Водорастворимые сульфосодержащие полимеры с собственной противовирусной активностью и способ их получения Российский патент 2024 года по МПК C08F12/08 C08F12/30 C08F212/08 C08F212/14 A61K31/795 A61P31/14 

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, а именно к получению водорастворимых полимеров биомедицинского назначения, обладающих противовирусной активностью.

Известно, что многие полианионы проявляют широкий спектр биологической активности, в частности, противовирусную и являются индуктором интерферона [Ершов Ф.И., Виноград И.А., Козловский М.М. «Биологическая активность отечественного индуктора интерферона, созданного на основе малеинового ангидрида». Сб.«Полимеры медицинского назначения» М.: Наука 1988 с. 127-152]. Противовирусное действие проявляют сополимеры кротоновой кислоты и малеинового ангидрида с N-винилпирролидоном. Они предупреждают гибель животных, зараженных вирусом клещевого энцефалита, гриппа, а также вирусом алеутской болезни норок [Зайтленок Н.А., Вильнер Л.М., Трухманова Л.Б., Кропачев В.А., Родин И.М., Маркелова Т.М., Голодфарб М.М. Вопросы вирусологии 1968, №4 с. 401; Тарасов В.Н., Кропачев В.А., Трухманова Л.Б. Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии 1970, № 11, с. 89-].

Противовирусная активность обнаружена у карбоцепных сульфосодержащих водорастворимых полимеров - в отношении различных вирусов [Scihandok F, K.F/ riber at. al Macromolecular activiral asents against Zika, Ebola, SARS and other pathogenic viruse Advanced Mater 2017 1700-745] в том числе патогенных вирусов Zika, Ebola, SARS.

Известно, что среди сульфосодержащих полимеров высокую активность проявляет полистиролсульфонат натрия в отношении вирусов ВИЧ-1, ВИЧ-2, генитального герпеса и др. и рассматривается перспективным кандидатом для использования в качестве безопасного эффективного вагинального контрацептива против заболеваний, передающихся половым путем [R.A. Anderson, K. Robert, A. Anderson, K. Feathergill, X. Diao, M. Cooper, R. Kirkpatrick, P. Spear, D.P. Waller, C. Chany, G.F. Doncel, B. Herold, L.J.D. Zaneveld, J. Andrology, 2000, 21, 862; DOI: 10.1002/j.1939-4640.2000.tb03417.x.].

Полагают [M.T. Shich, D. Wu Dunn, R.J. Montgomery, J.D. Elso, R.G. Spear. J. Cell. Biol. 116, 1273 (1992)] что, блокирование сульфосодержащими полианионами природного или синтетического происхождения взаимодействия вирусного лиганда с глюкозаминовым рецептором, расположенным на поверхности целевой клетки, препятствует развитию инфекционного процесса.

Известно получение путем гетерофазной сополимеризации сульфосодержащих гомо- и сополимеров на основе 2-акриламидо-2-метилпропансульфокислоты, имеющих противовирусную активность в отношении вирусов гриппа H₁N₁, H₃N₂ [Патент РФ №2635558. Бюл. изобр. 2017 №32].

Известны сополимеры N-виниламидов с солями оксикоричной кислоты, обладающие активностью в отношении респираторно-синцитиального вируса человека А-2 (патент РФ №2796573 Бюл. №6).

В ходе поиска не удалось найти сведений о гомо- и сополимерах стиролсульфоната натрия, обладающих активностью в отношении синцитиального вируса человека.

Технической задачей и положительным результатом изобретения является синтез нетоксичных сульфосодержащих сополимеров на основе стиролсульфоната натрия c высокой противовирусной активностью в отношении респираторно-синцитиального вируса человека и более низкой цитотоксичностью, чем полистиролсульфонат натрия.

Указанная задача достигается тем, что сульфосодержащие полимеры получают путем радикальной сополимеризации стиролсульфоната натрия с гидрофильными и гидрофобными виниловыми сомономерами в воде, органическом (ДМСО, ДМФА) или водно-органическом (H₂O/ДМСО, H₂O/ДМФА) растворителе, при температуре 65°С в атмосфере инертного газа с использованием азоинициаторов: 2,2'-бисазобисизобутиронитрила (ДАК) и 2,2'-азобис-2-метилпропанамидин дигидрохлорида (МПХ) с последующим выделением их стандартными методами. Сополимеры имеют общую формулу: A_m - B_n,

где: А и В - полимерные звенья;

А - звено стиролсульфоната натрия;

В - звено винилового сомономера;

m и n – содержание А и В в мол.%;

m - 18÷93;

n - 100- m мол.%

с характеристической вязкостью [] = 0,22 - 1,34 дл/г в 0.1 н NaCl при температуре 25°С.

При этом в качестве винилового сомономера берут стирол (Ст), N-винилпирролидон (ВП), N-винилформамид (ВФА), акриламид (АА), N-метил-N-винилацетамид (МВАА), п-(мет)акрилоиламиносалициловую кислоту (МАСК), п-(мет)акрилоиламинобензойную кислоту (МАБК).

Информационный поиск показал отсутствие каких-либо опубликованных документов, в которых была бы описана совокупность существенных признаков, а также решения, полностью совпадающее с представленными в заявке на изобретение.

Синтезированные сополимеры и полученный впервые результат является неочевидным и не вытекает из существующего уровня техники. Синтез сополимеров.

Сополимеризацию стиролсульфоната натрия с виниловыми сомономерами проводили в водно-органическом растворителе смеси H₂O/ДМСО или H₂O/ДМФА при 65°С в ампулах в атмосфере аргона в течение 24 ч. В качестве радикальных инициаторов использовали ДАК или МПХ. Сополимеры очищали диализом против воды и выделяли лиофильно. Их молекулярная масса оценивалась характеристической вязкостью в 0,1 н NaCl при 25°С.

Состав, полученных сополимеров и их структура определялись по данным элементного анализа на азот, ИК и УФ - спектроскопией, а также потенциометрическим титрованием 0,1 н NaOH, после удаления ионов Na⁺ путем пропускания растворов сополимеров через ионообменную колонку, заполненную катионитом КУ-2 в Н-форме. Строение синтезированных сополимеров подтверждали методами УФ (λ_max = 262 нм для звена CCNa), ИК, ЯМР - спектроскопии. В ИК спектрах наблюдаются полосы поглощения при 624, 1038 и 1219 см^-1, характерные для SO₃^- группы, полосы 1660 и 1680, характерные для валентных колебаний ароматического кольца и карбонильной С=О группы. Условия сополимеризации и характеристики синтезированных сополимеров представлены в таблице 1.

Все синтезированные сополимеры проявляют высокую противовирусную активность, низкую цитотоксичность и демонстрируют более высокий химико-терапевтический индекс, чем гомополимер стиролсульфоната натрия.

Таблица 1 - Условия синтеза, структурные характеристики и биологические свойства сополимеров стиролсульфоната натрия (CCNa) - А с виниловыми мономерами - В (винилпирролидоном (ВП), винилформамидом (ВФА), метилвинилацетамидом (МВАА), стиролом (Ст), акриламидом (АА), п-(мет)акрилоилсалициловой кислотой (МАСК), п-(мет)акрилоиламинобензойной кислотой (МАБК)). Продолжительность сополимеризации 24 ч, температура сополимеризации - 65°С № Сомономер наименование Состав исходной смеси, мол. % Растворитель Инициатор масс % Выход масс. % Состав сополимера, мол. % [η]²⁵ _{0.2 М NaCl}, дл/г ЦТД₅₀, мкг/мл ЭД₅₀, мкг/мл ХТИ А В А В 1 ВП 40 60 Н₂О+ДМФА ДАК, 3 90 35 65 0.37 273 3.3 83 2 ВП 20 80 Н₂О+ДМФА ДАК, 3 96 18 82 0.34 262 1.7 154 3 МВАА 30 70 Н₂О+ДМСО ДАК, 3 80 25 75 0.58 469 4.2 112 4 МВАА 40 60 Н₂О+ДМФА ДАК, 3 85 43 57 0.15 195 2.0 98 5 ВФА 50 50 Н₂О МПХ, 3 90 45 55 0.96 312 1.9 165 6 ВФА 72 28 Н₂О+ДМФА ДАК, 3 98 72 28 0.24 276 2.5 110 7 Ст 73 27 Н₂О+ДМФА ДАК, 1 83 67 33 0.22 230 1.5 131 8 АА 50 50 Н₂О МПХ, 3 93^* 50 50 1.07 1000 3.7 270 9 CCNa 100 - Н₂О МПХ, 0.2 92 100 0 0.63 163 3.5 47 10 МАБК 70 30 Н₂О+ДМСО ДАК, 1 83 75 25 1.3 262 1.7 154 11 МАСК 85 15 Н₂О+ДМФА+ДМСО ДАК, 1 84 88 12 0.4 325 3.4 96

Для подтверждения соответствия заявленного решения условиям патентоспособности, промышленной применимости приводим примеры конкретной реализации изобретения, которыми не исчерпывается сущность изобретения.

Пример 1 Синтез сополимера стиросульфоната натрия (CCNa) с N-винилпирролидоном (ВП) состава 35 : 65 мол %.

В стеклянную ампулу загружают 0,24 г ВП (60 мол %) и 0,31 г (40 мол %) CCNa, 0,018 г инициатора радикальной полимеризации ДАК, 1 мл Н₂О и 4 мл диметилсульфоксида (ДМСО), продувают аргоном и запаивают ампулу, нагревают при 65°С в течение 24 часов. Полученный сополимер растворяют в воде, удаляют низкомолекулярные примеси диализом против воды и выделяют методом лиофильной сушки. Выход 0,54 г (90% от теоретического). Состав сополимера определяют методом УФ-спектроскопии при λ_max 262 нм (содержание звеньев CCNa), а также потенциометрическим титрованием 0,1 н NaOH после перевода его в Н-форму с использованием хроматографической колонки с катионитом КУ-2 в Н-форме. Полученный сополимер имеет состав (ВП- CCNa) 65 : 35. [η] = 0,37 дл/г в 0,2 н NaCl при 25°С.

Пример 2. Синтез сополимера стиросульфоната натрия (CCNa) с N-винилпирролидоном (ВП) состава 18 : 82 мол %.

По методу, описанному в примере 1 из 0,5 г ВП и 0,23 г CCNa получают сополимер CCNa - ВП состава 18 : 82 с выходом 0,7 г (96 % от теоретического). [η] = 0,34 дл/г в 0,2 н NaCl при 25°С.

Пример 3. Синтез сополимера N-метил-N-винилацетамид (МВАА) со стиролсульфонатом натрия (CCNa) состава 75 : 25 мол %.

По методу, описанному в примере 1 в ампулу загружают 0,5 г МВАА (70 мол %), 0,44 г CCNa (30 в мол %), 0,029 г ДАК и 7,5 мл растворителя (ДМСО - Н₂О состава 5 : 1), запаивают ампулу после продувки аргоном и нагревают при 65°С в течение 24 часов. Полимер очищают, выделяют и анализируют по примеру №1. Выход 0,84 г (80% от теоретического). Состав (МВАА : CCNa) 65 : 35 мол %. [η] = 0,58 дл/г в 0,2 н NaCl при 25°С.

Пример 4. Синтез сополимера N-метил-N-винилацетамид (МВАА) со стиролсульфонатом натрия (CCNa) состава 57 : 43 мол %.

По методу, описанному в примере 3 из 0,2 г МВАА (60 мол %), 0,275 г CCNa (40 в мол %) получают 0,34 г сополимера (выход 80% от теоретического). Состав сополимера (МВАА : CCNa) 57 : 43 мол %. [η] = 0,15 дл/г в 0,2 н NaCl при 25°С.

Пример 5. Синтез сополимера стиролсульфоната натрия (CCNa) с N-винилформамидом (ВФА) состава 45 : 55 мол %.

По методу, описанному в примере 1 из 0,13 г ВФА (50 мол %) и 0,38 г CCNa (50 мол %) в воде с использованием водорастворимого радикального инициатора 2,2'-азобис-2-метилпропанамидин дигидрохлорида (МПХ) получают 0,51 г сополимера (выход 90% от теоретического) состава (CCNa : ВФА) 45:55 мол %. [η] = 0,96 дл/г в 0,2 н NaCl при 25°С.

Пример 6. Синтез сополимера стиролсульфоната натрия (CCNa) с N-винилформамидом (ВФА) состава 28 : 72 мол %.

По методу, описанному в примере 1 из 0,3 г CCN (30 мол %) и 0,27 г ВФА (70 мол %) в смеси 4 мл ДМСО и 1 мл Н₂О с использованием 0,017 г ДАК получают 0,58 г сополимера (выход от теоретического 98 %) состава 28:72. [η] = 0,24 дл/г в 0,2 н NaCl при 25°С.

Пример 7. Синтез сополимера стиролсульфоната натрия (CCNa) со стиролом (Ст) состава 67 : 33 мол %.

В ампулу загружают 1,0 г CCNa, 0,19 г Ст, 0,01 г ДАК, 7,8 мл ДМФА и нагревают в течение 24 ч при 70°С. Сополимер осаждают ацетоном, отделяют на фильтре, затем растворяют в воде, подвергают диализу против воды, выделяют лиофильно. Выход 1 г (83% от теоретического). [η] = 0,22 дл/г в 0,2 н NaCl при 25°С. Состав сополимера определяют потенциометрическим титрованием после удаления ионов Na⁺ на колонке, заполненной катионитом КУ-2 в Н-форме. Состав сополимера (CCNa : Ст) 67 : 33 мол %.

Пример 8. Синтез сополимера стиролсульфоната натрия (CCNa) с акриламидом (АА) состава 50:50 мол %.

По методу, описанному в примере 1, в ампулу загружают 1,0 г CCNa (50 мол %), 0,34 г АА (50 в мол %), 0,04 г МПХ и 3,1 мл растворителя (Н₂О), запаивают ампулу после продувки аргоном и нагревают при 65°С в течение 1,5 часов. Полимер очищают, выделяют и анализируют по примеру №1. Выход 1,26 г (93% от теоретического). Состав (CCNa : АА) 50 : 50 мол %. [η] = 1,07 дл/г в 0,2 н NaCl при 25°С.

Пример 9. Синтез полистиролсульфоната натрия (CCNa).

5 г CCNa, 0,01 г МПХ в воде, продувают аргоном и запаивают ампулу, Гомополимеризацию проводят при 65°С в течение 24 часов. Полимер очищают диализом против воды и выделяют лиофильной сушкой. Выход 4,6 г (92 % от теоретического). [η] = 0,63 дл/г в 0,2 н NaCl при 25°С.

Пример 10. Синтез сополимера стиролсульфоната натрия (CCNa) с 4-(мет)акрилоиламинобензойной кислотой (МАБК) состава 75 : 25 мол %.

В стеклянную ампулу загружают последовательно 1,0 г CCNa (70 мол %), 0,48 г МАБК (30 мол %), 0,015 г ДАК, 7,7 мл ДМСО и 1,7 мл Н₂О, продувают аргоном, запаивают ампулу и нагревают при 65°С в течение 24 часов. После завершения полимеризации реакционную массу растворяют в 10 мл 1 N NaOH, подвергают диализу для удаления низкомолекулярных компонентов против воды и выделяют методом лиофильной сушки. Выход 1,3 г (83 % от теоретического), состав сополимера (CCNa : МАБК) 75 : 25 мол %. [η] = 1,30 дл/г в 1 м NaCl при 25°С. Состав сополимера определяют элементным анализом на азот.

Пример 11. Синтез сополимера стиролсульфоната натрия (CCNa) с 4-(мет)акрилоиламиносалициловой кислотой (МАСК) состава 88 : 12 мол %.

По методу, описанному в примере 10, из 1.0 г CCNa (85 мол %), 0,21 г МАСК (15 мол %), 0,012 г ДАК, 2,7 мл ДМСО, 2,7 мл ДМФА и 1,2 мл Н₂О получают 1,1 г (выход от теоретического 84%) сополимера (CCNa : МАСК) состава 88 : 12 мол %. [η] = 0,41 дл/г в 1 м NaCl при 25°С. Состав сополимера определяют методом спектрометрии при λ_max = 301 нм для звеньев МАСК.

Методика биологических исследований

У всех синтезированных сополимеров определялась цитотоксичность (ЦТД₅₀) и противовирусная активность (ЭД₅₀) in vitro в отношении вируса респираторного синцитиального вируса человека А-2, а также химиотерапевтический индекс (ХТИ), представляющий собой отношение ЦТД₅₀/ЭД₅₀.

Для оценки цитотоксичности использовали культуру клеток эпидермоидной карциномы гортани человека (НЕр-2), полученную из рабочей коллекции лаборатории химиотерапии вирусных инфекций ФГБУ «НИИ Гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России.

Противовирусную активность оценивали в отношении широко распространенного среди населения Земли респираторно-синцитиального вируса человека штамм А2, полученного из рабочей коллекции лаборатории химиотерапии вирусных инфекций ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России.

Определение цитотоксичности полимеров.

Навеску полимера массой 2 мг растворяют в 100 мкл диметилсульфоксида. Далее доводят полученный раствор до концентрации 1000 мкг/мл средой (питательная среда ДМЕМ с глюкозой 4,5 мг/мл), и готовят из него серию 2-кратных разведений. Односуточную культуру клеток (HEp2) выращенную на 96-луночных планшетах с концентрацией клеток 3×10⁵ в лунке, проверяют визуально на целостность монослоя с использованием инвертированного микроскопа. Отбирают планшеты, в которых сомкнутость слоя клеток достигает 60-80%. В планшеты вносят 100 мкл раствора полимеров заданной концентрации, и планшеты инкубируют при 37°С с 5% СО₂ в течение 24 ч.

Оценку жизнеспособности клеток проводят с использованием микротетразолиевого теста (МТТ), который основан на восстановлении тетразолиевого (желтого) красителя дегидрогеназами живых клеток до формазана, имеющего голубой цвет, и его концентрацию определяют спектрофотометрически, при λ_max 535 нм после 1,5 часового контакта и рассчитывают концентрацию полимера в лунке, при которой погибает 50% клеток (ЦТД₅₀) - цитотоксическая доза.

Определение противовирусной активности полимеров методом иммуноферментного анализа (ИФА)

Путем 3-кратных разведений готовят водные растворы полимеров, начиная с концентрации ½ ЦТД₅₀, наносят на культуру клеток (НЕр-2) по 100 мкл на лунку в двойной концентрации и добавляют по 100 мкл вируса в серии 10-кратных разбавлений, после чего снова инкубируют в течение 1 часа при температуре 37°С и 5% СО₂, затем вирусы отмывают и снова наносят растворы полимеров с концентрацией ½ ЦТД₅₀ и инкубируют в течение 6 суток при 37°С в атмосфере 5% СО₂.

Для проведения ИФА (cell-ELIZA) клеточную культуру фиксируют холодным 80%-м ацетоном (t=-20°C) в течение 15 минут, затем промывают фосфатным буфером с добавлением Tween 20 до концентрации 0,05%; наносят на культуру раствор первичных мышиных антител к белку F респираторно-синцитиального вируса А2 инкубируют при непрерывном перемешивании в течение 2 часов при комнатной температуре. После этого клетки снова промывают буферным раствором и наносят вторичные антимышиные антитела, снова инкубируют при непрерывном перемешивании в течение 2 часов при комнатной температуре, отмывают антитела и наносят субстрат-хромогенную смесь, содержащую тетраметилбензидин. Через 5 минут реакцию останавливают добавлением 0,1н серной кислоты и определяют оптическую плотность раствора при λ_max = 450 нм. Лунки, в которых значение оптической плотности превышает в два и более раз по сравнению с контролем клеток, считают зараженными. Рассчитывают титр вируса известным методом Рида и Менча (Reed L.J., Muench H. // Am. J. Hygiene. 1938. V. 27. P. 493-497). Определяют концентрации полимера, при которых наблюдается снижение титра вируса в клетках и проводят расчет эффективной концентрации (ЭД₅₀) полимера, при которой титр вируса снижается на 50%.

Статистическую обработку результатов исследований проводили при помощи критерия t-Стьюдента с использованием программного пакета Microsoft Office Excel.

Данные цитотоксичности, противовирусной активности и значения химиотерапевтического индекса, синтезированных сополимеров разного химического строения, в отношении вирусов респираторно-синцитиального вируса человека приведены в таблице 1.

Проведенные биологические тесты подтверждают решение поставленной задачи - синтез водорастворимых сульфосодержащих полимеров с противовирусной активностью в отношении респираторно-синцитиального вируса человека А-2, обладающих низкой цитотоксичностью. Выход за пределы составов, заявляемых в описании, снижает противовирусную активность, повышает цитотоксичность и уменьшает значение химико-терапевтического индекса.

Технический результат заключается в получении сополимеров с низкой цитотоксичностью, с высокой активностью против респираторно-синцитиального вируса человека А-2, а также в использовании полученных сополимеров в качестве основы для создания эффективных противовирусных лекарственных средств.

Настоящее изобретение относится к сульфосодержащим сополимерам, обладающим противовирусной активностью в отношении респираторно-синцитиального вируса человека А-2. Сополимеры представляют собой соединения формулы: [А]_m[В]_n, в которой А – звено стиролсульфоната натрия, В – звено винилового сомономера, m=1÷93 мол.%, n=100-m мол.%. Характеристическая вязкость сополимеров [η] составляет 0,22-1,34 дл/г в 0,1 н NaCl при 25°С. Сополимеры получают радикальной сополимеризацией в воде или водно-органическом растворителе в присутствии радикального инициатора. Полученные сополимеры обладают низкой цитотоксичностью и высокой противовирусной активностью в отношении респираторно-синцитиального вируса человека А-2. 1 табл., 11 пр.

Сульфосодержащие полимеры с противовирусной активностью в отношении респираторно-синцитиального вируса человека А-2 общей формулы:

А_m - В_n,

где: А – звено стиролсульфоната натрия,

В – звено винилового сомономера,

m и n – содержание А и В в мол.%,

при этом m=18÷93, n=100-m мол.%,

с характеристической вязкостью [η] = 0,22 - 1,34 дл/г в 0,1 н NaCl при 25°С, при этом в качестве винилового сомономера берут стирол (Ст), N-винилпирролидон (ВП), N-винилформамид (ВФА), акриламид (АА), N-метил-N-винилацетамид (МВАА), п-(мет)акрилоиламиносалициловую кислоту (МАСК), п-(мет)акрилоиламинобензойную кислоту (МАБК), полученные радикальной сополимеризацией в воде или водно-органическом растворителе.