Способ выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у животных с помощью полимеразной цепной реакции.

Известен в медицине способ диагностики криптоспоридиоза включающий гистологическое исследование биоптата, дофиксацию срезов метанолом, экспозицию при окраске карболовым фуксином осуществляют в течение 5-10 мин, в качестве деклорайзера применяют 5% серную кислоту. Способ обеспечивает положительный эффект в виде выявления объективных критериев диагностики криптоспоридиоза, обеспечивающих тактику лечения (патент РФ №2229128, кл. G01N 1/30, 2004 г.).

Наиболее близким по технической сущности является изобретение по патенту RU №2785435, кл. C12Q 1/68, 2022 г., способ выявления токсиген-ных pasteurella multocida методом ПЦР в режиме реального времени, включающий выделение ДНК возбудителя инфекционного заболевания из материала, постановку полимеразной цепной реакции.

Недостатком известного технического решения является недостаточные возможности выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) в биологическом материале (кровь, сыворотка крови, фрагменты и суспензии паренхиматозных органов (легкие, селезенка и др.), лимфоузлы, молоко из пораженных долей вымени, смывы со слизистой оболочки носа) и кормах, а также в культурах микроорганизмов, смывах с поверхностей методом амплификации ДНК с флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени», а также недостаточная точность при выявлении возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida).

Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и повышение точности при выявлении возбудителя пастереллеза (Pasteurella multgbiSa)]

Технический результат достигается тем, что в способе выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающем выделение ДНК возбудителя инфекционного заболевания из материала, постановку полимеразной цепной реакции, согласно изобретению, выделение ДНК проводят сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией осуществляют в один этап с проведением 40 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя инфекционного заболевания животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей, внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл и положительного контрольного образца в виде смеси содержащую в одинаковом объемном соотношении фрагменты геномов возбудителя инфекционного заболевания животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

для положительного контрольного образца используют фрагмент генома возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) со следующей нуклеотидной последовательностью 5'-3':

при этом для ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) используют флуоресцентный краситель - ROX/Orange, измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей для специфического сигнала тестирования наличия возбудителя инфекционного заболевания животного и по каналу FAM/Green для внутреннего контрольного образца, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный. ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) выделяют из материала по выбору: кровь, сыворотка крови, фрагменты и суспензии паренхиматозных органов, лимфоузлы, молоко из пораженных долей вымени, смывы со слизистой оболочки носа, кормов, культур микроорганизмов, смывов с поверхностей.

Новизна заявляемого способа обусловлена тем, что идентификацию ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) проводят с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием специфичных для участка генома олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда, за счет того, что выделение ДНК проводят сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией осуществляют в один этап с проведением 40 циклов амплификации, а также за счет внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл и положительного контрольного образца в виде смеси содержащую в одинаковом объемном соотношении фрагменты геномов возбудителя инфекционного заболевания животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

для положительного контрольного образца используют фрагмент генома возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) со следующей нуклеотидной последовательностью 5'-3':

при этом для ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) используют флуоресцентный краситель - ROX/Orange, измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей для специфического сигнала тестирования наличия возбудителя инфекционного заболевания животного и по каналу FAM/Green для внутреннего контрольного образца, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат Такая постановка ПЦР в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Разработан способ выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) у животных методом полимеразной цепной реакции. Способ осуществляется методом амплификации ДНК с флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Выделяют ДНК возбудителя инфекционного заболевания сорбционным методом из материалов животных: кровь, сыворотку крови, фрагменты и суспензии паренхиматозных органов, лимфоузлы, молоко из пораженных долей вымени, смывы со слизистой оболочки носа, а также, используются корма, культуры микроорганизмов, смывы с поверхностей. Далее осуществляют постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией с проведением 40 циклов амплификации в реальном времени. Используют специфичные для участка генома ДНК возбудителя инфекционного заболевания животного олигонуклеотидные праймеры, зонды, флуоресцентные красители. Внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл и положительного контрольного образца в виде смеси содержащую в одинаковом объемном соотношении фрагменты геномов возбудителя инфекционного заболевания животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью: T4F: 5'-TACATATAAATCACGCAAAGC-3', T4R: 5'-TAGTATGGCTAATCTTATTGG-3', Т4Р: СУ5-5'-ACATTGGCACTGACCGAGTTC-3'-BHQ1, для положительного контрольного образца используют фрагмент генома возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) со следующей нуклеотидной последовательностью 5'-3': Pm-F: 5'-AACGTCCAATCAGTTGCGCC-3', Pm-R: 5'-AGTGGGCTTGTCGGTAGTC-3', Pm-P R6G-5'-CTCAACACACCAAACTCTGCCCAAC-3'-BHQ1. Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и повышение точности при выявлении возбудителя пастереллеза (Pasteurella multgbiSa). 1 з.п. ф-лы.

1. Способ выявления ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающий выделение ДНК возбудителя инфекционного заболевания из материала, постановку полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, выделение ДНК проводят сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции с флуоресцентной детекцией осуществляют в один этап с проведением 40 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя инфекционного заболевания животного олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей, внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл и положительного контрольного образца в виде смеси содержащую в одинаковом объемном соотношении фрагменты геномов возбудителя инфекционного заболевания животного и бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

для положительного контрольного образца используют фрагмент генома возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) со следующей нуклеотидной последовательностью 5'-3':

,

при этом для ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) используют флуоресцентный краситель - ROX/Orange, измерение накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей для специфического сигнала тестирования наличия возбудителя инфекционного заболевания животного и по каналу FAM/Green для внутреннего контрольного образца, проведение интерпретации результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.

2. Способ по п. 1, где ДНК возбудителя пастереллеза (Pasteurella multocida) выделяют из материала по выбору: кровь, сыворотка крови, фрагменты и суспензии паренхиматозных органов, лимфоузлы, молоко из пораженных долей вымени, смывы со слизистой оболочки носа, кормов, культур микроорганизмов, смывов с поверхностей.