Набор реагентов и способ детекции возбудителя малярии Plasmodium falciparum Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано для лабораторной диагностики малярии, как в практическом здравоохранении, так и для научных исследований в области микробиологии, эпидемиологии и патогенеза малярии.

Малярия - потенциально смертельное заболевание, вызываемое паразитами рода Plasmodium, которые передаются людям через укусы зараженных самок комаров рода Anopheles. Малярия относится к числу самых распространенных инфекций по всему миру и является одной из основных причин смертности.

Симптомы обычно возникают в течение 10-15 дней после укуса инфицированного комара и могут включать сильную лихорадку, озноб, крайнюю усталость и слабость, боль в мышцах и суставах, головную боль, тошноту и рвоту, анемию. К тяжелым симптомам болезни относятся нарушение сознания, множественные судороги, затрудненное дыхание, потемнение мочи или кровь в моче, желтуха (пожелтение белков глаз и кожных покровов), аномальное кровотечение.

Если малярию не лечить, серьезные повреждения могут задеть жизненно важные органы: мозг, сердце, печень и почки и привести к летальному исходу. Малярию можно предотвратить и лечить. Стратегии профилактики включают использование инсектицидных сеток для кроватей, применение репеллентов и антималярийные препараты. Лечение обычно включает в себя антибиотики и противомалярийные препараты.

В мире насчитывается пять типов паразитов рода Plasmodium, способных вызывать малярию у людей, из которых два - P. falciparum и P. vivax - являются наиболее опасными. P. falciparum считается паразитом, вызывающим самую тяжелую форму малярии и, как результат, высокую смертность, возбудитель наиболее распространен на африканском континенте. P. vivax, в свою очередь, доминирует в большинстве стран, расположенных за пределами Африки. Остальные виды паразитов, которые также могут заражать людей, включают P. malariae, P. ovale и P. knowlesi. Эти виды, хотя и менее распространены, также играют роль в эпидемиологии малярии.

Согласно данным Роспотребнадзора, в России ежегодно регистрируется от 10 до 50 случаев малярии, в основном у граждан, которые вернулись из стран Африки, Юго-Восточной Азии и Южной Америки. В Российской Федерации в 2023 году число завозных случаев малярии составило 136 случаев (в 2022 году - 110 случаев) (https://02.rospotrebnadzor.ru/content/228/42893).

Ранняя диагностика и лечение малярии помогают уменьшить тяжесть болезни и предотвратить смерть пациента, а также способствуют снижению интенсивности передачи малярии. К основным способам обнаружения малярии относятся световая микроскопия крови (тонкий и толстый мазок) и быстрые диагностические тесты, которые обнаруживают антигены Plasmodium или его ферменты в крови. Серологический анализ выявляет антинуклеарные антитела к паразиту, что позволяет установить не только текущую, но и перенесенную инфекцию. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) применяется, если предыдущие анализы на малярию не подтвердили диагноз. Точность выявления инфекции с помощью ПЦР составляет 95 %.

В случае низкоуровневой паразитемии обнаружить малярийного плазмодия можно с помощью методов молекулярной диагностики, таких как ПЦР, ПЦР-РВ или ОТ-ПЦР. В настоящее время на рынке имеются коммерческие тест-системы на основе ПЦР-РВ: «Malaria Parasite Real Time PCR Kit» LiferiverTM, США), «RealStar® Malaria PCR Kit» (Altona Diagnostics GmbH), «Malaria Detection Kit (Multiplex)» (Индия), «Artus Malaria RG PCR kit» (QIAGEN) и др. В Российской Федерации первый ПЦР-тест для диагностики малярии разработан и зарегистрирован ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в марте 2021 г. Набор реагентов «АмплиСенс® Plasmodium spp/P.falciparum/P.vivax-FL» обладает высокой аналитической чувствительностью (1-0,1 кл/мкл крови), позволяет выявлять инфекцию даже при низком уровне инфицирования, а также в инкубационном и начальном периодах заболевания. При его применении снижается риск ложноположительных результатов нередких при микроскопии мазков крови (старый «золотой стандарт») из-за их плохого качества (https://www.rospotrebnadzor.ru/about/info/news/news_details.php?ELEMENT_ID=17226).

ПЦР-тестирование используется в качестве высокотехнологичного экспресс-метода диагностики малярии в клинической практике. Однако это требует наличия дорогостоящего оборудования в лаборатории, а также квалифицированного персонала для работы (Mohon A.N., Lee L.D.Y., Bayih A.G., Folefoc A., Guelig D., Burton R.A., La Barre P., Chan W., Meatherall B., Pillai D.R. NINA-LAMP compared to microscopy, RDT, and nested PCR for the detection of imported malaria / Diagn Microbiol Infect Dis. - 2016. - Vol. 85. - P. 149-153. DOI: 10.1016/j.diagmicrobio).

Методы изотермической амплификации являются альтернативой ПЦР, т.к. они относительно быстрее, проще в использовании и не требуют сложного оборудования. В частности, петлевая изотермическая амплификация (loop-mediated isothermal amplification - LAMP) зарекомендовала себя как чувствительный, специфический и простой метод диагностики различных заболеваний, включая паразитарные болезни (Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N., Hase T. (2000). Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12): E63). В процессе амплификации используются ДНК-полимераза с функцией смещения цепи и набор из четырех (шести) специально разработанных праймеров, которые распознают шесть (восемь) отдельных областей целевой ДНК. Амплификация и детекция целевого гена проходит в один этап и при одной температуре в диапазоне 60-65 °С. В течение менее чем одного часа происходит синтез продукта на уровне примерно 10⁹ копий целевой ДНК. Амплифицированные продукты состоят из ампликонов типа «петля-на-стебле» различной длины.

Помимо электрофореза продукты амплификации можно обнаружить визуально или нефело/фото/флуорометрически, как косвенно (по регистрации изменений концентраций пирофосфата, магния и протонов, которое происходит в ходе реакции синтеза ДНК, проявляемое металлоиндикаторами, комплексонометрическими индикаторами, рН индикаторами), так и прямо (по регистрации нарастания количества амплификонов, что возможно при использовании интеркалирующих красителей или флуоресцентно-меченных петлевых праймеров (FLOS-LAMP) (Зубик, А.Н., Рудницкая Г.Е., Евстрапов А.А. Изотермическая петлевая амплификация LAMP в формате микроустройств / Научное приборостроение. - 2021. - Т. 31, №1. - C. 3-43). К настоящему времени опубликован ряд сообщений об успешном применении LAMP для диагностики малярии (Sharma S, Singh J, Sen A, Anvikar AR. Multiplex loop mediated isothermal amplification (m-LAMP) as a point of care technique for diagnosis of malaria. J Vector Borne Dis. 2022 Jan-Mar;59(1):29-36. doi: 10.4103/0972-9062.331409).

В 2015 г. опубликованы патентные сведения (United States Patent. Primers for detecting plasmodium. - 2015, US 9.222,140 B2. - [Электронный ресурс]. URL: https://patents.google.com/patent/US8936920B2/en) о применении петлевой изотермической амплификации для детекции/идентификации четырех видов малярийных паразитов в образце крови человека. Изобретение предлагает наборы праймеров, специфичных для рода Plasmodium, и наборы праймеров, каждый из которых специфичен для каждого из четырех видов Plasmodium: P. falciparum, P. vivax, P. malariae и P. ovale. В качестве мишени использован ген, кодирующий 18S rRNA.

Известен патент (Plasmodium gene diagnostic primers - 2019, CN 110331221 A China. - [Электронный ресурс]. URL: https://patents.google.com/patent/CN110331221A/en), в котором описаны праймеры для детекции специфического участка митохондриальной ДНК паразитов рода Plasmodium, гена ActinI P. falciparum, фрагмента 18SrRNA P. vivax, гена малой субъединицы рРНК P. ovale методом кольцевой изотермической амплификации. Авторы предлагают использовать запатентованные олигонуклеотиды для дифференциальной диагностики трех видов малярийной инфекции.

Также известен патент (Ultrasensitive loop mediated isothermal amplification (us-lamp) to detect malaria - 2021, WO 2021146814 A1. - [Электронный ресурс]. URL: https://patents.google.com/patent/WO2021146814A1/en). В документе описан метод обнаружения малярии в образцах крови пациентов с помощью петлевой изотермической амплификации. Для амплификации областей гена 18S рРНК Plasmodium, в т.ч. видов P. vivax, P. ovale, P. falciparum, P. malariae или P. knowlesi используются наборы родо- и видоспецифичных олигонуклеотидных праймеров. Авторы разработали недорогой, простой в выполнении и сверхчувствительный LAMP-тест (с пределом чувствительности менее 100 паразитов/мл) для обнаружения малярии в высушенных образцах крови. US-LAMP продемонстрировал превосходную чувствительность (>97%) и специфичность (>99%) для выявления бессимптомных инфекций в странах Африки и Азии с доходами ниже среднего уровня.

В настоящее время на рынке доступны 2 коммерческих набора для детекции малярии на основе LAMP: «LoopAmp malaria (Pan/Pf/Pv) detection kit» (Eiken Chemical Company, Япония) и «Alethia malaria» (Meridian Biosciences, США). Оба достаточно дорогие и имеют сложную систему пробоподготовки и регистрации результата. Чувствительность обоих наборов (нижний предел обнаружения) составляет около 1000 паразитов/мл, что не позволяет выявить часть бессимптомных пациентов, у которых уровень паразитов в крови может быть и меньше. Кроме того, «Alethia malaria» неспособен дифференцировать P. vivax и P. falciparum.

Известен фермент для проведения петлевой изотермической амплификации - Bst-полимераза, выделенная из Bacillus stearothermophilus (Nagamine K., Watanabe K., Ohtsuka K., Hase T., Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a non-denatured template. Clin. Chem. 2001; 47:1742-1743). Bst-полимераза активна при температуре до 66°С, но оптимальной для нее является температура 60°С. Успех изотермической амплификации зависит от активности ферментов по вытеснению цепи и от их способности проходить такие сложные области ДНК, как шпильки. Однако, в научных публикациях есть сообщения о появлении ложноположительных сигналов при работе с Bst-полимеразой.

Проведенный поиск по патентным базам и научно-техническим источникам информации показал отсутствие сведений об отечественных наборах, предназначенных для выявления P. falciparum методом петлевой изотермической амплификации. Поэтому, существует необходимость создания такого диагностикума для детекции ДНК малярийного плазмодия.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров для быстрого, специфичного и чувствительного способа выявлении малярийного плазмодия P. falciparum в биологических образцах.

Технический результат достигается тем, что предложен способ детекции малярийного плазмодия P. falciparum, при котором используется набор оригинальных праймеров:

SEQ ID NO: 2 (прямой внешний праймер Pfr31-F3 P. falciparum);

SEQ ID NO: 3 (обратный внешний праймер Pfr31-B3 P. falciparum);

SEQ ID NO: 4 (прямой внутренний праймер Pfr31-FIP P. falciparum);

SEQ ID NO: 5 (обратный внутренний праймер Pfr31-BIP P. falciparum);

SEQ ID NO: 6 (петлевой праймер Pfr31-LB P. falciparum)

и фермент SD-полимераза в реакции комбинированной петлевой изотермической амплификации в следующих условиях: первичная денатурация: при температуре 92 °С - 1 мин 45 сек, далее 4 цикла: при температуре 92 °С - 15 с, при температуре 63 °С - 1 мин, затем амплификация при температуре 63 °С в течение 20 мин со считыванием флуоресценции каждую минуту.

Технический результат также достигается тем, что в качестве целевой мишени используют некодирующую субтеломерную повторяющуюся последовательност Pfr364.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами (табл. 3, фиг. 1-5) и примерами (1-4).

Таблица 1. Характеристика олигонуклеотидных праймеров для детекции возбудителя малярии.

Таблица 2. Оценка специфичности набора LAMP-праймеров SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6.

Таблица 3. Оценка чувствительности набора LAMP-праймеров SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6.

Фиг. 1. Последовательность SEQ ID NO: 1 - нуклеотидная последовательность Pfr364 из генома P. falciparum 3D7.

Фиг. 2. Места отжига праймеров на последовательности SEQ ID NO: 1.

Фиг. 3. Результаты определения чувствительности набора LAMP-праймеров SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6. Использована ДНК тестовой плазмиды.

Обозначения: 1 - 2 нг pUC57-Mal784; 2 - 200 пг pUC57-Mal784; 3 - 20 пг pUC57-Mal784; 4 - 2 пг pUC57-Mal784; 5 - 200 фг pUC57-Mal784; 6 - 20 фг pUC57-Mal784; 7 - 2 фг pUC57-Mal784; 8 - отрицательный контроль LAMP (вода).

Фиг. 4. Результаты определения специфичности набора LAMP-праймеров SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6.

Обозначения: 1 - ДНК B. anthracis 71/12; 2 - ДНК F. tularensis 15 НИИЭГ; 3 - ДНК Y. pestis EV НИИЭГ; 4 - ДНК Y. pseudotuberculosis C79; 5 - ДНК Y. enterocolitica C-126; 6 - ДНК B. abortus 19 BA; 7 - B. melitensis 16-М; 8 - ДНК B. suis 1330; 9 - ДНК V. cholerae Р-19241; 10 - ДНК L. pneumophila ATCC 33152; 11 - ДНК E. coli АТСС 25922; 12 - положительный контроль 20 пг ДНК pUC57-Mal784; 13 - положительный контроль 2 пг ДНК pUC57-Mal784; 14 - положительный контроль 200 фг ДНК pUC57-Mal784; 15 - отрицательный контроль LAMP (вода).

Фиг. 5. Графики амплификации LAMP-продукта c ДНК из крови больных малярией с набором LAMP-праймеров SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6.

Обозначения: 1-10 - ДНК из крови больных малярией4-11 - положительный контроль pUC57-Mal784 ДНК; 12 - отрицательный контроль LAMP (вода).

Обоснование выбора олигонуклеотидных праймеров и ДНК-мишени.

Видоспецифическая диагностика имеет решающее значение для адекватного лечения малярии. Поэтому выбор мишени играет важную роль. Повышение диагностической чувствительности особенно важно для надежного выявления инфекций при низком уровне паразитемии, поэтому рекомендуется использовать многокопийные геномные последовательности. В геноме P. falciparum обнаружены некодирующие субтеломерные повторяющиеся последовательности Pfr364, представленные в 43 копиях (Nolasco O., Montoya J., Rosales Rosas A.L., Barrientos S., Rosanas-Urgell A., Gamboa D. Multicopy targets for Plasmodium vivax and Plasmodium falciparum detection by colorimetric LAMP / Malar J. - 2021. - Vol. 20. - P. 225. DOI:10.1186/s12936-021-03753-8). Pfr364 была выбрана в качестве мишени для выявления P. falciparum. Последовательность SEQ ID №1 (ген-мишень Pf3D7_13:7053-8580) для подбора праймеров с целью детекции ДНК возбудителя малярии методом петлевой изотермической амплификации была получена из базы GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США).

В качестве положительного контроля в экспериментах использовали тестовую плазмиду pUC57 с клонированным участком Pfr364 P. falciparum (ShineGene Molecular Biotech, Inc., Shanghai, China) - pUC57-Mal784.

Чувствительность реакции амплификации с праймерами оценивалась при исследовании десятикратных разведений тестовой плазмиды pUC57-Mal784.

Специфичность праймеров оценили на наборе штаммов микроорганизмов из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск».

Работу с возбудителями особо опасных инфекционных заболеваний проводили в соответствии с СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».

Ампулы с культурой B. anthracis вскрывали и вносили по 0,5 мл 0,9 % раствора натрия хлористого. После растворения микробные взвеси B. anthracis по 0,1 мл засевали в пробирки с 5 мл бульона Хоттингера рН (7,2±0,1) и инкубировали в течение 18-24 ч при температуре (371) °С. Затем производили посев на чашки Петри с агаром Хоттингера, рН (7,2±0,1), и инкубировали 18 ч при температуре (37±1) °С.

Ампулы с культурой F. tularensis вскрывали и вносили по 0,5 мл 0,9 % раствора натрия хлористого. После растворения микробные взвеси высевали на чашки Петри с «FT-агаром» (ФБУН ГНЦ ПМБ) и инкубировали в течение 48 ч при температуре (37±1) °С.

Ампулы с лиофилизированными культурами Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica и E. coli вскрывали и после растворения микробные взвеси по 0,1 мл засевали на чашки Петри с агаром Хоттингера рН 7,2 и инкубировали в течение 18-24 ч при температуре 37 °С - для Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis и E. coli и 28 °С - для Y. pestis.

После растворения микробную взвесь V. cholerae в объеме 0,1 мл высевали в 1 % пептонную воду, инкубируют в течение 3-6 ч при температуре (37±1) °С. Затем производили высев с помощью бактериальной петли на чашки Петри с щелочным агаром, инкубировали при температуре (37±1) °С в течение 18-20 ч.

Штаммы возбудителя бруцеллёза выращивали на бруцеллагаре (ФБУН ГНЦ ПМБ). Культуры выращивали 48-72 часа при температуре (37±1) °С.

Штаммы возбудителя легионеллёза выращивали на питательной среде для культивирования легионелл - легионелбакагаре (ФБУН ГНЦ ПМБ) при температуре (37±1) °С в присутствии 5 % СО₂. Колонии образовывались на 3-5 день инкубирования.

Из каждой культуры готовили отдельно суспензии в 2 мл 0,9 % раствора натрия хлористого по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ГИСК
им. Л. А. Тарасевича, что соответствует 1×10⁸ м.к./мл для B. anthracis. 1×10⁹ м.к./мл для Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Brucella, Legionella и E. coli, 5×10⁹ м.к./мл для F. tularensis, 2,2×10⁹ м.к./мл для V. cholerae. Затем проводили 10× разведения подготовленных суспензий микроорганизмов в 0,9 % растворе натрия хлористого до конечной концентрации 1×10⁷ м.к./мл.

Апробация праймеров была осуществлена на образцах ДНК из крови больных малярией, полученных из отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва).

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для детекции ДНК возбудителя малярии методом петлевой изотермической амплификации.

На основе анализа in silico нуклеотидных последовательностей возбудителя малярии, присутствующих в базе данных GenBank NCBI, для конструирования прямого и обратного внешних праймеров F3 и B3, прямого и обратного внутренних праймеров FIP и BIP, петлевого праймера LB был выбран участок генома P. falciparum размером 1528 п.н. К последовательности SEQ ID №1 (Фиг. 1) подобраны праймеры SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6. Расчетная длина предполагаемого ампликона, фланкируемого праймерами SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5, составила 146 п.н. (табл.1). Фиг. 2 отображает праймеры и места отжига праймеров на последовательности SEQ ID NO: 1.

При выборе олигонуклеотидных праймеров использовали программу для расчета праймеров он-лайн Primer Explorer 5 (http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html). При подборе праймеров руководствовались требованиями к олигонуклеотидам, используемым в LAMP. Анализ формирования вторичных структур (димеров, шпилек) выбранными праймерами проводили с помощью компьютерной программы mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form). Структуры всех олигонуклеотидов сравнивали с помощью информационного ресурса NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) с последовательностями ДНК, размещенными в базе данных GenBank. При проведении этого анализа олигонуклеотиды с существенной гомологией с ДНК каких-либо других организмов исключали.

Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК с помощью разработанных праймеров для детекции возбудителя малярии методом петлевой изотермической амплификации.

Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала 1х SD-буфер (РусЭнзим, Россия), 40 ед. SD-полимеразы (РусЭнзим, Россия), 3,5 мМ MgCl₂, 0,5 мМ каждого дНТФ, 5 праймеров: 0,2 мкМ SEQ ID №2 (Pfr31-F3), 0,2 мкМ SEQ ID №3 (Pfr31-B3), 0,8 мкМ SEQ ID №4 (Pfr31-FIP), 0,8 мкМ SEQ ID №5 (Pfr31-BIP), 0,4 мкМ SEQ ID №6 (Pfr31-LB), 5 мкл матрицы.

Проводили реакцию комбинированной петлевой изотермической амплификации в следующих условиях: первичная денатурация: при температуре 92 °С - 1 мин 45 сек, далее 4 цикла: при температуре 92 °С - 15 сек, при температуре 63 °С - 1 мин, затем амплификация при температуре 63 °С в течение 20 мин со считыванием флуоресценции каждую минуту на приборе для проведения ПЦР-анализа с детекцией продукта в режиме реального времени Applied Biosystems 7500 (США). Накопление специфического продукта амплификации - участка ДНК P. falciparum - детектировали по каналу VIC.

Учет результатов петлевой изотермической амплификации проводили с помощью программного обеспечения Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR Systems.

Результат амплификации считался положительным, если в анализируемых пробах зарегистрирован флуоресцентный сигнал по каналу VIC. Фиг 3. отображает результат амплификации ДНК возбудителя малярии с набором праймеров к последовательности SEQ ID №1.

Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров к последовательности SEQ ID №1 для идентификации ДНК возбудителя малярии.

Чувствительность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 оценивалась при исследовании 10-кратных разведений тестовой плазмиды pUC57-Mal784.

Специфичность разработанных праймеров оценена на коллекции из 11 штаммов гетерологичных микроорганизмов (по 1 штамму B. anthracis, F. tularensis, Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, B. abortus, B. melitensis, B. suis, V. cholerae, L. pneumophila, E. coli). Оценка специфичности показала отсутствие продуктов амплификации с ДНК гетерологичных штаммов. Таблица 2 и Фиг. 4 отображают результат оценки специфичности олигонуклеотидных праймеров.

Чувствительность праймеров оценивали с помощью амплификации 10-кратных разведений тестовой плазмиды pUC57-Mal784. Анализ результатов показал, что чувствительность разработанных праймеров составила 20 фг плазмидной ДНК. Таблица 3 и Фиг. 3 отображают результат определения чувствительности олигонуклеотидных праймеров.

Таким образом, в результате проведенной оценки установлено, что разработанные праймеры для детекции возбудителя малярии методом петлевой изотермической реакции могут быть использованы для обнаружения ДНК возбудителя малярии и позволяют в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителя малярии в анализируемых пробах.

Специфичность анализа составляет 100%, чувствительность анализа - 20 фг плазмидной ДНК в пробе.

Пример 4. Определение малярийного плазмодия в крови больных малярией.

Образцы ДНК из крови больных малярией получены из отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва). Наличие ДНК возбудителя малярии было подтверждено с помощью ПЦР. Фиг. 5 отображает результат определения малярийного плазмодия в образцах ДНК из крови больных малярией пациентов.

Таблица 1.

Характеристика олигонуклеотидных праймеров для детекции возбудителя малярии

Номер последовательности Наименование праймера Последовательность праймера Локализация Длина ампликона SEQ ID NO: 2 Pfr31-F3 5’-actaggtacgccaacat-3’ 498-515 нуклеотид последовательности Pf3D7_13:7053-8580 193 п.н. SEQ ID NO: 3 Pfr31-B3 5’-gcaacatcataatcatcaaatgc-3’ 668-690 нуклеотид последовательности Pf3D7_13:7053-8580 SEQ ID NO: 4 Pfr31-FIP 5’-gtagacaccatatggtaccacgta-ggatgtgtctatcatatagtccg-3’ 146 п.н. SEQ ID NO: 5 Pfr31-BIP 5’-atcacacgcgtggtgtttaatca-agtgcatgtgaattgtgc-3’ F2 5’-ggatgtgtctatcatatagtccg-3’ 516-538 нуклеотид последовательности Pf3D7_13:7053-8580 F1c 5’-gtagacaccatatggtaccacgta-3’ 556-579 нуклеотид последовательности Pf3D7_13:7053-8580 B2 5’-agtgcatgtgaattgtgc-3’ 645-662 нуклеотид последовательности Pf3D7_13:7053-8580 B1c 5’-atcacacgcgtggtgtttaatca-3’ 580-602 нуклеотид последовательности Pf3D7_13:7053-8580 SEQ ID NO: 6 Pfr31-LB 5’-ttcattgtacccaattttcccctag-3’ 610-634 нуклеотид последовательности Pf3D7_13:7053-8580

Таблица 2.

Оценка специфичности набора LAMP-праймеров SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6

Название штамма Участок хромосомы Pf3D7_13:7053-8580 pUC57-Mal784 + B. anthracis 71/12 - F. tularensis 15 НИИЭГ - Y. pestis EV НИИЭГ - Y. pseudotuberculosis C79 - Y. enterocolitica C-126 - B. abortus 19 BA - B. melitensis М-16 - B. suis 1330 - V. cholera Р-19241 - L. pneumophila ATCC 33152 - E. coli АТСС 25922 -

Таблица 3.

Оценка чувствительности набора LAMP-праймеров SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6.

Концентрация pUC57-Mal784 Число проб Положительный ответ (%) 2 нг 10 10 (100 %) 200 пг 10 10 (100 %) 20 пг 10 10 (100 %) 2 пг 10 10 (100 %) 200 фг 10 10 (100 %) 20 фг 10 10 (100 %) 2 фг 10 0 (0 %)

This XML file does not appear to have any style information associated with it. The document tree is shown below.

--->

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru" nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3" fileName="Набор реагентов и способ детекции возбудителя малярии Plasmodium falciparum.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0" productionDate="2025-03-26">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2024133567/10(074561)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-11-08</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>2024133567/10(074561)</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2024133567/10(074561)</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-11-08</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное бюджетное учреждение науки

«Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия

человека Российской Федерации</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Federal Budget Institution of Science "State Scientific Center

for Applied Microbiology and Biotechnology" is a part of the Federal Service for

Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare of the Russian

Federation</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Щит Ирина Юрьевна</InventorName>

<InventorNameLatin>Shchit Irina Yuryevna</InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Набор реагентов и способ детекции возбудителя

малярии Plasmodium falciparum</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>5</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>17</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..17</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q11">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Plasmodium falciparum</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>actaggtacgccaacat</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q4">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Plasmodium falciparum</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gcaacatcataatcatcaaatgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>47</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q6">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Plasmodium falciparum</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtagacaccatatggtaccacgtaggatgtgtctatcatatagtccg</INSDSeq_sequenc

e>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>41</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..41</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q8">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Plasmodium falciparum</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>atcacacgcgtggtgtttaatcaagtgcatgtgaattgtgc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="5">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>25</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..25</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q10">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Plasmodium falciparum</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttcattgtacccaattttcccctag</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к областям биотехнологии, молекулярной биологии и медицинской микробиологии. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров для реакции петлевой изотермической амплификации (LAMP). Набор олигонуклеотидных включает: праймер F3 - «Pfr31-F3», имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, праймер В3 - «Pfr3-B3», имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, праймер FIP - «Pfr3-FIP», имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4, праймер ВIP - «Pfr3-BIP», имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5, петлевой праймер - «Pfr3-LB», имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6. Предложен способ детекции возбудителя малярии Plasmodium falciparum методом петлевой изотермической амплификации. В способе используют праймеры с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, которые направляют синтез и накопление фрагментов гена-мишени Pfr364 малярийного плазмодия вида Plasmodium falciparum, с помощью фермента SD-полимеразы при 63°C в течение максимум 40 мин, а определение целевого гена-мишени проводят окрашиванием продуктов реакции амплификации интеркалирующим красителем SYTO82. Изобретение позволяет в течение 1 часа с высокой специфичностью детектировать наличие возбудителя малярии - Plasmodium falciparum в пробах ДНК из крови людей. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 3 табл., 4 пр.

1. Набор реагентов для детекции возбудителя малярии Plasmodium falciparum, содержащий олигонуклеотиды SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, комплементарные участку генома Pfr364 малярийного плазмодия вида Plasmodium falciparum, кодируемому нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.

2. Способ детекции возбудителя малярии Plasmodium falciparum методом петлевой изотермической амплификации, отличающийся тем, что используют праймеры с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, которые направляют синтез и накопление фрагментов гена-мишени Pfr364 малярийного плазмодия вида Plasmodium falciparum, с помощью фермента SD-полимеразы при 63°C в течение максимум 40 мин, а определение целевого гена-мишени проводят окрашиванием продуктов реакции амплификации интеркалирующим красителем SYTO82.