофилизированного состава составляет меньше чем приблизительно 5%, и предпочтительно менее приблизительно 3%. Давление может быть таким же, как и на этапе первичной сушки. Условия сублимационной сушки можно варьировать в зависимости от состава и размера флакона.

В некоторых случаях может быть желательно лиофилизировать белковый состав в контейнере, в котором должно быть выполнено растворение белка, чтобы избежать стадии переноса. Контейнер в данном случае может быть, например, флаконом объемом 3, 5, 10, 20, 50 или 100 мл.

Лиофилизированные составы настоящего изобретения восстанавливают перед введением. Белок можно восстанавливать при концентрации приблизительно 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 90 или приблизительно 100 мг/мл или больших концентрациях, таких как приблизительно 150 мг/мл, 200 мг/мл, 250 мг/мл, или 300 мг/мл и вплоть до приблизительно 500 мг/мл. В одном варианте осуществления, концентрация анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента после восстановления составляет приблизительно 4-7 мг/мл. В одном варианте осуществления, концентрация анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента после восстановления составляет приблизительно 3-7 мг/мл. В одном варианте осуществления, концентрация анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента после восстановления составляет приблизительно 4 мг/мл. В одном варианте осуществления, концентрация анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента после восстановления составляет приблизительно 5 мг/мл. В одном варианте осуществления, концентрация анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента после восстановления составляет приблизительно 6 мг/мл. В одном варианте осуществления, концентрация анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента после восстановления составляет приблизительно 18-22 мг/мл. В одном варианте осуществления, концентрация анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента после восстановления составляет приблизительно 20 мг/мл. В одном варианте осуществления, концентрация анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента после восстановления составляет приблизительно 16-22 мг/мл. В одном варианте осуществления, анти-PD-1 или концентрация анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента после восстановления составляет приблизительно 3-300 мг/мл. В одном варианте осуществления, концентрация анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента после восстановления составляет приблизительно 4-250 мг/мл. В одном варианте осуществления, концентрация анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента после восстановления составляет приблизительно 150-250 мг/мл. В одном варианте осуществления, концентрация анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента после восстановления составляет приблизительно 180-220 мг/мл. В одном варианте осуществления, концентрация анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента после восстановления составляет приблизительно 50-150 мг/мл. В одном варианте осуществления, концентрация анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента после восстановления составляет приблизительно 50 мг/мл. В одном варианте осуществления, концентрация анти-PD-1 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента или анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента после восстановления составляет приблизительно 25 мг/мл. Высокие концентрации белка являются особенно пригодными там, где предполагается подкожная доставка восстановленного состава. Однако для других способов введения, таких как внутривенное введение, могут быть желательны более низкие концентрации белка (например, приблизительно 5-25 мг/мл).

Восстановление обычно происходит при температуре примерно 25°C для обеспечения полной гидратации, хотя при желании можно применять другие температуры. Время, необходимое для восстановления, будет зависеть, например, от типа разбавителя, количества вспомогательного вещества (веществ) и белка. Примеры разбавителей включают стерильную воду, бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), pH-буферный раствор (например, фосфатно-солевой буферный раствор), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения, анти-LAG3 антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) и анти-PD-1 антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) формулируют совместно в виде лиофилизированного порошка для внутривенного введения. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, совместно сформулированный продукт представляет собой лиофилизированный порошок для подкожного введения. В некоторых вариантах осуществления, антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) обеспечивают при приблизительно 100-1200 мг/флакон, и восстанавливают стерильной водой для инъекции перед применением. В других вариантах осуществления, антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) обеспечивают при приблизительно 200 мг/флакон, и восстанавливают стерильной водой для инъекции перед применением. В одном варианте осуществления, целевой pH восстановленного состава составляет приблизительно 6,0. В различных вариантах осуществления, лиофилизированный состав настоящего изобретения обеспечивает восстановление анти-LAG3 антитела или анти-PD-1 антитела, или их антигенсвязывающих фрагментов до концентраций, таких как приблизительно 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 250 или более мг/мл. В других вариантах осуществления, концентрация анти-LAG3 антитела или анти-PD-1 антитела или их антигенсвязывающих фрагментов после восстановления составляет приблизительно 3-300, 10-300, 20-250, 150-250, 180-220, 20-200, 40-100 или 50-150 мг/мл. В других вариантах осуществления, концентрация анти-LAG3 антитела или анти-PD-1 антитела или их антигенсвязывающих фрагментов перед лиофилизацией составляет приблизительно 3-300, 10-300, 150-250, 180-220, 10-100, 10-50 или 25-50 мг/мл.

В других вариантах осуществления, лиофилизированный состав анти-LAG3 антитела или антигенсвязывающий фрагмент и анти-PD-1 антитела или антигенсвязывающего фрагмента определяют в пересчете на восстановленный раствор, полученный из лиофилизированного состава. Восстановленные растворы может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент при концентрациях приблизительно 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 80, 90 или 100 мг/мл или больших концентрациях, таких как 150 мг/мл, 200 мг/мл, 250 мг/мл или вплоть до приблизительно 300 мг/мл. В одном варианте осуществления, восстановленный состав может содержать приблизительно 3-300 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В другом варианте осуществления, восстановленный состав может содержать приблизительно 10-200 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В другом варианте осуществления восстановленный состав может содержать приблизительно 10-100 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В другом варианте осуществления, восстановленный состав может содержать приблизительно 10-60 или приблизительно 15-50 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В другом варианте осуществления, восстановленный состав может содержать приблизительно 10-25 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В предпочтительном варианте осуществления, восстановленный состав может содержать приблизительно 20-30 или 25 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.

Жидкий состав

Жидкий состав антител можно получить, применяя лекарственное вещество, которое находится, например, в водном фармацевтическом составе, и буфер, заменяя его на требуемый буфер на последней стадии процесса очистки. В данном варианте отсутствует стадия лиофилизации. Лекарственное вещество в конечном буфере концентрируют до требуемой концентрации. Вспомогательные вещества, такие как стабилизаторы и поверхностно-активные соединения, добавляют к лекарственному веществу и разбавляют, применяя соответствующий буфер, до конечной концентрации белка. Конечное сформулированное лекарственное вещество фильтруют, применяя фильтр 0,22 мкм и заполняют в окончательную емкость (например, стеклянные флаконы). Состав можно хранить во флаконе и доставляться через инъекционное устройство или сосуд.

В другом аспекте настоящего изобретения, для жидкого совместно сформулированного состава, содержащего анти-PD-1 антитело и анти-LAG3 антитело (или их антигенсвязывающие фрагменты), анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет концентрацию приблизительно 3-300 мг/мл. В другом варианте осуществления, анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет концентрацию приблизительно 4-250 мг/мл. В другом варианте осуществления, анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет концентрацию приблизительно 40-100 мг/мл. В следующем варианте осуществления, анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет концентрацию приблизительно 10-60 мг/мл. В следующем варианте осуществления, анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет концентрацию приблизительно 20-30 мг/мл. В следующем варианте осуществления, анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет концентрацию приблизительно 10-30 мг/мл. В следующем варианте осуществления, анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет концентрацию приблизительно 15-50 мг/мл. В другом варианте осуществления, анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент присутствует при концентрации приблизительно 10-100 мг/мл. В еще следующем варианте осуществления, анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент присутствует при концентрации приблизительно 20-30 или 25 мг/мл. В еще следующем варианте осуществления, анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент присутствует при концентрации приблизительно 16-22 мг/мл. В еще следующем варианте осуществления, анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент присутствует при концентрации приблизительно 18-22 мг/мл. В еще следующем варианте осуществления, анти-LAG3 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент присутствует при концентрации приблизительно 20 мг/мл.

В другом аспекте настоящего изобретения, анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в жидком составе имеет концентрацию приблизительно 3-300 мг/мл. В одном варианте осуществления, анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент присутствует при концентрации приблизительно 4-250 мг/мл. В другом варианте осуществления, анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент присутствует при концентрации приблизительно 40-100 мг/мл. В следующем варианте осуществления, анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент присутствует при концентрации приблизительно 10-60 мг/мл. В следующем варианте осуществления, анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент присутствует при концентрации приблизительно 20-30 мг/мл. В следующем варианте осуществления, анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент присутствует при концентрации приблизительно 10-30 мг/мл. В следующем варианте осуществления, анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент присутствует при концентрации приблизительно 15-50 мг/мл. В другом варианте осуществления, анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент присутствует при концентрации приблизительно 10-100 мг/мл. В другом варианте осуществления, анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент присутствует при концентрации приблизительно 20-30 или 25 мг/мл. В одном варианте осуществления, анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент присутствует при концентрации приблизительно 3-7 мг/мл. В одном варианте осуществления, анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент присутствует при концентрации приблизительно 4-7 мг/мл. В одном варианте осуществления, анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет концентрацию приблизительно 4 мг/мл. В одном варианте осуществления, анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет концентрацию приблизительно 5 мг/мл. В одном варианте осуществления, анти-PD-1 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет концентрацию приблизительно 6 мг/мл.

В одном варианте осуществления, жидкий состав содержит буфер при pH приблизительно 4,5-8, 5,0-6,5, 5,5-6,5, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1 или 6,2 и аргинин или его фармацевтически приемлемую соль. В одном варианте осуществления, жидкий состав содержит буфер при pH приблизительно 5-8. В одном варианте осуществления, жидкий состав содержит буфер при pH приблизительно 5,0-6,5. В одном варианте осуществления, жидкий состав содержит буфер при pH приблизительно 5,0-6,0. В других вариантах осуществления, буфер представляет собой гистидин. В другом варианте осуществления, буфер представляет собой цитрат или ацетат. В следующем варианте осуществления, жидкий состав содержит ацетатный буфер при pH приблизительно 5-8, 5,0-6,5, 5,5-6,5, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1 или 6,2 и аргинин или его фармацевтически приемлемую соль.

Жидкий состав антител настоящего изобретения является пригодным для парентерального введения, такого как внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное или подкожное введение; особенно подходит для подкожного введения.

Дозирование и введение

Токсичность следует учитывать при выборе правильной дозировки терапевтического агента, такого как гуманизированные анти-LAG3 или анти-PD-1 антитело (или их антигенсвязывающие фрагменты). Токсичность и терапевтическая эффективность композиций антител, вводимых отдельно или в комбинации с иммуносупрессивным агентом, можно определить стандартными фармацевтическими способами на культурах клеток или экспериментальных животных, например, для определения LD50 (доза, летальная для 50% популяции) и ED50 (доза, терапевтически эффективная для 50% популяции). Соотношение доз между токсическим и терапевтическим эффектами представляет собой терапевтический индекс и может быть выражено как отношение LD50 к ED50. Предпочтительными являются антитела с высокими терапевтическими индексами. Данные, полученные в результате данных анализов клеточных культур и исследований на животных, можно применять для определения диапазона доз для применения на человеке. Дозировка данных соединений находится предпочтительно в диапазоне циркулирующих концентраций, которые включают ED50 с небольшой токсичностью или без нее. Дозировка может варьироваться в данном диапазоне в зависимости от применяемой лекарственной формы и применяемого пути введения.

Подходящие пути введения могут, например, включать парентеральное введение, включая внутримышечные, внутрикожные, подкожные, интрамедуллярные инъекции, а также интратекальное, прямое внутрижелудочковое, внутривенное, внутрибрюшинное. Лекарственные средства можно вводить различными обычными способами, такими как внутрибрюшинное, парентеральное, внутриартериальное или внутривенное введение. Режимы введения, при которых объем раствора должен быть ограничен (например, подкожное введение), требуют, чтобы лиофилизированный состав обеспечивал восстановление при высокой концентрации.

Альтернативно, можно вводить антитело местным, а не системным способом, например, путем инъекции антитела непосредственно в патоген-индуцированное поражение, характеризующееся иммунопатологией, часто в виде депо состава или состава с замедленным высвобождением. Кроме того, можно вводить антитело в системе адресной доставки лекарственного средства, например, в липосоме, покрытой тканеспецифическим антителом, нацеливая, например, на патоген-индуцированное поражение, характеризующееся иммунопатологией. Липосомы будут нацелены и селективно захвачены пораженной тканью.

Выбор режима введения терапевтического средства зависит от нескольких факторов, включая скорость метаболизма в сыворотке или ткани молекулы, уровень симптомов, иммуногенность молекулы и доступность клеток-мишеней в биологической матрице. Предпочтительно, режим введения максимизирует количество терапевтического агента, доставляемого пациенту, в соответствии с приемлемым уровнем побочных эффектов. Соответственно, количество доставляемого биологического агента частично зависит от конкретной молекулы и тяжести состояния, которое лечат. Доступными являются инструкции по выбору подходящих доз антител, цитокинов и малых молекул. Смотри, например, Wawrzynczak (1996) Antibody Therapy, Bios Scientific Pub. Ltd, Oxfordshire, UK; Kresina (ed.) (1991) Monoclonal Antibodies, Cytokines and Arthritis, Marcel Dekker, New York, NY; Bach (ed.) (1993) Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases, Marcel Dekker, New York, NY; Baert et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:601-608; Milgrom et al. (1999) New Engl. J. Med. 341:1966-1973; Slamon et al. (2001) New Engl. J. Med. 344:783-792; Beniaminovitz et al. (2000) New Engl. J. Med. 342:613-619; Ghosh et al. (2003) New Engl. J. Med. 348:24-32; Lipsky et al. (2000) New Engl. J. Med. 343:1594-1602; Physicians' Desk Reference 2003 (Physicians' Desk Reference, 57th Ed); Medical Economics Company; ISBN: 1563634457; 57th edition (November 2002).

Определение подходящей дозы производится клиницистом, например, применяя параметры или факторы, известные или предполагаемые в данной области как влияющие на лечение или предполагаемые как влияющие на лечение. Подходящая дозировка («терапевтически эффективное количество») белка будет зависеть, например, от состояния, которое подлежит лечению, тяжести и течения состояния, от того, вводится ли белок в профилактических или терапевтических целях, от предыдущей терапии, от клинического анамнеза пациента и реакции на белок, типа применяемого белка и на усмотрение лечащего врача. Обычно доза начинается с количества, несколько меньшего, чем оптимальная доза, и после этого ее увеличивают небольшими приращениями до тех пор, пока не будет достигнут требуемый или оптимальный эффект относительно любых негативных побочных эффектов. Важные диагностические показатели включают степень симптомов, например, воспаления или уровни продуцируемых воспалительных цитокинов. Белок подходящим образом вводят пациенту однократно или многократно. Белок можно вводить отдельно или в сочетании с другими лекарственными средствами или терапиями.

Антитела или фрагменты антител можно обеспечивать непрерывной инфузией или дозами с интервалами, например, один день, 1-7 раз в неделю, одна неделю, две недели, три недели, ежемесячно, раз в два месяца и т.д. Предпочтительный протокол дозирования представляет собой протокол, включающий максимальную дозу или частоту приема, позволяющую избежать значительных нежелательных побочных эффектов.

В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические составы настоящего изобретения будут вводить внутривенным (IV) вливанием или инъекцией.

В других вариантах осуществления, фармацевтические составы настоящего изобретения будут вводить подкожным введением. Подкожное введение можно осуществлять инъекцией, применяя шприц или применяя другие устройств для инъекций (например, устройства Inject-easy®); шприц-ручки; или безыгольные устройства (например, MediJector и BioJector®).

Подкожное введение можно осуществлять инъекцией, применяя шприц, автоинжектор, шприц-ручку или безыгольного инъекционного устройства. Внутривенное введение можно проводить после разбавления состава подходящим коммерческим разбавителем, таким как физиологический раствор или 5% раствор декстрозы в воде.

Хотя составы в растворе с высокой концентрацией настоящего изобретения являются особенно выгодными для применений, требующих высокой концентрации антитела, нет причин, по которым составы нельзя применять при более низкой концентрации антитела в обстоятельствах, когда высокие концентрации антитела не требуются или нежелательны. Более низкие концентрации антитела могут быть пригодными при подкожном введении в низких дозах или в других режимах введения (например, внутривенное введение), когда объем, который может быть доставлен, существенно превышает 1 мл. Данные более низкие концентрации могут включать приблизительно 15, 10, 5, 2, 1 мг/мл или меньше.

Применения

Настоящее изобретение относится к лиофилизированным или жидким составам анти-LAG3 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и анти-PD-1 антитела или антигенсвязывающего фрагмента для применения в лечении рака и инфекции.

Специалисты в данной области поймут, что термин «рак» является названием заболеваний, при которых клетки организма становятся аномальными и бесконтрольно делятся. Рак, который можно лечить соединениями, композициями и способами настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются: сердце: саркома (ангиосаркома, фибросаркома, рабдомиосаркома, липосаркома), миксома, рабдомиома, фиброма, липома и тератома; легкие: бронхогенная карцинома (плоскоклеточная, недифференцированная мелкоклеточная, недифференцированная крупноклеточная, аденокарцинома), альвеолярная (бронхиолярная) карцинома, бронхиальная аденома, саркома, лимфома, хондроматозная гамартома, мезотелиома; желудочно-кишечный тракт: пищевод (плоскоклеточный рак, аденокарцинома, лейомиосаркома, лимфома), желудок (карцинома, лимфома, лейомиосаркома), поджелудочная железа (протоковая аденокарцинома, инсулинома, глюкагонома, гастринома, карциноидные опухоли, випома), тонкая кишка (аденокарцинома, лимфома, карциноидные опухоли, саркома Капоши, лейомиома, гемангиома, липома, нейрофиброма, фиброма; толстый кишечник (аденокарцинома, канальцевая аденома, ворсинчатая аденома, гамартома, лейомиома) колоректальный; мочеполовые пути: почки (аденокарцинома, опухоль Вильма [нефробластома], лимфома, лейкемия), мочевой пузырь и уретра (плоскоклеточная карцинома, переходно-клеточная карцинома, аденокарцинома), простата (аденокарцинома, саркома), яички (семинома, тератома, эмбриональная карцинома, тератокарцинома, хориокарцинома, саркома, интерстициально-клеточная карцинома, фиброма, фиброаденома, аденоматоидные опухоли, липома); печень: гепатома (гепатоцеллюлярная карцинома), холангиокарцинома, гепатобластома, ангиосаркома, гепатоцеллюлярная аденома, гемангиома; кость: остеогенная саркома (остеосаркома), фибросаркома, злокачественная фиброзная гистиоцитома, хондросаркома, саркома Юинга, злокачественная лимфома (ретикулум-клеточная саркома), множественная миелома, злокачественная гигантоклеточная хордома, остеохондрома (костно-хрящевые экзостозы), доброкачественная хондрома, хондробластома, хондромиксофиброма, остеоид-остеома и гигантоклеточные опухоли; нервная система: череп (остеома, гемангиома, гранулема, ксантома, деформирующий остит), мозговые оболочки (менингиома, менингиосаркома, глиоматоз), головной мозг (астроцитома, медуллобластома, глиома, эпендимома, герминома [пинеалома], мультиформная глиобластома, олигодендроглиома, шваннома, ретинобластома, врожденные опухоли), нейрофиброма спинного мозга, менингиома, глиома, саркома); гинекологические: матка (карцинома эндометрия), шейка матки (карцинома шейки матки, предопухолевая дисплазия шейки матки), яичники (карцинома яичников [серозная цистаденокарцинома, муцинозная цистаденокарцинома, неклассифицированная карцинома], гранулезно-текально-клеточные опухоли, опухоли клеток Сертоли-Лейдига, дисгерминома, злокачественная тератома, вульва (плоскоклеточная карцинома, интраэпителиальная карцинома, аденокарцинома, фибросаркома, меланома), влагалище (светлоклеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома, ботриоидная саркома (эмбриональная рабдомиосаркома), маточные трубы (карцинома), грудь; гематологические: кровь (миелолейкоз [острый и хронический], острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфолейкоз, миелопролиферативные заболевания, множественная миелома, миелодиспластический синдром), болезнь Ходжкина, неходжкинская лимфома [злокачественная лимфома]; кожа: злокачественная меланома, базальноклеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома, саркома Капоши, родинки диспластические невусы, липома, ангиома, дерматофиброма, келоиды, псориаз; и надпочечники: нейробластома. В одном варианте осуществления рак выбран из колоректального рака, рака желудка и рака головы и шеи.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: исследования условий для снижения самоассоциации анти-LAG3 антитела Ab6

Измерение параметра диффузионного взаимодействия (k_D)

B₂₂ в 10 мМ гистидине pH 5,6 оказался отрицательным, что указывает на присущую молекуле способность к самоассоциации. Было обнаружено, что присутствие 50 мМ хлорида натрия в 10 мМ гистидине pH 5,6 увеличивает параметр диффузионного взаимодействия (KD) или снижает самовзаимодействие, улучшает относительную растворимость и уменьшает мутность (OD350) анти-LAG3 антитела Ab6 (SEQ ID NO:35 и 57, легкая и тяжелая цепи), как видно на рисунке 12. Стабильность анти-LAG3 антитела в 10 мМ гистидине pH 5,6 исследовали в присутствии 40 мМ гидрохлорида L-аргинина, применяя параметр диффузионного взаимодействия (KD), мутность (OD350) и тест на относительную растворимость (% PEGmid-point).

Как видно на рисунке 13, было обнаружено, что самовзаимодействие и мутность резко снижаются, тогда как было обнаружено, что относительная растворимость анти-LAG3 антитела значительно увеличивается при добавлении 40 мМ гидрохлорида L-аргинина в 10 мМ гистидиновом буфере при pH 5,6. Исследование диапазона количеств гидрохлорида L-аргинина (40 мМ-100 мМ) с 50 мг/мл анти-LAG3 антитела проводили при pH 5,8 и при pH 6,0, при этом было обнаружено, что концентрация гидрохлорида L-аргинины 70 мМ (14,7 мг/мл) является эффективной в снижении самовзаимодействия и улучшении коллоидной стабильности (Фигура 13).

Было обнаружено, что анти-LAG3 антитело разделяется на фазы в буферах с низкой ионной силой (10 мМ). Чтобы оценить самоассоцирующие свойства, а также коллоидную, физическую, химическую, а также термическую стабильность анти-LAG3 антитела в присутствии трех различных заряженных частиц [L-аргинин, L-гистидин и хлорид натрия (NaCl)] при различных концентрациях (мМ), девять различных составов получали, как указано в таблице 3 ниже. Неформулированное анти-LAG3 (~ 37 мг/мл) в 10 мМ L-гистидине 70 мМ гидрохлориде L-аргинина pH 5,8 подвергали диализу относительно трех 10 мМ гистидиновых буферных растворов pH 5,8; причем каждый буферный раствор содержал 100 мМ L-аргинин, 100 мМ хлорид натрия или 100 мМ L-гистидин. Анти-LAG3 антитело формулировали при 25 мг/мл, применяя диализаты соответствующих составов. Составы, содержащие от 40 мМ до 130 мМ L-аргинина или хлорида натрия, получали разбавлением соответствующего исходного раствора анти-LAG3 антитела L-гистидиновым буфером при pH 5,8 и концентрируя анти-LAG3 антитело до 25 мг/мл.

Таблица 3 Высокопроизводительный скрининг предварительных составов анти-LAG3 антитела с заряженными соединениями (L-аргинин, L-гистидин и хлорид натрия) Состав# Концентрация вспомогательного вещества Описание состава 1 40 мМ L-Аргинин 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 40 мМ L-аргинин, pH 5,8 2 70 мМ L-Аргинин 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ L-аргинин, pH 5,8 3 100 мМ L-Аргинин 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 100 мМ L-аргинин, pH 5,8 4 40 мМ L-Гистидин 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 40 мМ L-гистидин, pH 5,8 5 70 мМ L-Гистидин 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ L-гистидин, pH 5,8 6 100 мМ L-Гистидин 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 100 мМ L-гистидин, pH 5,8 7 40 мМ Хлорид натрия 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 40 мМ хлорид натрия, pH 5,8 8 70 мМ Хлорид натрия 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ хлорид натрия, pH 5,8 9 100 мМ Хлорид натрия 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 100 мМ хлорид натрия, pH 5,8

Параметр диффузионного взаимодействия (k_D) девяти составов оценивали, применяя динамическое рассеяние света (DLS) при 20°C для пяти выборок. Параметр взаимодействия (kD) рассчитывали по наклону и y-пересечению графика записанных значений коэффициента диффузии (см²/с) в зависимости от серии разбавленных концентраций (мг/мл) соответствующих составов. Положительный параметр диффузионного взаимодействия (kD) указывает на отталкивающее взаимодействие. При увеличении концентрации (>40 мМ) L-аргинина, L-гистидина или хлорида натрия анти-LAG3 антитело показывает увеличение kD, что свидетельствует о снижении молекулярной самоассоциации (меньшее молекулярное скопление). Эффект сравнительно выражен для L-аргинина, за которым следуют хлорид натрия и L-гистидин в относительном порядке (смотри Фигура 15).

Исследования относительной растворимости

Автоматизированный скрининг на относительную растворимость девяти составов оценивали, применяя вызванное полиэтиленгликолем (ПЭГ) осаждение, требующее 10 мг/мл концентрацию белка. 40% (вес/об) ПЭГ 6000 получали в каждом буферном растворе, после чего получали растворы ПЭГ-6000, 2%-36% (вес/об) с различными приращениями, применяя автоматизированную систему обработки жидкостей JANUS G3. Раствор белка 10 мг/мл добавляли к растворам ПЭГ в 96-луночном прозрачном планшете Costar для получения конечной концентрации 1 мг/мл. Планшет уравновешивали при температуре в течение ночи, переносили в планшет Abgene для ПЦР и центрифугировали при 4600 об/мин в течение 30 мин, чтобы вызвать осаждение осадка белка на дне каждой лунки. Супернатант переносили из каждой лунки в свежий 96-луночный прозрачный планшет. Планшет считывали на ридере SpectraMax M5 при 280 и 320 нм для определения потери белка из-за осаждения во время инкубации в течение ночи. Данные по абсорбции (280-320) относительно концентрации PEG анализировали для определения %PEG_midpt.

Анти-LAG3 антитело показало улучшенную относительную растворимость в присутствии повышающихся концентраций заряженных молекул, таких как L-аргинин, L-гистидин или хлорид натрия (40 мМ вплоть до 100 мМ), предполагая снижение молекулярного краудинга анти-LAG3 антитела при данных концентрациях. Смотри Фигура 16. Величина увеличения относительной растворимости была аналогичной для всех трех заряженных соединений.

Исследования измерения заряженных частиц

Изменение в гетерогенности зарядов и изоэлектрической точке (pI) анти-LAG3 антитела в присутствии L-аргинина, L-гистидина или хлорида натрия оценивали, применяя систему капиллярного изоэлектрического фокусирования ProteinSimple (cIEF). Образцы смешивали с носителем амфолитом перед инъекцией в капилляр. При приложении электрического поля к капилляру носитель амфолит в капилляре создавал градиент pH, и молекулы белка мигрировали в место в капилляре, где локальное значение pH равнялось значениям изоэлектрического pH (pI). Обнаружение разделенных белков осуществляли путем полного сканирования всего капилляра, применяя систему iCE (iCE3 от ProteinSimple). Последнее изображение, полученное прибором, применяли для количественной оценки данных. Процент площади разрешенных пиков оценивали путем деления площади отдельных форм на общую площадь белка. Значение pI белка оценивают путем линейной калибровки расстояния между двумя маркерами pI, ограничивающими белок. Рабочие параметры включали температуру автосэмплера 10°C; картридж с покрытием из фторуглерода (FC), длину волны детектирования 280 нм, период фокусировки 1 минута при 1500 В. Девять составов переносили на 96-луночный планшет и оценивали на изменение заряженных частиц (% кислых вариантов, % основного пика и % основных вариантов) в начальный момент времени, применяя cIEF. Оставшиеся образцы девяти составов переносили в другой 96-луночный планшет, плотно закрывали и помещали для термического стресса на 10 дней при 50°C. При стрессе изменение заряженных частиц оценивали снова. Данные на рисунке 17 показывают изменение (разницу) в % кислых вариантов, % изменение основного пика, а также % изменение основных вариантов при термическом стрессе по сравнению с исходными.

Хлорид натрия показал наименьшее изменение в % кислых вариантов и % основного пика для состава анти-LAG3 антитело, за которым следовали L-аргинин и L-гистидин. Хлорид натрия показал улучшение химической стабильности в диапазоне концентраций от 40 до 100 мМ, особенно при ≥70 мМ. L-аргинин показал лучшую химическую стабильность при концентрации 70 мМ, тогда как L-гистидин показал лучшую химическую стабильность вплоть до концентрации 100 мМ.

Чтобы оценить самоассоциирующиеся свойства, а также коллоидную стабильность анти-LAG3 антитела в присутствии L-аргинина или хлорида натрия (NaCl), получали двенадцать различных составов, перечисленных в таблице 4. Несформулированное анти-LAG3 антитело (~ 37 мг/мл) в 10 мМ L-гистидине 70 мМ гидрохлорид L-аргинина pH 5,8 подвергали диализу относительно четырех буферных растворов 10 мМ гистидина pH 5,8; причем каждый буферный раствор содержал либо 150 мМ L-аргинин, 150 мМ хлорид натрия, либо смесь 35 мМ L-аргинина и 35 мМ хлорида натрия, или смесь 50 мМ L-аргинина и 50 мМ хлорида натрия. Анти-LAG3 антитело формулировали при 25 мг/мл, применяя диализаты соответствующего состава. Составы, содержащие 40-130 мМ L-аргинина или хлорида натрия, получали разбавлением соответствующего исходного раствора анти-LAG3 антитела L-гистидиновым буфером при pH 5,8 и концентрируя анти-LAG3 антитело до 25 мг/мл.

Таблица 4 Оптимизация состава L-аргинином, хлоридом натрия и их смесью Состав# Концентрация вспомогательного вещества Описание состава 1 40 мМ L-Аргинин 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 40 мМ L-аргинин, pH 5,8 2 70 мМ L-Аргинин 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ L-аргинин, pH 5,8 3 100 мМ L-Аргинин 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин , 100 мМ L-аргинин, pH 5,8 4 130 мМ L-Аргинин 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 130 мМ L-аргинин, pH 5,8 5 150 мМ L-Аргинин 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 150 мМ L-аргинин, pH 5,8 6 40 мМ Хлорид натрия 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 40 мМ хлорид натрия, pH 5,8 7 70 мМ Хлорид натрия 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ хлорид натрия, pH 5,8 8 100 мМ Хлорид натрия 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 100 мМ хлорид натрия, pH 5,8 9 130 мМ Хлорид натрия 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 130 мМ хлорид натрия, pH 5,8 10 150 мМ Хлорид натрия 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 150 мМ хлорид натрия, pH 5,8 11 35 мМ: 35 мМ L-Аргинин:хлорид натрия 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 35 мМ L-аргинин, 35 мМ хлорид натрия, pH 5,8 12 50 мМ:50 мМ L-Аргинин:хлорид натрия 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 50 мМ L-аргинин, 50 мМ хлорид натрия, pH 5,8

Измерение второго вириального коэффициента (B22)

Измерение второго вириального коэффициента (B22) для каждого из двенадцати составов осуществляли при 5 мг/мл, применяя динамическое рассеяние света (DLS). Автоматизированные измерения осуществляли при 20°C, применяя обратное рассеяние 173°.

Положительный второй вириальный коэффициент (B22) предполагает отталкивающие взаимодействия между белковыми молекулами (меньшая скученность) в матрице состава. И L-аргинин, и хлорид натрия в концентрациях, больших 40 мМ, оказались благоприятными для уменьшения молекулярного краудинга. Смотри Фигура 18.

Измерение мутности (OD₃₅₀)

Для оценки коллоидной стабильности анти-LAG3 антитела в матрице состава, мутность (OD₃₅₀) двенадцати составов оценивали, применяя спектрофотометр с поглощением в ультрафиолетовом (УФ) диапазоне. УФ-поглощение образцов измеряли в 96-луночном прозрачном планшете co-star при длине волны 350 нм с поправкой на оптическую плотность планшета.

Анти-LAG3 антитело показывает повышенную коллоидную стабильность (OD₃₅₀) с повышением концентраций или L-аргинина или хлорида натрия со сравнимыми величинами для обоих. Смотри Фигура 19. Эквивалентное соотношение L-аргинина и хлорида натрия (35:35 или 50:50) в матрице состава анти-LAG3 антитела также показывает сравнимую коллоидную стабильность.

Измерение вязкости

Для оценки концентрируемости анти-LAG3 в различной матрице составов, двенадцать составов анти-LAG3 антитела, перечисленных в таблице 4, концентрировали вплоть до 60 мг/мл, применяя центрифугу Eppendorf при 3000 об/мин при 15°C. Вязкости двенадцати составов измеряли при 20°C, применяя RheoSense VROC® Initium вискозиметр на 96-луночном планшете.

Вязкости анти-LAG3 антитела при 60 мг/мл в присутствии смеси L-аргинина или хлорида натрия были сопоставимы в диапазоне концентраций от 40 до 150 мМ. Вязкости при 60 мг/мл в присутствии эквивалентного соотношения L-аргинина и хлорида натрия (35:35 или 50:50) показали аналогичные значения вязкости. Смотри Фигура 20.

Измерение осмолярности

Осмолярность анти-LAG3 антитела измеряли, применяя Vapro Vapor Pressure 5520 Осмометр. Ячейку калибровали калибровочными стандартами 100 ммоль/кг, 290 ммоль/кг и 1000 ммоль/кг перед измерением.

Было обнаружено, что осмолярности двенадцати составов анти-LAG3 антитела, перечисленных в таблице 4, были сопоставимыми в присутствии либо L-аргинин, либо хлорида натрия. Осмолярности в присутствии эквивалентного соотношения L-аргинина и хлорида натрия (50:50) показали аналогичные значения вязкости, тогда как эквивалентные соотношения 35:35 показали более низкие значения осмолярности. Смотри Фигура 21.

Пример 2: Предварительный скрининг состава с заряженными соединениями (соль и аминокислота) состава анти-LAG3 антитела Ab6

Для оценки стабильность анти-LAG3 антитела в присутствии заряженных соединений (соль и аминокислоты), десять составов, перечисленных в таблице 5, получали и скринировали на изменения физико-химических свойств анти-LAG3 антитела высокопроизводительным анализом. Составы подходящим образом герметично закрывали в 96-луночном планшете и подвергали стрессу при 50°C в течение 10 дней в сухожаровом шкафу. Образцы, подвергнутые термическому стрессу, также анализировали на изменения физико-химических свойств анти-LAG3 антитела. 20 мМ концентрации L-аспарагиновой кислоты или L-глютаминовой кислоты выбирали, исходя из ограничений по растворимости.

Таблица 5 Состав# Номенклатура образцов Описание состава 1 L-Asp 20 мМ 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 20 мМ L-аспарагиновая кислота, pH 5,8 2 L-Glu 20 мМ 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 20 мМ L-глютаминовая кислота, pH 5,8 3 L-Arg 40 мМ 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 40 мМ L-аргинин, pH 5,8 4 NaCl 40 мМ 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 40 мМ хлорид натрия, pH 5,8 5 L-His 40 мМ 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 40 мМ L-гистидин, pH 5,8 6 L-Arg 70 мМ 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ L-аргинин, pH 5,8 7 NaCl 70 мМ 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ хлорид натрия, pH 5,8 8 L-His 70 мМ 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ L-гистидин, pH 5,8 9 L-Asp/Gly 20 мМ/50 мМ 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 20 мМ L-аспарагиновая кислота, 50 мМ глицин, pH 5,8 10 L-Glu/Gly 20 мМ/50 мМ 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 20 мМ L-глютаминовая кислота, 50 мМ глицин, pH 5,8

Протокол для мутности (OD350)

Мутность (OD350) девяти составов оценивали, применяя спектрофотометр с поглощением в ультрафиолете (УФ). УФ-поглощение образцов измеряли в 96-луночном прозрачном планшете co-star при длине волны 350 нм с поправкой на оптическую плотность планшета.

Как видно на рисунке 37, при тепловом стрессе, изменение коллоидной стабильности (OD₃₅₀) анти-LAG3 антитела было сравнимым между 40 мМ хлоридом натрия или L-аргинином и 20 мМ L-аспарагиновой кислоты или L-глютаминовой кислоты. Аналогично, изменение коллоидной стабильности (OD₃₅₀) анти-LAG3 между 70 мМ хлоридом натрия или L-аргинином было сравнимым с комбинацией 20 мМ L-аспарагиновой кислоты или L-глютаминовой кислоты с 50 мМ глицином (70 мМ суммарная сила). Изменение коллоидной стабильности (OD₃₅₀) анти-LAG3 антитела в присутствии или 40 мМ или 70 мМ L-гистидина было сравнительно высоким.

UP-SEC

Чистоту образца оценивали UP-SEC, в котором определяли процентное содержание мономера, а также процентное содержание высокомолекулярных соединений (HMW) и пики позднего элюирования (LMW соединения). UP-SEC проводили на Acquity H классе (DS) путем разбавления образцов до 1,0 мг/мл в подвижной фазе (100 мМ фосфат, 100 мМ хлорид натрия, pH 7,0). Температуру колонки поддерживали на уровне 25±3°C, и скорость потока поддерживали на уровне 0,5 мл/мин, применяя изократическое элюирование. Разбавленные образцы вводили (1 мкл) в UPLC, оборудованный колонкой Waters BEH200 и УФ-детектором. Белки в образце разделяли по размеру и детектировали по УФ-поглощению при 214 нм.

Как видно на рисунке 38, при тепловом стрессе, изменение количеств растворимых агрегатов (% высокомолекулярные соединения, HMW) и изменение в % мономера для анти-LAG3 антитела было сравнимым между 40-70 мМ хлорида натрия и 20-70 мМ аминокислот отдельно и в некоторых комбинациях. Изменение низкомолекулярных соединений было сравнительно низким для 20 мМ L-аспарагиновой кислоты или L-глютаминовой кислоты, 40 мМ L-гистидина, 70 мМ хлорида натрия, и комбинации 20 мМ L-аспарагиновой кислоты и 50 мМ глицина.

cIEF

Изменение гетерогенности заряда и изоэлектрической точке (pI) анти-LAG3 в присутствии L-аргинина, L-гистидина или хлорида натрия оценивали, применяя систему капиллярного изоэлектрического фокусирования ProteinSimple (cIEF). Образцы смешивали с носителем амфолитом перед инъекцией в капилляр. При приложении электрического поля к капилляру носитель амфолит в капилляре создавал градиент pH, и молекулы белка мигрировали в место в капилляре, где локальное значение pH равнялось значениям изоэлектрического pH (pI). Обнаружение разделенных белков осуществляли путем полного сканирования всего капилляра, применяя систему iCE (iCE3 от ProteinSimple). Последнее изображение, полученное прибором, применяли для количественной оценки данных. Процент площади разрешенных пиков оценивали путем деления площади отдельных форм на общую площадь белка. Значение pI белка оценивают путем линейной калибровки расстояния между двумя маркерами pI, ограничивающими белок. Рабочие параметры включали температуру автосэмплера 10°C; картридж с покрытием из фторуглерода (FC), длину волны детектирования 280 нм, период фокусировки 1 минута при 1500 В.

Данные на рисунке 39 показывают изменение (различие) в % кислых вариантов, % изменение основного пика, а также % изменение основных вариантов при тепловом стрессе, по сравнению с исходными.

Как видно на рисунке 39, изменение в % кислых вариантов и основном пике анти-LAG3 антитела было сравнимым между 20 мМ L-аспарагиновой кислоты или L-глютаминовой кислоты, 40 мМ L-гистидина и 40 мМ L-аргинина. Изменение было наименьшим для 40 мМ хлорида натрия. Аналогично, изменение % кислых вариантов и основного пика при 70 мМ было сравнимым между L-гистидином и комбинацией или 20 мМ L-аспарагиновой кислоты или L-глютаминовой кислоты с 50 мМ глицином. Изменение было наименьшим для 70 мМ хлорида натрия и 70 мМ L-аргинина. Изменение % основных вариантов было минимальным для всех десяти составов, перечисленных в таблице 5.

DLS

Измерение гидродинамического диаметра выполняли, применяя прибор Уайетта динамического рассеяние света (DLS) на 96-луночном планшете со стеклянным дном. Образец разбавляли до концентрации белка 5 мг/мл и анализировали в автоматическом режиме, применяя детектирование по рассеянию 158 ° при 20°C, продолжительность анализа 5 секунд для пяти измерений.

Как видно на рисунке 40, изменение в процентах диаметра анти-LAG3 антитела было минимальным для 20 мМ L-аспарагиновой кислоты или L-глютаминовой кислоты и их комбинации с 50 мМ глицином. Изменение диаметра было между 6 и 11% для хлорида натрия (40-70 мМ), L-аргинина (40-70 мМ) и L-гистидин (40-70 мМ) и в пределах вариабельности анализа.

Пример 3: Скрининг стабилизатора состава анти-LAG3 антитела Ab6

Для оценки стабильность анти-LAG3 антитела Ab6 (25 мг/мл в 10 мМ L-гистидине 70 мМ гидрохлориде L-аргинина или в 70 мМ хлориде натрия при pH 5,8) в присутствии различных стабилизаторов, таких как сахара и полиолы, получали одиннадцать составов, перечисленных в таблице 6.

Таблица 6 Оптимизация состава анти-LAG3 антитела стабилизаторами Состав# Номенклатура образца Описание состава 1 L-Arg70 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8 2 NaCl70 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ хлорид натрия (NaCl), pH 5,8 3 L-Arg70+Suc5% 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8, 5% (вес/об) сахароза 4 L-Arg70+Suc9% 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8, 9% (вес/об) сахароза 5 L-Arg70+Treh5% 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8, 5% (вес/об) трегалоза 6 L-Arg70+Treh9% 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8, 9% (вес/об) трегалоза 7 L-Arg70+Sorb2,5% 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8, 2,5% (вес/об) сорбит 8 L-Arg70+PEG400 2% 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8, 2,0% (вес/об) PEG400 9 L-Arg70+Glycer 2,5% 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8, 2,5% (вес/об) глицерин 10 NaCl70+Suc5% 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ хлорид натрия, pH 5,8, 5,0% (вес/об) сахароза 11 NaCl70+Suc9% 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ хлорид натрия, pH 5,8, 9,0% (вес/об) сахароза

Ультраэффективная эксклюзионная хроматография (UP-SEC)

Чистоту образца оценивали UP-SEC, в котором определяли процентное содержание мономера, а также процентное содержание высокомолекулярных соединений (HMW) и пики позднего элюирования (LMW соединения). UP-SEC проводили на Waters Acquity UPLC системе H-класса Bio путем разбавления образцов до 1,0 мг/мл в подвижной фазе (100 мМ фосфат, 100 мМ хлорид натрия, pH 7,0). Температуру колонки поддерживали на уровне 25±3°C, и скорость потока поддерживали на уровне 0,5 мл/мин, применяя изократическое элюирование. Разбавленные образцы вводили (5 мкл) в UPLC, оборудованный колонкой Waters BEH200 и УФ-детектором. Белки в образце разделяли по размеру и детектировали по УФ-поглощению при 214 нм.

Как видно на рисунке 24, было обнаружено, что изменение в процентах высокомолекулярных соединений и % мономера анти-LAG3 антитела (25 мг/мл в 10 мМ L-гистидине pH 5,8, 70 мМ L-аргинин) было меньшим в присутствии стабилизаторов, таких как сахароза, трегалоза, PEG 400 и глицерин. Эффект был выражен при большей концентрации сахарозы и трегалозы (9% вес/об), по сравнению с анти-LAG3 антителом (25 мг/мл в 10 мМ L-гистидине pH 5,8, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина) отдельно. Аналогично, было обнаружено, что изменение в процентах высокомолекулярных соединений и % мономера анти-LAG3 антитела (25 мг/мл в 10 мМ L-гистидине pH 5,8, 70 мМ хлорид натрия) было меньшим в присутствии сахарозы с выраженным эффектом при большей концентрации сахарозы и трегалозы (9% вес/об), по сравнению с анти-LAG3 антителом (25 мг/мл в 10 мМ L-гистидине pH 5,8, 70 мМ хлорид натрия) отдельно.

Изменение заряженных частиц (cIEF)

Изменение гетерогенности заряда и изоэлектрической точке (pI) анти-LAG3 антитела в присутствии L-аргинина, L-гистидина или хлорида натрия оценивали, применяя систему капиллярного изоэлектрического фокусирования ProteinSimple (cIEF). Образцы смешивали с носителем амфолитом перед инъекцией в капилляр. При приложении электрического поля к капилляру носитель амфолит в капилляре создавал градиент pH, и молекулы белка мигрировали в место в капилляре, где локальное значение pH равнялось значениям изоэлектрического pH (pI). Обнаружение разделенных белков осуществляли путем полного сканирования всего капилляра, применяя систему iCE (iCE3 от ProteinSimple). Последнее изображение, полученное прибором, применяли для количественной оценки данных. Процент площади разрешенных пиков оценивали путем деления площади отдельных форм на общую площадь белка. Значение pI белка оценивают путем линейной калибровки расстояния между двумя маркерами pI, ограничивающими белок. Рабочие параметры включали температуру автосэмплера 10°C; картридж с покрытием из фторуглерода (FC), длину волны детектирования 280 нм, период фокусировки 1 минута при 1500 В.

Одиннадцать составов заполняли в стерильные флаконы на 2 мл (заполнение 2,0 мл), герметично закрывали крышкой и осматривали визуально. В начальный момент времени одиннадцать составов хранили при температуре от 2 до 8°C (в защищенном от света), а образцы, предназначенные для теплового стресса, помещали перевернутыми в контейнер, защищенный от света, на 10 дней при 50°C в сушильном шкафу. Данные на рисунке 25 сообщают об изменении (различии) % кислых вариантов, % изменении основного пика, а также % изменении основных вариантов при тепловом стрессе по сравнению с исходными.

Как показано на рисунке 25, анти-LAG3 антитело (25 мг/мл в 10 мМ L-гистидине, 70 мМ L-аргинин pH 5,8) показывает меньшую химическую лабильность в присутствии 5% сахарозы. Стабилизирующий эффект трегалозы (5% вес/об и 10% вес/об), сорбита, PEG 400 и глицерина были сравнимыми. Анти-LAG3 антитело (25 мг/мл в 10 мМ L-гистидине, 70 мМ хлорид натрия pH 5,8) показало лучшую химическую стабильность в отсутствии сахарозы.

ДСК

Теплоемкости (cp) в ккал/°C одиннадцати составов анти-LAG3 антитела, перечисленные в таблице 6, измеряли, применяя дифференциальный сканирующий микрокалориметр (ДСК) при 1 мг/мл. T_m1, T_m2 и T_onset для одиннадцати составов определяли по графику зависимости cp (кал/моль/°C) от температуры (°C).

Как видно на рисунке 26, на основе величин T_m1, T_m2 и T_onset, сахароза и трегалоза (каждая при 5% вес/об-9% вес/об) обладала стабилизирующим эффектом на анти-LAG3 (25 мг/мл в 10 мМ L-гистидине, 70 мМ гидрохлориде L-аргинина pH 5,8), а также на анти-LAG3 антитело (25 мг/мл в 10 мМ L-гистидине, 70 мМ хлориде натрия pH 5,8). Стабилизирующий эффект сорбита, PEG 400 и глицерина были сравнимыми.

Пример 4: Исследование диапазона концентрации полисорбата состава анти-LAG3 антитела Ab6

Для определения оптимальной концентрации полисорбата 80 в матрице состава (25 мг/мл анти-LAG3 антитело в 10 мМ L-гистидине, 70 мМ гидрохлориде L-аргинина, 5% вес/об сахарозе, pH 5,8), восемь различных составов получали, причем каждый содержал полисорбат в диапазоне от 0 мг/мл вплоть до 1,0 мг/мл, как показано в таблице 7. Составы подвергали встряхиванию при 300 об/мин вплоть до 7 дней. Два состава состояли из плацебо (0,1 мг/мл или 1,0 мг/мл полисорбат 80 в той же матрице состава без анти-LAG3 антитела т.е., состав #1 в таблице 7).

Таблица 7 Скрининговое исследование поверхностно-активных соединений Состав# Полисорбат 80 (PS80) количество в мг/мл Полисорбат 80 (PS80) количество в % (вес/об) Описание состава 1 0 0 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, 5% (вес/об) сахароза, pH 5,8 2 0,05 0,005 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, 5% (вес/об) сахароза, 0,05 мг/мл полисорбат 80, pH 5,8 3 0,1 0,01 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, 5% (вес/об) сахароза, 0,1 мг/мл полисорбат 80, pH 5,8 4 0,2 0,02 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, 5% (вес/об) сахароза, 0,2 мг/мл полисорбат 80, pH 5,8 5 0,5 0,05 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, 5% (вес/об) сахароза, 0,5 мг/мл полисорбат 80, pH 5,8 6 1,0 0,1 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, 5% (вес/об) сахароза, 1,0 мг/мл полисорбат 80, pH 5,8 7 0,1 0,01 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, 5% (вес/об) сахароза, 0,1 мг/мл полисорбат 80, pH 5,8 (Placebo) 8 1,0 0,1 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, 5% (вес/об) сахароза, 1,0 мг/мл полисорбат 80, pH 5,8 (Placebo)

Мутность

Для оценки коллоидной стабильности анти-LAG3 антитела в матрице состава, содержащей различные концентрации полисорбата 80, мутность (OD350) восьми составов оценивали, применяя спектрофотометр с поглощением в ультрафиолете (УФ). УФ-поглощение образцов измеряли в 96-луночном прозрачном планшете co-star при длине волны 350 нм с поправкой на оптическую плотность планшета.

Как видно на рисунке 27, в отсутствии полисорбата 80, анти-LAG3 антитело в матрице состава (25 мг/мл анти-LAG3 в 10 мМ L-гистидине, 70 мМ гидрохлориде L-аргинина, 5% вес/об сахарозы, pH 5,8) показало увеличение мутности при встряхивании. В присутствии концентраций 0,1 мг/мл-1,0 мг/мл полисорбата 80 в матрице состава (25 мг/мл анти-LAG3 антитело в 10 мМ L-гистидине, 70 мМ гидрохлориде L-аргинина, 5% вес/об сахарозы, pH 5,8), было обнаружено, что анти-LAG3 антитело является стабильным. Не было влияния на коллоидную стабильность плацебо от 0,1 мг/мл до 1,0 мг/мл.

UP-SEC

Чистоту образца оценивали UP-SEC, в котором определяли процентное содержание мономера, а также процентное содержание высокомолекулярных соединений (HMW) и пики позднего элюирования (LMW соединения). UP-SEC проводили на Waters Acquity систем жидкостной хроматографии путем разбавления образцов до 1,0 мг/мл в подвижной фазе (0,1 М моногидрат дигидрофосфата натрия, 0,1 М дигидрат гидрофосфата натрия, 0,1 М L-аргинин, pH 7,0). Разбавленные образцы вводили (5 мкл) в жидкостной хроматограф, оборудованный колонкой with Protein BEH SEC и УФ-детектором. Белки в образце разделяли по размеру и детектировали по УФ-поглощению при 214 нм.

Как видно на рисунке 28, не было изменения в уровне растворимых агрегатов (% высокомолекулярных соединений) или фрагментации (% низкомолекулярных соединений) или изменения в % мономера в присутствии полисорбата 80 (концентрация 0,1-1,0 мг/мл). Было обнаружено, что анти-LAG3 антитело было коллоидно стабильно в присутствии полисорбата 80 в матрице состава.

HP-IEX

Для определения изменения вариантов составов анти-LAG3 антитела, применяли высокоэффективную ионообменную хроматографию (HP-IEX). Анализ проводили, применяя колонку Dionex MabPac® SCX-10,10 мкм 4×250 мМ и градиент подвижной фазы от 25 мМ MES, 14 мМ Tris, pH 6,25 до 25 мМ MES, 22 мМ Tris, 100 мМ LiCl pH 6,85. УФ-детектирование выполняли при 280 нм. Данный способ также включает необязательный буфер для стриппинга (15 мМ EDTA, 40 мМ Tris, 10 мМ CHES, 500 мМ NaCl, pH 8,1) для повышения надежности и устойчивости анализа. Образец получали из расчета 5 мг/мл с объемом введения 10 мкл.

Как видно на рисунке 29, не было изменения уровня заряженных частиц (% кислые варианты, % основной пик, % основные варианты) в присутствии полисорбата 80 (концентрация 0,1-1,0 мг/мл). Было обнаружено, что анти-LAG3 антитело было коллоидно стабильным в присутствии полисорбата 80 в матрице состава.

Пример 5: Исследование диапазона pH анти-LAG3 антитела Ab6

Состав A анти-LAG3 антитела Ab6: 25 мг/мл анти-LAG3 антитело; 50 мг/мл сахарозы; 0,2 мг/мл полисорбата 80; 10 мМ гистидиновый буфер; 70 мМ L-Аргинин-HCl скринировали в диапазоне pH 5,3-6,4, с учетом целевого pH состава 5,8. Как видно на рисунке 14, не было значительного изменения концентрации, мутности, % высокомолекулярных соединений, % низкомолекулярных соединений или % мономера между pH 5,3 и pH 6,4. Снижение % кислых вариантов (например, 17,28% при pH 5,5-14,10% при pH 6,0) на фоне увеличения % основного пика (например, 64,0% при pH 5,5-66,9% при pH 6,0) наблюдали от pH 5,3 вплоть до pH 6,4. Изменение гидродинамического диаметра по оси Z было минимальным (менее 1 нм) от pH 5,3 до pH 6,4. Небольшое увеличение количества невидимых частиц на миллилитр (диапазон размеров ≥5 мкм, ≥10 мкм и ≥25 мкм) было отмечено при pH ближе к изоэлектрической точке ~6,3 (т.е., pH 6,0-pH 6,4). В целом, анти-LAG3-антитело оказалось стабильным при pH от 5,3 до 6,4, что подтверждает выбор pH 5,8 в качестве целевого pH состава.

Пример 6: Скрининг антиоксидантов состава анти-LAG3 антитела Ab6

Для определения эффекта антиоксиданта на анти-LAG3 антитело в составе (25 мг/мл анти-LAG3 антитело в 10 мМ L-гистидине, 70 мМ гидрохлориде L-аргинина, 5% вес/об сахарозы, pH 5,8), три различные концентрации L-метионина оценивали в составе. Четыре различных состава, перечисленных в таблице 8, заполняли (2,2 мл) в стеклянный флакон 1 типа объемом 2 мл и надлежащим образом герметично закрывали. Четыре состава подвергали световым воздействиям 0,2 ICH, 0,5 ICH и 1ICH (ультрафиолетовый и холодный белый свет или видимый свет). Темный контроль (покрытый фольгой) для каждого из четырех составов (контроль) также подвергался воздействию светового стресса вплоть до 1 ICH.

Таблица 8 Скрининг антиоксидантов для состава анти-LAG3 антитела концентрация L-метионина (мМ) Описание состава контроль 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, 5% (вес/об) сахароза, 0,2 мг/мл полисорбат 80, pH 5,8 (контроль) 5 мМ 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, 5 мМ L-метионин, 5% (вес/об) сахароза, 0,2 мг/мл полисорбат 80, pH 5,8 7 мМ 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, 7 мМ L-метионин, 5% (вес/об) сахароза, 0,2 мг/мл полисорбат 80, pH 5,8 10 мМ 25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, 10 мМ L-метионин, 5% (вес/об) сахароза, 0,2 мг/мл полисорбат 80, pH 5,8

Мутность

Мутность (OD350) четырех составов оценивали, применяя спектрофотометр с поглощением в ультрафиолете (УФ). УФ-поглощение образцов измеряли в 96-луночном прозрачном планшете co-star при длине волны 350 нм с поправкой на оптическую плотность планшета.

Как видно на рисунке 30, было обнаружено, что L-метионин (5 мМ-10 мМ) коллоидно стабилизирует анти-LAG3 антитело (25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ L-аргинин, 5% вес/об сахароза, pH 5,8) по сравнению с контролем, как перечислено в таблице 8; причем 10 мМ L-метионин является оптимальным количеством. Не было влияния на коллоидную нестабильность для контрольного темного образца при воздействии света 1 ICH.

UP-SEC

Чистоту образца оценивали UP-SEC, в которой определяли процент мономера, а также процент высокомолекулярных соединений (HMW) и поздно элюирующиеся пики (LMW соединения). UP-SEC проводили на системе UPLC acquity H класса разбавлением образцов до 1,0 мг/мл в подвижной фазе (100 мМ фосфат и 100 мМ хлорида натрия, pH 7,0). Разбавленные образцы вводили (5 мкл) в жидкостной хроматограф, оборудованный колонкой Protein BEH SEC и УФ-детектором, скорость потока 0,5 мл/мин. Белки в образце разделяли по размеру и детектированы по УФ-поглощению при 214 нм и 280 нм.

Как видно на рисунке 31, было обнаружено, что L-метионин (5 мМ-10 мМ) снижает образование растворимых агрегатов (%HMW) в составе анти-LAG3 антитела (25 мг/мл анти-LAG3 антитело, 10 мМ L-гистидин, 70 мМ L-аргинин, 5% вес/об сахароза, pH 5,8) по сравнению с контролем, как перечислено в таблице 8; причем 10 мМ L-метионин является оптимальным количеством. Не наблюдали образования растворимых агрегатов для темного контрольного образца после воздействия светом 1 ICH.

HP-IEX

Для определения изменения вариантов в составах анти-LAG3 антитела, применяли высокоэффективную ионообменную хроматографию (HP-IEX). Анализ проводили, применяя Dionex MabPac® SCX-10,10 мкм 4×250 мм колонку и градиент подвижной фазы от 25 мМ MES, 14 мМ Tris, pH 6,25 до 25 мМ MES, 22 мМ Tris, 100 мМ LiCl pH 6,85. Уф детекцию проводили при 280 нм. Данный способ также включает необязательный буфер для стриппинга (15 мМ EDTA, 40 мМ Tris, 10 мМ CHES, 500 мМ NaCl, pH 8,1) для повышения надежности и устойчивости анализа. Образец получали при 5 мг/мл с вводимым объемом 10 мкл и скорость потока 0,5-1,0 мл/мин.

Как видно на рисунке 32, было обнаружено, что 5 мМ-10 мМ L-метионин был эффективным по снижению увеличения количества заряженных частиц (% кислых вариантов и % основных вариантов) вплоть до воздействия светом 1 ICH для анти-LAG3 антитела (25 мг/мл анти-LAG3 в 10 мМ L-гистидине, 70 мМ гидрохлориде L-аргинина, 5% вес/об сахарозы, 0,2 мг/мл полисорбата 80) по сравнению с контролем. Для темного контрольного образца 1 ICH влияние на заряженные соединения не наблюдали.

Картирование восстановленных пептидов

Изменения уровня окисления окислительных посттрансляционных модификаций анти-LAG3 антитела оценивали, применяя картирование восстановленных пептидов. Картирование восстановленных пептидов проводили на Waters Acquity системе H Bio класса с подвижной фазой A (0,1% трифторуксусная кислота в воде чистоты LC/MS), с подвижной фазой B (0,1% трифторуксусная кислота в ацетонитриле чистоты LC/MS). Вводимый объем составляет 50 мкл, снабженный колонкой HALO Peptide ES-C18 со скоростью потока 0,2 мл/мин и оптической плотностью для обнаружения 214 нм. Масс-спектрометрия состояла из капилляра 3,0, конуса образца 30, температуры источника 120 ° C, газа конуса 30, газа десольватации, диапазона m/z 100-200, МС собирали от 2 до 110 мин. Перед прогоном через колонку образцы восстанавливали и алкилировали соответствующими реагентами. Для выявления пиков, не связанных с образцом, элюируемых в интересующей области, проводили холостое (не относящееся к образцу) расщепление.

Как видно на рисунке 33, было обнаружено, что 5 мМ-10 мМ L-метионин эффективно снижал окисления посттрансляционных модификаций анти-LAG3 антитела (25 мг/мл анти-LAG3 антитело в 10 мМ L-гистидине, 70 мМ гидрохлориде L-аргинина, 5% вес/об сахароза, 0,2 мг/мл полисорбат 80) при воздействии светом 1 ICH, по сравнению с контролем.

Пример 7: Исследования высоких концентраций анти-LAG3 антитела Ab6

Для оценки пригодности высокой концентрации (200 мг/мл) анти-LAG3 антитела в трех различных буферах при pH 5,8 (гистидин, ацетат и цитрат; каждый содержит 70 мМ гидрохлорид L-аргинина) и состава, содержащего L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8 в присутствии различных стабилизаторов, девять составов получали, как перечислено в таблице 9. Каждый из девяти составов заполняли в 96-луночные планшеты и герметично закрывали подходящим образом. Составы подвергали стрессу при 50°C в течение 10 дней в сухожаровом шкафу. Анализ проводили для исходных образцов и образцов, подвергнутых стрессовому воздействию.

Таблица 9 Пригодность высокой концентрации состава анти-LAG3 антитела Состав# Анти-LAG3 антитело Концентрация (мг/мл) Описание состава Стабилизатор 1 200 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8 Стабилизатора нет 2 200 10 мМ ацетат, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8 Стабилизатора нет 3 200 10 мМ цитрат, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8 Стабилизатора нет 4 200 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8 5% (вес/об) сахароза 5 200 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8 5% (вес/об) глицерин 6 200 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8 70 мМ L-глютамин 7 200 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8 70 мМ L-глицин 8 200 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8 70 мМ пролин 9 200 10 мМ L-гистидин, 70 мМ гидрохлорид L-аргинина, pH 5,8 70 мМ L-метионин

Мутность

Мутность (OD350) девяти составов оценивали, применяя спектрофотометр с поглощением в ультрафиолетовом диапазоне (УФ). УФ-поглощение образцов измеряли в 96-луночном прозрачном планшете co-star при длине волны 350 нм с поправкой на оптическую плотность планшета.

Как видно на рисунке 34, коллоидная стабильность (OD350) анти-LAG3 антитела (200 мг/мл анти-LAG3 антитело в 10 мМ L-гистидине 70 мМ L-аргинине, pH 5,8) была ниже в присутствии 70 мМ L-метионина в качестве стабилизатора по сравнению с контролем (200 мг/мл анти-LAG3 антитело в 10 мМ L-гистидине 70 мМ L-аргинине, pH 5,8). Стабилизирующий эффект (коллоидный) 70 мМ L-глютамина и 70 мМ пролина в составе 200 мг/мл анти-LAG3 антитела был сравнимым. Аналогично, стабилизирующий эффект (коллоидный) 5% вес/об глицерина и 70 мМ L-глицина в составе 200 мг/мл анти-LAG3 антитела был сравнимым. Коллоидная стабильность 200 мг/мл анти-LAG3 антитела была сравнительно высокой в присутствии 5% вес/об сахарозы.

UP-SEC

Чистоту образца оценивали UP-SEC, в которой определяли процент мономера, а также процент высокомолекулярных соединений (HMW) и поздно элюирующихся пиков (LMW соединения). UP-SEC проводили на Acquity H класса (DS) разбавлением образцов до 1,0 мг/мл в подвижной фазе (100 мМ фосфат, 100 мМ хлорид натрия, pH 7,0). Температуру колонки поддерживали на уровне 25±3°C, и скорость потока поддерживали на уровне 0,5 мл/мин, применяя изократическое элюирование. Разбавленные образцы вводили (5 мкл) в UPLC, оборудованную колонкой Waters BEH200 и УФ-детектором. Белки в образце разделяли по размеру и детектировали по УФ-поглощению при 214 нм.

Как видно на рисунке 35, 10 мМ L-гистидиновый буфер в присутствии 70 мМ гидрохлорида L-аргинина является эффективным по снижению количеств растворимых агрегатов по сравнению с 10 мМ L-ацетатным или 10 мМ цитратным буфером для высокой концентрации состава анти-LAG3 антитела (200 мг/мл). 5% (вес/об) сахароза является эффективной в качестве стабилизатора по дополнительному снижению количеств растворимых агрегатов, с последующим 5% (вес/об) глицерином. Стабилизирующий эффект аминокислот т.е., 70 мМ L-глютамина, 70 мМ L-глицина, 70 мМ пролина и 70 мМ L-метионина был сравнимым.

Изменение заряженных частиц (cIEF)

Изменение гетерогенности заряда и изоэлектрической точке (pI) анти-LAG3 антитела в присутствии L-аргинина, L-гистидина или хлорида натрия оценивали применяя систему капиллярного изоэлектрического фокусирования ProteinSimple (cIEF). Образцы смешивали с носителем амфолитом перед инъекцией в капилляр. При приложении электрического поля к капилляру носитель амфолит в капилляре создавал градиент pH, и молекулы белка мигрировали в место в капилляре, где локальное значение pH равнялось значениям изоэлектрического pH (pI). Обнаружение разделенных белков осуществляли путем полного сканирования всего капилляра, применяя систему iCE (iCE3 от ProteinSimple). Последнее изображение, полученное прибором, применяли для количественной оценки данных. Процент площади разрешенных пиков оценивали путем деления площади отдельных форм на общую площадь белка. Значение pI белка оценивают путем линейной калибровки расстояния между двумя маркерами pI, ограничивающими белок. Рабочие параметры включали температуру автосэмплера 10°C; картридж с покрытием из фторуглерода (FC), длину волны детектирования 280 нм, период фокусировки 1 минута при 1500 В.

Химическая стабильность 200 мг/мл анти-LAG3 антитела была сравнимой в 10 мМ L-гистидине, а также 10 мМ цитратном буфере по сравнению с 10 мМ ацетатным буфером в присутствии 70 мМ гидрохлорида L-аргинина при pH 5,8. 5% (вес/об) глицерин был эффективным в снижении изменения заряженных частиц (% кислых и основных вариантов), с последующей 5% (вес/об) сахарозой (% основные варианты). Стабилизирующий эффект аминокислот т.е., 70 мМ L-глютамина, 70 мМ L-глицина, 70 мМ пролина и 70 мМ L-метионина был сравнимым.

Пример 8: исследование стабильность совместного состава анти-PD-1 и анти-LAG3 антитела

Совместные составы анти-PD-1 антитела (MK-3475, пембролизумаб, тяжелая цепь SEQ ID NO:10 и легкая цепь SEQ ID NO:5) и анти-LAG3 антитело Ab6 (тяжелая цепь SEQ ID NO:57, и легкая цепь SEQ ID NO:35) получали, как в таблице 10.

Таблица 10

форма No. Анти-LAG3 мг/мл) Анти-PD-1 (мг/мл) Гистидин (мМ) Аргинин (мМ) Сахароза (мг/мл) Метионин (мМ) PS-80 (мг/мл) pH F1 20 0 10 70 50 0 0,2 5,8 F2 0 20 10 70 50 0 0,2 5,8 F3 20 20 10 70 50 0 0,2 5,8 F4 0 20 10 0 70 0 0,2 5,8 F5 20 20 10 70 50 10 0,2 5,8 F6 20 20 10 40 50 10 0,2 5,8

Исследование термической стабильности

Исследования термической стабильности проводили, применяя 1,0 мл жидкий составы F1-F6 в 2 мл пробирках с 13 мм пенициллиновой пробкой в течение вплоть до 12 недель в условиях хранения 5°C (комнатная влажность), 25 °C (60% влажность), и 40 °C (75% относительная влажность). Стабильность образцов оценивали по мутности и хроматографии со смешанным режимом (MMC).

Хроматография со смешанным режимом

Хроматография со смешанным режимом позволила разделить отдельные антитела (анти-LAG3 антитело и анти-PD-1 антитело) в совместных составах, а также обеспечила мониторинг агрегатов анти-LAG3 антитела и агрегатов анти-PD-1 антитела и окисление совместных составов. В MMC процент мономера для каждого mAb определяли по площади основного пика каждого mAb. Для анти-LAG3-антитела рассчитывали процент высокомолекулярных (агрегатов) и низкомолекулярных соединений (фрагментов). Для анти-PD-1 антитела процент высокомолекулярных (агрегатов) и низкомолекулярных соединений (фрагментов), а также окисленных соединений (Ox1 и Ox2) рассчитывали на основе площади индивидуальных пиков, соответствующих каждому соединению. Хроматографию со смешанным режимом проводили разбавлением образцов до 1,0 мг/мл в подвижной фазой (PBS, pH 7,4). Температуру колонки поддерживали на уровне 25°C, и скорость потока поддерживали на уровне 0,5 мл/мин, применяя изократическое элюирование. Разбавленные образцы вводили (15 мкл) в ВЭЖХ, оборудованную настраиваемой колонкой Sepax Zenix SEC-300. Различные компоненты в образце разделяли как по размеру, так и по гидрофобности и детектировали по УФ-поглощению при 280 нм.

Измерение мутности

Анализ мутности проводили на образцах стабильности, применяя УФ-видимую спектроскопию на планшетном ридере SpectrMax M5 Plate. Поглощение измеряли при 350 нм и 500 нм. Мутность рассчитывали путем вычитания поглощения при 500 нм из поглощения при 350 нм.

Вывод

Совместные составы (F3, F5 и F6) показали аналогичную или лучшую стабильность, чем составы отдельных соединений (рисунки 22 и 23). Состав F2 показал сравнительно низкую мутность и потерю мономера, чем состав F4 с течением времени при хранении при 40°C, указывая, что анти-PD-1 антитело показывает лучшую стабильность в составе с аргинином (рисунки 22 и 23). F5 и F6 совместные составы показали минимальное изменение количества мономера с течением времени после 12 недельного хранения при 40°C по сравнению с составами отдельных соединений. L-Метионин помогал снизить до минимума потерю мономера в совместных составах (F5, F6) (Фигура 23).

Лекарственные вещества (DS) анти-LAG3 антитело Ab6 и пембролизумаб (MK-3475) смешивали в следующих соотношениях: 1:1 (12D), 3:1 (12E), 4:1 (12F) и 5:1 (12G). Составы 12A и 12C представляют собой контроли только с Ab6 (SE) и с MK-3475 y (SE), соответственно, в их первоначальной композиции. Состав 12B представляет собой контроль MK-3475 SE в композиции вспомогательных веществ 12A. 12F-12H представляют собой совместные состав с отношением Ab6 к MK-3475 4:1, с (12H) и без разбавителя (12F). Разбавитель добавляли к композиции состава для восстановления композиции Ab6 (с концентрацией 70 мМ аргинина).

Таблица 11 Составы

Состав ID # отношение Ab6: MK-3475 Конечная композиция 12A 1:0 Ab6 25 мг/мл, 70 мМ L-аргинин HCl, 5% сахароза, 10 мМ метионин, 0,02% PS-80, 10 мМ гистидиновый буфер 12B 0:1 MK-3475 25 мг/мл, 70 мМ L-аргинин HCl, 5% сахароза, 10 мМ метионин, 0,02% PS-80, 10 мМ гистидиновый буфер 12C 0:1 MK-3475 25 мг/мл, 7% сахароза, 0,02% PS-80, 10 мМ гистидиновый буфер 12D 1:1 Ab6 10 мг/мл с MK-3475 10 мг/мл, 70 мМ L-аргинин HCl, 5% сахароза, 10 мМ метионин, 0,02% PS-80, 10 мМ гистидиновый буфер 12E 3:1 Ab6 18,75 мг/мл с MK-3475 6,25 мг/мл, 52,5 мМ L-аргинин HCl, 5,5% сахароза, 7,5 мМ метионин, 0,02% PS-80, 10 мМ гистидиновый буфер 12F 4:1 Ab6 20 мг/мл с MK-3475 5 мг/мл, 56 мМ L-аргинин HCl, 5,4% сахароза, 8,0 мМ метионин, 0,02% PS-80, 10 мМ гистидиновый буфер 12G 5:1 Ab6 20,83 мг/мл с MK-3475 4,17 мг/мл, 58,3 мМ L-аргинин HCl, 5,3% сахароза, 8,3 мМ метионин, 0,02% PS-80, 10 мМ гистидиновый буфер 12H 4:1 Ab6 18,02 мг/мл с MK-3475 4,505 мг/мл, 70 мМ L-аргинин HCl, 5% сахароза, 10 мМ метионин, 0,02% PS-80, 10 мМ гистидиновый буфер

Составы фильтровали через 0,22 мкм мембранный фильтр из ацетата целлюлозы. Фильтрат для каждого состава заполняли в 2R пробирки с 2,2 мл наполнение/пробирка. Стабильность составов оценивали через 10 суток при 5°C, 25°C и 40°C. Стабильность составов проанализировали проверкой атрибутов качества, включая мутность, суммарная концентрация содержание белка в невидимых частицах, агрегацию, окисление для МК-3475, чистоту и профиль заряда. Составы 12А, 12Б, 12F и 12H в основном оценивали на стабильность.

Мутность и суммарная концентрация белка

Мутность измеряли, применяя Spectramax спектрофотометр с УФ поглощением (MRK0406661). Образцы по 200 мкл помещали в 96-луночный прозрачный планшет Co-star, оптическую плотность измеряли при 350 нм и 500 нм и путь кооректировали с оптической плотностью планшета 0,025 и 0,020, соответственно.

Концентрацию измеряли, применяя SoloVPE Variable Pathlength Extension (MRK0416083), применяя Quick Slope. Средневзвешенный коэффициент экстинкции, зависящий от соотношения (1,42 для MK-3475 и 1,45 для Ab6), и длину волны 280 нм применяли для измерения суммарной концентрации белка.

Таблица 12: Мутность и суммарная концентрация белка

Название образца Мутность, OD 350 Мутность, OD 350-500 10 дней - 5°C 12A 0,073 0,052 12B 0,081 0,059 12C 0,062 0,044 12D 0,067 0,049 12E 0,079 0,056 12F 0,074 0,055 12G 0,074 0,054 12H 0,067 0,049 10 дней - 40°C 12A 0,076 0,055 12B 0,083 0,062 12C 0,066 0,048 12D 0,073 0,054 12E 0,083 0,062 12F 0,080 0,060 12G 0,078 0,059 12H 0,071 0,052 10 дней - 50°C 12A 0,083 0,063 12B 0,118 0,091 12C 0,076 0,059 12D 0,092 0,070 12E 0,096 0,073 12F 0,093 0,072 12G 0,09 0,069 12H 0,081 0,061

Все образцы были прозрачными, бесцветными и без видимых частиц. Влияние соотношения Ab6:MK-3475 на мутность не наблюдали. Все прототипы с диапазоном доз Ab6 200-1000 мг в совместном составе показали одинаковую мутность при всех условиях стабильности. Состав матрицы не влиял на мутность.

Анализ агрегации UP-SEC

Высокопроизводительную эксклюзионную хроматографию (UP-SEC) применяли для оценки суммарной агрегации белка и определения содержания высокомолекулярных соединений (HMW), низкомолекулярных соединений (LMW) и общего содержания мономера. Оба образца и контрольный материал разбавляли до 5 мг/мл и применяли 200 мкл разбавленного образца. Подвижная фаза состояла из 50 мМ Na фосфата, 450 мМ аргинина HCl, pH 7,0. Применяли изократическую скорость потока 0,5 мл/мин, длину волны детектирования 280 нм, вводимый объем 6 мкл и температуру колонки 30°C. Для каждого испытуемого образца рассчитывали процент площади пиков мономера (Mon), HMW соединений и LMW соединений (ранее известных как поздно элюирующиеся).

% мономера=PMon x 100 ÷ Σ P (все пики)

% HMW соединений=PHMW x 100 ÷ Σ P (все пики)

% LMW соединений=PLMW x 100 ÷ Σ P (все пики)

PMon, PHMW, PLMW представляют собой площади отдельных пиков, и ΣP представляет собой сумму всех площадей пиков (исключая пики артефактов, пики, появляющиеся в пустом объеме, и пики, связанные с буфером).

Состав # 12B только с MK-3475 показывал наибольшее количество Высокомолекулярных (HMW) соединений (смотри рисунки 41 и 42). Наличие 70 мМ аргинина приводило в результате к повышенным количествам HMW соединений MK-3475. По мере увеличения соотношения Ab6: MK-3475 в совместном составе от (1:1) до (5:1), количество HMW соединений снижается. Повышенная концентрация Ab6, по-видимому, стабилизирует MK-3475 против агрегации (образования HMW). MK-3475 в составе 12C имеет более высокую склонность к агрегации по сравнению с 12A составом Ab6. Никаких измеримых различий не наблюдали для прототипов совместного состава 800: 200 с (12H) или без разбавителя (12F).

Анализ размера частиц микропроточной визуализацией (MFI)

Невидимые частицы в диапазоне >1 мкм, >2 мкм, >5 мкм, >10 мкм, >25 мкм, >50 мкм анализировали, применяя MFI путем объединения достаточного количества образцов для анализа минимум 3 повторов, применяя Brightwell Micro систему микропроточной визуализации.

Таблица 13: Невидимые частицы

# Частицы/мл, ≥10 мкм 12A 12B 12C 12D 12E 12F 12G 12H 5ºC-10день 10 10 7 8 14 5 1 4 40ºC-10день 5 4 12 8 23 3 10 5 50ºC-10день 581 6 9 6 8 41 33 10 # Частицы/мл, ≥25 мкм 12A 12B 12C 12D 12E 12F 12G 12H 5ºC-10день 1 4 0 1 1 2 0 1 40ºC-10день 1 1 2 3 0 2 2 1 50ºC-10день 206 2 1 0 2 2 3 0

Количество частиц было выше для составов с высокой концентрацией (отдельный компонент и совместный состав) по сравнению с составами с низкой концентрацией (12D и 12E). Значительное увеличение количества для всех размеров частиц наблюдали для отдельного компонента Ab6 (12A) при 50ºC в течение 10 дней. Аналогично, совместные составы с более высокой концентрацией белка (12F, 12G и 12H) показали более высокое количество частиц всех размеров при всех условиях хранения по сравнению с составами 12D и 12E. Однако количество частиц ≥10мкм и ≥25мкм было значительно ниже, чем наблюдавшееся для отдельного компонента Ab6 (12A) при 50ºC.

Хроматография с гидрофобным взаимодействием (HIC) для количественного определения окисления MK-3475 в совместном составе

HIC применяли для оценки идентификации и количеств всех продуктов окисления MK-3475 в совместном составе. В качестве колонки применяли Tosoh Phenyl-5PW 10 мкм 7,5×75 мм и применяли температуру колонки 30°C. Образцы разбавляли, чтобы получить общую концентрацию белка 5 мг/мл с общим объемом образца, по меньшей мере, 200 мкл. Применяли градиентный способ с комбинацией подвижной фазы A: 2% ACN в 5 мМ Na₃(PO₄), pH 7,0, и подвижной фазы B: 2% ACN в 400 мМ сульфат аммония, 5 мМ Na₃(PO₄), pH 6,9, и объем инъекции 10 мкл. Применяли длину волны детектирования 280 и 214 нм, и результаты приводили только при 280 нм. Для отчета о результатах относительный% площади для предварительного пика 3 равен% от предварительного пика 3. Предварительные пики 1 и 2 суммируются, чтобы они равнялись % от предварительного пика 1+2.

Что касается результатов, относительная площадь в % для предварительного пика 3 равна % предварительного пика 3. Предварительные пики 1 и 2 суммируют, чтобы они равнялись % предварительного пика 1+2.

Таблица 14: Окисление MK-3475 в совместном составе

Состав# Суммарная площадь % препдик 1+2 (1 Fab Met Ox) % предпик 3 % основной % пост-пик 1 % пост-пик 2 12A 0 0 0 12B-4°C 7889980 5,40 0,62 86,0 6,17 1,83 12B-40°C 7946807 8,25 0,71 83,0 6,03 1,96 12B-50°C 7617017 7,70 0,52 83,8 5,95 2,04 12F-4°C 1683729 5,48 0,28 82,2 7,81 4,2 12F-40°C 1688135 8,06 0,54 78,6 8,73 4,06 12F-50°C 1574991 7,72 0,70 79,6 8,02 3,94 12H-4°C 1692349 5,78 0,33 81,8 8,02 4,04 12H-40°C 1675188 9,05 0,59 78,2 8,17 4,02 12H-50°C 1543496 9,26 0,98 78,9 7,93 2,97

Ab6/MK-3475 coвместный состав (12H) показал наибольшую степень окисления Fab (Met 105) в MK-3475. (12F) композиция показала наименьшую степень окисления.

Ионообменная хроматография (IEX) для оценки изменения распределения заряда отдельных mAb в совместном составе

Ионообменную хроматографию (IEX) применяли для оценки идентификации и количества всех заряженных и основных вариантов в каждом из mAb совместного состава. Каждый из образцов разбавляли для получения общего количества суммарного белка 50 мкг при максимальном объеме инъекции 125 мкл. Применяли колонку Dionnex MabPac SCX-10 10 мкм, 4×250 мм при температуре колонки 35°C. Применяемой подвижной фазой была комбинация (A): 5 мМ MES, 14 мМ Tris, pH 6,25 (B): 20 мМ Na₃(PO₄), 95 мМ NaCl, pH 8,0, 4% ацетонитрил (ACN) и (C): 15 мМ EDTA, 40 мМ Tris, 10 мМ CHES, 500 мМ NaCl, pH 8,1. Градиентный способ с общим временем прогона 70 минут применяли с длиной волны обнаружения 280 нм. С помощью данного способа идентифицировали и количественно определены кислотные, основные и основные варианты каждого из mAb в совместном составе. В целом, при повышении температуры профиль заряда меняется, и наибольшее изменение наблюдается при 50°C (смотри таблицу 15). Не наблюдали заметной разницы в основном пике или кислотных и основных вариантах через 10 дней при 5°C, 40°C и 50°C для прототипов совместного состава 800: 200 с (12H) и без разбавителя (12F).

Таблица 15: Профиль заряда по IEX

F# Кислотная группа Ab6
% Основной пик Ab6
% Основная группа Ab6
% Кислотная группа
MK-3475
% Основной пик
MK-3475
% Основная группа
MK-3475
% MK-3475 суммарное % Ab6 суммарное % 12A-4°C 13,2 77,1 9,7 12A-40°C 18,6 71,9 9,5 12A-50°C 33,1 56,2 10,7 12B-4°C 18,7 61,6 19,71 12B-40°C 24,4 57,2 18,43 12B-50°C 37,2 47,0 15,75 12F-4°C 10,7 60,5 8,1 4,1 11,8 4,83 20,8 79,2 12F-40°C 15,3 55,3 8,6 5,2 11,0 4,57 20,8 79,2 12F-50°C 26,5 43,0 9,7 7,9 8,9 4,06 20,9 79,1 12G-4°C 10,7 60,5 8,1 4,0 11,8 4,79 20,7 79,3 12G-40°C 15,2 55,3 8,5 5,3 11,0 4,65 20,9 79,1 12G-50°C 26,0 43,6 9,7 7,7 8,9 4,10 20,7 79,3 12H-4°C 10,7 60,5 8,1 4,0 11,8 4,8 12H-40°C 15,2 55,3 8,5 5,3 11,0 4,7 12H-50°C 26,0 43,6 9,7 7,7 8,9 4,1

Анализ чистоты капиллярным электрофорезом-SDS (CE-SDS)

Анализ чистоты mAb проводили, применяя невосстанавливающий CE-SDS. Образцы получали в соответствии с внутренними протоколами способа и инкубировали при 70°C в течение 10 минут на тепловом блоке. Затем образцы уравновешивали до температуры окружающей среды, центрифугировали при 10000 g, и 95 мкл образца применяли для анализа.

Таблица 16: чистота по CE-SDS

NR-CE-SDS Анализ стабильности 40°C Состав ID IgG чистота (%) LMW (%) HMW (%) 12A 98,5 1,5 - 12B 98,2 1,7 0,1 12C 98,3 1,7 - 12D 98,1 1,9 - 12E 98,1 1,9 0,05 12F 98,4 1,6 - 12G 98,1 1,9 0,04 12H 98,1 1,9 - NR-CE-SDS Анализ стабильности 50°C Состав ID IgG Чистота (%) LMW (%) HMW (%) 12A 97,1 2,9 0,1 12B 97,1 2,7 0,2 12C 97,0 2,8 0,1 12D 97,1 2,7 0,1 12E 97,1 2,8 0,2 12F 96,8 3,1 0,2 12G 97,0 2,9 0,1 12H 97,1 2,8 0,1

Из приведенной выше таблицы видно, что соотношение Ab6: MK-3475 не влияет на чистоту.

Пример 9: исследования долгосрочной стабильности coвместного состава лекарственного продукта Ab6A (4:1 отношение анти-LAG3 антитела и анти-PD-1 антитела)

Ab6A инъекция представляет собой стерильный, раствор без консервантов, который требует разбавления для внутривенного вливания. Ab6A представляет собой комбинацию с фиксированной дозой анти-LAG3 антитела Ab6 и анти-PD-1 антитела MK-3475 (пембролизумаб, тяжелая цепь SEQ ID NO:10 и легкая цепь SEQ ID NO:5), каждая одноразовая пробирка содержит 40 мг Ab6 и 10 мг MK-3475 в 2,0 мл наполнении. Композиция лекарственного продукта представляет собой 20,0 мг/мл Ab6, 5,0 мг/мл MK-3475 в 0,56 мг/мл L-гистидине, 1,35 мг/мл моногидрате моногидрохлорида L-гистидина, 11,80 мг/мл гидрохлориде L-аргинина, 1,19 мг/мл L-метионине, 54,0 мг/мл сахарозы, 0,20 мг/мл полисорбата 80 при pH 5,8 (состав 12F в примере 8). Рекомендованные условия хранения представляют собой 5°C±3°C (2-8°C) с защитой от света.

Данные о трехмесячной стабильности лекарственного препарата Ab6A в стеклянных флаконах практически не изменились при хранении в рекомендуемых условиях хранения 5°C (5°C ±3°C). Незначительные изменения наблюдали в некоторых характеристиках до трех месяцев при хранении в форсированных условиях 25° C (25°C, 60% относительная влажность). Изменения в стрессовых условиях 40°C (40°C, 75% RH) были более существенными, чем изменения при 25°C. Следующие анализы остаются практически неизменными в течение трех месяцев при всех температурных условиях (включая стрессовые условия 40°C, 75% RH): внешний вид и видимые частицы, прозрачность и степень опалесценции, цвет, активность, концентрация белка, pH и твердые частицы Имеющиеся данные о стабильности подтверждают применение данного продукта при хранении при 5 °C ±3°C со сроком хранения 12 месяцев.

Ниже резюмируются данные о трехмесячной стабильности Ab6A лекарственного продукта при условиях хранения 5 °C ± 3 °C (обращенные) при форсированных условиях 25°C (25 °C ± 2 °C, 60% относительная влажность, обращенные), и при стрессовых условиях 40 °C (40 °C±2 °C, 75% относительная влажность, обращенные) в соответствии с директивами ICH.

Внешний вид и видимые частицы

Внешний вид и видимые частицы определяли, применяя световой короб, оборудованный источником белого света для образцов в прозрачном флаконе. Результаты теста на внешний вид и видимые частицы лекарственного продукта Ab6A во всех оцененных на настоящий момент условиях: «Жидкость практически не содержит видимых частиц». Наблюдения не меняются в зависимости от условий хранения или времени.

Прозрачность и степень опалесценции

Прозрачность и степень опалесценции измеряли, применяя HACH™ 2100AN турбидиметр. HACH™ StablCal стандартные растворы (<0,1, 1,0, 3,0, 6,0, 10,0, 18,0 и 30,0 NTU)) и очищенную воду (в качестве холостого опыта) применяли для проверки пригодности системы (SST) перед анализом образцов. Не было изменений в прозрачности и степени опалесценции лекарственного продукта Ab6A в начальной временной точке до трехмесячной временной точки во всех условиях.

Варианты с зарядом по HP-IEX

Высокоэффективную ионообменную хроматографию (HP-IEX) проводили на Waters e2695 модуле для разделения с 2489 детекцией в УФ-видимом спектре, применяя Dionex MabPac® SCX-10,10 мкм 4×250 мм, part # 074625. Подвижная фаза A содержит 20 мМ MES, 14 мМ Tris (pH 6,25). Подвижная фаза B содержит 20 ММ NaPO₄, 96 мМ NaCl, 4% ацетонитрил (pH 8,0), и подвижная фаза C содержит 15 мМ EDTA, 40 мМ Tris, 10 мМ CHES, 500 мМ NaCl, pH 8,1. Температуру колонки и образца устанавливали на 35°C и 4°C, соответственно. Общий прогон 70 минут с настройкой градиента при скорости потока 0,5 мл/мин с УФ-детектированием на 280 нм. Для каждой хроматограммы молекулы (Ab6 и MK-3475) была рассчитана относительная процентная площадь для 5 пиков (кислый 2, кислый 1, основной, основный 1 и основный) и их объединяли, чтобы иметь только три категории (кислые варианты, основные и основные варианты) для каждого антитела. Кроме того, нормализуют % каждой группы для каждого антитела, так что % всех пиков равен 100% для каждого антитела, как рассчитано. Кислотные и основные пики MK-3475 и Ab6 разделяли ионообменной колонкой, и они элюируются либо раньше (кислые варианты), либо позже (основные варианты) относительно основного пика. Фигура 47 показывает типичную хроматограмму.

Способ HP-IEX представляет собой комбинированный способ, который разделяет заряженные варианты для обоих Ab6 и MK-3475. Для кислых вариантов обоих Ab6 (Фигура 1) и MK-3475 (Фигура 4), не было изменений в условиях 5°C для данных о стабильности в течение 3 месяцев. Было небольшое увеличение для кислых вариантов обоих Ab6 и MK-3475 в условиях 25°C и резкое увеличение для обоих в условиях 40°C.

Основные соединения для обоих Ab6 и MK-3475 при 5°C не показали изменений в течение 3 месяцев (Фигура 2 и Фигура 5). Было небольшое уменьшение основных соединений при 25°C для обоих, что коррелирует с увеличением кислых вариантов, и резкое уменьшение основных соединений при 40°C для обоих Ab6 и MK-3475.

Основные варианты для Ab6 не показали изменений в условиях и при 5°C и при 25°C вплоть до 3 месяцев (Фигура 3). При 40°C для основных вариантов Ab6, было небольшое увеличение основных вариантов вплоть до 3 месяцев. Основные варианты для MK-3475 также не показали изменения в условиях при 5°C вплоть до 3 месяцев (Фигура 6). Основные варианты для MK-3475 при 25°C показали небольшое снижение и 40°C показали большее снижение в течение 3 месяцев стабильности (таблица 17, таблица 18 и таблица 19).

Таблица 17. Сводка заряженных вариантов для Ab6A при 5°C обращенная

Момент времени (месяцы) анализ первоначальный 1 2 3 заряженные варианты %
по HP-IEX Ab6 кислые варианты 12,5 12,7 12,9 12,3 Ab6 основные в сумме 77,0 77,0 76,8 76,9 Ab6 основные варианты 10,5 10,4 10,3 10,8 MK-3475 кислые варианты 17,8 17,4 17,4 18,4 MK-3475 основные в сумме 58,4 59,9 60,1 58,2 MK-3475 основные варианты 23,8 22,6 22,5 23,4

Таблица 18. Сводка заряженных вариантов для Ab6A при 25°C/60%RH обращенная

Момент времени (месяцы) анализ первоначальный 1 2 3 заряженные варианты % по HP-IEX Ab6 кислые варианты 12,5 14,0 16,6 17,7 Ab6 основные в сумме 77,0 75,4 72,9 71,2 Ab6 Основные варианты 10,5 10,5 10,5 11,0 MK-3475 Кислые варианты 17,8 19,0 21,3 23,7 MK-3475 основные в сумме 58,4 59,0 57,3 54,5 MK-3475 Основные варианты 23,8 22,1 21,3 21,8

Таблица 19. Сводка заряженных вариантов для Ab6A при 40°C/75%RH обращенный

Момент времени (месяцы) анализ первоначальный 1 2 3 заряженные варианты % по HP-IEX Ab6 кислые варианты 12,5 27,2 41,8 49,0 Ab6 основные в сумме 77,0 61,2 46,1 38,4 Ab6 Основные варианты 10,5 11,6 12,1 12,6 MK-3475 кислые варианты 17,8 31,1 44,5 51,7 MK-3475 основные в сумме 58,4 49,0 38,1 31,0 MK-3475 основные варианты 23,8 19,9 17,3 17,3

Чистота по UP-SEC

Эксклюзионная хроматография представляет собой способ разделения по размерам. Ab6 и MK-3475 мономеры являются аналогичными по размерам, таким образом мономеры элюируются совместно. Достигают достаточного отделения HMW частиц от совместно элюирующихся мономеров, и, следовательно, данный способ является подходящим для определения чистоты Ab6A лекарственного продукта (DP). Ab6A DP содержит низкие концентрации высокомолекулярных (HMW) соединений, разрешаемые UP-SEC. Низкомолекулярные (LMW) соединения обычно выявляется, но при низких концентрациях. Проводили обращенно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (RP-HPLC), применяя Waters H-Class Acquity UPLC с HALO C4 UHPLC COLUMN, 2,1×75 мм. Подвижная фаза представляла собой воду с 0,1% (об/об) трифторуксусной кислоты (подвижная фаза A) и ацетонитрил с 0,1% (об/об) трифторуксусной кислоты (подвижная фаза B). Референсные стандарты MK-3475 и Ab6 получали при 4 мг/мл с водой и применяли для построения стандартной кривой, и все образцы разбавляли до 4 мг/мл и вводили 5 мкл для измерения. Колонку и автосэмплер поддерживали при 75°C и 4°C, соответственно. УФ-обнаружение на 280 нм и Water Empower программное обеспечение применяли для анализа данных. Концентрации MK-3475 и Ab6 в целом могут быть основаны на стандартной кривой, полученной при измерении.

UP-SEC для Ab6A не показала изменения в условиях при 5°C для высокомолекулярных соединений и только небольшое увеличение при 25°C с соответствующим небольшим уменьшением количества мономера в течение 3 месяцев стабильности (Фигура 7 и Фигура 8). В условиях при 40°C было увеличение высокомолекулярных соединений с соответствующим уменьшением % мономера вплоть до 3 месяцев.

Невосстанавливающий (NR) CE-SDS и восстанавливающий (R) CE-SDS

В невосстанавливающем (NR) CE-SDS и восстанавливающем (R) CE-SDS анализе применяют Beckman PA800 Plus CE прибор и капилляры из плавленого кремния без покрытия (суммарная длина 30,2 см и внутренний диаметр 50 мкм) с 100×200 мкм отверстием. Образцы получали, применяя набор для анализа чистоты/гетерогенности IgG и обрабатывали перед анализом на приборе в соответствии с перспективными протоколами, где в восстанавливающих условиях образцы mAb денатурировали в присутствии 1,0% SDS и восстанавливали, применяя 5% β-меркаптоэтанол, и в невосстанавливающих условиях образцы mAb денатурировали в присутствии 1,0% SDS и обрабатывали N-этилмалеимидом (NEM) с последующим нагреванием в течение 10 мин при 70°C. Разделение проводили при 15 кВ в течение 40 мин и УФ-детектирование проводили при 220 нм, и программное обеспечение Water Empower применяло для анализа данных. Для NR-CE-SDS интактный IgG (чистота) и общее количество низкомолекулярных примесей приводили в процентах. Для R-CE-SDS общую чистоту (тяжелая цепь+легкая цепь) и общее количество примесей приводили в процентах.

Невосстанавливающий CE-SDS проводили для Ab6A лекарственного продукта вплоть до 3 месяцев на стабильность. При температуре 5°C изменений не наблюдали (Фигура 9 и Фигура 10). При температуре 25°C наблюдали небольшое увеличение суммарного количества низкомолекулярных соединений с соответствующим снижением интактного IgG. Наблюдали более резкое увеличение суммарного количества низкомолекулярных соединений при 40°C с резким снижением интактного IgG вплоть до 3 месяцев на стабильность.

Восстанавливающий CE-SDS проводили для Ab6A лекарственного продукта вплоть до 3 месяцев на стабильность. При температуре 5°C изменений не наблюдали (Фигура 43 и Фигура 44). При температуре 25°C наблюдали небольшое увеличение суммарного количества примесей с соответствующим уменьшением тяжелой цепи+легкой цепи. Было более резкое увеличение суммарного количества примесей при 40°C с резким снижением тяжелой цепи+легкой цепи вплоть до 3 месяцев на стабильность.

Твердые частицы

Характеризацию невидимых частиц проводили, применяя систему визуализации Brightwell Micro-Flow. Каждый образец объединяли из нескольких контейнеров (минимум из трех) в полипропиленовые пробирки объемом 50 мл, осторожно выливая пробирки и оставляя пробирки в покое в условиях окружающей среды в течение 30 минут перед тестированием. Невидимые частицы в диапазоне >1 мкм, >2 мкм, >5 мкм, >10 мкм, >25 мкм, >50 мкм анализировали, применяя стандартный фильтр в программном обеспечении прибора MVSS (версия 2-R5.0.0.43.5864).

Данные о твердых частицах по HIAC рассчитывали для Ab6A лекарственного продукта. При условиях 5°C, 25°C и 40°C результаты были значительно ниже критериев приемлемости: ≤6000 частиц на контейнер для ≥10 мкм и ≤600 частиц на контейнер для ≥25 мкм с начального периода до 3 месяцев). При размерах частиц ≥2 мкм и ≥5 мкм, которые являются отчетными результатами, для всех условий вплоть до 3 месяцев никаких серьезных тенденций в данных не наблюдали.

Окисление MK-3475 по HP-HIC

Хроматографию гидрофобного взаимодействия ВЭЖХ (HP-HIC) проводили на Agilent 1260 системе, применяя Tosoh колонку Phenyl-5PW 10 мкм, 7,5×75 мм (PN 05753). Подвижные фазы представляли собой 2,0% ацетонитрил в 5 мМ фосфате натрия при pH7,0 (подвижная фаза A) и 2,0% ацетонитрил в 400 мМ сульфате аммония и 5 мМ фосфате натрия при pH 6,9 (подвижная фаза B). Скорость потока составляла 0,5 мл/мин. Колонку и автосэмплер поддерживали при 30°C и 4°C, соответственно. Образцы разбавляли водой Milli-Q до 5 мг/мл, на колонку загружали 10 мкл (общее количество вводимой жидкости 50 мкг). Для анализа была установлена длина волны детектирования 280 нм. Приводят относительную площадь в% для предварительного пика 3. Предварительные пики 1 и 2 суммируют, чтобы они равнялись % предварительных пиков 1+2. Кроме того, относительные % площади для постпиков 1 и 2 суммируют, чтобы они были равными % гидрофобных вариантов.

Анализ HP-HIC проводили для оценки окисления MK-3475 в Ab6A лекарственном продукте. Не было изменений суммарного количества предварительных пиков при 5°C (Фигура 45). При температуре 25 ° C наблюдали небольшое увеличение суммарного количества предпиков, и при 40°C было большее увеличение суммарного количества предпиков вплоть до 3 месяцев на стабильность.

Мутность A350

Мутность измеряли, применяя спектрофотометр с УФ поглощением Spectramax UV. 200 мкл образцы помещали в 96-луночный прозрачный планшет Co-star, оптическую плотность измеряли при 350 нм и 500 нм и путь проверяли, корректируя на оптическую плотность планшета 0,025 и 0,020, соответственно.

Мутность A350 оценивали для Ab6A лекарственного продукта. Существенных изменений в условиях при 5°C вплоть до 3 месяцев на стабильность не обнаружено (Фигура 46). Однако было небольшое повышение в улсовиях при 25°C и еще более заметное повышение при 40 ° C вплоть до 3 месяцев.

Пример 10: Тирозиновый анализ и FRET анализ для детекции белок-белкового взаимодействия

Тирозиновый анализ

Ab6 и MK-3475 смешивали в присутствии 10 мМ гистидина, 56 мМ аргинина, 54,0 мг/мл сахарозы, 0,20 мг/мл полисорбата 80, при pH 5,8. Три раствора получали с соотношениями белков MK-3475:Ab6 0:1, 1:0, 1:1, где концентрации Ab6, MK-3475 и концентрации Ab6/MK-3475 составляют 20 мг/мл, 20 мг/мл и 10 мг/мл, соответственно. Результаты флуоресценции, полученные для состава с одним белком и совместного состава, были сопоставимы только в том случае, если общая концентрация белка является одинаковой для всех образцов. Растворы инкубируют при комнатной температуре в течение 72 часов, аликвоты отбирают через равные промежутки времени и подвергают окислению с последующей реакцией флуорогенного мечения.

Образцы, отобранные в заранее определенные моменты времени, смешивают с 2,2'-азобис (2-амидинопропан)дигидрохлоридом (AAPH) и инкубируют при 37°C в течение 3 часов в темноте для окисления белков. Данную реакцию прекращают добавлением метионина. Следующая флуорогенная реакция состоит из смешивания образцов окисленного белка с (2-аминометил) бензолсульфоновой кислотой (ABS) в присутствии мягкого окислителя (K₃Fe(CN)₆).

Реакция окисления ААРН приводит к образованию 3,4-дигидроксифенилаланина (ДОФА) по остаткам тирозина. Реакция флуорогенного мечения дает возможность специфического мечения продуктов ДОФА. Конечный флуорофор состоит из бензоксазольной группы, резонансной с бензольным фрагментом молекулы ABS. Данный флуорофор позволяет отслеживать образование ДОФА по флуоресценции при λ_em=490 нм после возбуждения конечных образцов при λ_ex=360 нм.

Если при хранении образца вплоть до 72 часов происходит агрегация белка, ожидается ослабление сигнала флуоресценции (Фигура 48, столбцы) в зависимости от времени, когда аликвоты отбирают из различных составов белков. Уменьшение флуоресценции можно интерпретировать как изменение конформации белка, ограничивающее доступность некоторых остатков тирозина для реакций окисления и/или флуорогенного мечения. Сигнал флуоресценции, полученный от совместного состава Ab6+MK-3475, является стабильным в течение 72 часов инкубации (Фигура 48, точки). Последнее приводит к выводу, что в совместном составе 1:1 не происходит взаимодействия между MK-3475 и Ab6, которое могло бы повлиять на стабильность белка в растворе.

FRET анализ

Широко применяемый флуоресцентный способ для изучения бимолекулярных взаимодействий является FRET (резонансный перенос энергии Ферстера), который применяет безызлучательный (диполь-дипольный) перенос энергии от флуоресцентного донора к акцептору, который может иметь место только тогда, когда два флуорофора находятся на расстоянии <10 нм. В случае двух белков, меченных донорными и акцепторными метками, это означает, что FRET возникает, только если и когда два белка взаимодействуют друг с другом.

Очищенные белки Ab6 и MK-3475 модифицировали флуоресцентными красителями Dylight-488® и Dylight-596®, соответственно. Dylight-488® и Dylight-596® представляют собой красители, реагирующие с амином, которые реагируют преимущественно с первичным амином остатков лизина. Флуоресцентно меченные Ab6 и MK-3475 имеют названия Ab6-488 и MK-3475-596, где метки 488 и 596 относятся к флуоресцентным красителям Dylight-488® и Dylight-596®, соответственно.

Ab6-488 и MK-3475-596 смешивали в присутствии 10 мМ гистидина, 54,0 мг/мл сахарозы при pH 5,8, в отсутствие или в присутствии i) аргинина (56 мМ) и/или ii) полисорбата 80 (0,20 мг/мл). Соотношения MK-3475-596/Ab6-488 составляют 1:4, 1:1 и 4:1. Из-за чувствительности анализа молярная концентрация флуорогенных меченых белков составляет 3,2 мкМ или 800 нМ в зависимости от соотношения белков. Сигналы FRET флуоресценции регистрируют в течение 72 часов при λ_em=620 нм (λ_ex=488 нм) (Фигура 49).

Если происходит взаимодействие белков, мы ожидаем увидеть рост сигнала флуоресценции как функцию времени (Фигура 49). Взаимодействие оценивают по скорости нарастания флуоресценции и максимуму сигнала флуоресценции. Отсутствие взаимодействия (или уменьшенное взаимодействие) характеризуется: i) низкой скоростью роста сигнала флуоресценции и ii) низким максимальным плато. Сигнал флуоресценции состава с соотношением MK-3475/Ab6 1/4 в присутствии 10 мМ гистидина, 56 мМ аргинина, 54,0 мг/мл сахарозы, 0,20 мг/мл полисорбата 80, при pH 5,8 находится в пределах диапазон базовой линии флуоресценции (Фигура 49). Базовый уровень флуоресценции измеряют в отсутствие меченого белка. Комбинация аргинина и PS80 устраняет белковое взаимодействие между Ab6 и MK-3475 при соотношении смеси 4: 1.

С учетом данных анализа тирозина и анализа FRET, когда совместный состав MK-3475 и Ab6 получают в присутствии 10 мМ гистидина, 54,0 мг/мл сахарозы, 56 мМ аргинина и 0,20 мг/мл полисорбата 80 при pH 5,8, стабильность совместного состава улучшается по сравнению с составом только с антителом для той же матрицы вспомогательных веществ. Для совместных составов 1:1 и 1:4, на основе анализа тирозина и анализа FRET, соответственно, маловероятно, что совместный состав будет обуславливать межбелковые взаимодействия, следовательно, нет увеличения агрегации белков.

Пример 11: исследование окисления совместного состава и состава с одним компонентом

Таблица 20

Ab6A Ab6 (20 мг/мл)+MK-3475 (5 мг/мл),
0,56 мг/мл L-гистидин, 1,35 мг/мл гидрохлорид L-гистидина, 11,8 мг/мл гидрохлорид L-аргинина, 1,19 мг/мл L-метионин, 54,0 мг/мл сахароза, 0,20 мг/мл полисорбат 80, pH 5,8 MK-3475 MK-3475 (5 мг/мл), 0,56 мг/мл L-гистидин, 1,35 мг/мл гидрохлорид L-гистидина, 11,8 мг/мл гидрохлорид L-аргинина, 1,19 мг/мл L-метионин, 54,0 мг/мл сахароза, 0,20 мг/мл полисорбат 80, pH 5,8

Сравнение образцов состава Ab6A и MK-3475, подвергнутых термическому стрессу при 25°C и 40°C в одной и той же матрице состава, показывает, что уровень окисления M105 MK-3475 в композиции Ab6A был ниже по сравнению с MK-3475 отдельно (смотри рисунки 50 и 51). Следовательно, присутствие Ab6 в композиции Ab6A приводит к уменьшенному окислению M105 MK-3475. Совместный состав Ab6:MK-3475 4:1 имеет повышенную стойкость к окислению по сравнению с одним компонентом MK-3475 в той же матрице состава. Уровень окисления M105 измеряли HIC и SEC анализами, описанными в примере 9.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> МЕРК ШАРП И ДОУМ КОРП.

АНТОЩУК, Валентин

ДЕСАИ, Прити, Дж.

КРИШНАМАХАРИ, Йогита

САНГАНИ, Сахил, С.

<120> СОВМЕСТНЫЕ СОСТАВЫ АНТИ-LAG3 АНТИТЕЛА И АНТИ-PD-1 АНТИТЕЛА

<130> 24667-WO-PCT

<150> 62/756,678

<151> 2018-11-07

<160> 76

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Пембролизумаб-Легкая цепь CDR1

<400> 1

Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Пембролизумаб-Легкая цепь CDR2

<400> 2

Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Пембролизумаб-Легкая цепь CDR3

<400> 3

Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 4

<211> 111

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Пембролизумаб-Вариабельная область легкой цепи

<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 5

<211> 218

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Пембролизумаб-Легкая цепь

<400> 5

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 6

<211> 5

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Пембролизумаб-Тяжелая цепь CDR1

<400> 6

Asn Tyr Tyr Met Tyr

1 5

<210> 7

<211> 17

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Пембролизумаб-Тяжелая цепь CDR2

<400> 7

Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asn

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Пембролизумаб-Тяжелая цепь CDR3

<400> 8

Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 9

<211> 120

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Пембролизумаб-Вариабельная область тяжелой цепи

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 447

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Пембролизумаб-Тяжелая цепь

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 11

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 13

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr

1 5

<210> 14

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 15

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 16

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Asn Ser Gly Met His

1 5

<210> 17

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 18

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

Asn Asp Asp Tyr

1

<210> 19

<211> 113

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 20

<211> 440

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser

115 120 125

Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

130 135 140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

145 150 155 160

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys

180 185 190

Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

195 200 205

Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala

210 215 220

Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

225 230 235 240

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

245 250 255

Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val

260 265 270

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

275 280 285

Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

290 295 300

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly

305 310 315 320

Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

325 330 335

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr

340 345 350

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

355 360 365

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

370 375 380

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

385 390 395 400

Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe

405 410 415

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

420 425 430

Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> hPD-1.08A Легкая цепь CDR1

<400> 21

Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Phe Ser Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> hPD-1.08A Легкая цепь CDR2

<400> 22

Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> hPD-1.08A Легкая цепь CDR3

<400> 23

Gln His Ser Trp Glu Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 24

<211> 5

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> hPD-1.08A Тяжелая цепь CDR1

<400> 24

Ser Tyr Tyr Leu Tyr

1 5

<210> 25

<211> 17

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> hPD-1.08A Тяжелая цепь CDR2

<400> 25

Gly Val Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Ser Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> hPD-1.08A Тяжелая цепь CDR3

<400> 26

Arg Asp Ser Asn Tyr Asp Gly Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 27

<211> 120

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> h109A вариабельная область тяжелой цепи

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 28

<211> 111

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> K09A вариабельная область легкой цепи

<400> 28

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 29

<211> 111

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> K09A вариабельная область легкой цепи

<400> 29

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 30

<211> 111

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> K09A вариабельная область легкой цепи

<400> 30

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 31

<211> 447

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь зрелого 409

<400> 31

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 32

<211> 218

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> легкая цепь зрелого K09A

<400> 32

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 33

<211> 218

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> легкая цепь зрелого K09A

<400> 33

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 34

<211> 218

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> легкая цепь зрелого K09A

<400> 34

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser

20 25 30

Gly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro

35 40 45

Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Lys Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg

85 90 95

Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 35

<211> 218

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> легкая цепь иммунноглобулина Ab1

<400> 35

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Leu Asp Tyr Glu

20 25 30

Gly Asp Ser Asp Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 36

<211> 449

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Тяжелая цепь иммунноглобулина Ab 1

<400> 36

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 37

<211> 111

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> вариабельный домен легкой цепи иммунноглобулина Ab1

<400> 37

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Leu Asp Tyr Glu

20 25 30

Gly Asp Ser Asp Met Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser

65 70 75 80

Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 38

<211> 119

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> вариабельный домен тяжелой цепи иммунноглобулина Ab1

<400> 38

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 39

<211> 15

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Ab1 легкая цепь CDR1

<400> 39

Lys Ala Ser Gln Ser Leu Asp Tyr Glu Gly Asp Ser Asp Met Asn

1 5 10 15

<210> 40

<211> 7

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Ab1 легкая цепь CDR2

<400> 40

Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser

1 5

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Ab1 легкая цепь CDR3

<400> 41

Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Arg Thr

1 5

<210> 42

<211> 5

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Ab1 тяжелая цепь CDR1

<400> 42

Asp Tyr Asn Val Asp

1 5

<210> 43

<211> 17

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Ab1 тяжелая цепь CDR2

<400> 43

Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Glu

<210> 44

<211> 10

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Ab1 тяжелая цепь CDR3

<400> 44

Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His

1 5 10

<210> 45

<211> 449

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь иммунноглобулина Ab2

<400> 45

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 46

<211> 119

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> вариабельный домен тяжелой цепи иммунноглобулина Ab2

<400> 46

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 47

<211> 17

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Ab2 тяжелая цепь CDR2

<400> 47

Asp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Glu

<210> 48

<211> 449

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь иммунноглобулина Ab3

<400> 48

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asp Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 49

<211> 119

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> вариабельный домен тяжелой цепи иммунноглобулина Ab3

<400> 49

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asp Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 50

<211> 17

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Ab3 тяжелая цепь CDR2

<400> 50

Asp Ile Asn Pro Asn Asp Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Glu

<210> 51

<211> 449

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь иммунноглобулина Ab4

<400> 51

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Gln Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 52

<211> 119

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> вариабельный домен тяжелой цепи иммунноглобулина Ab4

<400> 52

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Gln Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 53

<211> 17

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Ab4 тяжелая цепь CDR2

<400> 53

Asp Ile Asn Pro Asn Gln Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Glu

<210> 54

<211> 446

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь иммунноглобулина Ab5

<400> 54

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 55

<211> 119

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> вариабельный домен тяжелой цепи иммунноглобулина Ab5

<400> 55

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 56

<211> 17

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Ab5 тяжелая цепь CDR2

<400> 56

Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Glu

<210> 57

<211> 446

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь иммунноглобулина Ab6

<400> 57

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asp Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 58

<211> 119

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> вариабельный домен тяжелой цепи иммунноглобулина Ab6

<400> 58

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asp Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 59

<211> 17

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Ab6 тяжелая цепь CDR2

<400> 59

Asp Ile Asn Pro Asn Asp Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Glu

<210> 60

<211> 446

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь иммунноглобулина Ab7

<400> 60

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 61

<211> 119

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> вариабельный домен тяжелой цепи иммунноглобулина Ab7

<400> 61

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 62

<211> 17

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Ab7 тяжелая цепь CDR2

<400> 62

Asp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Glu

<210> 63

<211> 446

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь иммунноглобулина Ab8

<400> 63

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Gln Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 64

<211> 119

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина Ab8

<400> 64

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Gln Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 65

<211> 17

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Ab8 тяжелая цепь CDR2

<400> 65

Asp Ile Asn Pro Asn Gln Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Glu

<210> 66

<211> 446

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> тяжелая цепь иммунноглобулина Ab9

<400> 66

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 67

<211> 119

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> вариабельный домен тяжелой цепи иммунноглобулина Ab9

<400> 67

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Asn Val Asp Trp Val Arg Gln Ala Arg Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Asn Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Glu Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Arg Trp Phe Gly Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 68

<211> 17

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<223> Ab9 тяжелая цепь CDR2

<400> 68

Asp Ile Asn Pro Asn Gly Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Glu

<210> 69

<211> 214

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="описание синтезированной последовательности:

синтетический полипептид"

<400> 69

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 70

<211> 447

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<221> источник

<223> / примечание="описание синтезированной последовательности:

синтетический полипептид""

<400> 70

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

210 215 220

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 71

<211> 11

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<221> источник

<223> / примечание="описание синтезированной последовательности:

синтетический пептид""

<400> 71

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 72

<211> 7

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="описание синтезированной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 72

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 73

<211> 9

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="описание синтезированной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 73

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu Thr

1 5

<210> 74

<211> 5

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="описание синтезированной последовательности:

синтетический пептид"

"

<400> 74

Asp Tyr Tyr Trp Asn

1 5

<210> 75

<211> 16

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="описание синтезированной последовательности:

синтетический пептид"

"

<400> 75

Glu Ile Asn His Arg Gly Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 76

<211> 12

<212> PRT

<213> Синтезированная последовательность

<220>

<221> источник

<223> / примечание="описание синтезированной последовательности:

синтетический пептид"

<400> 76

Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro

1 5 10

<---

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины, а именно к вариантам стабильного фармацевтического состава, содержащего анти-LAG3 антитело, анти-PD-1 антитело, сахарозу, полисорбат 80, гистидиновый буфер, L-аргинин или его фармацевтически приемлемую соль и L-метионин. Технический результат заключается в снижении самоассоциации, улучшенной коллоидной стабильности анти-LAG3 антитела, а также улучшенной стабильности совместных составов анти-PD-1 и анти-LAG3 антител. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 51 ил., 20 табл., 11 пр.

1. Стабильный фармацевтический состав, содержащий: 18-22 мг/мл анти-LAG3 антитела; 4-7 мг/мл анти-PD-1 антитела; 50-90 мг/мл сахарозы; 0,05-1,0 мг/мл полисорбата 80; 3-30 мМ гистидинового буфера при pH 5,0-6,0; 40-100 мМ L-аргинина или его фармацевтически приемлемой соли; и 5-15 мМ L-метионина; где анти-LAG3 антитело содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 35 и последовательность тяжелой цепи, содержащую последовательность вариабельного участка тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 58, и константную область IgG4, и анти-PD-1 антитело содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 10 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 5.

2. Фармацевтический состав по п.1, содержащий: 18-20 мг/мл анти-LAG3 антитела; 4-7 мг/мл анти-PD-1 антитела; 50-60 мг/мл сахарозы; 0,05-1,0 мг/мл полисорбата 80; 8-12 мМ гистидинового буфера при pH 5,0-6,0; 40-70 мМ L-аргинина или его фармацевтически приемлемой соли; и 5-15 мМ L-метионина.

3. Фармацевтический состав по любому из пп. 1 и 2, содержащий 5-10 мМ L-метионина.

4. Фармацевтический состав по п.1, содержащий: 18,75 мг/мл анти-LAG3 антитела; 6,25 мг/мл анти-PD-1 антитела; 55 мг/мл сахарозы; 0,2 мг/мл полисорбата 80; 10 мМ гистидинового буфера при pH 5,8; 52,5 мМ L-аргинина или его фармацевтически приемлемой соли; и 7,5 мМ L-метионина.

5. Фармацевтический состав по п.1, содержащий: 20 мг/мл анти-LAG3 антитела; 5 мг/мл анти-PD-1 антитела; 54 мг/мл сахарозы; 0,2 мг/мл полисорбата 80; 10 мМ гистидинового буфера при pH 5,8; 56 мМ L-аргинина или его фармацевтически приемлемой соли; и 8 мМ L-метионина.

6. Фармацевтический состав по п.1, содержащий: 20,83 мг/мл анти-LAG3 антитела; 4,17 мг/мл анти-PD-1 антитела; 53 мг/мл сахарозы; 0,2 мг/мл полисорбата 80; 10 мМ гистидинового буфера при pH 5,8; 58,3 мМ L-аргинина или его фармацевтически приемлемой соли; и 8,3 мМ L-метионина.

7. Фармацевтический состав по п.1, содержащий: 18,02 мг/мл анти-LAG3 антитела; 4,505 мг/мл анти-PD-1 антитела; 50 мг/мл сахарозы; 0,2 мг/мл полисорбата 80; 10 мМ гистидинового буфера при pH 5,8; 70 мМ L-аргинина или его фармацевтически приемлемой соли; и 10 мМ L-метионина.

8. Стабильный фармацевтический состав, содержащий: 20 мг/мл анти-LAG3 антитела; 50-90 мг/мл сахарозы; 0,05-1,0 мг/мл полисорбата 80; 5-20 мМ L-гистидинового буфера при pH 5,0-6,0; 40-100 мМ L-аргинина или его фармацевтически приемлемой соли; 5-15 мМ L-метионина; и 5 мг/мл анти-PD-1 антитела, где анти-LAG3 антитело содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 35 и последовательность тяжелой цепи, содержащую вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий SEQ ID NO: 58, и константную область IgG4, и анти-PD-1 антитело содержит последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 10 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 5.

9. Фармацевтический состав по п.8, содержащий: 20 мг/мл анти-LAG3 антитела; 5 мг/мл анти-PD-1 антитела; 50-60 мг/мл сахарозы; 0,05-1,0 мг/мл полисорбата 80; 8-12 мМ L-гистидинового буфера при pH 5,0-6,0; и 40-70 мМ L-аргинина или его фармацевтически приемлемой соли; и 5-10 мМ L-метионина.

10. Фармацевтический состав по п.8, содержащий: 20 мг/мл анти-LAG3 антитела; 50 мг/мл сахарозы; 0,2 мг/мл полисорбата 80; 10 мМ L-гистидинового буфера при pH 5,8-6,0; 70 мМ L-аргинина или L-аргинин-HCl; 10 мМ L-метионина; и 5 мг/мл анти-PD-1 антитела.

11. Фармацевтический состав по любому из пп.1-10, который представляет собой жидкий состав.

12. Фармацевтический состав по любому из пп.1-11, где анти-LAG3 антитело содержит последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 35 и последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO: 57.

13. Фармацевтический состав по любому из пп.1-12, где анти-LAG3 антитело состоит из двух тяжелых и двух легких цепей и анти-PD-1 антитело представляет собой пембролизумаб.

14. Фармацевтический состав по любому из пп.1-3 и 11-13, где молярное отношение анти-LAG3 антитела к анти-PD-1 антителу составляет 4:1.

название	год	авторы	номер документа
АНТИ-PD-1 АНТИТЕЛА	2019	Фаядат-Дилман, Лоренс Цзюань, Вероника Хан, Ширин Хуан, Шаопэн Ин, Хуа	RU2788095C2
АНТИ-ORAI1 АНТИТЕЛО	2015	Комай Томоаки Кимура Такако Баба Дайти Онодера Йосикуни Танака Кенто Кагари Такаси Аки Анри Нагаока Нобуми	RU2724742C2
АНТИ-IL31 АНТИТЕЛА ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ВЕТЕРИНАРИИ	2018	Ли, Шир Цзяннь Нгуйен, Лам Чжань, Ханцзюнь	RU2795485C2
АНТИ-CDH6-АНТИТЕЛО И КОНЪЮГАТ АНТИ-CDH6-АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО	2018	Саито Ацуко Хирата Цуёси Накамура Кенсуке	RU2798285C2
СПОСОБ ОЧИСТКИ ДЛЯ УДАЛЕНИЯ ВАРИАНТОВ АНТИТЕЛ С СУЛЬФАТИРОВАНИЕМ ТИРОЗИНА; ОЧИЩЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ	2017	Чжао, Цзя Райос, Сандра Шюсслер, Светлана Дуклеска	RU2793400C2
АНТИ-ОХ40 АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ	2017	Хардинг, Фиона А.	RU2753493C2
АНТИТЕЛА АНТИ-TNFRSF25	2017	Шрейбер Тейлор Х. Хатчинс Джефф Т.	RU2746314C2
АНТИ-SIRPα АНТИТЕЛА	2018	Верхейден, Гейсбертус Франсискус Мария Раувендал, Герард Арендс, Роланд Ян Ван Ден Берг, Тимо Карс Матлунг, Ханке Лотти Франке, Катарина	RU2771174C2
АНТИ-CEACAM1 АНТИТЕЛО И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ	2018	Еун, Со-Янг Ох, Миянг Парк, Хие-Янг Ли, Мидзунг Йоон, Аерин Юм, Хие Ин Нам, Хиеми Ли, Еунхи Вон, Дзонгвха	RU2754876C2
АНТИ-CD39 АНТИТЕЛА, КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ АНТИ-CD39 АНТИТЕЛА, И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ АНТИ-CD39 АНТИТЕЛ	2018	Сорос, Ванесса Коваленко, Мария Корбин, Джон Биирс, Кортни Видбоом, Пол Фредерик Варфилд, Джозеф Роберт	RU2795348C2

WO 2016168716 A1, 20.10.2016
WO 2016028672 A1, 25.02.2016
US 2015290325 A1, 15.10.2015
US 2016090419 A1, 31.03.2016
WO 2018091729 A2, 24.05.2018
СТАБИЛЬНЫЕ КОМПОЗИЦИИ С ВЫСОКИМИ КОНЦЕНТРАЦИЯМИ БЕЛКОВ АНТИТЕЛ ЧЕЛОВЕКА ПРОТИВ TNF-АЛЬФА	2010	Фраунхофер Вольфганг Краузе, Ханс- Юрген Ной Михаэль	RU2560701C2

СОВМЕСТНЫЕ СОСТАВЫ АНТИ-LAG3 АНТИТЕЛА И АНТИ-PD-1 АНТИТЕЛА Российский патент 2024 года по МПК A61K9/08 A61K39/395 A61K47/18 A61K47/20 A61K47/22 A61K47/26

Описание патента на изобретение RU2822192C2

Похожие патенты RU2822192C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 822 192 C2

Реферат патента 2024 года СОВМЕСТНЫЕ СОСТАВЫ АНТИ-LAG3 АНТИТЕЛА И АНТИ-PD-1 АНТИТЕЛА

Формула изобретения RU 2 822 192 C2

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2024 года RU2822192C2

RU 2 822 192 C2