Сополимеры N-виниламидов с солями оксикоричной кислоты Российский патент 2023 года по МПК C08F226/06 C08F226/10 A61P31/12 

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, в частности, к сополимерам N-виниламидов (ВА) с собственной биологической активностью, предназначенных для использования в качестве полимеров – носителей и для создания эффективных лекарственных средств с противовирусной активностью.

Известно, что поли-N-виниламиды широко используются в фармацевтике, медицине, биотехнологии и технике (Кирш Ю.Э., Лавров Н.А., Соловский М.В., Шальнова Л.И. Полимеры - носители биологически активных веществ СПб.: ЦОП «Профессия» 2014 – 304 с.).

Гомополимеры N-виниламидов водорастворимы, нетоксичны, а их сополимеры с различными сомономерами обладают широким спектром биологической активности: антимикробным, интероногенным, противоопухолевым, ростстимулирующим, иммуностимулирующим действием. [Панарин Е.Ф. N-виниламиды и полимеры на их основе – носители биологически активных веществ (Изв. АН Сер. Хим. 2015 № 1, с. 15-23).

Известны авторские свидетельства № 221288, № 316703, в которых описывается способ получения сополимеров N-винилпирролидона с оксикоричной кислотой путем радикальной сополимеризации кумарина с N-винилпирролидоном, с последующим раскрытием лактонного кольца путем гидролиза в щелочной среде, с осаждением сополимера путем нейтрализации минеральной кислотой.

Однако, в материалах описания данных изобретений никаких данных о биологической активности сополимеров N-винилпирролидона с солями оксикоричной кислоты нет.

В связи с широким распространением респираторных вирусных заболеваний актуальной задачей является создание полимеров с противовирусной активностью на основе N-виниламидов.

Задача решена созданием сополимеров N-виниламидов с солями оксикоричной кислоты общей формулы:

A_n – B_m

где:

A - N-виниламидное звено;

B – звено соли оксикоричной кислоты;

n и m содержание А и В в мол%, n = 100-m, а m = 15÷48

с характеристической вязкостью [η] ²⁵_0.1нNaCl от 0,2 до 0,5 дл/г.

При этом в качестве N-виниламидного звена берут N-винилпирролидон (ВП), N-винилформамид (ВФА), N-метил-N-винилацетамид (МВАА).

Положительным результатом изобретения является синтез сополимеров на основе N-виниламидов с противовирусной активностью, нетоксичных, эффективных в отношении респираторно-синцитиального вируса человека А2.

В ходе поиска не удалось найти сведений о сополимерах N-виниламидов с оксикоричной кислотой, обладающих какими-либо видами биологической, в том числе противовирусной, активности. Информационный поиск показал отсутствие опубликованных документов, в которых была бы описана совокупность существенных признаков, а также решение полностью совпадающего с представленным в заявке на изобретение. Таким образом, мы можем утверждать, что заявляемое изобретение характеризуется таким признаком охраноспособности как новизна.

Синтезированные сополимеры и полученный впервые результат является неочевидным и не вытекает из существующего уровня техники. Это подтверждает соответствие заявляемого изобретения такому признаку охраноспособности как изобретательский уровень.

Синтез сополимеров.

1. Сополимеризацию N-виниламидов с кумарином проводят в массе в присутствии радикального инициатора динитрила азобисизомасляной кислоты (ДАК). Условия сополимеризации и характеристики полученных сополимеров представлены в таблице 1.

2. Сополимеры выделяют осаждением из раствора в органический растворитель в диэтиловый эфир. Молекулярная масса полученных сополимеров оценивалась характеристической вязкостью при 25ºС в диметилформамиде (ДМФА).

3. Водорастворимые сополимеры N-виниламидов с солями (Na⁺, K⁺) оксикоричной кислоты получают щелочным гидролизом сополимеров кумарина с N-виниламидами с последующим диализом против воды и лиофильной сушкой. Условия гидролиза и характеристики полученных сополимеров представлены в таблице 2.

Молекулярная масса полученных сополимеров оценивалась характеристической вязкостью при 25ºС в воде в 0,1 н NaCl.

Состав полученных сополимеров определялся по данным элементного анализа на азот, методом УФ и ЯМР-спектроскопии, а также потенциометрическим титрованием звеньев оксикоричной кислоты в сополимерах.

Для подтверждения заявленного решения условию патентоспособности - промышленная применимость приводим примеры конкретной реализации изобретения, которыми не исчерпывается сущность изобретения.

Пример 1 Синтез сополимера N-винилпирролидона (ВП) с аммониевой солью оксикоричной кислоты (ОК NH₄⁺).

В ампулу загружают 1,97 мл ВП (90 мол%), 0,29 г кумарина (К) (10 мол%) и 0,023 г ДАК (1 масс% от суммы сомономеров), нагревают при 70°С в течение 1 часа в токе аргона. Полученный сополимер растворяют в ДМФА и выделяют осаждением в диэтиловый эфир с последующей вакуумной сушкой при комнатной температуре. Выход 0,84 г (37% от теоретического). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМФА при 25ºС [η]=0,49 дл/г. Состав сополимера -66 (ВП) – 34 (К) мол%.

0,3726 г сополимера (ВП - К) перемешивают с 6,88 мл воды и добавляют 0,19 мл 10% раствора NaOH, нагревают при 70 ºС в течение 4 часов. Затем проводят нейтрализацию избытка NaOH 0,1 н HCl. При рН = 2 сополимер (ВП – ОК) полностью выпадает в осадок, который выделяют из реакционной среды центрифугированием и сушкой при комнатной температуре в вакууме. Выход 0,39 г (99 % от теоретического). К сополимеру ВП с оксикоричной кислотой добавляют 6,5 мл 0,1 н NH₄ OH. Сополимер аммониевой соли оксикоричной кислоты выделяют диализом против воды и лиофильно сушат. Полученный сополимер имеет состав -71 мол% (ВП) - 29 мол% (ОК NH₄⁺). Выход 0,407 г (81% от теоретического). Характеристическая вязкость, измеренная в 0,1н NaCl при 25ºС [η]=0,4 дл/г.

Пример 2 Синтез сополимера N-винилпирролидона с калиевой солью оксикоричной кислоты.

По методу, описанному в примере 1 смесь 1,97 мл ВП (70 мол%), 1,13 г кумарина (30 мол%) и 0,0987 г ДАК (3 масс% от суммы сомономеров) нагревают при 90°С в течение 1 часа в токе аргона. Полученный сополимер растворяют в ДМФА и выделяют осаждением в диэтиловый эфир с последующей вакуумной сушкой при комнатной температуре. Выход 2,61 г (83% от веса сомономеров). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМФА при 25ºС [η]=0,205 дл/г. Состав сополимера - 64 (ВП) -36 (К) мол%.

Для получения калиевой соли оксикоричной кислоты с ВП к 1 г сополимера добавляют 6,1 мл 0,1 н КOH Смесь 1,14 г полученного сополимера и 13 мл 5% раствора КOH нагревают с перемешиванием при температуре при 70ºС в течение 3 часов. Водорастворимый сополимер калиевой соли оксикоричной кислоты выделяют диализом против воды и лиофильно сушат. Выход 1,12 г (98% от теоретического). Состав сополимера -60 (ВП) – 40 (ОК К⁺) мол%.

Пример 3 Синтез сополимера N-винилформамида с натриевой солью оксикоричной кислоты.

В ампулу загружают 1 г ВФА (83мол%), 0,4 кумарина (17 мол%), 0,042 г ДАК (1% от суммы сомономеров), продувают аргоном, выдерживают при 65°С в течение 24 часов. Полученный сополимер растворяют в ДМФА и выделяют осаждением в ацетон с последующей вакуумной сушкой при комнатной температуре. Выход 1,14 г (81% от веса сомономеров). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМФА при 25ºС [η]=0,3 дл/г. Состав сополимера- ВФА 84 мол% – К 16 мол%.

0,5г полученного сополимера растворяют в 17,5 мл 0,09 н раствора NaOH при перемешивании при комнатной температуре в течение 20 ч. Сополимер ВФА и натриевой соли оксикоричной кислоты выделяют диализом против воды и лиофильно сушат. Выход 0,435 г (81% от теоретического). Характеристическая вязкость, измеренная в 0.1н NaCl при 25ºС [η]=0,42 дл/г. Состав сополимера- 83 (ВФА) – 17 (ОК Na⁺) мол%.

Пример 4 Синтез сополимера N-винилформамида с натриевой солью оксикоричной кислоты. Состав исходной смеси .

По методу, описанному в примере 3 из 1 г ВФА (70 мол%) и 0,88г кумарина (30 мол%), 0,019 г ДАК. Выход 0,66 г (35%). Состав сополимера- 66 (ВФА)– 34 (К) мол%. Характеристическая вязкость, измеренная в ДМФА при 25ºС [η]=0,29 дл/г.

0,4г полученного сополимера растворяют при перемешивают в 32 мл 0,09 н раствора NaOH при комнатной температуре в течение 24 ч. Очищают диализом и лиофильно сушат. Выход 0,359 г (46% от теоретического). Характеристическая вязкость, измеренная в 0,1н NaCl при 25ºС [η]=0,2 дл/г.

Пример 5 Синтез сополимера N-винилформамида с натриевой солью оксикоричной кислоты.

По методу, описанному в примере 3 из 1 г ВФА (70 мол%) и 2,06 г кумарина (30 мол%), 0,031 г ДАК. Выход 0,51 г (17% от теоретического). Состав сополимера- 59 (ВФА) – 41 (К) мол%. Характеристическая вязкость, измеренная в ДМФА при 25ºС [η]=0,2 дл/г.

Далее 0,1г полученного сополимера растворяют при перемешивании с 7,11 мл 0,09 н раствора NaOH при комнатной температуре в течение 24 ч. Состав сополимера 59 (ВФА) -41 (ОК натриевая соль) мол%. Выход 0,084 г (78% от теоретического). Характеристическая вязкость, измеренная в 0,1н NaCl при 25ºС [η]=0,2 дл/г.

Пример 6 Синтез сополимера N-метил-N-винилацетамида с натриевой солью оксикоричной кислоты.

По методу, описанному в примере 1 из 1г МВАА (90 мол%), 0,16г кумарина (10 мол%) и 0,035 г ДАК (3масс % от суммы сомономеров). Полученный сополимер с выходом 0,88 г (77% от теоретического). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМФА при 25ºС [η]=0,33 дл/г. Состав сополимера- 87 (МВАА) -13 (К) мол%.

0,5 г полученного сополимера растворяют в 0,94 мл 5% раствора NaOH, 8,5 мл Н₂О и перемешивают при комнатной температуре в токе аргона в течение 20 часов. Сополимер выделяют из реакционной массы подкислением 0,1 N НСl до рН = 2, с последующим центрифугированием и сушкой осадка при комнатной температуре в вакууме. Состав сополимера -87 (МВАА) - 13 (ОК Na⁺) мол%.

Пример 7 Синтез сополимера N-метил-N-винилацетамида с натриевой солью оксикоричной кислоты.

В ампулу загружают 1 г МВАА (70 мол%), 0,632 г кумарина (30 мол%) и 0,049 г ДАК (3 масс% от суммы сомономеров), перемешивают и нагревают при 70°С в течение 20 часов. Полученный сополимер растворяют в ДМФА и выделяют осаждением в диэтиловый эфир с последующей вакуумной сушкой при комнатной температуре. Выход 1,38 г (86% от теоретического). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМФА при 25ºС [η]=0,3 дл/г. Состав сополимера -70 (МВАА) – 30 (К) мол%.

0,5 г сополимера растворяют в 2 мл 5% раствора NaOH, 7,5 мл Н₂О и перемешивают в токе аргона при комнатной температуре в течение 20 часов. Сополимер МВАА натриевой соли оксикоричной кислоты выделяют диализом против воды и лиофильно сушат. Состав сополимера -77 (МВАА) – 23 (ОК Na⁺) мол%. Характеристическая вязкость, измеренная в 0,1н NaCl при 25ºС [η]=0,29 дл/г.

Пример 8 Синтез сополимера N-метил-N-винилацетамида с Na солью оксикоричной кислотой.

По методу, описанному в примере 7 из 1 г МВАА (50 мол%), 1,47г кумарина (50 мол%) и 0,0741 г ДАК (3масс % от суммы мономеров) получают 1,87 г (выход 77% от веса сомономеров). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМФА при 25ºС [η]=0,3 дл/г. Состав сополимера- 63 (МВАА) -37 (К) мол%.

0,5 г полученного сополимера растворяют в смеси 3,1 мл 5% раствора NaOH и 6,4 мл Н₂О и перемешивают при комнатной температуре в течение 20 часов в токе аргона. Сополимер МВАА с натриевой солью оксикоричной кислоты получают с выходом 0,48 г (85% от теоретического). Характеристическая вязкость, измеренная в 0,1 н NaCl при 25ºС [η]=0,27 дл/г.

Таблица 1 - Условия сополимеризации в массе и характеристики сополимеров N-виниламидов с кумарином (К) Т=65ºС, 24 часа. Инициатор ДАК 1 масс%

№ п/п Виниламид
(ВА) Состав мономерной смеси, мол% Выход, % [η]²⁵_ДМФА
дл/г Состав сополимера, мол% ВА Кумарин N-ВА Кумарин 1 ВП 70 30 80 0,2 64 36 90 10 37 0,5 77 23 2 ВФА 83 17 81 0,3 84 16 50 50 17 0,3 59 41 3 МВАА 50 50 77 0,3 63 37 70 30 86 0,3 70 30 90 10 77 0,33 87 13

Таблица 2 – Условия гидролиза сополимеров N-виниламидов (ВА) с кумарином (К). Характеристики синтезированных сополимеров оксикоричной кислоты (КК) и результаты биологических исследований, синтезированных сополимеров

Наименование сополимера Состав сополимера
N-ВА/К, мол% Раст-ль Выход масс% Состав, мол% КК [η]²⁵_0.1нNaCl ЦТД₅₀ мкг/мл ЭД₅₀ мкг/мл ХТИ ВП-КК 60/40 ДМФА 98 40 0,2 345 2,6 132,5 ВФА-КК 59/41 0.09 н NaOH 78 41 0,2 220 2,5 88 МВАА-КК 62/38 ДМФА 85 37 0,27 570 2,7 211

Методика биологических исследований

У сополимеров N-виниламидов с оксикоричной кислотой определяется прежде всего цитотоксичность и противовирусная активность на клетках.

Для оценки цитотоксичности и противовирусной активности использовали клетки культуры НЕр-2 - эпидермоидная карцинома гортани человека, полученная из коллекции клеточных культур лаборатории клеточных культур ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева».

Противовирусную активность оценивали в отношении респираторно-синцитиального вируса человека штамм А2, который получен из лаборатории биотехнологии диагностических препаратов НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева, накоплен на культуре клеток HЕр-2 и хранился при температуре -80°С.

Определение цитотоксичности полимеров.

Навеску полимера массой 2 мг растворяют в 100 мкл диметилсульфоксида. Далее доводят полученный раствор до концентрации 1000 мкг/мл средой (питательная среда ДМЕМ с глюкозой 4.5 мг/мл), и готовят из него серию 2-кратных разведений. Односуточную культуру клеток HEp2, выращенную на 96-луночных планшетах с концентрацией клеток 3×10⁵ в лунке, проверяют визуально на целостность монослоя с использованием инвертированного микроскопа. Отбирают планшеты, в которых сомкнутость слоя клеток достигает 60-80%. В планшеты вносят 100 мкл раствора полимеров заданной концентрации, и планшеты инкубируют при 37°С с 5% СО₂ в течение 24 ч.

Оценка жизнеспособности клеток проводится с использованием микротетразолиевого теста (МТТ), который основан на восстановлении тетразолиевого (желтого) красителя дегидрогеназами живых клеток до формазана, имеющего голубой цвет, и его концентрацию определяют спектрофотометрически, при λ_max 535 нм после 1,5 часового контакта и расчитывается доза полимера в лунке, при которой погибает 50% клеток (ЦТД₅₀) – цитотоксическая доза.

Определение противовирусной активности полимеров методом иммуноферментного анализа (ИФА)

Путем 3-кратных разведений готовят водные растворы полимеров, начиная с концентрации ½ ЦТД50, наносят на культуру клеток НЕр-2 по 100 мкл на лунку в двойной концентрации и добавляют по 100 мкл вируса в серии 10-кратных разбавлений, после чего снова инкубируют в течение 1 часа при температуре 37°С и 5 % СО₂, затем вирусы отмывают и снова наносят растворы полимеров с концентрацией ½ ЦТД₅₀ и инкубируют в течение 6 суток при 37°С в атмосфере 5 % СО₂.

Для проведения ИФА (cell-ELIZA) клеточную культуру фиксируют холодным 80 %-м ацетоном (-20°) в течение 15 минут, затем промывают фосфатным буфером с добавлением Tween 20 до концентрации 0,05 %; наносят на культуру раствор первичных мышиных антител к белку F респираторно-синцитиального вируса А2; инкубируют при непрерывном перемешивании в течение 2 часов при комнатной температуре. После этого клетки снова промывают буферным раствором и наносят вторичные антимышиные антитела, снова инкубируют при непрерывном перемешивании в течение 2 часов при комнатной температуре, отмывают антитела и наносят субстрат-хромогенную смесь, содержащую тетраметилбензидин. Через 5 минут реакцию останавливают добавлением 0,1н серной кислоты и определяют оптическую плотность раствора при λ_max 450 нм. Лунки, в которых значение оптической плотности превышает в два и более раз по сравнению с контролем клеток, считают зараженными. Рассчитывают титр вируса известным методом Рида и Менча [Reed L.J., Muench H. // Am. J. Hygiene. 1938. V. 27. P. 493–497]. Определяют концентрации полимера, при которых наблюдается снижение титра вируса в клетках и проводят расчет эффективной концентрации (EC₅₀) полимера, при которой титр вируса снижается на 50%.

Статистическая обработка результатов исследований проводилась при помощи критерия t-Стьюдента с использованием программного пакета Microsoft Office Excel.

Данные по биологической активности некоторых из синтезированных сополимеров приведены в таблице 2.

Результаты проведенных биологических тестов подтверждают решение поставленной задачи - синтез сополимеров N-виниламидов с оксикоричной кислотой, активных в отношении респираторно-синцитиального вируса человека А2 и обладающих низкой цитотоксичностью.

Выход за пределы составов, заявляемых в описании, снижает противовирусную активность.

Технический результат заключается в том, что полученные сополимеры могут быть использованы в качестве основы для создания эффективных противовирусных лекарственных средств.

Настоящее изобретение относится к применению в качестве противовирусного средства сополимеров N-виниламидов с солями оксикоричной кислоты общей формулы A_n – B_m, где A – N-виниламидный остаток, B – звено Na⁺, K⁺, NH₄⁺ соли оксикоричной кислоты; n и m – содержание А и В в мол.%, при этом n = 100-m, m = 15÷48 мол.%, с характеристической вязкостью [η]²⁵_0.1нNaCl от 0,2 до 0,5 дл/г, при этом N-виниламидный остаток берут из N-винилпирролидона, N-винилформамида, N-метил-N-винилацетамида. Настоящее изобретение обеспечивает использование сополимеров в качестве основы для создания эффективных противовирусных лекарственных средств. 8 пр., 2 табл.

Применение в качестве противовирусного средства сополимеров N-виниламидов с солями оксикоричной кислоты общей формулы A_n – B_m,

где A – N-виниламидный остаток,

B – звено Na⁺, K⁺, NH₄⁺ соли оксикоричной кислоты,

n и m – содержание А и В в мол.%,

при этом n = 100-m, m = 15÷48 мол.%, с характеристической вязкостью [η]²⁵_0.1нNaCl от 0,2 до 0,5 дл/г, при этом N-виниламидный остаток берут из N-винилпирролидона, N-винилформамида, N-метил-N-винилацетамида.