ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS VAR. ISRAELENSIS, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, АКТИВНОГО ПРОТИВ ЛИЧИНОК КОМАРОВ Российский патент 1998 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии. Изобретение может быть использовано для создания биоинсектицида для борьбы с личинками комаров.

Комары являются переносчиками возбудителей ряда опасных заболеваний человека и животных (малярия, вирусные энцефалиты, гельминтозы, лихорадка Денге, желтая лихорадка и др.). Кроме того, городские комары являются назойливыми кровососами, вызывают ухудшение сна, снижают работоспособность, вредят здоровью детей. Городские комары становятся серьезной социальной проблемой, являясь источником беспокойства и жалоб населения, а также вызывая аллергенные реакции у детей. В последние годы значительно увеличилась численность комаров. Многие подземные сооружения в жилых и нежилых помещениях городов, включая различные коммуникации, служат местом выплода городских комаров.

Для борьбы с комарами в настоящее время в основном используются химические инсектициды, которые не обладают специфическим действием, они не безопасны для человека и других нецелевых организмов, у комаров к ним возникает устойчивость, инсектициды накапливаются в окружающей среде, вызывая ее загрязнение.

Альтернативным методом борьбы с комарами является использование экологически безопасных биологических препаратов, однако имеющиеся препараты обладают непродолжительным остаточным действием, замедленным проявлением биологического действия, что ограничивает их применение [1, 2].

Наиболее близким техническим решением (прототипом) к предлагаемому изобретению является использование штамма Bacillus thuringiensis (H14) N 71 [1] , активного против личинок комаров. Однако штамм-прототип обладает рядом существенных недостатков: длительным временем культивирования и относительно слабой инсектицидностью.

Для эффективной борьбы с комарами и оздоровления экологической и специальной обстановки предлагается штамм Bacillus thuringiensis (BT) var. israelensis ВКПМ В-6405, высокоактивный против комаров, который может быть использован в качестве продуцента биоинсектицида, эффективного против личинок комаров Aedes, Anopheles и Culex.

Заявляемый штамм имеет следующие характеристики:
1. Культурально-морфологические признаки.

Граммположительные подвижные палочки с закругленными краями на стадии вегетативных клеток размером 1,5 х 2,5 мкм. Зрелые споры овальной формы, кристаллические включения иррегулярной формы. На агаризованных средах через 24 ч роста образуются колонии размером 3-4 мм с плоской шероховатой поверхностью и ризоидными краями без явно выделенного валика и центра. После 30 ч роста на агаризованной среде клетки начинают спорулировать, спорообразование завершается к 60 ч.

При культивировании в жидких питательных средах (LB-бульоне: триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 10 г/л, pH после стерилизации 7,2 [3] и ДПС (дрожже-полисахаридная среда: 15 г/л кукурузной муки и 30 г/л дрожжей, pH 7.0, стер. 30 мин при 0.8 атм) при аэрации штамм растет равномерно по всему объему. Титр термоустойчивых спор при культивировании штамма в жидкой ДПС при 26-28^oC с аэрацией через 3 суток - 2 млрд.спор/мл. При культивировании данного штамма выход фага не наблюдается.

2. Физиолого-биохимические признаки.

Биотипирование штамма проводили по схеме, предложенной Баржак и Бонфуа [4] . Штамм не усваивает маннозу, сахарозу, салицин, эскулин, образует лецитиназу.

Кристаллические включения штамма состоят по крайней мере из 3-х белков с молекулярной массой 130, 70 и 30 кД.

Серотипирование штамма проводили по методу Баржак [5] с использованием стандартных жгутиковых сывороток - культур разных серотипов ВТ. Суспензии клеток штамма аглютинировали с сывороткой H14-антигена.

3. Генетические характеристики штамма.

Штамм устойчив в полимиксину - 100 мкг/мл.

Анализ плазмидного профиля штамма показал наличие 3-х плазмид размером 110, 6.5 и 5.5 тыс. пар нуклеотидов.

4. Инсектицидные свойства.

Инсектицидные свойства штамма оценивали на личинках III стадии комаров лабораторной культуры Culex pipiens, Aedes aeqypti, Anopheles stephensi, An. sacharovi, An.atroparvus [6].

5. Способ получения штамма.

Штамм получен из природных источников. Инсектицидная активность штамма повышена путем многоступенчатой селекции.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Способ культивирования штамма.

Для культивирования штамма использовали жидкую среду ДПС (pH среды 6,8-7,2 после стерилизации). Засев производят с косяков в асептических условиях. После завеса отбирают пробу для световой микроскопии для контроля концентрации клеток и отсутствия посторонней микрофлоры. Культивирование производят при температуре 26-28^oC с аэрацией (250 об/мин) 68 ч. На 48 ч роста по данным световой микроскопии 80% клеток спорулируют, на 60 ч роста практически все вегетативные клетки превращаются в споры, соотношение спора : кристалл = 1:1. В результате ферментации концентрация жизнеспособных спор в культуральной жидкости составляет не менее 2 млрд./мл.

Пример 2.

Оценка эффективности штамма В-6405 на личинках III стадии комаров Anopheles stephensi, An.sacharovi и An.atroparvus в лабораторных условиях.

В лабораторных условиях оценивали биологическую активность штамма на личинках III стадии комаров An. stephensi, An.sacharovi и An.atroparvus. Штамм выращивали в стеклянных колбах (V = 750 мл, заполняемость колбы 50 мл) в жидкой ДПС 60 ч. В качестве штамма-эталона использовали штамм ВТ var.israelensis N 71 [1]. В опыт брали по 25 личинок комаров в 4-х повторностях в 3-х независимых опытах. В стеклянные сосуды емкостью по 100 мл вносили по 50 мл дехлорированной воды и личинок, использовали 6 концентраций с 2-х разовым шагом. Гибель определяли через 24 ч. LC-50 определяли по пробит-анализу. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Как видно из представленных данных в таблице 1 предложенный нами штамм В-6405 примерно в 2 раза активнее штамма N 71 на личинках комаров An.stephensi и более активен для An.sacharovi и An.atroparvus.

Пример 3.

Оценка эффективности штамма В-6405 на личинках III стадии комаров Aedes aegypti и Culex pipiens в лабораторных условиях.

В лабораторных условиях проверяли активность штамма на личинках комаров Aedes aegypti и Culex pipiens. Штамм выращивали как в примере 2, биотестирование проводили в аналогичных условиях. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Как видно из представленных данных в таблице 2, штамм В-6405 в 2 раза активнее штамма-эталона действует против личинок Culex pipiens и в 1,5 раза - против личинок Aedes agypti.

Полученные в результате данной работы значения активности предложенного штамма Bacillus thuringiensis var.israelensis ВКПМ В-6405 на личинках III стадии комаров разных родов (Aedes, Anopheles и Culex) позволяют сделать вывод о большей инсектицидной активности нашего штамма по сравнению со штаммом-прототипом ВТ (H14) N 71.

Литература
1. Кандыбин Н.В., Барбашева Н.М., Ермакова В.П., Смирнова О. В. , и др. Штамм Bacillus thuringiensis (H14) N 71 и способ получения ларвицидного препарата на его основе. Авт. свидет. N 1135024 (СССР, МКИ, A 01 N 63/00. Бюлл. 1987. 16. с .270).

2. Соколова Э.М., Макарова Г.Л. и др. Штамм Bacillus H/14 BTS-393 N B-2547 для изготовления энтомоцидного препарата против кровососущих комар. Авт. свид. N 1121806 (СССР, МКИ, A 01 N 63/00). Бюлл. 1986. 26. с. 265.

3. Маниатис Т. Молекулярное клонирование. 1984. М.: Мир. с. 85.

4. De Barjac H., Bonnefoi A. A classification of strains with a key to their differentiation. J. Invertebr. Pathol. 1968. 11: 335-337.

5. De Barjac H. Identification of H-serotypes of Bacillus thuringiensis. In Microbial Control of Pests and Plant Diseases, 1970-1980. H.D.Burgess (ed.). Academic Press, London.

6. Armstrong J., Rohrmann G., Beaudreau G., Delta Endotoxin of Bacillus thuringiensis subst. israelensis. J. Bacteriology. 1985. v. 161. 39-47.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии и может быть использовано при создании биоинсектицида для борьбы с личинками комаров рода Aedes, Anоpheles и Culex. Из природных источников получен штамм Bаcillus thuringiensis var. israelensis ВКПМ В-6405. Инсектицидная активность штамма против личинок комаров, которые переносят ряд опасных заболеваний человека и животных, повышена путем многоступенчатой селекции. 2 табл.

Штамм бактерий Bacillus thuringiensis var. israelensis ВКПМ В-6405, предназначенный для получения препарата, активного против личинок комаров.