Способ оценки повреждения миокарда в условиях перфузии изолированного сердца по методу Лангендорфа Российский патент 2024 года по МПК G09B23/28 A61M60/31 

Изобретение относится к медицине и фармакологии и может быть использовано в качестве скринингового метода оценки факта и размеров повреждения миокарда в модельных системах с использованием изолированных органов, количественного метода анализа

кардипротективных свойств лекарственный средств.

Нарушения в регуляции свободнорадикальных процессов является важным базисом для развития тяжелых сердечно-сосудистых патологий и ряда других заболеваний. Система антиоксидантной защиты обеспечивает адекватную регуляцию образования свободных радикалов в клетках. При снижении её эффективности закономерным является кумуляция свободных радикалов в организме и, как следствие, развитие оксидативного стресса.

Восстановление макро- и микроциркуляции в ишемизированных органах и тканях в послеоперационном, критическом периодах, обширных травмах также является важной причиной развития оксидативного стресса. Это связано с развитием постишемической (реперфузионной) контрактуры, которая развивается на фоне метаболических и структурных изменений. В условиях дефицита кислорода и нарушения функционирования ионных насосов ввиду низкого энергообеспечения, происходит нарушение трансмембранного обмена ионов, в первую очередь Са2+, Na+, К+. Повышение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ активирует «липидную триаду»: ещё в большей степени активируются процессы свободно радикального окисления, повышается активность липаз, фосфолипаз, аккумулируются свободные длинноцепочечные высшие жирные кислоты (ВЖК). «Липидная триада» - источник веществ с детергентной активностью (ВЖК, лизофосфолипидов). Эти соединения составляют основу повреждения лизосомальных мембран и способствуют высвобождению из них протеолитических ферментов. Оптимумом активности протеолитических ферментов является кислый диапазон pH, который формируется в том числе вследствие повышенного накопления и сниженной элиминации кислых продуктов гликолиза, гидролиза, липолиза. В последующем это потенцирует повреждение целостности, полупроницаемости и других мембранных органоидов, нарушает функционирование трансмембранных катионных насосов. Угнетение Na⁺/K⁺ насоса приводит к увеличению внутриклеточного уровня ионов Na⁺, препятствует удалению ионов Са²⁺. Повышение уровня ионов Са²⁺ в клетке происходит еще и от нарушения активности Са²⁺-насоса саркоплазматического ретикулума, который в физиологических условиях выполняет функцию его внутриклеточного депо. Это обстоятельство, с одной стороны, замыкает «порочный круг», так как активирует совокупность процессов «липидной триады», а с другой, повышение уровня ионов Са²⁺ носит самостоятельное повреждающее действие, т.н. «кальциевая триада», суммирующаяся из контрактуры миофибрилл, нарушении функционирования митохондрий и активации миофибриллярных протеаз, митохондриальных фосфолипаз [Меерсон, Ф.З. Адаптация к стрессорным ситуациям и физическим нагрузкам / Ф.З. Меерсон, М.Г. Пшенникова. Москва: Наука, 1988].

На сегодняшний день применяется несколько способов моделирования повреждения миокарда, имитирующих острый коронарный синдром.

Известен способ изучения степени повреждения миокарда у лабораторных крыс путем непосредственной перевязки ветвей коронарных артерий после торакотомии с последующим ушиванием раны и ликвидацией пневмоторакса, либо термической коагуляции коронарных артерий при помощи разогретого спиртовой горелкой инструмента / электрокоагулятора [патент RU 2407062, 2010]. Однако недостатком данного метода является техническая сложность, требовательность к мастерству исследователя, а также высокая смертность экспериментальных животных. При этом оценка степени повреждения миокарда возможна только либо косвенно по оценке биохимических маркеров цитолиза (оценка тропонина, миоглобина, КФК, КФК-МВ, АЛТ, АСТ и др.), либо морфогистологическими методами (гистология, иммуногистохимия, прижизненная эхокардиография и коронарография др.) [Plitt A, Dangas G. Cardiac enzyme elevation after coronary revascularization. Catheter Cardiovasc Interv. 2018 Feb 1;91(2):224-225. doi: 10.1002/ccd.27502. PMID: 29405598 и Fan J, Ma J, Xia N, Sun L, Li B, Liu H. Clinical Value of Combined Detection of CK-MB, MYO, cTnI and Plasma NT- proBNP in Diagnosis of Acute Myocardial Infarction. Clin Lab. 2017 Mar 1;63(3):427-433. doi: 10.7754/Clin.Lab.2016.160533. PMID: 28271683.].

Наиболее близким аналогом изобретения является метод перфузии изолированного сердца по Лангендорфу, заключающийся в перфузии оксигенированным раствором Кребса-Хензелайта выделенного сердца крыса с последующей ишемией. При реализации данного метода проводится оценка сократимости левого желудочка посредством введения измерительного баллончика непосредственно в полость левого желудочка, определение биохимических свойств перфузата, полученного после прохождения сердца раствором Кребса-Хензелайта и оценка степени повреждения миокарда окраской трифенилтетразолийхлоридом [Методика перфузии изолированного сердца крысы / С. М. Минасян, М. М. Галагудза, Д. Л. Сонин [и др.] // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2009. - Т. 8, № 4(32). - С. 54-59]. Достоинством данного метода является способность создать тотальную ишемию миокарда, точно дозировать период ишемии. Недостатками прототипа являются редукционистичность метода, ограниченная стабильность и невозможность оценить развитие оксидативного стресса.

Задача изобретения - разработка способа оценки повреждения миокарда в условиях перфузии изолированного сердца по методу Лангендорфа.

Технический результат при использовании изобретения - упрощение и сокращение времени исследования, возможность отсроченного анализа после заморозки-разморозки проб.

Предлагаемый способ оценки повреждения миокарда в условиях перфузии изолированного сердца по методу Лангендорфа осуществляется следующим образом. Проводят оценку методом люминол-зависимой железоиндуцированной хемилюминесценции уровня липидной пероксидации перфузата, полученного до и после перфузии изолированного сердца по методу Лангендорфа. Изменение уровня липидной пероксидации перфузата оценивают в простой модельной системе, имитирующей перекисное окисление липидов. Регистрацию свечения проводят на хемилюминомере «ХЛМ-003» (Россия). Для выявления активных форм кислорода используют люминол (5-амино-2,3- дегидро-4-фталазиндион), который окисляется и образует электронновозбужденные карбонильные хромофоры с высоким квантовым выходом, в результате чего резко повышается интенсивность свечения, связанного с образованием активных форм кислорода. Хемилюминесценцию регистрируют в течение 3 минут. Одна условная единица хемилюминесценции - 5,1*10⁵ квант/с. Для моделирования перекисного окисления липидов из куриного желтка готовят липопротеиновые комплексы. Желток смешивают с фосфатным буфером в соотношении 1:5, затем гомогенизируют. Хемилюминесценцию инициируют добавлением 1 мл 50 мМ раствора сернокислого железа, запускающим процесс окисления ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов. Регистрируют показатели интенсивности свечения: светосумму свечения и амплитуду медленной вспышки модельной системы в присутствии перфузата, полученного до перфузии, и интенсивность свечения модельной системы в присутствии перфузата, полученного после перфузии. По интенсивности развивающегося свечения судят о процессах перекисного окисления липидов в модельной системе в присутствии перфузата. Чем больше значения показателей интенсивности хемилюменисценции модельной системы в присутствии перфузата, полученного после перфузии, в сравнении с исходными показателями, тем массивнее степень повреждения миокарда в результате ишемических и ишемически-реперфузионных факторов повреждения миокарда.

Вся экспериментальная работа в условиях in vivo выполнена на 50 белых бecпoрoдных пoлoвoзрeлых крыеах самцах (225,7±22,4 г) в соответствии с международными рекомендациями Европейской конвенции по защите позвоночных животных в лабораторных условиях, Правилами проведения лабораторных доклинических исследований в Российской Федерации (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96, ГОСТ 50258-92) и приказом Минздравсоцразвития России № 708н (23.08.2010) "Об утверждении правил проведения лабораторных исследований" (GLP). Содержание животных осуществлялось в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Директива 2010/63/EU) и Руководством по содержанию и уходу за лабораторными животными (ГОСТ 33215-2014). В асептических условиях животных наркотизировали тиопенталом натрия (40 мг/кг внутрибрюшинно), проводили торакотомию, отсекали магистральные сосуды сердца (выше места захвата). Извлеченные сердца с целью прекращения спонтанных сокращений помещали в раствор Кребса-Хензелайта (Tраствора= + 4°С). Для того, чтобы обеспечить поступление в миокард раствора Кребса-Хензелайта, насыщенного карбогеном (95% О2 и 5% СО2), восходящую часть аорты канюлировали. Для определения показателей сократимости миокарда в полость левого желудочка вводили катетер с баллончиком, заполненный очищенной водой (объем жидкости достаточный для создания конечного диастолического давления (КДД) 10-15 мм рт. ст.). После окончания всех манипуляционных действий выдерживался стабилизационный период в течение 5 минут. С помощью системы мониторинга PhysExp (ООО «Кардипротект», Россия) проводилась регистрация кардиофизиологических показателей. Осуществляли регистрацию показателей сократимости изолированного миокарда: давление, развиваемое левым желудочком; частоту сердечных сокращений (ЧСС, уд/мин); конечное диастолическое давление (мм рт. ст.). В условиях эксперимента поступление кислорода и плазмозамещающего раствора (раствора Кребса-Хензелайта) к кардиомиоцитам, а также отток от них продуктов диссимиляции был полностью прекращен (модель тотальной ишемии), после ишемии 45, 60 и 90 минут (в зависимости от задач) проводилось восстановление перфузии сердца с последующим проведением оценки оксидативного потенциала перфузата, показателя pH, а также биохимического анализа и морфологической оценкой миокарда. Перфузат подвергали заморозке и хранению при -20-22°С, с последующей разморозкой и повторной оценкой параметров для определения стабильности уровня липидной пероксидации.

По окончанию реперфузии половина сердец подвергалась окрашиванию с макроскопической оценкой трифенилтетразолийхлоридом, другую половину сердец подвергали фиксацией 10% нейтральным раствором формалина, проводили стандартную обработку, для подготовки парафиновых секций использовался микротом LEICA RM 2145 (Leica Biosystems, Германия). Далее секции образцов проходили окраску гематоксилином и эозином, окраску по Мэллори (H&E, Mallory). Полученные секции анализировались с помощью бинокулярного микроскопа LEICA CME (Leica Biosystems, Германия) на видимом световом оптическом уровне с увеличением 40х и 100х в 10 полях обзора.

Результаты исследования были обработаны с применением статистического пакета Statistica 10,0 (StatSoft Inc, США). Проверку на нормальность распределения фактических данных выполняли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Для описания групп использовали медиану и межквартильный интервал. Дисперсионный анализ проводили с помощью критериев Краскела-Уоллиса или Манна-Уитни (для независимых наблюдений) и Фридмена (для повторных наблюдений). Критический уровень значимости р для статистических критериев принимали равным 0,05.

Пример 1. Динамика уровня липидной пероксидации перфузионного раствора при исследовании изолированного сердца по методу Лангендорфа.

Результаты исследования перфузата, собранного до развития ишемии и после реперфузии, а также данные измерений кардифизиологических параметров и гистологического исследования в эксперименте при 45 минут ишемии и реперфузии представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты оценки свойств перфузата и морфологической картины в эксперименте при 45 минут ишемии и реперфузии, Me (25%-75%)

Показатель Интактные значения После стабилизационного периода (до ишемии) Реперфузия 1 мин. 5 мин. 10 мин. 15 мин. 30 мин. 45 мин. pH 7,37 (7,337,42)* 7,07 (6,98
7,12) 6,95 (6,877,08)* 6,75 (6,616,92)* 7,04 (6,897,13) 7,10 (7,017,15) 7,18 (7,097,21) 7,31 (7,277,36)* САД, мм рт.ст. - 163,2 (161,5172,4) 143,5 (140,2149,7)* 151,2 (147,3158,4)* 149,4 (142,6154,2)* 124,5 (120,5134,9)** 144,5 (140,2151,4)* 141,3 (137,8145,4)* ДАД, мм рт.ст. - 10,8 (9,1
11,6) 18,5 (17,419,3)* 17,4 (17,118,2)* 16,5 (15,717,8)* 17,1 (16,8
18,3)* 16,5 (15,217,9)* 17,7 (16,718,5)* ПД, мм рт.ст. - 106,1 (104,2107,8) 56,1 (54,360,2)* 41,8 (38,542,7)* 42,4 (40,145,4)* 51,6 (49,353,1)* 64,3 (62,765,0)* 71,3 (70,273,5)* ЧСС, уд/мин - 241,2 (237,8245,3) 187,8 (180,2192,4)* 290,4 (287,3296,5)* 292,7 (284,5300,2)* 252,2 (247,1263,5) 264,3 (251,6274,8) 231,9 (227,6233,8)

ОСКП - 13,8 (12,3
14,7) 19,8 (17,821,4)* 15,3 (14,217,8) 14,4 (12,515,7) 10,6 (8,6
12,7)* 9,2 (8,7
10,3)* 9,4 (8,511,2)* КФК- МВ, МЕ/л - 10,4 (9,8
11,7) 12,3 (10,713,8) 17,4 (15,819,2)* 21,3 (19,422,6)* 26,8 (24,329,5)* 12,8 (11,514,6) 11,9 (10,212,5) ЛДГ, МЕ/л - 16,2 (15,4
17,9) 18,3 (17,620,4) 28,4 (24,530,7)* 32,6 (28,434,7)* 29,3 (28,730,1)* 17,2 (16,418,9) 17,1 (15,719,3) Светосумма свечения, 5,1*10⁵ квант/с - 30,7 (26,5
33,8) 45,4 (38,147,3)* 104,5 (98,5107,6)* 105,2 (96,3102,4)* 104,7 (97,6107,8)* 100,2 (97,3104,5)* 110,3 (106,3113,7)* Амплитуда медленной вспышки, 5,1*105 квант/с - 16,6 (14,4
18,7) 24,5 (19,427,3)* 37,2 (34,442,3)* 38,7 (35,242,6)* 36,7 (33,440,2)* 36,2 (33,3 - 39,6)* 38,4 (36,144,3)* Толщи на миокарда, мкм 11,8 (10,512,1)* 13,8 (12,4
14,2) 13,6 (13,114,9) 13,9 (12,715,2) 14,9 (14,517,1)* 16,7 (14,917,3)* 18,3 (16,819,1)* 19,1 (17,420,1)*

Примечание: ОСКП - Объемная скорость коронарной перфузии, ВЖД - Внутрижелудочковое давление в период ишемии, САД/ДАД/ПД - систолическое/диастолическое/пульсовое давление, ЧСС - частота сердечных сокращений. *p<0.05 показатели до ишемии vs после.

Таким образом, мы видим, что уровень липидной пероксидации меняется закономерно в соответствии с результатами биохимического анализа и морфологического исследования, однако при реперфузии дольше сохраняются в перфузате, что показывает возможность применения предлагаемого способа с целью определения факта (более чувствительный метод по сравнению с оценкой ферментов и морфологией) и степени ишемического и ишемическо-перфузионного повреждения миокарда.

Пример 2. Оценка размеров повреждения миокарда, установленных макроскопической оценкой при окраске трифенилтетразолийхлоридом, и уровня липидной пероксидации, установленной методом хемилюминесценции.

Результаты оценки влияния длительности ишемии на размеры некротизированного миокарда, установленные макроскопической оценкой при окраске трифенилтетразолий хлоридом, и уровень липидной пероксидации, установленный методом хемилюминесценции, через 10 минут после реперфузии, представлены в таблице 2.

Таблица 2

Показатели уровня липидной пероксидации, установленные методом хемилюминисценции, и значения объема повреждения миокарда, установленные макроскопически при окраске трифенилтетразолийхлоридом, Me (25%-75%)

Показатель Раствор Кребса-Хензелайта до перфузии После стабилизационного периода (до ишемии) 30 минут ишемии 45 минут ишемии 60 минут ишемии Светосумма свечения, 5,1*105 квант/с 53,76 (48,3-57,8) 30,7 (26,4-33,6)" 100,2 (97,3104,5)" 104,2 (99,4107,7)" 109,3
(104,4
112,3)" Амплитуда медленной вспышки, 5,1*105 квант/с 24,73 (20,1-27,6) 16,6 (14,4-18,7)^Л 36,2 (33,3 - 39,6)^Л 37,4 (35,5- 41,2)^Л 38,5 (35,3-
43,6)^Л Объем зоны инфаркта к общему объему сердца. % - - 8,9 (6,7-11,9) 21 (17,9- 23,5)“ 39,4 (34,5-
40,3)“

Примечание: данные достоверны в сравнении с контролем при р<0,05; ^ар<0,05; ^вр>0.05 - объем зоны инфаркта к общему объему сердца после ишемии 30 минут vs ишемии 45 и 60 минут. "р<0.05; ^ур>0.05 - светосумма раствора Кребса-Хензелайта до перфузии сердца vs значения перфузата. ^Лр<0.05; ®р>0.05 - вспышка свечения раствора Кребса-Хензелайта до перфузии сердца vs значения перфузата.

Таким образом. степень повреждения миокарда напрямую влияет на значения липидной пероксидации. установленные методом хемилюминесценции.

Пример 3. Влияние длительности хранения на значения уровня липидной пероксидации. установленные методом хемилюминесценции.

Результаты оценки влияния одного цикла «заморозки-хранение- разморозки» на стабильность показаний уровня липидной пероксидации, установленных методом хемилюминесценции представлены в таблице 3.

Таблица 3

Результаты оценки свойств перфузата одного цикла «заморозки-
хранение-разморозки», Me (25%-75%)

Показатель Раствор Значения до заморозки 1 сутки заморозки 3 сутки заморозки 7 сутки заморозки 14 сутки заморозки Светосумма свечения, 5,1*105 квант/с I 100,2 (97,3
104,5) 101,5(97,5-
106,6)^b 100,5 (95,6- 104,2)^b 102,4
(98,4-
106,2)^b 101,3(96,2-
103,4)^b II 98,5 (96,3- 101,4)^b,* 99,8 (95,6- 100,8)^b,* 97,5 (93,1- 100,2)^b,* 98,6 (97,9- 101,4)^b,* 98,7 (97,7- 101,5)^b,* Амплитуда медленной вспышки, 5,1*105 квант/с I 36,2 (33,7 -39,6) 35,2 (32,6 - 37,6)^b 36,2 (33,5 - 37,7)^b 38,3 (34,6- 41,5)^b 36,4 (34,2 - 38,6)^b II 35,4 (32,4- 37,3)^b,* 33,5 (30,5- 36,4)^b,* 33,8 (30,2- 35,3)^b,* 35,2 (35,7- 38,2)^b,* 36,8 (36,4- 39,3)^b,*

Примечание: I - раствор Кребса-Хензелайта до перфузии, II - перфузат через 45 минут ишемии и 5 минут реперфузии изолированного сердца. Данные достоверны в сравнении с контролем при р<0,05; *р<0,05 - показатели I vs II для соответствующего периода разморозки; ^ар<0,05; bp>0,05 - показатели раствора Кребса-Хензелайта до перфузии сердца (I) и значения перфузата (II) vs размороженные пробы.

Таким образом, установлено, что хранение образцов перфузата изолированных сердец не изменяет показатели уровня липидной пероксидации методом регистрации хемилюминесценции.

Изобретение относится к медицине и фармакологии и может быть использовано в качестве скринингового метода оценки факта и размеров повреждения миокарда в модельных системах с использованием изолированных органов. Проводят оценку методом люминол-зависимой железоиндуцированной хемилюминесценции уровня липидной пероксидации перфузата, полученного до и после перфузии изолированного сердца по методу Лангендорфа. Регистрируют показатели интенсивности свечения: светосумму свечения и амплитуду медленной вспышки модельной системы в присутствии перфузата, полученного до перфузии, и интенсивность свечения модельной системы в присутствии перфузата, полученного после перфузии. Чем больше значения показателей интенсивности хемилюминесценции модельной системы в присутствии перфузата, полученного после перфузии, в сравнении с исходными показателями, тем массивнее степень повреждения миокарда в результате ишемических и ишемически-реперфузионных факторов повреждения миокарда. Использование изобретения обеспечивает упрощение и сокращение времени исследования, возможность отсроченного анализа после заморозки-разморозки проб. 3 табл., 3 пр.

Способ определения степени повреждения миокарда в условиях перфузии изолированного сердца по методу Лангендорфа с последующей ишемией и реперфузией, включающий оценку перфузата до и после перфузии изолированного сердца по методу Лангендорфа, отличающийся тем, что проводят люминол-зависимую железоиндуцированную хемилюминесценцию уровня липидной пероксидации перфузата, регистрируют показатели интенсивности свечения модельной системы в присутствии перфузата, полученного до перфузии, и интенсивность свечения модельной системы в присутствии перфузата, полученного после перфузии изолированного сердца по методу Лангендорфа, чем больше значения показателей интенсивности хемилюминесценции модельной системы в присутствии перфузата, полученного после перфузии, в сравнении с исходными показателями, тем массивнее степень повреждения миокарда.