УМЕНЬШЕНИЕ ПЕРЕДАЧИ МАЛЯРИИ Российский патент 2024 года по МПК A01N63/20 A01P15/00 A61K35/74 A61P33/06 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области малярии и обеспечивает композиции и способы, применимые для предотвращения передачи малярии.

Уровень техники

Паразитарные протозойные инфекции ответственны за широкий ряд заболеваний, имеющих важное медицинское значение, в том числе малярию.

Малярия является болезнью, переносимой комарами, которая у людей может быть вызвана пятью видами паразита в виде Plasmodium (плазмодия), из которых Plasmodium falciparum (P. falciparum) является самым вирулентным. В 2018 году во всем мире насчитывалось приблизительно 228 миллионов человек, зараженных малярией, и малярия была причиной приблизительно 405000 смертей, при этом самыми пострадавшими группами были маленькие дети и беременные женщины - 11 миллионов беременных женщин в странах Африки к югу от Сахары были заражены малярией в 2018 г., а на детей в возрасте до 5 лет приходилось 67% всех смертей от малярии (Всемирная организация здравоохранения, 2018, World malaria report. Geneva, Switzerland, World Health Organization).

Недостаток вакцин и эффективных лекарственных средств наряду с устойчивостью к противомалярийным средствам и инсектицидам в сочетании с ослабленными системами здравоохранения в бедных и слаборазвитых странах, эндемичных по малярии, препятствуют усилиям по ликвидации очагов малярии.

Крайне необходимо разработать и внедрить дополнительные средства блокировки передачи малярии, которые можно было бы интегрировать в существующие подходы для достижения целей ликвидации.

Краткое изложение сущности настоящего изобретения

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения обеспечивается композиция, содержащая бактерии рода Delftia.

В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения обеспечивается способ уменьшения или предотвращения переноса вызывающих малярию паразитов, при этом способ включает стадию приведения одного или более комаров в контакт с бактериями рода Delftia.

В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает бактерии рода Delftia для применения для уменьшения передачи малярии.

В еще одном аспекте обеспечивается комар рода Anopheles, заселенный бактериями рода Delftia (в дальнейшем именуемый комаром по настоящему изобретению).

В конкретных вариантах осуществления этих аспектов бактериями рода Delftia являются Delftia tsuruhatensis.

Настоящее изобретение может быть полезным во многих отношениях. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что бактерии рода Delftia, в частности Delftia tsuruhatensis, препятствуют переносу паразитов в виде Plasmodium комарами. При попадании в среду, содержащую комаров, композиции по настоящему изобретению предотвращают перенос вызывающих малярию паразитов путем ингибирования оокинет и ооцист Plasmodium в средней кишке комаров. Бактерии рода Delftia, в частности Delftia tsuruhatensis (D. tsuruhatensis), могут применяться в качестве средства борьбы с распространением малярии.

Описание чертежей

На фиг. 1 показана морфология колонии Delftia tsuruhatensis.

На фиг. 2 показано влияние D. tsuruhatensis на плотность ооцист P. falciparum. Каждая точка представляет собой общее количество ооцист в средней кишке одного комара, а горизонтальная линия отображает среднюю интенсивность инфицирования ооцистами. Критерий Манна-Уитни использовали для сравнения статистической значимости между различными обработками и контролем. (Обработки, которые показывают статистически значимое распределение, обозначены звездочками: p<0,1, p<0,01, p<0,001, p<0,0001 представлены *, **, ***, ****, соответственно, и ns=незначимое). В таблице под графиком показано общее количество сытых комаров, препарированных в случае каждой обработки, % распространения инфекции, потенциал блокировки передачи, снижение средней плотности ооцист и средняя плотность ооцист. Потенциал блокировки передачи в процентах и снижение средней плотности ооцист рассчитывали путем приведения к значениям из контрольной группы. На фиг. 2A и 2B представлены результаты двух независимых экспериментов.

Подробное описание настоящего изобретения

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает композицию, содержащую бактерии рода Delftia. Delftia представляет собой род грамотрицательных подвижных палочек, относящихся к классу Betaproteobacteria и семейству Comamonadaceae.

Бактериями рода Delftia могут быть любые бактерии рода Delftia. В одном варианте осуществления настоящего изобретения бактериями рода Delftia являются D. tsuruhatensis. Бактерия была депонирована в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Шотландия) 21 мая 2019 г., регистрационный номер NCIMB 43398. Эта бактерия была изолирована и идентифицирована с помощью секвенирования 16S рРНК как D.tsuruhatensis. Она является грамотрицательной бактерией, относящейся к классу Betaproteobacteria и семейству Comamonadaceae. В одном варианте осуществления настоящего изобретения бактерии рода Delftia представляют собой бактерии, депонированные в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Шотландия) 21 мая 2019 г., регистрационный номер NCIMB 43398.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения композиция подходит для уменьшения или предотвращения: (i) передачи малярии и/или (ii) переноса вызывающих малярию паразитов комарами. В одном варианте осуществления композиция подходит для предотвращения передачи малярии комарами. В другом варианте осуществления композиция подходит для предотвращения переноса вызывающих малярию паразитов комарами.

«Уменьшение или предотвращение передачи малярии или переноса вызывающих малярию паразитов» определяется как предотвращение малярии, например, путем ингибирования стадий развития вызывающего малярию паразита у комаров (образования ооцист).

Было обнаружено, что бактерии рода Delftia, в частности D.tsuruhatensis, могут подавлять передачу малярии комарами, блокируя вызывающих малярию паразитов. В частности, здесь было показано, что при попадании в среду, содержащую комаров, D.tsuruhatensis может предотвращать перенос вызывающих малярию паразитов путем ингибирования оокинет и ооцист Plasmodium в средней кишке комаров. Таким образом, композиции по настоящему изобретению могут уменьшить или предотвратить передачу малярии и/или перенос вызывающих малярию паразитов комарами.

Комаром может быть любой комар, способный передавать малярию, например комары рода Anopheles. Предусматривается, что композиции и способы по настоящему изобретению распространяются на любые виды комаров рода Anopheles. В одном варианте осуществления настоящего изобретения комар представляет собой Anopheles gambiae или Anopheles stephensi. В одном варианте осуществления комар представляет собой Anopheles stephensi. В другом варианте осуществления комар представляет собой Anopheles gambiae.

Вызывающим малярию паразитом может быть любой вызывающий малярию паразит. В одном варианте осуществления вызывающий малярию паразит представляет собой паразит в виде плазмодия. В одном варианте осуществления паразитом является Plasmodium falciparum. В другом варианте осуществления паразитом является Plasmodium berghei.

Композиции по настоящему изобретению могут иметь любую подходящую форму и могут включать любой подходящий носитель.

Композиция может быть кормовой смесью, т.е. композиция может иметь форму, которая может быть предоставлена комару для потребления. В одном варианте осуществления кормовая смесь представляет собой источник сахара или корм в виде нектара. В одном варианте осуществления кормовая смесь представляет собой источник сахара. Источник сахара может быть привлекательной сахарной приманкой или содержаться в привлекательной сахарной приманке. Привлекательные сахарные приманки включают сахар и токсичный ингредиент. Предусматривается, что привлекательная сахарная приманка в соответствии с настоящим изобретением будет включать композицию по настоящему изобретению вместо токсичного ингредиента, т.е. будет включать сахар и композицию по настоящему изобретению.

В одном варианте осуществления композиция имеет форму приманки. Приманка предназначена для приманивания комара на контакт с композицией. В одном варианте осуществления при контакте с композицией она затем усваивается комаром, например, при проглатывании. Также может применяться аттрактант. Аттрактант может представлять собой феромон, например мужской или женский феромон. Аттрактант заманивает комара на приманку. Приманка может быть в любой подходящей форме, например в твердой, пастообразной, гранулированной или порошкообразной форме.

Приманки могут быть помещены в подходящий «приют» или «ловушку». Такие приюты и ловушки коммерчески доступны, и существующие ловушки могут быть адаптированы для включения композиций по настоящему изобретению. Приют или ловушка может, например, иметь форму коробки и может быть предоставлен в предварительно созданном состоянии или может быть создан, например, из складного картона. Подходящие материалы для приюта или ловушки включают пластик и картон, в частности, гофрированный картон. Внутренние поверхности ловушек могут быть покрыты липким веществом для ограничения движения комара, попавшего в ловушку. Приют или ловушка может содержать внутри подходящий желоб, который может удерживать приманку на месте. Ловушка отличается от приюта, поскольку комар не может легко покинуть ловушку после проникновения в нее, в то время как приют функционируют в качестве «станции кормления», которая предоставляет комару предпочтительную среду, в которой он может кормиться и чувствовать себя в безопасности от хищников.

Во втором аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ уменьшения или предотвращения переноса вызывающих малярию паразитов, при этом способ включает стадию приведения одного или более комаров в контакт с бактериями рода Delftia.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения бактериями рода Delftia являются Delftia tsuruhatensis.

В другом варианте осуществления бактерии рода Delftia представляют собой бактерии, депонированные в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9 мая, Шотландия) 2019, регистрационный номер NCIMB 43398.

Стадия приведения комаров в контакт с бактериями может осуществляться любым подходящим способом. Например, человеку не нужно физически контактировать с комаром и бактериями Delftia, он может оставить бактерии в том месте, где, как он знает, они вступят в контакт с комаром.

Бактерии могут быть представлены в форме композиции по настоящему изобретению, как описано в первом аспекте настоящего изобретения.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения контактирование может быть достигнуто обработкой участка композицией по настоящему изобретению, например, с использованием препарата в виде спрея, такого как аэрозоль или пульверизатор. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения участок может быть обработан, например, с помощью пневматической доставки, с помощью оборудования, установленного на грузовике, и т.п. В некоторых вариантах осуществления композицию напыляют, например, путем ранцевого распыления, пневматического распыления, распыления/разбрасывания и т.д.

Комаром может быть любой комар, способный к передаче малярии, например комары рода Anopheles. Предусматривается, что композиции и способы по настоящему изобретению распространяются на любые виды комаров Anopheles. В одном варианте осуществления настоящего изобретения комар представляет собой Anopheles gambiae или Anopheles stephensi. В одном варианте осуществления комар представляет собой Anopheles stephensi. В другом варианте осуществления комар представляет собой Anopheles gambiae.

Вызывающим малярию паразитом может быть любой вызывающий малярию паразит. В одном варианте осуществления вызывающий малярию паразит представляет собой паразит в виде плазмодия. В одном варианте осуществления паразитом является Plasmodium falciparum. В другом варианте осуществления паразитом является Plasmodium berghei.

В третьем аспекте настоящее изобретение обеспечивает бактерии рода Delftia для применения для уменьшения передачи малярии. В одном варианте осуществления бактериями рода Delftia являются Delftia tsuruhatensis. Бактерии могут быть представлены в форме композиции, описанной выше в первом аспекте настоящего изобретения. В одном варианте осуществления бактерии рода Delftia предназначены для применения для уменьшения передачи малярии комарами. Здесь уменьшение передачи малярии может также пониматься как «уменьшение переноса вызывающих малярию паразитов».

Комаром может быть любой комар, способный к передаче малярии, например комары рода Anopheles. В одном варианте осуществления настоящего изобретения комар представляет собой Anopheles gambiae или Anopheles stephensi. В одном варианте осуществления комар представляет собой Anopheles stephensi. В другом варианте осуществления комар представляет собой Anopheles gambiae.

Вызывающим малярию паразитом может быть любой вызывающий малярию паразит. В одном варианте осуществления вызывающий малярию паразит представляет собой паразит в виде плазмодия. В одном варианте осуществления паразитом является Plasmodium falciparum. В другом варианте осуществления паразитом является Plasmodium berghei.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения бактерии рода Delftia могут применяться в стратегии борьбы с заболеванием, основанной на прямом подвергании комаров на стадии личинок или взрослых особей воздействию бактерии. Воздействие может быть достигнуто путем направленного введения бактерий или посредством взаимодействия местной популяции комаров с комарами, уже заселенными бактериями рода Delftia. Комары по настоящему изобретению, которые содержат бактерии рода Deltfia, могут применяться в качестве средств, которые могут спариваться с другими популяциями комаров и, таким образом, переносить бактерии в другие популяции комаров в пределах участка. Комар, содержащий Delftia, может быть без труда получен путем инфицирования подходящего вида комаров, используя желаемый штамм Delftia.

В качестве альтернативы, бактерии могут использоваться непосредственно для заселения в местную популяцию комаров. Комар Anopheles может подвергаться воздействию бактерий рода Delftia из другого комара или непосредственно самих бактерий. В случае непосредственного воздействия бактерий рода Delftia (т.е. не через другого комара) бактерии могут быть доставлены любым подходящим способом и в комбинации со средством доставки любым подходящим способом, который позволяет вводить композицию комару. Например, комар может контактировать с бактериями в чистой или практически чистой форме, например с раствором, содержащим Delftia.

В конкретном варианте осуществления бактерии рода Delftia находятся в композиции вместе со средством доставки.

В другом конкретном варианте осуществления личиночные формы комаров можно просто «пропитать» или «опрыскать» раствором, содержащим бактерии.

В качестве альтернативы, композиция, содержащая Delftia, может быть соединена с компонентом корма для комара, таким как искусственный нектар или сахарная приманка, для облегчения доставки и/или для увеличения потребления композиции комаром. Способы перорального введения включают, например, непосредственное смешивание композиции с кормом для комаров, распыление композиции в среде обитания комаров или на полях, в том числе участках со стоячей водой. Композиция также может быть включена в среду, в которой комар растет, живет, размножается, кормится или заражает.

В другом варианте осуществления композиция имеет форму приманки. Приманка предназначена для приманивания комара на контакт с композицией. В одном варианте осуществления при контакте с композицией она затем усваивается комаром, например, при проглатывании. Приманка может зависеть от вида, являющегося мишенью. Также может применяться аттрактант. Аттрактант может представлять собой феромон, например мужской или женский феромон. Аттрактант заманивает комара на приманку. Приманка может быть в любой подходящей форме, например в твердой, пастообразной, гранулированной или порошкообразной форме.

Приманки могут быть помещены в подходящий «приют» или «ловушку». Такие приюты и ловушки коммерчески доступны, и существующие ловушки могут быть адаптированы для включения композиций по настоящему изобретению. Приют или ловушка может, например, иметь форму коробки и может быть предоставлен в предварительно созданном состоянии или может быть создан, например, из складного картона. Подходящие материалы для приюта или ловушки включают пластик и картон, в частности, гофрированный картон. Внутренние поверхности ловушек могут быть покрыты липким веществом для ограничения движения комара, попавшего в ловушку. Приют или ловушка может содержать внутри подходящий желоб, который может удерживать приманку на месте. Ловушка отличается от приюта, поскольку комар не может легко покинуть ловушку после проникновения в нее, в то время как приют функционируют в качестве «станции кормления», которая предоставляет комару предпочтительную среду, в которой он может кормиться и чувствовать себя в безопасности от хищников.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения участок может быть обработан композицией по настоящему изобретению, например, с использованием препарата в виде спрея, такого как аэрозоль или пульверизатор. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения участок может быть обработан, например, с помощью пневматической доставки, с помощью оборудования, установленного на грузовике, и т.п. В некоторых вариантах осуществления композицию напыляют, например, путем ранцевого распыления, пневматического распыления, распыления/разбрасывания и т.д.

Комары в соответствии с настоящим изобретением не могут переносить вызывающих малярию паразитов, что делает их подходящими средствами для применения для предотвращения передачи малярии, помимо прямого применения бактерий рода Delftia.

Предусматривается, что настоящее изобретение будет использоваться вместе с другими усилиями по ликвидации малярии. Например, композиции, способы и бактерии для применения по настоящему изобретению могут использоваться вместе с известными противомалярийными средствами. В одном варианте осуществления композиции или бактерии для применения по настоящему изобретению могут использоваться в комбинации с одним, двумя или тремя дополнительными противомалярийными средствами. Комплексное управление переносчиками инфекций (IVM) предлагает в полной мере использовать имеющиеся средства.

По крайней мере одно другое противомалярийное средство также может быть выбрано из феррохина, KAF156, ципаргамина, DSM265, артемизона, артемизинона, артефеномела, MMV048, SJ733, P218, MMV253, PA92, DDD498, AN13762, DSM421, UCT947, ACT 451840, OZ609, OZ277 и SAR97276.

При лечении инфекций, вызванных P. falciparum, по крайней мере одно, два или три дополнительных противомалярийных средства могут быть выбраны из следующего списка, причем по крайней мере одно из противомалярийных средств представляет собой средство на основе артемизинина: артеметер+люмефантрин, артесунат+амодиахин, артесунат+мефлохин, дигидроартемизинин+пиперакин или артесунат+сульфадоксин-пириметамин (SP).

Вышеупомянутые комбинированные терапии известны как комбинированные терапии на основе артемизинина (ACT). Выбор ACT обычно основан на результатах исследований терапевтической эффективности против местных штаммов P. falciparum, вызывающих малярию.

При лечении инфекций, вызванных P. vivax, может использоваться ACT, описанная выше. В качестве альтернативы, по крайней мере одним другим противомалярийным средством может быть хлорохин, особенно в районах, где отсутствует устойчивый к хлорохину P. vivax. В тех районах, где был идентифицирован устойчивый P. vivax, инфекции можно лечить с помощью АКТ, описанной выше.

Комбинации терапевтических средств могут быть удобно представлены для применения в форме фармацевтической композиции или препарата и могут вводиться вместе или по отдельности, а при раздельном введении это может происходить отдельно или последовательно в любом порядке (одним и тем же или разными путями введения).

Композиции или бактерии для применения по настоящему изобретению могут использоваться в сочетании с сетками, обработанными инсектицидами (ITN), включающими инсектицидные сетки длительного действия (LLIN) и IRS (спреи для остаточного действия в помещении). ATSB (привлекательные токсичные сахарные приманки) заманивают комаров питаться сахаром с токсичными соединениями, убивающими комаров. Для эффективности ATSB могут также включать бактерии рода Delftia или, как обсуждалось выше, использовать бактерии рода Delftia вместо токсичного соединения.

Следующие ниже неограничивающие примеры иллюстрируют настоящее изобретение.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

Изоляция и идентификация микроорганизмов из колонии комаров Anopheles stephensi после наблюдения, что эта колония не могла быть инфицирована Plasmodium falciparum

Наблюдали, что колония комаров не могла быть инфицирована Plasmodium falciparum. Пытаясь установить факторы, которые могут влиять на утрату восприимчивости к Plasmodium falciparum комарами Anopheles stephensi из GSK исследовали ткани средней кишки комаров, а также способность к репродукции, выживаемость и микробную флору, присутствующую на различных стадиях развития комаров и в средах, которые использовались для разведения этих комаров.

В августе 2012 года была создана новая колония комаров Anopheles stephensi, яйца которой были импортированы из Imperial College в Лондоне. Взрослых самок комаров обычно использовали для инфицирования Plasmodium falciparum в стандартном анализе кормления через мембрану (SMFA), и у комаров отмечалась достаточная средняя плотность ооцист в средней кишке (от 2 до 25 ооцист у каждого комара) и уровень распространения (от 80 до 100%). Эта колония постепенно теряла восприимчивость к Plasmodium falciparum после одного года колонизации. В настоящем исследовании авторы настоящего изобретения изучили несколько различных факторов, включающих микрофлору, присутствующую в различных тканях комаров и различные условия размножения в лаборатории, условия размножения, корм, температуру, воду среди прочих факторов, которые могут способствовать снижению восприимчивости.

МЕТОДЫ

Выживаемость и репродуктивная способность комаров

Отслеживали смертность взрослых самок комаров. Отмечали процент комаров, питавшихся кровью мышей (во время размножения) и кровью человека (во время SMFA). Также отмечали продукцию яиц после кормления кровью мышей.

Сбор и анализ образцов из инкубаторов, которые использовались для разведения комаров (поверхностей, увлажнителей и воды)

Тип образцов: мазки с внутренних стен всех инкубаторов (1-6)

Источник образцов: установленные участки для сбора мазков находились на: внутреннем полу, внутреннем потолке и двух боковых стенках с внутренней стороны.

Метод отбора образцов: установленные участки (описанные выше) протирали палочкой с ватой у основания. Каждый из тампонов из соответствующих участков помещали в 5 мл стерильной среды LB в пробирках. На отдельных пробирках указывали дату сбора, номер инкубатора и место отбора образца внутри инкубаторов.

Затем их инкубировали при 37°C на роторном шейкере, и проверяли наличие мутности через регулярные промежутки времени; O/N (за одну ночь), 24 ч, 48 ч, 96 ч.

Тип образца: источник - водяной увлажнитель и резервуар воды в инкубаторах, используемых для целей разведения (инкубаторах 5 и 6)

Источник образцов: вода из контейнера увлажнителя (В случае, если контейнер для воды был пуст, мазки брали внутри резервуара и обрабатывали, как описано выше).

Метод отбора образцов: 250-мл образец воды отбирали в стерильную стеклянную бутылку из резервуара для воды. Затем его фильтровали через 0,22-мкм фильтр, помещенный в устройство для вакуумной фильтрации. Фильтр удаляли пинцетом и помещали в 5 мл стерильной среды LB в пробирках. Затем фильтр осторожно промывали LB. На отдельных пробирках указывали дату сбора, номер инкубатора и место отбора образца внутри инкубаторов.

Затем их инкубировали при 37°C на роторном шейкере, и проверяли наличие мутности через регулярные промежутки времени; O/N (за одну ночь), 24 ч, 48 ч, 96 ч.

Анализ образцов

Результаты анализа образцов, указанные выше, были сведены в крупноформатные таблицы Xcel.

Отобранный набор образцов отправляли на анализ для идентификации бактерий внешней аналитической группой (DYNAMIMED SL). Бактериальные колонии были идентифицированы с помощью биохимической характеристики, используя стандартные биохимические исследования.

Сбор образцов тканей комаров (яиц, личинок, целых комаров, средней кишки)

Источник образцов: осуществляли свежий сбор ткани комаров на различных стадиях развития в стерильные пробирки Eppendorf с 100 мкл стерильного PBS, и их немедленно замораживали при -80°C для дальнейшего использования. Ткани включали: яйца (которые были собраны с увлажненной фильтровальной бумаги); целые личинки с различных стадий (10-12/пробирку); взрослых самок комаров подвергали микропрепарированию ради ткани средней кишки, и в общей сложности использовали 10-12 средних кишок; и целые взрослые самки комаров (10-12 на пробирку) - PBS не добавляли, но хранили непосредственно в стерильных пробирках Eppendorf при -80°C.

Анализ образцов тканей комаров

Образцы тканей комаров гомогенизировали с использованием ручного автоматического гомогенизатора KONTES, оснащенного стерильными одноразовыми пестиками. Гомогенаты в полном объеме переносили в стерильный бульон LB или бульон YESP в стеклянных пробирках (5-10 мл) и инкубировали при 27°C на роторном шейкере. Когда наблюдали помутнение, образцы помещали на твердый агар (LB или YESP) для получения одиночных, истинных отдельных колоний. Одиночные отдельные колонии отбирали на основе отличной морфологии колоний и переносили в свежую жидкую среду. Выращенные в течение ночи культуры (500 мкл) тщательно смешивали с равным объемом 80% стерильного глицерина и подвергали криоконсервации при -80°C.

Анализ образцов

Образцы бактерий, выделенных из различных тканей, описанных выше, отправляли на идентификацию внешней аналитической группой (DYNAMIMED SL). Бактериальные колонии идентифицировали с помощью биохимической характеристики, используя стандартные биохимические исследования.

Микроскопическое исследование тканей средней кишки

Комаров (взрослых самок) разного возраста после появления препарировали (Leica, M80) ради средних кишок, и последние помещали в стерильный PBS на предметном стекле ИЛИ инкубировали в 0,2% растворе меркурохрома в D/W (дистиллированной воде) в течение 10-15 минут. Отдельные средние кишки наблюдали с помощью светового микроскопа (Leica, DM2000) с объективом 10Х или 40Х (100-кратном или 400-кратном общим увеличением) или с объективом 100Х с использованием масляной иммерсии, помещая каплю масла на покровное стекло.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Выживание и репродуктивная способность комаров

Колония Anopheles stephensi CRESA была создана в августе 2012 года на территории Tres Cantos с использованием яиц, импортированных из CRESA, Барселона. Изначально колония комаров была создана в CRESA из яиц Imperial College в Лондоне (Robert Sinden Group). Со временем выживаемость, репродуктивная способность и общее качество комаров не ухудшались. Не наблюдали необычную смертность комаров. Процент кормления кровью человека составлял не менее 60-70% (это была средняя степень кормления, наблюдаемая у комаров из этой колонии).

Таблица 1: Результаты идентификации бактерий с помощью биохимической характеристики

Образцы, обозначенные как Источник Описание образца Изолированные бактерии Личиночная стадия 2, небольшая колония Личиночная стадия 2 Истинная колония-небольшая Pseudomonas oryzihabitans Личиночная стадия 2, большая колония Личиночная стадия 2 Истинная колония-большая Pseudomonas oryzihabitans Личиночная стадия 3 Личиночная стадия 3 Гомогенат в LB Pseudomonas oryzihabitans, Staphylococcus aureus Вода с личиночной стадии 3 Вода с личиночной стадии 3 Образец в LB Pseudomonas oryzihabitans,
Aerococcus viridans Куколка Куколка Гомогенат в LB Pseudomonas oryzihabitans Средняя кишка, AN STEPHENSI, 6 дней, до SMFA из комнаты 1 Средние кишки, день 6, без обработки Гомогенат в LB Pseudomonas oryzihabitans Средняя кишка, AN STEPHENSI, 6 дней, после 3 дней обработки Pen-Strept (до SMFA) Средние кишки, день 6, 1X обработка PenStrep Гомогенат в LB Staphylococcus aureus Средняя кишка, 17 дней Средняя кишка, день 17 (с кормлением сахаром) Гомогенат в LB Enterobacter cloacae Средняя кишка, 26 дней Средняя кишка, день 26 (с кормлением сахаром) Гомогенат в LB Pseudomonas oryzihabitans Комната 1, 37ºC, небольшая колония Средняя кишка-Комары из комнаты 1 Истинная колония - небольшая при 37ºC Pseudomonas oryzihabitans Комната 1, 26ºC, небольшая колония Средняя кишка - Комары из комнаты 1 Истинная колония - небольшая при 26ºC Pseudomonas oryzihabitans Комната 1, возраст 6, небольшая колония, 26ºC Средняя кишка - Комары возрастом 6 дней из комнаты 1 Истинная колония - небольшая при 26ºC Staphylococcus aureus Комната 2, возраст 20 Средняя кишка - Комары возрастом 20 дней из комнаты 2 ? Candida spp Комната 2, возраст 20, 26ºC Средняя кишка - Комары возрастом 20 дней из комнаты 2 Истинная колония - при 26ºC Pseudomonas oryzihabitans YESP (агар с дрожжевым экстрактом) Целая средняя кишка, размещенная на агаре с дрожжевым экстрактом Целая средняя кишка Pseudomonas oryzihabitans

Все эти образцы показали преобладание одной основной бактерии, первоначально идентифицированной с помощью биохимической характеристики (тест-полосок API от Biomerieux) как Pseudomonas oryzihabitans. Эти образцы были повторно проанализированы с помощью типирования 16S рРНК, и были идентифицированы две разные бактерии; Delftia tsuruhatensis (фиг. 1) и Pseudomonas putida. Преобладающие бактерии были идентифицированы с помощью типирования 16S рРНК как Delftia tsuruhatensis. Pseudomonas putida, другая бактерия, также была изолирована из тканей комаров, но она не была такой преобладающей, как Delftia tsuruhatensis.

ПРИМЕР 2

Перенос Delftia tsuruhatensis и передача малярии. Эксперименты по установлению роли Delftia tsuruhatensis в блокировке переноса Plasmodium falciparum для подтверждения концепции

Оценивали способность Delftia tsuruhatensis подавлять инфекцию, вызванную P. falciparum, у комаров Anopheles stephensi.

В августе 2012 года на территории GSK, Tres Cantos, Испания, была создана новая колония комаров Anopheles stephensi, яйца которой были импортированы из Imperial College в Лондоне. Взрослых самок комаров обычно использовали для инфицирования Plasmodium falciparum в стандартном анализе кормления через мембрану (SMFA), и у комаров отмечалась достаточная средняя плотность ооцист в средней кишке (от 2 до 25 ооцист у каждого комара) и уровень распространения (от 80 до 100%). Эта колония постепенно теряла восприимчивость к Plasmodium falciparum после одного года колонизации. Хотя приспособленность колонии и репродуктивная способность не были нарушены, авторы настоящего изобретения наблюдали, что в средней кишке комаров отмечалось появление преломляющих микроскопических подобных кристаллам структур, рассредоточенных по мембране, и отсутствие каких-либо ооцист. Ткань комара проверяли на присутствие как грибков, так и бактерий, и авторы настоящего изобретения подтвердили присутствие по крайней мере одного вида бактерий, который преимущественно присутствовал во всех тканях. Авторы настоящего изобретения исследовали несколько различных факторов, в том числе условия разведения, корм, температуру, воду, которые могут способствовать снижению восприимчивости. Один из факторов, который мог способствовать такому избытку бактерий конкретного типа, мог быть связан с протоколом разведения, который использовался в то время. Существование колонии комаров было прекращено из-за отсутствия восприимчивости к плазмодиям. Образцы тканей комаров (личинок, взрослых самцов и самок, ткани средней кишки) хранили при -80°C. Преобладающие бактерии идентифицировали с помощью типирования 16S рРНК как Delftia tsuruhatensis. Pseudomonas putida, другая бактерия, также была изолирована из тканей комаров, но она не была такой преобладающей, как Delftia tsuruhatensis.

Обработка криоконсервированных образцов тканей комаров

Криоконсервированные образцы тканей средней кишки личинок и взрослых самок Anopheles stephensi были отобраны из запасов в глицерине в GSK, хранящихся при -80°C после выращивания в бульоне LB при 27°C. Эти образцы были получены из колонии Anopheles stephensi, созданной в 2012 году, которая не смогла переносить Plasmodium falciparum. Были отобраны три разных флакона, обозначенные номерами 5, 11 и 28;

№ 5=Средние кишки комаров возрастом 5-8 дней;

№ ll=Средние кишки взрослых комаров возрастом 26-30 дней;

№ 28=Большая колония, изолированная из гомогенизированных личинок стадии II.

Для изоляции отдельных колоний из каждого образца стерильную петлю вводили в каждую пробирку и инокулировали в 20 мл бульона LB, сохраняемого при 37°C в течение ночи при 200 об/мин (Delftia может расти как при 37°C, так и при 27°C). Образцы наносили штрихами на чашки с LB и выдерживали при 37°C в течение 24-48 часов. Истинные колонии отправляли для идентификации во внешнюю лабораторию (DYNAMIMED SL). Все эти образцы продемонстрировали преобладание одного основного вида бактерий, первоначально идентифицированный с помощью биохимической характеристики (тест-полосок API от Biomerieux) как Pseudomonas oryzihabitans. Но позже эти образцы были повторно проанализированы с помощью типирования 16S рРНК, и были идентифицированы две разные бактерии; Delftia tsuruhatensis (фиг. 1) и отличный вид Pesudomonas putida. На фиг. 1 показана морфология колонии Delftia tsuruhatensis: кремово-белая круглая колония, грамотрицательные палочки, положительные по каталазе и оксидазе, подвижные бактерии из семейства Comamonadaceae.

Выращивание комаров и подвергание воздействию антибиотиков для ликвидации бактериальной флоры из средней кишки

Круглые колонии Anopheles stephensi поддерживали в камерах с климат-контролем при температуре 26,5±1°C, с фотопериодом 14L (свет):10D (темнота) и при относительной влажности 75±5% (Panasonic MLR352 PE). Взрослые особи, содержащиеся в клетках для выращивания насекомых (30×30x30 см; Bugdorm®), имели неограниченный доступ к 10% сахарозе (SigmaAldrich® S7903)/водный раствор+1% сироп Karo®. Личинок выращивали в пластиковых лотках (20×15х6 см) группами по 250 личинок на лоток и кормили порошкообразными палочками Tetra® Goldfish.

Для ликвидации нормальной бактериальной флоры средней кишки недавно появившихся комаров кормили 10% раствором сахарозы в стерильной дистиллированной воде с 1X пенициллином-стрептомицином [Sigma-Aldrich®, P4333] и 0,4% гентамицином [Sigma-Aldrich®, G1397]. Вату заменяли свежей ватой, пропитанной раствором антибиотика, каждые 48 часов. Самок комаров осторожно переносили в картонные контейнеры, запечатанные двойной сеткой, за два дня до проведения экспериментов. Этих комаров подвергали голоданию в течение ночи, лишив их пропитанной сахаром ваты. Для определения эффективности воздействия антибиотиков средние кишки 10-12 комаров препарировали, гомогенизировали в PBS и помещали на чашки с агаром в LB.

Приготовление бактериального образца и повторное заселение An. stephens в средние кишки

Бактериальный образец для введения комарам готовили с использованием истинной колонии Delftia tsuruhatensis из чашки с LB (см. фиг. 1). Одиночные бактериальные колонии выращивали в 100 мл бульона LB в течение ночи при 37°C и 200 об/мин до ОП₆₀₀=1,0 {10⁶ колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл}. 8 мл культуры осаждали (центрифуга 2 мин, 10000хg), дважды промывали в 10% растворе сахарозы и, наконец, ресуспендировали в 4 мл 10% раствора сахарозы (конечная ОП₆₀₀=приблизительно 2,0). Эту суспензию вносили в небольшую (5 мл) стеклянную пробирку, закрытую ватной пробкой. Пробирку переворачивали, чтобы вата полностью абсорбировала суспензию, и впоследствии помещали в чашу с комарами для допуска кормления. В день эксперимента комарам позволяли кормиться в течение 2 часов ватой, пропитанной 10% раствором сахара+бактерии. Комаров, подвергнутых воздействию антибиотиков (от 40 до 50 взрослых самок на чашку, как описано выше), подвергали голоданию в течение 24 часов перед кормлением этой бактериальной суспензией. Впоследствии всю вату заменяли свежей ватой, пропитанной 10%-ным раствором сахара. Не подвергнутым обработке комарам (контроль) давали 10% раствор сахарозы без бактериальных суспензий.

Подсчет бактериальных масс (нагрузок) в средних кишках комаров

Комаров осторожно препарировали под стереомикроскопом на предметном стекле, содержащем стерильный PBS. Средние кишки от 10 самок комаров (в случае каждой обработки) быстро помещали в 100 мкл стерильного PBS в пробирках Eppendorf на 1,5 мл. Образцы гомогенизировали, используя ручной гомогенизатор, и выполняли серийные разведения. 100 мкл каждого разведения помещали на чашки с агаром в LB, инкубировали при 37°C в течение 24-48 часов. Подсчитывали колонии бактерий, и определяли КОЕ/мл.

Роль Delftia tsuruhatensis в переносе Plasmodium falciparum

Для определения роли Delftia tsuruhatensis в переносе Plasmodium, комаров, заселенных бактериями (как описано выше), кормили зрелыми гаметоцитами в SMFA, как описано ниже. В таблице 2 описаны различные обработки в контрольной и тестируемых группах.

Таблица 2: Схема обработок в эксперименте для определения появления D. tsuruhatensis в средней кишке самок комаров (обработка 1 и 2) и роли D. tsuruhatensis в переносе Plasmodium (обработка 3)

Обработка Контроль Test 1 Сахар Сахар+Бактерии 2 Сахар+Кровь Сахар+Бактерии+Кровь 3 Сахар+Кровь+Плазмодий Сахар+Бактерии+Кровь+
Плазмодий

Получение гаметоцитов

Культуры гаметоцитов были получены из штамма-продуцента гаметоцитов P. falciparum NF54, любезно предоставленного M. Delves (Imperial College, Лондон). Паразитов на бесполой стадии содержали в среде RPMI с 10% сыворотки человека при максимальном уровне общей паразитемии=1%. Протокол культивирования гаметоцитов был адаптирован из протокола, описанного Ifediba и Vanderberg (1981). Индукцию гаметоцитов начинали при уровне паразитемии=0,5% (>70% колец) и гематокрите=4% в среде RMPI с 5% сыворотки человека A+ и 0,5% Albumax {среда для получения гаметоцитов RPMI 1640 (Sigma R5886) 1500 мл, 30 мМ бикарбонат (Sigma-Aldrich S5761), 5 мМ гипоксантин (Gibco 11067-030). Среду делали полной добавлением 5% сыворотки человека A+ и 0,5% Albumax}.

Культуры сохраняли до 20 дней с ежедневной сменой среды и без добавления свежих эритроцитов. В дни 13-15 после индукции среду заменяли дополненной только сывороткой средой для обработки гаметоцитов {RPMI1640 (15,87 г) с L-глютамином и 25 мМ HEPES (Gibco 13018-031), 10 мМ глюкозой (Sigma-Aldrich G8270); 20 мМ бикарбонатом (Sigma-Aldrich S5761); 5 мМ гипоксантином (Gibco 11067)/л. Среду делали полной добавлением 10% сыворотки человека A+ (Межгосударственный банк крови)}. Культуры контролировали ежедневно после дня 13 с использованием окрашенных по Гимзе мазков на предмет гаметоцитемии стадии V, соотношения мужских и женских гаметоцитов и путем проведения анализа эксфлагелляции на жизнеспособность.

Стандартный анализ кормления через мембрану (SMFA)

За два дня до начала SMFA подвергнутых воздействию антибиотиков комаров кормили Delftia sp. как описано выше. В день кормления культуры зрелых гаметоцитов центрифугировали при 2500хg в течение 3 минут при 37°C. Супернатант удаляли, осадок разводили 1:1 свежими эритроцитами человека в 100% объеме упакованных клеток и, наконец, готовили в виде порций искусственной крови для комаров с гематокритом=50% с использованием предварительно нагретой сыворотки человека. Все этапы выполняли при 37°C. Аналогичным образом готовили порцию крови без гаметоцитов. Приготовленными порциями крови кормили в двух повторах самок комаров An. stephensi в течение 30-40 минут через мембрану Parafilm, прикрепленную к стеклянным кормушкам (Fisher Scientific, #12831283), подключенным к циркуляционной водяной бане с температурой 37°C. Накормленных комаров содержали в инкубаторе при температуре 26,5±1°C, с фотопериодом 14L (свет): 10D (темнота) и при относительной влажности 75±5%. Через 24 часа после кормления кровью комаров осторожно препарировали ради средней кишки, и определяли количество бактерий, как описано выше. Для подсчета ооцист в средней кишке комаров с полностью развитыми яичниками (накормленных комаров) препарировали (Leica, M80) ради средней кишки через 7-8 дней после кормления и инкубировали в 0,2% растворе меркурохрома в D/W (дистиллированной воде) в течение 10-15 минут. Общее количество ооцист в отдельных средних кишках подсчитывали с помощью светового микроскопа (Leica, DM2000) с объективом 10Х (100-кратным увеличением). В случае каждой обработки определяли как уровень распространения инфекции (процент комаров с одной или более ооцист), так и среднюю интенсивность инфицирования ооцистами.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Delftia tsuruhatensis мог успешно приживляться в средней кишке An. stephensi

Для определения, был ли Delftia sp. (Delftia tsuruhatensis) эффективным в заселении средней кишки комаров, комаров, которых кормили Delftia, препарировали в двух различных моментах времени; перед кормлением инфекционной кровью (SMFA) и через 24 часа после кормления кровью. Средние кишки 10 комаров объединяли, гомогенизировали в 100 мкл PBS и помещали на агар в LB, и определяли КОЕ. Наблюдали только один тип колонии. Морфология колонии и характеристики выделенных бактерий (хотя и очень небольшого числа) были идентичны Delftia sp., тем самым подтверждая, что Delftia sp. может заселять среднюю кишку комара (таблица 3). После кормления кровью количество бактерий увеличилось на два-три порядка (в соответствии с отчетами/исследованиями, которые показывают увеличение флоры в средней кишке после кормления кровью). В средней кишке комаров из контрольных необработанных групп не было обнаружено присутствие каких-либо колоний как до, так и после кормления кровью, что доказывает эффективность подвергания воздействию гентамицина-пенициллина-стрептомицина в ликвидации местной бактериальной флоры (таблица 3).

Таблица 3. Бактерии Delftia sp., выделенные из средних кишок самок An. stephensi до и после кормления кровью. В таблице показан log КОЕ/мл в контрольной и тестируемых группах

- бактерии + бактерии Контрольная группа (log КОЕ/мл) Тестируемая группа (log КОЕ/мл) Бактериальная нагрузка (масса) перед кормлением кровью 0 1-2 Бактериальная нагрузка через 24 часа после кормления кровью 0 5

D. tsuruhatensis значительно снижал среднюю плотность ооцист Plasmodium falciparum и уровень распространения инфекции у комаров An. stephensi

У повторно заселенных комаров наблюдалось снижение средней плотности ооцист более чем на 70% по сравнению с необработанной контрольной группой. Результаты показали, что у подвергнутых обработке комаров блокировка переноса превышает 60% (фиг. 2).

Применение гентамицина-пенициллина-стрептомицина оказалось успешным в ликвидации местной культивируемой бактериальной флоры в средней кишке, присутствующей у комаров An. stephensi из GSK. Популяция бактерий D. tsuruhatensis была успешно обнаружена в средней кишке комаров, которых кормили сахаром или кровью. У комаров, которых кормили кровью, количество бактерий увеличивалось в два-три раза по сравнению с комарами, которых кормили сахаром, через 24 часа после порции крови. Было обнаружено снижение средней плотности ооцист P. falciparum более чем на 70% и блокировка переноса на 60% по сравнению с необработанными контролями. Инвазия оокинет P. falciparum в среднюю кишку комаров происходит между 16 и 24 часами после кормления кровью. В течение этого периода времени (24 часа после кормления кровью) из средней кишки комаров были выделены только колонии бактерий D. tsuruhatensis, что свидетельствует о прямом участии D. tsuruhatensis в снижении количества ооцист P. falciparum.

Изобретение относится к области предотвращения передачи малярии и может быть использовано для борьбы с распространением малярии. Предложен способ уменьшения или предотвращения переноса вызывающих малярию паразитов, включающий стадию приведения одного или более комаров в контакт с бактериями рода Delftia tsuruhatensis. Предложено также применение бактерий рода Delftia tsuruhatensis для уменьшения передачи малярии. При попадании в среду, содержащую комаров, бактерии рода Delftia tsuruhatensis предотвращают перенос вызывающих малярию паразитов Plasmodium комарами путем ингибирования оокинет и ооцист Plasmodium в средней кишке комаров. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 2 пр.

1. Способ уменьшения или предотвращения переноса вызывающих малярию паразитов, включающий стадию приведения одного или более комаров в контакт с Delftia tsuruhatensis.

2. Способ по п. 1, где комаром является комар рода Anopheles.

3. Способ по п. 2, где комаром является Anopheles gambiae или Anopheles stephensi.

4. Способ по п. 3, где комаром является Anopheles stephensi.

5. Применение Delftia tsuruhatensis для уменьшения передачи малярии.