СПОСОБ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИШЕМИЧЕСКИХ И РЕПЕРФУЗИОННЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ИЗОЛИРОВАННОГО СЕРДЦА Российский патент 2008 года по МПК A61K33/08 A61K51/12 A61P9/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно к сердечно-сосудистой хирургии, и может быть использовано при оперативных вмешательствах на сердце, требующих временного прекращения в нем кровотока, и при трансплантации, когда острая тотальная ишемия органа во время забора его от донора и переноса реципиенту является неизбежной и оказывает существенное влияние на результаты и исход трансплантации.

Проблемы ишемических и реперфузионных повреждений тканей и их предупреждение занимают важное место в современной биологии и медицине. Ишемия и репефузия вызывают каскад внутриклеточных изменений, ведущее значение в которых придается процессам свободнорадикального окисления. Нарушение барьерной функции мембран и перегрузка клеточных структур Са²⁺ при ишемии миокарда проявляются в угнетении насосной и сократительной функции сердца. Восстановление перфузии ишемизированного миакарда, являясь одним из эффективных путей восстановления жизнедеятельности клеток, одновременно и усугубляет при значительной длительности ишемии все мембранные повреждения. При этом развивается феномен no-reflow, что увеличивает уже имеющееся угнетение насосной и сократительной функции сердца. При ишемии и последующей реперфузии происходит усиление процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в самом сердце, а после реперфузии - увеличение содержания продуктов ПОЛ также в крови и других неишемизированных органах, т.е. происходит генерализация процессов ПОЛ в организме.

Известен способ коронарной перфузии изолированного сердца по Лангендорфу в модификации Фаллена, включающий использование в качестве перфузата раствора натрия хлорида Кребса-Хенслейта (Биленко М.В., Булгаков В. Г., Моргунов А.А. Ж. «Кардиология», 1989, №6, с.88-94). Для исследования защитного действия в раствор вводили фосфолипиды различного состава (Σ ФЛ, ФЭА + ФХ или ФХ) в течение 30 мин после окончания стабилизирующей перфузии, показатели которой принимали за исходные данные. Сократительная функция миокарда во всех сериях опытов восстанавливалась слабо, величина Р_макс к концу наблюдений составляла 40-49% от исходного уровня. Окисленные фосфолипиды усиливали степень невосстановления коронарного кровотока, т.е. способствовали усугублению феномена no-reflow.

Известен способ предупреждения постишемических повреждений миокарда с помощью липосом, заключающийся в том, что в сердце перед восстановлением кровотока вводили внутривенно лецитиновые липосомы (А.В.Стефанов и др. Предупреждение постишемических повреждений миокарда с помощью липосом. «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины», 1992. Т.113, №6, с.590-593).

В результате проведенных исследований было установлено, что липосомы и/или продукты их деградации предупреждают увеличение свободнорадикального окисления в условиях тканевой гипоксии, тем самым оказывая протективное действие на миокард. Не менее важным является возможность нормализации с помощью липосом функционального состояния клеточных мембран как кардиомиоцитов, так и эндотелиоцитов коронарных сосудов.

При оценке результатов экспериментальных исследований известного способа следует отметить, что они носят чисто исследовательский характер и не содержат практических рекомендаций по применению способа. Кроме того, эксперименты по моделированию ишемии проводились в условиях ограниченной перфузии одной из ветвей левой коронарной артерии, что не соответствует развитию ишемических повреждений на изолированном сердце и, в частности, при тотальной ишемии. Еще одним существенным недостатком является возможность перекисного окисления липосом.

Предложен способ предупреждения ишемических и реперфузионных повреждений изолированного сердца с помощью липосом, вводимых в перфузат.

Отличием является то, что перфузию проводят ретроградно через аортальную канюлю сначала оксигенированным раствором в течение 15 мин, а затем в течение 1-5 мин перфузируют неоксигенированным раствором с добавкой липосом, причем указанные процедуры проводят 2-5 раз с продолжительностью последующих периодов перфузии оксигенированным раствором 2-10 мин.

Отличием является также то, что в неоксигенированный раствор перфузата вводят липосомы, содержащие антиоксиданты. Применение способа позволяет значительно улучшить восстановление сократительной функции и ритма сердца после длительной тотальной ишемии и реперфузии.

Полученный защитный эффект свидетельствует о значительном повышении резистентности сердца к повреждающим факторам длительной ишемии и последующей реперфузии в результате интракоронарного введения липосомальных препаратов, содержащих и не содержащих антиоксиданты. Эффект достигается за счет стабилизации клеточных мембран кардиомиоцитов и эндотелия, снижения активности процессов ПОЛ, удаления продуктов распада и проникновения липосом с содержащимися в них препаратами в клетку и включения их в клеточный метаболизм.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1.

Липосомы, не содержащие антиоксиданты, готовят из фосфатидилхолина и холестерина в соотношении 7:5. Сначала получают липидную пленку необходимого состава, используя роторный испаритель и бензол (растворитель). Полученную пленку гидратируют раствором внутренней фазы и встряхивают до образования мультиламелярных везикул. Внутренняя фаза представляет собой 0,9%-ный раствор NaCl. Для улучшения гидратации везикулы подвергают десятикратному циклу «замораживание-оттаивание». Полученную суспензию пропускают через экструдер с использованием поликарбонатных фильтров с размером пор 30-100 нм. В заключительной стадии липосомы очищают от невключенных веществ методом гель-фильтрации и разбавляют физиологическим раствором до концентрации липида 25 мг/мл. Диаметр используемых липосом составляет 40-50 нм.

Исследования эффективности способа проводят на крысах-самцах линии Вистар массой тела 250-300 г. Животным под тиопенталовым наркозом вскрывают грудную клетку, извлекают сердце и после кратковременной его остановки в охлажденном растворе Кребса-Хенслейта перфузируют ретроградно через аортальную канюлю ( по Лангендорфу) этим раствором, насыщенным смесью O₂ (95%) и CO₂ (5%). Сердце при этом сокращается в изометрическом режиме. Перфузионное давление составляет 60 мм рт. ст., температура перфузата 37°С. Одновременно подготавливают еще один объем раствора Кребса-Хенслейта, который подогревают до 37°С, и в него вводят липосомы. Для ограничения возможности перекисного окисления липосом перфузат, содержащий липосомы, не оксигенируется. Через 15 мин перфузии оксигенированным раствором сердце переводят на перфузию неоксигенированным раствором, содержащим липосомы, при этом длительность перфузии им составляет 1-5 мин. Такую процедуру повторяют 2-5 раз, при этом длительность последующих периодов перфузии оксигенированным раствором составляет 2-10 мин.

Перфузия неоксигенированным раствором вызывает гипоксию органа, поэтому продолжительность этого цикла не может превышать 5 мин из-за опасности гипоксических повреждений сердца, и его чередуют с перфузией оксигенированным раствором. Это позволяет восстановить клеточный метаболизм и создает эффект «тренировки» гипоксии, известный как эффект precondition.

Для получения сравнительных данных аналогичные исследования проводят и с контрольной группой сердец, которые перфузируют в том же режиме, однако неоксигенированный раствор перфузата не содержит липосом.

После окончания циклов перфузии изолированного сердца полностью перекрывают поступление к нему перфузата, воспроизводя, таким образом, тотальную нормотермическую ишемию длительностью 30 мин, а затем возобновляют перфузию. По истечении 10 мин реперфузии через аортальную канюлю перфузионной системы вводят 1 мл перфузата, содержащего 10^-8 М адреналина.

С помощью установки для исследования изолированного сердца на компьютере регистрируют электрограмму сердца и силу его сокращения. Кривую силы сокращения регистрируют перед моделированием тотальной ишемии и на 10-й минуте реперфузии, а электрограмму сердца - непрерывно в течение всего исследования.

По кривой силы сокращения определяют следующие показатели:

силу натяжения сердца, закрепленного на аортальной канюле перфузионной системы;

максимальную силу сокращения;

максимальную скорость повышения силы сокращения;

максимальную скорость снижения силы сокращения (скорость расслабления);

максимальное положительное ускорение сокращения;

максимальное отрицательное ускорение расслабления.

По электрограмме оценивают изменение ритма сердца.

Анализ показателей кривой силы сокращения и электрограммы сердца свидетельствует о восстановлении сократительной функции сердца на уровне, сравнимом с уровнем исходных показателей (75-95% относительно показателей, измеренных до ишемии), что значительно превышает соответствующие показатели сердец контрольной группы (30-60%). Фибрилляция желудочков и желудочковая тахикардия у исследуемого сердца не развивается, а количество экстрасистол, длительность атриовентрикулярного блока и длительность периода реперфузионных аритий оказываются в несколько раз меньше показателей сердец контрольной группы.

Пример 2.

Липосомы диаметром 40-50 нм, содержащие антиоксиданты, приготавливают по методике, приведенной в примере 1. Отличия заключаются в том, что в исходные компоненты в липидной фазе включают α-токоферол при соотношении компонентов 7:5:0,5, а во внутреннюю фазу липосом дополнительно вводят супероксиддисмутазу (8000-10000 ед/мл), каталазу (10000-150000 ед/мл) и восстановленный глутатион (2-40 мМ/мл).

Указанные липосомы вводят в неоксигенированный раствор перфузата, например раствор Кребса-Хенслейта, и все исследования проводят по схеме, приведенной в примере 1.

Анализ показателей кривой силы сокращения и электрограммы сердца свидетельствует о такой же высокой степени восстановления сократительной функции и ритма сердца, как и в примере 1. Вместе с тем максимальное отрицательное ускорение сокращения, характеризующее интенсивность работы кальциевого насоса саркоплазматического ретикулума, значительно превышает соответствующий показатель сердца, которому вводили липосомы, не содержащие антиоксиданты. Антиоксиданты, входящие в состав липосом, способствуют лучшему восстановлению активности кальций-транспортных систем. Защитный эффект липосом обусловлен также сорбцией ими токсичных метаболитов белковой природы, продуктов ПОЛ.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что предложенный способ обеспечивает высокий защитный эффект и может быть использован в сердечно-сосудистой хирургии для предупреждения повреждений при длительной тотальной ишемии и реперфузии.

Изобретение относится к области медицины, а именно к сердечно-сосудистой хирургии, и может быть использовано при оперативных вмешательствах на сердце в эксперименте. Для этого перфузию проводят ретроградно через аортальную канюлю сначала оксигенированным раствором, а затем неоксигенированным раствором с добавкой липосом в определенном режиме. Способ обеспечивает восстановление сократительной функции и ритма сердца за счет стабилизации липосомами клеточных мембран и уменьшения продуктов перикисного окисления липидов. 1 з.п. ф-лы.

1. Способ предупреждения ишемических и реперфузионных повреждений изолированного сердца с помощью липосом, вводимых в раствор перфузата, отличающийся тем, что сердце перфузируют ретроградно через аортальную канюлю сначала оксигенированным раствором в течение 15 мин, а затем проводят в течение 1-5 мин перфузию неоксигенированным раствором с добавкой липосом, причем указанные процедуры проводят 2-5 раз с продолжительностью последующих периодов перфузии оксигенированным раствором 2-10 мин.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в неоксигенированный раствор перфузата вводят липосомы, содержащие антиоксиданты.