Способ защиты миокарда от ишемического и реперфузионного повреждения в эксперименте Российский патент 2022 года по МПК G09B23/28 A61B17/00 A61K38/22 A61P9/10 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано в доклинических исследованиях, а также для разработки лекарственного подхода с целью уменьшения объема ишемического повреждения миокарда при операциях на сердце с прогнозируемой ишемией.

Известно исследование кардиопротективного действия лептина в экспериментах на изолированных кардиомиоцитах и на модели глобальной ишемии-реперфузии изолированного сердца мышей [Smith СС, Mocanu MM, Davidson SM, Wynne AM, Simpkin JC, Yellon DM. Leptin, the obesity-associated hormone, exhibits direct cardioprotective effects. Br J Pharmacol. 2006 Sep; 149(l):5-13]. Согласно описанному в указанной работе протоколу, изолированные сердца мышей прошли период стабилизации 30 мин с последующей 35-минутной глобальной ишемией и 35-минутной реперфузией буфером Кребса, содержащим 10 нМ лептина. Зона некроза изолированных сердец из гиперлептиновой модели была меньше по сравнению с контролем.

Недостатки указанного способа состоят в том, что авторы оценили эффект на модели с недостаточной продолжительностью периода реперфузии. Авторы использовали высокую, превышающую физиологический диапазон, концентрацию лептина, которая в условиях организма может оказать негативное воздействие. Изучение эффекта лептина было проведено в единственной концентрации, без исследования эффектов разных его концентраций. В исследуемой группе лептина было всего 5 мышей, что статистически может дать противоречивый результат. Не были оценены функциональные показатели сердца.

Данных о кардиопротективном эффекте лептина на общепринятой модели ишемического и реперфузионного повреждения миокарда у крыс в доступной литературе не обнаружено.

Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке способа защиты миокарда от ишемического и реперфузионного повреждения на общепринятой модели ишемического и реперфузионного повреждения миокарда у крыс и определении оптимальной для этих целей концентрации лептина.

Указанный технический результат достигается в способе защиты миокарда от ишемического и реперфузионного повреждения в эксперименте, заключающемся в том, при моделировании глобальной ишемии-реперфузии на изолированном сердце крысы на всех этапах используют перфузионный раствора Кребса с рабочей концентрацией лептина 1.0 нМ, при этом этап кондиционирования составляет 60 минут, этап ишемии - 30 минут и этап реперфузии - 120 минут.

На фигурах представлены:

- Фиг. 1 Пульсовое давление в левом желудочке (LVDP) в группах CON, LEP1.0 и LEP3.1. Данные представлены в виде среднего ± стандартное отклонение; *Р<0,01; **Р<0,001; #Р<0,0001;

- Фиг. 2 Конечно-диастолическое давление в левом желудочке (LVEDP) в группах CON, LEP1.0 и LEP3.1. Данные представлены в виде среднего ± стандартное отклонение; *Р=0.021; **Р<0.001; #Р<0.0001;

- Фиг. 3 Ишемическая контрактура в группах CON, LEP1.0 и LEP3.1 Данные представлены в виде среднего ± стандартное отклонение; *Р<0.0001.

Способ был разработан по результатам анализа данных экспериментального исследования перфузии изолированных сердец по Лангендорфу 28 крыс стока Wistar, разделенных на три группы:

1 - контрольная группа - 9 крыс (CON) - в ходе всего эксперимента для перфузии использовали стандартный перфузионный раствор Кребса;

2 - группа Лептин 1,0 - 10 крыс (LEP1.0) - в ходе всего эксперимента для перфузии использовали раствор лептина с концентрацией 1,0 нМ, созданный на основе стандартного перфузионного раствора Кребса;

3 - группа Лептин 3,1-9 крыс (LEP3.1) - в ходе всего эксперимента для перфузии использовали раствор лептина с концентрацией 3,1 нМ, созданный на основе стандартного перфузионного раствора Кребса.

Дизайн исследования был общим для всех групп и включал три последовательных этапа: I этап - 60 минут, кондиционирование сердца рабочим раствором; II этап - 30 минут, глобальная ишемия миокарда; III этап - 120 минут, реперфузия миокарда рабочим раствором. Длительность всех этапов моделирования была разработана авторами экспериментально. Применяли блочную рандомизацию с использованием компьютерного генератора случайных чисел.

В ходе эксперимента регистрировали конечно-диастолическое (LVEDP) и пульсовое давление (LVDP), скорость коронарного потока, частоту сердечных сокращений. Давление в левом желудочке измеряли только во время глобальной ишемии. После завершения 120-й минуты реперфузии три центральных среза сердца использовали для оценки объема необратимого повреждения миокарда с помощью гистохимического окрашивания срезов 1% раствором трифенилтетразолия хлорида.

Согласно полученным данным, конечно-диастолическое и пульсовое давление значимо не различались между группами в течение I этапа эксперимента - 60-минутного периода кондиционирования. Во время II этапа эксперимента - глобальная ишемия, спонтанной механической активности сердца во всех группах не зарегистрировано. На III этапе эксперимента - период реперфузии, в группе LEP3.1 в течение первых 5 минут сердечных сокращений не было. Восстановление давления в группе LEP3.1 было значимо эффективнее, чем в группе CON, Р<0,01 (Фиг. 1).

Более значительная разница была обнаружена в группе LEP1.0 по сравнению с группами CON и LEP3.1, Р<0,0001 и Р<0,001 соответственно (Фиг. 1). LVEDP после периода ишемии было значимо ниже в группе LEP3.1, чем в CON, Р<0,001 (Фиг. 2). В периоде реперфузии LVEDP было наиболее близко к исходному уровню только в группе LEP1.0 по сравнению с группами CON и LEP3.1, Р<0,0001 и Р=0,021 соответственно (Фиг. 2).

Динамика давления в левом желудочке (LV) во время глобальной ишемии в группах CON, LEP1.0 и LEP3.1 показана на Фиг. 3. Ишемическая контрактура определяется как по меньшей мере 3-кратное повышение давления в левом желудочке в любой момент периода ишемии по сравнению с давлением левом желудочке после 5 минут ишемии. Ишемической контрактуры не было обнаружено в группе LEP1.0. Давление в левом желудочке во время ишемии было значительно выше в группах CON и LEP3.1, чем в группе LEP1.0, Р<0,0001 (Фиг. 3).

Значения частоты сердечных сокращений и скорости коронарного потока были одинаковыми между группами для всех сердец в течение 60-минутного периода кондиционирования (I этап эксперимента) и в течение 120-минутной реперфузии (III этап эксперимента) (Таблица). Никаких значимых межгрупповых и внутригрупповых различий по частоте сердечных сокращений и скорости коронарного потока не наблюдалось.

При оценке объема необратимого повреждения миокарда или размера инфаркта миокарда различий между сериями CON и LEP3.1 не было (69±7% и 71±9%, соответственно, Р=0,947). Однако в группе LEP1.0 выявлено значимое уменьшение размера инфаркта (31±3%; Р<0,001) по сравнению с группами CON и LEP3.1.

Таким образом, в результате проведенных исследований было выявлено, что лептин в концентрации 1.0 нМ, добавленный к стандартному перфузионному раствору Кребса, оказывает инфаркт-лимитирующий эффект у крыс на модели глобальной ишемии миокарда в эксперименте на изолированном сердце по сравнению с контрольной группой и группой с более высокой концентрацией лептина в рабочем растворе. Эффект проявляется в значимо лучшем восстановлении показателей, характеризующих функцию левого желудочка - конечно-диастолическое давление левого желудочка, пульсовое давление левого желудочка и давление в левом желудочке, а также значимом уменьшении размера инфаркта при моделировании глобальной ишемии миокарда в эксперименте на изолированном сердце крысы, перфузируемому по Лангендорфу.

Осуществление способа иллюстрируется следующим примером.

Крыса самец стока Wistar, вес 270 г. Проведены стандартные подготовительные процедуры, наркотизация животного и эксплантация сердца. Далее подключение сердца к аппарату Лангендорфа с перфузией стандартного перфузионного раствора Кребса с добавлением лептина в концентрации 1.0 нМ. Затем в соответствии с заявленным способом выполнены этапы эксперимента: I этап - 60 минут, кондиционирование сердца рабочим раствором; II этап - 30 минут, глобальная ишемия миокарда; III этап - 120 минут, реперфузия миокарда.

В ходе эксперимента на первом этапе кондиционирования все 60 минут LVDP и LVEDP было на уровне 128,4±12 мм рт.ст. и 5,7±0,6 мм рт.ст, соответственно; коронарный поток и частота сердечных сокращений были на уровне 11,5±1,6 мл/мин. и 258,2±16 уд./мин., соответственно.

Во втором периоде эксперимента LVDP, LVEDP, коронарный кровоток и частота сердечных сокращений не определялись. Ишемической контрактуры обнаружено не было. Давление в левом желудочке во время ишемии было на уровне 10,3±8 мм рт.ст.

На третьем этапе эксперимента в периоде реперфузии LVEDP составило 8,1±0,7 мм рт.ст, LVDP регистрировалось на уровне 108,4±14 мм рт.ст. коронарный поток и частота сердечных сокращений были на уровне 5,5±1,1 мл/мин. и 229±28 уд./мин., соответственно.

При оценке объема необратимого повреждения миокарда или размера инфаркта его размер составил 27,4% от площади левого желудочка за вычетом камер.

Заявленный способ может быть использован в доклинических исследованиях для разработки лабораторного критерия пороговой концентрации лептина, выше которой возрастает риск тяжелого течения инфаркта миокарда, а также для разработки лекарственного подхода с целью уменьшения объема ишемического повреждения миокарда при операциях на сердце с прогнозируемой ишемией, например, в качестве прекондиционирования перед операциями коронарного шунтирования или чрескожной коронарной ангиопластики.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к кардиологии. При моделировании глобальной ишемии-реперфузии на изолированном сердце крысы на всех этапах используют перфузионный раствор Кребса с рабочей концентрацией лептина 1.0 нМ. При этом этап кондиционирования составляет 60 минут, этап ишемии - 30 минут и этап реперфузии - 120 минут. Способ обеспечивает защиту миокарда от ишемического и реперфузионного повреждения в эксперименте с использованием оптимальной для этих целей концентрации лептина и может найти применение в доклинических исследованиях для разработки лабораторного критерия пороговой концентрации лептина, выше которой возрастает риск тяжелого течения инфаркта миокарда, а также для разработки лекарственного подхода с целью уменьшения объема ишемического повреждения миокарда при операциях на сердце с прогнозируемой ишемией, например в качестве прекондиционирования перед операциями коронарного шунтирования или чрескожной коронарной ангиопластики. 1 табл., 3 ил., 1 пр.

Способ защиты миокарда от ишемического и реперфузионного повреждения в эксперименте, заключающийся в том, что при моделировании глобальной ишемии-реперфузии на изолированном сердце крысы на всех этапах используют перфузионный раствор Кребса с рабочей концентрацией лептина 1.0 нМ, при этом этап кондиционирования составляет 60 минут, этап ишемии - 30 минут и этап реперфузии - 120 минут.