Водорастворимые сополимеры оксикоричной кислоты с виниловыми сомономерами, активные против вирусов гриппа и герпеса Российский патент 2025 года по МПК C08F212/14 C08F220/06 C08F220/56 C08F234/02 C08F226/10 C08F226/02 C08F8/12 

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, в частности, к водорастворимым сополимерам оксикоричной кислоты активных в отношении вирусов гриппа и герпеса, предназначенных для использования в качестве субстанций и создания эффективных лекарственных средств с противовирусной активностью.

Известно, что многие полианионы проявляют широкий спектр биологической активности, в том числе демонстрируют противовирусную активность в отношении ряда вирусов [Schandok F, C.F. Riler at. al Macromolecular activiral asents against Zika, Ebola, SARS and other pathogenic viruse Advanced Healtcare Mater 2017 1700-745].

Противовирусное действие проявляют сополимеры кротоновой кислоты и малеинового ангидрида с N-винилпирролидоном [В.Н. Тарасов, В.А. Кропачев, Л.Б. Трухманова, Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии, 1970, № 11, с.89].

Известны сополимеры N-виниламидов с солями оксикоричной кислоты, активные в отношении респираторно-синцитиального вируса человека А-2 (патент РФ № 2796573. Бюл. Изобретения 2022 №6).

В ходе поиска не удалось найти сведений о водорастворимых сополимерах оксикоричной кислоты с N-виниламидами и другими виниловыми мономерами, обладающих активностью в отношении вирусов гриппа и герпеса.

Технической задачей и положительным результатом изобретения является синтез сополимеров оксикоричной кислоты с виниловыми сомономерами нетоксичных и активных в отношении вирусов гриппа и герпеса.

Указанная задача достигается тем, что сополимеры оксикоричной кислоты синтезируют путем радикальной сополимеризацией кумарина с виниловыми сомономерами в массе или органическом растворителе (диметилсульфоксиде, изопропаноле, диметилформамиде, этаноле) при 65 ºС в атмосфере аргона с использованием инициаторов 2,2´-азобисизобутиронитрила (ДАК), 2,2´-азобисметилпропан дигидрохлорида (МПХ) с последующим гидролизом лактамного кольца звена кумарина с дальнейшим выделением стандартными методами. Сополимеры имеют общую формулу:

A_n – B_m,

где: А и В – полимерные звенья.

A – звено оксикоричной кислоты

B – звено винилового сомономера;

n и m - содержание А и В, мол.%, n = 8 - 46, а m = 100 - n

с молекулярной массой 10³÷10⁵, получаемые радикальной сополимеризацией в массе или органическом растворителе, где остаток винилового сомономера берут из ряда стиролсульфонат натрия (CCNa), акриловая (АК), метакриловая кислота (МАК), акриламид (АА).

Информационный поиск показал отсутствие опубликованных документов, в которых была бы описана совокупность существенных признаков, а также решение, полностью совпадающее с представленным в заявке на изобретение.

Таким образом, мы можем утверждать, что заявляемое изобретение характеризуется таким признаком охраноспособности как новизна.

Синтезированные сополимеры и полученный впервые результат является неочевидным и не вытекает из существующего уровня техники. Это подтверждает соответствие заявляемого изобретения такому признаку охраноспособности как изобретательский уровень.

Синтез сополимеров.

1. Сополимеризацию кумарина (К) с виниловыми сомономерами проводят в массе или органическом растворителе: этаноле, изопропаноле, диметилформамиде (ДМФА), диметилсульфоксиде (ДМСО) в присутствии радикальных инициаторов динитрила азобисизомасляной кислоты (ДАК) или 2,2´-азобисметилпропан дигидрохлорида (МПХ). Условия сополимеризации, молекулярно-массовые и гидродинамические характеристики полученных сополимеров представлены в таблицах 1 и 2.

Сополимеры выделяют осаждением из раствора диметилформамида (ДМФА), диметилсульфоксида (ДМСО), изопропанола или этанола в органический растворитель (диэтиловый эфир, ацетон). Молекулярные массы (М_w), синтезированных сополимеров были определены в ДМСО при 25ºС методами статического и динамического светорассеяния. Характеристическую вязкость сополимеров определяли с помощью капиллярного вискозиметра Оствальда в ДМСО при 25ºС.

2. Нерастворимые в воде сополимеры виниловых мономеров с оксикоричной кислотой (ОК) получают щелочным гидролизом звеньев кумарина в воде с последующим осаждением сополимера нейтрализацией реакционной массы минеральной кислотой (HCl). Условия гидролиза и характеристики полученных сополимеров представлены в таблицах 3 и 4. Состав полученных сополимеров определялся по данным элементного анализа на азот, методом УФ и ЯМР-спектроскопии, а также потенциометрическим титрованием звеньев оксикоричной кислоты.

3. Водорастворимые сополимеры виниловых сомономеров с солями (Na⁺, K⁺, NH₄⁺) оксикоричной кислоты получают щелочным гидролизом сополимеров кумарина или нейтрализацией сополимеров оксикоричной кислоты растворами NH₄ОН, NaОН, KОН с последующим диализом против воды и лиофильной сушкой (таблица 4).

Молекулярная масса полученных сополимеров солей ОК оценивалась характеристической вязкостью, измеренной в 0.1 н NaCl при 25ºС, а также методом динамического светорассеяния.

Для подтверждения заявленного решения условию патентоспособности - промышленная применимость приводим примеры конкретной реализации изобретения, которыми не исчерпывается сущность изобретения.

Пример 1. Синтез сополимера N-винилпирролидона (N-ВП) 54 мол.% с аммониевой солью оксикоричной кислоты (ОК NH₄⁺) 46 мол%.

В ампулу загружают 1.98 мл N-ВП (50 мол%), 2.64 г кумарина (К) (50 мол%) и 0.042 г ДАК (1 масс% от суммы сомономеров), нагревают при 65°С в течение 72 часов в атмосфере аргона. Полученный сополимер растворяют в ДМСО и выделяют осаждением в диэтиловый эфир с последующей вакуумной сушкой при комнатной температуре. Выход 4.2 г (91%). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМСО при 25ºС [η]=0.44 дл/г, М_w = 152000. Состав сополимера N-ВП (54) – К (46) мол.%

1.0 г сополимера (N-ВП - К) перемешивают с 129.7 мл 0.09н NaOH, нагревают при 60 ºС в течение 5 часов. Затем проводят нейтрализацию избытка NaOH 0.1 н HCl. При рН = 2 сополимер (N-ВП – ОК) полностью выпадает в осадок, который выделяют из реакционной среды центрифугированием и сушкой при комнатной температуре в вакууме. Выход 0.84 г (80%).

К 0.54 г сополимера N-ВП с оксикоричной кислотой добавляют 17.28 мл H₂О и 0.72 мл 5% раствора NH₄OH до рН=8.4. Сополимер аммониевой соли оксикоричной кислоты выделяют диализом против воды с последующей лиофильной сушкой. Полученный сополимер имеет состав - 54 мол% (N-ВП) - 46 мол% (ОКNH₄⁺). Выход 0.82 г (81%). Характеристическая вязкость, измеренная в 0.1н NaCl при 25ºС [η]=0.41 дл/г.

Пример 2. Синтез сополимера N-винилпирролидона (N-ВП) 64 мол.% с калиевой солью оксикоричной кислоты (ОК К⁺) 36 мол.%.

По методу, описанному в примере 1 смесь 0.99 мл N-ВП (60 мол%), 0.88 г кумарина (40 мол%) и 0.019 г ДАК (1 масс% от суммы сомономеров) нагревают при 65°С в течение 48 часов в атмосфере аргона. Полученный сополимер растворяют в ДМФА и выделяют осаждением в диэтиловый эфир с последующей вакуумной сушкой при комнатной температуре. Выход 1.6 г (85%). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМСО при 25ºС [η]=0.42 дл/г. М_w = 84000. Состав сополимера 63 (N-ВП) - 37 (К) мол.%

Для получения калиевой соли сополимера оксикоричной кислоты с N-ВП, cмесь 1.00 г сополимера и 11.4 мл 5% раствора КOH нагревают с перемешиванием при температуре 70ºС в течение 3 часов. Водорастворимый сополимер N-ВП с калиевой солью оксикоричной кислоты очищают диализом против воды и лиофильно сушат. Выход 0.98 г (98%). Состав сополимера - 64 (N-ВП) – 36 (ОК К⁺) мол%.

Пример 3. Синтез сополимера N-винилпирролидона (N-ВП) 92 мол% с калиевой солью оксикоричной кислоты (ОК К⁺) 8 мол.%.

По методу, описанному в примере 1 смесь 0.99 мл N-ВП (90 мол%), 0.14 г кумарина (10 мол%) и 0.011 г ДАК (1 масс% от суммы сомономеров) нагревают при 65°С в течение 24 часа в атмосфере аргона. Полученный сополимер растворяют в ДМФА и выделяют осаждением в диэтиловый эфир с последующей вакуумной сушкой при комнатной температуре. Выход 1.0 г (96 %). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМСО при 25ºС [η]=0.62 дл/г. М_w = 262000. Состав сополимера 81.7 (N-ВП) – 8.3 (К) мол.%.

Для получения калиевой соли сополимера оксикоричной кислоты с N-ВП, cмесь 1.0 г сополимера с 4.5 мл 3% раствора КOH нагревают с перемешиванием при температуре 60ºС в течение 4 часов. Водорастворимый сополимер N-ВП с калиевой солью оксикоричной кислоты очищают диализом против воды и лиофильно сушат. Выход 0.98 г (94%). Состав сополимера - 92 (N-ВП) – 8 (ОК К⁺) мол%.

Пример 4. Синтез сополимера N-винилпирролидона (N-ВП) 89 мол% с калиевой солью оксикоричной кислоты (ОК К⁺) 11 мол.%.

По методу, описанному в примере 3 получают сополимер N-ВП (89 мол.%) с К (11 мол.%). Смесь 0.28 г сополимера, 5.22 мл Н₂О и 0.144 мл 10% раствора NaOH нагревают с перемешиванием при температуре при 70ºС в течение 4 часов. Далее раствор подкисляют 5% HCl до pH = 2, отделяют осадок, промывают водой и сушат в вакууме при комнатной температуре до постоянного веса. Выход 0.28 г (96%). Состав сополимера - 89 (N-ВП) – 11 (ОК) мол%.

Водорастворимый сополимер N-ВП с калиевой солью оксикоричной кислоты получают нейтрализацией полученного сополимера N-ВП-ОК 0.1 н КОН до рН = 8.5 и выделяют лиофильной сушкой.

Пример 5. Синтез сополимера N-винилформамида (ВФА) 83 мол% с натриевой солью оксикоричной кислоты (ОК Na⁺) 17 мол.%.

В ампулу загружают 2.97 мл ВФА (80 мол.%), 0.99 г кумарина (20 мол.%), 0.126 г ДАК (1% от суммы сомономеров), продувают аргоном, ампулу запаивают и выдерживают при 65°С в течение 24 часов. Полученный сополимер растворяют в ДМФА и выделяют осаждением в ацетон с последующей вакуумной сушкой при комнатной температуре. Выход 3.42 г (81%). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМСО при 25ºС [η]=0.44 дл/г. М_w = 130000. Состав сополимера 84 (ВФА) - 16 (К) мол.%.

1 г полученного сополимера растворяют в 35 мл 0.09 н раствора NaOH при перемешивании при комнатной температуре в течение 20 ч. Сополимер ВФА и натриевой соли оксикоричной кислоты очищают диализом против воды и выделяют лиофильной сушкой. Выход 0.88 г (81%). Характеристическая вязкость, измеренная в 0.1н NaCl при 25ºС [η]=0.42 дл/г. Состав сополимера - 83 (ВФА) – 17 (ОК Na⁺) мол.%.

Пример 6. Синтез сополимера N-винилформамида (ВФА) 59 мол% с натриевой солью оксикоричной кислоты (ОК Na⁺) 41 мол.%.

По методу, описанному в примере 5 из 1.98 мл ВФА (50 мол%) и 4.12 г кумарина (50 мол%), 0.062 г ДАК получают 1.5 г (выход 24%) сополимера ВФА – К. Состав сополимера 59 (ВФА) - 41 (К) мол.%. Характеристическая вязкость, измеренная в ДМСО при 25ºС [η]=0.24 дл/г. М_w = 73000.

Далее 1г полученного сополимера растворяют при перемешивании в 71.1 мл 0.09н NaOH при комнатной температуре в течение 48 ч, очищают диализом против воды и лиофильно сушат. Состав сополимера 59 (ВФА) - 41 (ОКNa⁺) мол%. Выход 0.8 г (78%). Характеристическая вязкость, измеренная в 0.1н NaCl при 25ºС [η]=0.2 дл/г.

Пример 7. Синтез сополимера N-метил-N-винилацетамида (МВАА) 62 мол.% с натриевой солью оксикоричной кислоты (ОК Na⁺) 41 мол.%.

В ампулу загружают 3.12 мл МВАА (50 мол%), 4.41г кумарина (50 мол%) и 0.222 г ДАК (3масс % от суммы мономеров), нагревают при 70°С в течение 20 часов в атмосфере аргона. Полученный сополимер растворяют в ДМФА и выделяют осаждением в ацетон с последующей вакуумной сушкой при комнатной температуре до постоянного веса. Выход сополимера 5.61 г (77%). Характеристическая вязкость сополимера, измеренная в ДМСО при 25ºС [η]=0.39 дл/г. М_w = 40000. Состав сополимера- 62 (МВАА) -38 (К) мол.%.

5 г полученного сополимера растворяют в смеси 31 мл 5% раствора NaOH и 64 мл Н₂О и перемешивают при комнатной температуре в течение 20 часов в атмосфере аргона. Сополимер МВАА с натриевой солью оксикоричной кислоты очищают диализом против воды и выделяют лиофильной сушкой. Выход 4.8 г (85%). Характеристическая вязкость сополимера, измеренная в 0.1 н NaCl при 25ºС [η]=0.27 дл/г.

Пример 8. Синтез сополимера N-метил-N-винилацетамида (МВАА) 87 мол.% с натриевой солью оксикоричной кислоты (ОК Na⁺) 13 мол.%.

По методу, описанному в примере 7 из 2.08 мл МВАА (90 мол%), 0.32 г кумарина (10 мол%) и 0.07 г ДАК получают сополимер МВАА – К с выходом 1.76 г (78%). Состав сополимера 87 (МВАА) - 13 (К) мол%. Характеристическая вязкость, измеренная в ДМСО при 25ºС [η]=0.33 дл/г. М_w = 45000

Далее 1 г полученного сополимера растворяют в 1.88 мл 5% раствора NaOH, 17 мл Н₂О и перемешивают при комнатной температуре в атмосфере аргона в течение 20 часов. Сополимер МВАА с натриевой солью оксикоричной кислоты очищают диализом против воды и лиофильно сушат. Выход 0.9 г (85%). Характеристическая вязкость, измеренная в 0.1н NaCl при 25ºС [η]=0.29 дл/г. Состав сополимера 87 (МВАА) - 13 (ОК Na⁺) мол%.

Пример 9. Синтез сополимера кумарина с N-винилпирролидоном (N-ВП) 95 мол.% с натриевой солью оксикоричной кислоты (ОК Nа) 5 мол.%.

В ампулу загружают 0.99 мл N-ВП (94 мол%), 0.071 г кумарина (К) (6 мол%) и 0.011 г ДАК (1 масс% от суммы сомономеров), 5.42 мл этанола (концентрация сомономеров 20 мас.%). Реакционную смесь нагревают при 65°С в течение 24 часов в атмосфере аргона. После окончания реакции, ампулу охлаждают, вскрывают, содержимое переносят в круглодонную колбу, снабженную холодильником и перемешивающим устройством для проведения гидролиза. Вносят в реакционную смесь 4.8 мл 0.2 н NaOH и нагревают при 70 ºС в течение 3 часов при постоянном перемешивании. Сополимер натриевой соли оксикоричной кислоты выделяют диализом против воды с последующей лиофильной сушкой. Полученный сополимер имеет состав - 95 мол% (N-ВП) - 5 мол% (ОКNа). Выход 0.25 г (79%). Характеристическая вязкость, измеренная в 0.1н NaCl при 25ºС [η]=0.34 дл/г.

Пример 10. Синтез сополимера N-винилпирролидона (N-ВП) 90 мол.% с натриевой солью оксикоричной кислоты (ОК Nа) 10 мол%.

В ампулу загружают 0.99 мл N-ВП (90 мол%), 0.146 г кумарина (К) (10 мол%) и 0.012 г ДАК (1 масс% от суммы сомономеров), 3.34 мл этанола и нагревают реакционную смесь при 65°С в течение 72 часов в атмосфере аргона. Полученный сополимер выделяют осаждением в диэтиловый эфир с последующей вакуумной сушкой при комнатной температуре. Выход 2.0 г (94%). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМСО при 25ºС [η]=0.31 дл/г, М_w = 54000. Состав сополимера N-ВП (90) – К (10) мол.%

0.50 г сополимера (N-ВП - К) перемешивают с 17.4 мл 0.09н NaOH, нагревают при 60 ºС в течение 5 часов. Сополимер натриевой соли оксикоричной кислоты выделяют диализом против воды с последующей лиофильной сушкой. Полученный сополимер имеет состав - 90 мол% (N-ВП) - 10 мол% (ОКNа). Выход 0.41 г (79%).

Пример 11. Синтез сополимера N-винилпирролидона (N-ВП) 67 мол.% с натриевой солью оксикоричной кислоты (ОК Nа) 33 мол%.

По методу, описанному в примере 10 смесь 0.99 мл N-ВП (70 мол%), 0.564 г кумарина (30 мол%), 0.0156 г ДАК (1 масс% от суммы сомономеров), 4.63 мл этанола (концентрация сомономеров 30 масс.%) нагревают при 65°С в течение 72 часов в атмосфере аргона. Полученный сополимер выделяют осаждением в диэтиловый эфир с последующей вакуумной сушкой при комнатной температуре. Выход 0.74 г (47%). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМСО при 25ºС [η]=0.20 дл/г. М_w = 43000. Состав сополимера 67 (N-ВП) - 33 (К) мол.%

Для получения натриевой соли сополимера оксикоричной кислоты с N-ВП, cмесь 0.5 г сополимера и 16 мл 0.07 н раствора NaOH нагревают с перемешиванием при температуре 60ºС в течение 25 часов. Водорастворимый сополимер N-ВП с натриевой солью оксикоричной кислоты очищают диализом против воды и лиофильно сушат. Выход 0.4 г (80%). Состав сополимера - 67 (N-ВП) – 33 (ОК Na⁺) мол%.

Пример 12. Синтез сополимера N-винилпирролидона (N-ВП) 60 мол.% с натриевой солью оксикоричной кислоты (ОК Nа) 40 мол%.

По методу, описанному в примере 10 смесь 0.99 мл N-ВП (60 мол%), 0.877 г кумарина (40 мол%), 0.0188 г ДАК (1 масс% от суммы сомономеров), 5.55 мл этанола (концентрация сомономеров 30 масс.%) нагревают при 65°С в течение 72 часов в атмосфере аргона. Полученный сополимер выделяют осаждением в диэтиловый эфир с последующей вакуумной сушкой при комнатной температуре. Выход 0.68 г (36%). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМСО при 25ºС [η]=0.21 дл/г. М_w = 45000. Состав сополимера 60 (N-ВП) - 40 (К) мол.%

Для получения натриевой соли сополимера оксикоричной кислоты с N-ВП, cмесь 0.26 г сополимера и 25.5 мл 0.098 н раствора NaOH нагревают с перемешиванием при температуре 65ºС в течение 5 часов. Водорастворимый сополимер N-ВП с натриевой солью оксикоричной кислоты очищают диализом против воды и лиофильно сушат. Выход 0.22 г (85%). Состав сополимера - 60 (N-ВП) – 40 (ОК Na⁺) мол%.

Пример 13. Синтез сополимера N-винилпирролидона (N-ВП) 57 мол.% с натриевой солью оксикоричной кислоты (ОК Nа) 43 мол%.

По методу, описанному в примере 10 смесь 0.99 мл N-ВП (50 мол%), 1.315 г кумарина (50 мол%), 0.0231 г ДАК (1 масс% от суммы сомономеров), 8.86 мл этанола (концентрация сомономеров 30 масс.%) нагревают при 65°С в течение 72 часов в атмосфере аргона. Полученный сополимер выделяют осаждением в диэтиловый эфир с последующей вакуумной сушкой при комнатной температуре. Выход 0.67 г (29%). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМСО при 25ºС [η]=0.18 дл/г. М_w = 42000. Состав сополимера 57 (N-ВП) - 43 (К) мол.%

Для получения натриевой соли сополимера оксикоричной кислоты с N-ВП, cмесь 0.03 г сополимера и 3.8 мл 0.098 н раствора NaOH нагревают с перемешиванием при температуре 65ºС в течение 5 часов. Водорастворимый сополимер N-ВП с натриевой солью оксикоричной кислоты очищают диализом против воды и лиофильно сушат. Выход 0.022 г (73%). Состав сополимера - 57 (N-ВП) – 43 (ОК Na⁺) мол%.

Пример 14. Синтез сополимера N-винилпирролидона (N-ВП) 85 мол.% с натриевой солью оксикоричной кислоты (ОК Nа) 15 мол.%.

В ампулу загружают 0.99 мл N-ВП (90 мол%), 0.146 г кумарина (К) (10 мол%), 0.0115 г ДАК (1 масс% от суммы сомономеров), 2.83 мл ДМФА, нагревают при 65°С в течение 72 часов в атмосфере аргона. Полученный сополимер выделяют осаждением в диэтиловый эфир с последующей вакуумной сушкой при комнатной температуре. Выход 0.95 г (83%). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМСО при 25ºС [η]=0.152 дл/г, М_w = 72000. Состав сополимера N-ВП (85) – К (15) мол.%

0.30 г сополимера (N-ВП - К) перемешивают с 10.44 мл 0.09н NaOH при 60 ºС в течение 5 часов. Сополимер натриевой соли оксикоричной кислоты выделяют диализом против воды с последующей лиофильной сушкой. Полученный сополимер имеет состав - 83 мол% (N-ВП) - 17 мол% (ОКNа⁺). Выход 0.24 г (80%).

Пример 15. Синтез сополимера N-винилформамида (N-ВФА) 62 мол.% с натриевой солью оксикоричной кислоты (ОК Nа) 38 мол.%.

В ампулу загружают 0.49 мл N-ВФА (50 мол%), 1.028 г кумарина (К) (50 мол%) и 0.015 г ДАК (1 масс% от суммы сомономеров), 7.75 мл этанола (концентрация сомономеров 20 мас.%), 6.97 мл 10% NaOH. Реакционную смесь нагревают при 65°С в течение 48 часов в атмосфере аргона. Сополимер натриевой соли оксикоричной кислоты выделяют диализом против воды с последующей лиофильной сушкой. Полученный сополимер имеет состав - 62 мол% (N-ВФА) - 38 мол% (ОКNа). Выход 0.69 г (45%). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМСО при 25ºС [η]=0.14 дл/г М_w = 10400.

Пример 16. Синтез сополимера стиролсульфоната натрия (ССNа) 92 мол.% с натриевой солью оксикоричной кислоты (ОК Nа) 8 мол.%.

В ампулу загружают 0.5 г кумарина (50 мол.%), 0.75 г стиролсульфоната натрия (ССNа) (50 мол.%), 0.012 г ДАК (1 масс% от суммы сомономеров), 2.84 г ДМСО (концентрация сомономеров 30 масс%), нагревают при 65°С в течение 48 часов в атмосфере аргона. Полученный сополимер выделяют осаждением в ацетон с последующей вакуумной сушкой при комнатной температуре. Выход 0.78 г (65%). М_w = 8000. Состав сополимера ССNа (92) – К (8) мол.%.

0.3 г сополимера (ССNа - К) перемешивают с 28.6 мл 0.09н NaOH при 60ºС в течение 2 часов. Сополимер натриевой соли оксикоричной кислоты выделяют диализом против воды с последующей лиофильной сушкой. Полученный сополимер имеет состав - 92 мол.% (ССNа) - 8 мол.% (ОКNа). Выход 0.27 г (89%). Характеристическая вязкость, измеренная в 0.1 н NaCl при 25ºС [η]=0.11 дл/г

Пример 17. Синтез сополимеров натриевой соли метакриловой кислоты (МАК) 92 мол.% с натриевой солью оксикоричной кислоты (ОК) 8 мол.%.

В ампулу загружают 0.85 г кумарина (50 мол.%), 0.49 мл метакриловой кислоты (МАК) (50 мол.%), 0.013 г ДАК (1 масс% от суммы сомономеров), 3.99 мл изопропанола (концентрация сомономеров 30 масс%), нагревают при 65°С в течение 22 часов в атмосфере аргона. Полученный сополимер выделяют диализом против воды с последующей лиофильной сушкой. Полученный сополимер имеет состав 92 мол.% (МАК) - 8 мол.% (К). Выход 0.38 г (28%). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМСО при 25ºС [η]=0.13 дл/г

0.3 г сополимера перемешивают с 37.5 мл 0.1н NaOH при 40 ºС в течение 6 часов. Сополимер натриевой соли оксикоричной кислоты выделяют диализом против воды с последующей лиофильной сушкой. Полученный сополимер имеет состав - 92 мол.% (МАКNa) - 8 мол.% (ОКNа). Выход 0.36 г (95%). Характеристическая вязкость, измеренная в 0.1 NaCl при 25ºС [η]=0.15 дл/г.

Пример 18. Синтез сополимеров натриевой соли акриловой кислоты (АК) 78 мол.% с натриевой солью оксикоричной кислоты (ОК) 22 мол.%.

В ампулу загружают 1.013 г кумарина (50 мол.%), 0.476 мл акриловой кислоты (АК) (50 мол.%), 0.015 г МПХ (1 масс% от суммы сомономеров), 4.5 мл изопропанола (концентрация сомономеров 30 масс%), нагревают при 65°С в течение 24 часов в атмосфере аргона. Полученный сополимер выделяют осаждением в диэтиловый эфир с последующей вакуумной сушкой при комнатной температуре. Полученный сополимер имеет состав 77.8 мол.% (АК) – 22.2 мол.% (К). Выход 0.43 г (30%). Характеристическая вязкость, измеренная в ДМСО при 25ºС [η]=0.08 дл/г

0.3 г сополимера перемешивают с 37.5 мл 0.1н NaOH при 40 ºС в течение 6 часов. Сополимер натриевой соли оксикоричной кислоты выделяют диализом против воды с последующей лиофильной сушкой. Полученный сополимер имеет состав - 78 мол.% (АКNa) - 22 мол.% (ОКNа). Выход 0.35 г (90%). Характеристическая вязкость, измеренная в 1 н NaCl при 25ºС [η]=0.13 дл/г.

Таблица 1 - Условия сополимеризации кумарина (К) с N-виниламидами (N-ВА) в массе и характеристики полученных сополимеров. Инициатор ДАК

Пример N-ВА Состав мономерной смеси, мол.% с_ДАК, % Т,ºС t, ч Выход, масс.% Состав сополимера, мол.% [η]^25ºС _ДМСО
дл/г М_w
10^-3 К N-ВА К N-ВА 1
2
3, 4 ВП 50 50 3 65 48 86 46 54 0.25 57 30 70 3 90 10 83 36 64 0.28 63 10 90 3 70 1 78 11 89 0.28 74 5
6 ВФА 17 83 1 65 24 81 16 84 0.44 130 50 50 1 65 20 24 41 59 0.24 73 7
8 МВАА 50 50 3 70 20 77 38 62 0.39 40 10 90 3 70 20 78 13 87 0.33 45

Таблица 2 – Условие сополимеризации кумарина [m₁] с виниловыми сомономерами [m₂] в органических растворителях при 65ºС в присутствии 1 % инициатора ДАК

№ примера m₂ Состав мономерной смеси, мол.% Растворитель Концентрация сомономеров Продолжительность реакции, ч Выход, масс.% Состав сополимера, мол.% [η]^25ºС _ДМСО
дл/г М_w
10^-3 [m₁] [m₂] [m₁] [m₂] 9 ВП 5 95 этанол 20 24 79 4.8 95.2 0.34 108 10 ВП 10 90 этанол 30 72 94 10 90 0.31 53.8 11 ВП 30 70 этанол 30 72 47 33 67 0.2 42.6 12 ВП 40 60 этанол 30 72 36 40 60 0.21 44.9 13 ВП 50 50 этанол 30 72 29 43 53 0.18 42.1 14 ВП 10 90 ДМФА 30 72 93 17 83 0.15 72 15 ВФА 50 50 этанол 20 48 45 38 62 0.14 10.4 16 ССNa 50 50 ДМСО 30 24 65 8 92 - 8 17 МАК 50 50 изопропанол 30 22 28 8 92 0.13 - 18 АК 50 50 изопропанол 30 24 30 22.2 77.8 0.08 -

Таблица 3 – Условия гидролиза сополимеров кумарина [m₁] с виниловыми сомономерами [m₂] в воде и характеристики полученных сополимеров ОК

№ примера m₂ Состав сополимера, мол.% С_соп, % n_NaOH/n_к Т,ºС t, ч Выход, масс.% Состав сополимера, мол.% [m₂] [m₁] [m₂] ОК 1 ВП 54 46 0.1 1.5 60 5 80 56 44 2 64 36 7.8 2.2 22 3 98 64 36 4 89 11 5.0 1.5 70 4 96 89 11 5 ВФА 84 16 2.8 1.5 22 20 81 83 17 6 59 41 1.3 1.5 22 48 78 59 41 7 МВАА 62 38 5.0 2.5 22 20 85 62 37 8 87 13 5.0 1.9 22 20 85 87 13 9 ВП 95 5 20.0 2.0 70 3 79 95 5 10 90 10 2.8 3.6 60 5 79 90 10 11 70 30 3.0 0.8 60 24 80 67 33 12 60 40 1.0 3.0 65 5 85 60 40 13 57 43 0.8 3.7 65 5 73 57 43 14 85 15 2.8 2.4 60 5 80 83 17 15 ВФА 62 38 20.0 2.2 65 48 45 62 38 16 ССNa 92 8 1.0 2.1 60 2 89 92 8 17 МАК 92 8 0.3 14.2 40 6 95 92 8 18 АК 77.8 22.2 0.3 4.9 40 6 90 78 22

Таблица 4 – Характеристики сополимеров виниловых мономеров [m₂] с солями ОК

№ примера Строение сополимера Состав сополимера, мол.% Мԝ [η]^25ºС _{0.1н NaCl}
дл/г [m₂] Соль ОК [m₂] Соль ОК 1 N-ВП ОК NH₄⁺ 56 44 152000 0.41 2 N-ВП ОК К⁺ 64 36 84000 0.2 3 N-ВП ОК К⁺ 89 11 262000 0.28 4 N-ВП ОК К⁺ 89 11 - 0.27 5 ВФА ОК Na⁺ 83 17 130000 0.42 6 ВФА ОК Na⁺ 59 41 73000 0.20 7 МВАА ОК Na⁺ 62 37 40000 0.27 8 МВАА ОК Na⁺ 87 13 45000 0.29 9 ВП ОК Na⁺ 95 5 - 0.34 10 ВП ОК Na⁺ 90 10 54000 0.31 11 ВП ОК Na⁺ 67 33 43000 0.20 12 ВП ОК Na⁺ 60 40 45000 0.21 13 ВП ОК Na⁺ 57 43 42000 0.18 14 ВП ОК Na⁺ 83 17 72000 0.15 15 ВФА ОК Na⁺ 62 38 10400 0.14 16 ССNa ОК Na⁺ 92 8 8000 0.11 17 МАКNa ОК Na⁺ 92 8 - 0.15 18 АКNa ОК Na⁺ 78 22 17000 0.10

Методика биологических исследований

У водорастворимых сополимеров оксикоричной кислоты определялась цитотоксичность (ЦТД₅₀) и противовирусная активность (ЭД₅₀), а также химиотерапевтический индекс (ХТИ), представляющий собой отношение ЦТД₅₀/ЭД₅₀.

Для оценки цитотоксичности использовали культуры клеток: MDCK (клетки почки собаки), Vero-81 (почечный эпителий зеленой мартышки). Все культуры получены из рабочей коллекции лаборатории химиотерапии вирусных инфекций ФГБУ «НИИ Гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России.

Противовирусную активность оценивали в отношении широко распространенных среди населения Земли вирусов: вируса гриппа (A/Aichi/2/68 (H3N2)) и вируса простого герпеса человека (герпес - 1 штамм ЕС), которые были получены из рабочей коллекции лаборатории химиотерапии вирусных инфекций ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Минздрава России.

Определение цитотоксичности полимеров.

Навеску полимера массой 2 мг растворяют в 100 мкл диметилсульфоксида. Далее доводят полученный раствор до концентрации 1000 мкг/мл средой (питательная среда ДМЕМ с глюкозой 4.5 мг/мл), и готовят из него серию 2-кратных разведений. Односуточную культуру клеток (MDCK, Vero-81) выращенную на 96-луночных планшетах с концентрацией клеток 3×10⁵ в лунке, проверяют визуально на целостность монослоя с использованием инвертированного микроскопа. Отбирают планшеты, в которых сомкнутость слоя клеток достигает 60-80%. В планшеты вносят 100 мкл раствора полимеров заданной концентрации, и планшеты инкубируют при 37°С с 5% СО₂ в течение 24 ч.

Оценку жизнеспособности клеток проводят с использованием микротетразолиевого теста (МТТ), который основан на восстановлении тетразолиевого (желтого) красителя дегидрогеназами живых клеток до формазана, имеющего голубой цвет, и его концентрацию определяют спектрофотометрически, при λ_max 535 нм после 1.5 часового контакта и рассчитывают концентрацию полимера в лунке, при которой погибает 50% клеток (ЦТД₅₀) – цитотоксическая доза.

Определение противовирусной активности полимеров методом иммуноферментного анализа (ИФА)

Путем 3-кратных разведений готовят водные растворы полимеров, начиная с концентрации ½ ЦТД₅₀, наносят на культуру клеток (MDCK, Vero-81) по 100 мкл на лунку в двойной концентрации и добавляют по 100 мкл вируса в серии 10-кратных разбавлений, после чего снова инкубируют в течение 1 часа при температуре 37°С и 5 % СО₂, затем вирусы отмывают и снова наносят растворы полимеров с концентрацией ½ ЦТД₅₀ и инкубируют в течение 6 суток при 37°С в атмосфере 5 % СО₂.

Для проведения ИФА (cell-ELIZA) клеточную культуру фиксируют холодным 80 %-м ацетоном (-20°) в течение 15 минут, затем промывают фосфатным буфером с добавлением Tween 20 до концентрации 0,05 %; наносят на культуру раствор первичных мышиных антител к белку F гриппа и герпеса; инкубируют при непрерывном перемешивании в течение 2 часов при комнатной температуре. После этого клетки снова промывают буферным раствором и наносят вторичные антимышиные антитела, снова инкубируют при непрерывном перемешивании в течение 2 часов при комнатной температуре, отмывают антитела и наносят субстрат-хромогенную смесь, содержащую тетраметилбензидин. Через 5 минут реакцию останавливают добавлением 0,1н серной кислоты и определяют оптическую плотность раствора при λ_max = 450 нм. Лунки, в которых значение оптической плотности превышает в два и более раз по сравнению с контролем клеток, считают зараженными. Рассчитывают титр вируса известным методом Рида и Менча (Reed L.J., Muench H. // Am. J. Hygiene. 1938. V. 27. P. 493–497). Определяют концентрации полимера, при которых наблюдается снижение титра вируса в клетках и проводят расчет эффективной концентрации (ЭД₅₀) полимера, при которой титр вируса снижается на 50%.

Статистическую обработку результатов исследований проводили при помощи критерия t-Стьюдента с использованием программного пакета Microsoft Office Excel.

Данные цитотоксичности, противовирусной активности и значения химиотерапевтического индекса, синтезированных сополимеров разного химического строения, в отношении вирусов гриппа и герпеса приведены в таблицах 5 - 6.

Таблица 5 - Противовирусная активность сополимеров солей оксикоричной кислоты в отношении вируса гриппа А /Aichi/2/68 (H3N2) на клетках MDCK

Пример Состав ЦТД₅₀, мкг/мл ЭД₅₀, мкг/мл ХТИ 1 ВП – ОК NH₄⁺
56 – 44 > 1000 > 300 3.3 2 ВП – ОК К⁺
64 – 36 > 1000 > 300 3.3 3 ВП – ОК К⁺
89 – 11 > 1000 < 3.7 270 5 ВФА – ОК Na⁺
83-17 > 1000 > 300 3.3 6 ВФА – ОК Na⁺
59-41 > 1000 > 300 3.3 7 МВАА – ОК Na⁺
62 – 38 > 1000 > 300 3.3 16 CCNa - ОК Na⁺
92 - 8 800 7.8 103 18 AKNa - ОК Na⁺
78 - 22 ˃500 9 ˃55

Таблица 6 - Противовирусная активность сополимеров солей оксикоричной кислоты в отношении вируса простого герпеса-1 штамм ЕС на клетках Vero-81

Пример Состав ЦТД₅₀, мкг/мл ЭД₅₀, мкг/мл ХТИ 1 ВП – ОК NH₄⁺
56 – 44 > 300 23.0 13.0 2 ВП – ОК К⁺
64 – 36 > 300 235.0 1.3 3 ВП – ОК К⁺
89 – 11 > 300 > 300 1.0 5 ВФА – ОК Na⁺
83-17 > 300 > 300 1.0 6 ВФА – ОК Na⁺
59 - 41 > 300 3.9 78 7 МВАА – ОК Na⁺
62 – 38 > 300 23.4 13 16 CCNa - ОК Na⁺
92 - 8 ˃300 15.0 20 18 AKNa - ОК Na⁺
78 - 22 ˃300 4.5 ˃66

Все синтезированные сополимеры солей оксикоричной кислоты характеризуются низкой цитотоксичностью. Они активны в отношении вирусов гриппа (A/Aichi/2/68 (H3N2)) и герпеса (герпес-1 штамм ЕС). Уровень активности зависит от химического строения сополимеров и типа вируса. Выход за пределы составов, заявляемых в описании, снижает противовирусную активность.

Технический результат заключается в том, что полученные водорастворимые сополимеры могут быть использованы в качестве основы для создания эффективных противовирусных лекарственных средств.

Настоящее изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений биомедицинского назначения. Описаны водорастворимые сополимеры оксикоричной кислоты и виниловых мономеров с активностью в отношении вируса гриппа и простого герпеса общей формулы:

A_n - B_m,

где: А и В - полимерные звенья; А - звено оксикоричной кислоты; В - звено винилового сомономера; n и m - содержание А и В, мол.%, n=8-46, m=100-n, с молекулярной массой 10³÷10⁵, получаемые радикальной сополимеризацией в массе или органическом растворителе кумарина с виниловыми сомономерами с последующим щелочным гидролизом звеньев кумарина, где остаток винилового сомономера берут из ряда: стиролсульфонат натрия, акриловая, метакриловая кислота, акриламид. Технический результат – получение водорастворимых сополимеров, которые могут быть использованы в качестве основы для создания эффективных противовирусных лекарственных средств. 6 табл., 18 пр.

Водорастворимые сополимеры оксикоричной кислоты и виниловых мономеров с активностью в отношении вируса гриппа и простого герпеса общей формулы:

A_n - B_m,

где: А и В - полимерные звенья;

А - звено оксикоричной кислоты;

В - звено винилового сомономера;

n и m - содержание А и В, мол.%, n=8-46, m=100-n,

с молекулярной массой 10³÷10⁵, получаемые радикальной сополимеризацией в массе или органическом растворителе кумарина с виниловыми сомономерами с последующим щелочным гидролизом звеньев кумарина, где остаток винилового сомономера берут из ряда: стиролсульфонат натрия, акриловая, метакриловая кислота, акриламид.