Тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а именно к средствам диагностики инфекции у животных с помощью полимеразной цепной реакции.

Известно выявление ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannhcimia haemolytica) в биологическом материале животных с помощью полимеразной цепной реакции, которую осуществляли в реакционной смеси следующего состава: 3 мкл кДНК, по 10 пмоль праймеров, 2 мМ MgCl2, 200 мкМ каждого dNTP, 1,25 ед. Taq ДНК-полимеразы, 2,5 мкл 10х буфера для Taq-полимеразы и деионизированная вода до объема 25 мкл. (М.А. Шибаев Разработка метода выявления mannheimia haemolytica с помощью полимеразпой цепной реакции и нуклеотидного секвеиирования (Журнал Ветеринарная патология. №4. 2007, стр. 95-99, https://vetpat.ru/wp-content/uploads/2014/03/vet_patologija_04_07.pdf).

Однако известное техническое решение недостаточно точное из-за использования метода электрофореза в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

Наиболее близким по технической сущности является изобретение по патенту RU №2726242, кл. C12Q 1/68, 2020 г., включающее буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидиой последовательностью:

- прямой праймер

- обратный праймер - зонд, взятых в объемном соотношении 1:1.

Недостатком известного технического решения является отсутствие возможности выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале (кровь, сыворотка крови, фрагменты и суспензии паренхиматозных органов (легкие, селезенка и др.), лимфоузлы, молоко из пораженных долей вымени, смывы со слизистой оболочки носа) и кормах, а также в культурах микроорганизмов, смывах с поверхностей методом амплификации ДНК с флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».

Техническим результатом является расширение функциональных возможностей и повышение точности при выявлении возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica).

Технический результат достигается тем, что в тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающее буфер для проведения полимеразной ценной реакции, смесь для ее проведения, состоящая из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

- прямой праймер

- обратный праймер - зонд, взятых в

объемном соотношении 1:1, согласно изобретению для положительного контрольного образца использован фрагмент генома возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) со следующей нуклеотидной последовательностью:

, при этом для ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) использован флуоресцентный краситель - ROX/Orange.

Новизна заявляемой тест-системы для состоит в идентификации ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием специфичных для участка генома олигонуклеотидных праймеров флуоресцентно-меченного зонда. Такая постановка HI IP в реальном времени сокращает и упрощает процедуру анализа, снижает риск контаминации. Кроме того, флуоресцентная детекция продуктов амплификации осуществляется с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда.

Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».

Заявляемая тест-система рекомендована для использования в специализированных ветеринарных, санитарно-эпидемиологических, животноводческих, сельскохозяйственных предприятиях, что соответствует критерию «промышленная применимость».

Тест система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени реализуют следующим образом.

Предварительно выделяют ДНК из биологического материала животного сорбционным методом. В качестве биологического материала по выбору может быть использованы: кровь, сыворотка крови, фрагменты и суспензии паренхиматозных органов (легкие, селезенка и др.), лимфоузлы, молоко из пораженных долей вымени, смывы со слизистой оболочки носа) и корма, а также культуры микроорганизмов, смывы с поверхностей.

Проводят полимеразную цепную реакцию с флуоресцентной детекцией с проведением 40 циклов амплификации в реальном времени с использованием специфичных для участка генома ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) олигонуклеотидных праймеров, зондов, флуоресцентных красителей: для специфического сигнала для ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) используют флуоресцентный краситель - ROX/Orange и для внутреннего контрольного образца бактериофаг Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл - FAM/Grcen. Для положительного контрольного образца используют смесь, содержащую в одинаковом объемном соотношении фрагменты геномов возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) и бактериофага Т4 со следующими нуклеотидными последовательностями:

- праймер прямой

праймер обратный

- зонд

- Праймер прямой

- Праймер обратный

- зонд.

Затем измеряют накопления флуоресцентных сигналов по каналам соответствующих флуоресцентных красителей, проводят интерпретацию результатов на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, то результат реакции - отрицательный.

Для повышения точности идентификации возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) для внутреннего контрольного образца используют бактериофаг Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, если концентрация фаговых частиц отклоняется в большую или меньшую сторону, то наблюдаются повторности сомнительных образцов.

При конструировании праймеров и зонда основными требованиями были: степень гомологии (комилементарность) с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри олигонуклеотидов и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига праймеров.

Конструирование специфических праймеров и зонда осуществляли с помощью компьютерных программ на основании анализа нуклеотидных последовательностей референтных штаммов и изолятов, опубликованных на ресурсе GenBank и подбора условий для проведения ПЦР в реальном времени с применением разработанных праймеров и зонда, несущего флуорофор и тушитель, и комплементарного части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента.

Праймеры, специфичные для генома Mannheimia haemolytica, были отобраны на основе нуклеотидной последовательности гена супероксиддис-мутаза (SOD, superoxide dismutase, CDS 765102..765743, product='superoxide dismutase", CP004752 2657957 bp DNA circular BCT 24-APR-2020 DEFINI-TION Mannheimia haemolytica USDA-ARS-USMARC-183 chromosome, complete genome).

Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд Mh-P (комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров Mh-F и Mh-R). На 5'-конце олигонуклеотидного зонда помещен флуоресцентный краситель Карбокси-Х-родамин (ROX).

В качестве внутреннего контроля использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный зонд Т4-Р, помеченный флуоресцентным красителем карбоксифлуоресцеин (FAM).

Используя программу "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР в качестве праймеров и зонда. Ни одна из выбранных последовательностей не обнаружена в геномах других представителей кокцидий из группы простейших, а также в геномах любых видов животных и человека.

Пример конкретного использования тест-системы для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР РВ)

Пример включает следующие этапы:

1. Отбор материала для исследования

Для исследования используют следующий материал:

• Мазки и соскобы слизистых оболочек носа. Снимают с помощью стерильного зонда, зонд помещают в пластиковую микропробирку объемом 1,5 мл с 0,5 мл стерильного физиологического раствора;

• Фрагменты паренхиматозных органов (фрагменты печени, легких, селезенки, а также миндалины, лимфоузлы и др.). Отбирают в стерильный контейнер.

• Цельная кровь. Кровь забирается в пробирку с 6% ЭДТА из расчета 50 мкл раствора ЭДТА на 1 мл крови, закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают.

• Молоко, отбирают в объеме 10-30 мл в стерильную посуду.

• Отбор исследуемых образцов кормов/сырья проводят по национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп сырья, пищевых продуктов и кормов.

2. Подготовка исследуемого материала

Мазки и соскобы со слизистых конъюнктивы в физиологическом растворе исследуют без предварительной подготовки.

Пробы тканей и органов, а также пробы продуктов животного происхождения гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем обычно готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 10-12 тыс. об/мин в течение 2 минут. Надосадочную жидкость используют для экстракции ПК. В некоторых случаях образовавшуюся суспензию не центрифугируют, а отстаивают при комнатной температуре в течение 5 мин, затем верхнюю фазу по 0,4-0,5 мл переносят пастеровской пипеткой (или наконечником с аэрозольным барьером) в пробирки на 1,5 мл, и в количестве 0,1 мл используют для выделения нуклеиновой кислоты (ПК).

Молоко в объеме до 10 мл обеззараживают и центрифугируют при 3 тыс об/мин в течение 10-15 мин. Надосадочную жидкость осторожно отбирают, оставив над осадком примерно 0,2 мл жидкости. Осадок ресуспендируют в оставшейся надосадочной жидкости и 0,1 мл суспензии используют для выделения ДНК.

От кормов/сырья плотной консистенции отбирают на исследование общую пробу весом 10-50 г. Гранулированные или консервированные корма/сырье перед исследованием (10-20 г) растирают в ступке до гомогенного состояния. Отбирают лабораторные пробы (20-40 мг) в одноразовые микропробирки вместимостью 1,5 мл и направляют на выделение НК. 3. Проведение анализа Исследование проводили с помощью набора реагентов «ПЦР-МАНХЕЙМИО3-ФАКТОР» для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica). Набор состоит из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР (Таблица 1, комплект №1) и комплекта контрольных образцов (Таблица 2, комплект №2). Набор выпускается в двух вариантах: 1) Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы) 2) Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).

Наборы используют в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов «ПЦР-МАНХЕЙМИО3-ФАКТОР» для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале и кормах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием принципа выщепления флуоресцентной метки на 5' конце олигонуклеотидного зонда. Для диагностики in vitro, http://www.vetfaktor.ru/.

Исследование с помощью набора реагентов «ПЦР-МАНХЕЙМИО3-ФАКТОР» состоит из трех циклов:

• экстракция ДНК;

• проведение ПЦР РВ;

• учет результатов анализа.

4. Экстракция (выделение) НК из клинического материала

Отбирают необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Вносят во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для ОКО, по 10 мкл ВКО Т2.

Вносят исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения ДНК, в пробирку отрицательного контроля выделения вместо исследуемой пробы внести ОКО (пробирку обозначить как ВК-).

Выделяют ДНК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения ДНК. Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2°С до 8°С или в течение года при температуре не выше минус 16°С.

5. Подготовка образцов к проведению ПЦР

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.

Успешное прохождение реакции контролируют использованием НКО MANNHEIMIA, ВКО Т2 и ДНК буфера.

В отдельной пробирке смешивают компоненты набора из расчета па каждую реакцию ПЦР:

• 5 мкл ПЦР СМЕСЬ MANNHEIMIA

• 10 мкл ПЦР БУФЕР MANNHEIMIA

• 0,5 мкл I AQ POLYMERASE

Перемешивают смесь па вортексе и сбрасывают капли кратковременным центрифугированием.

Отбирают необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Вносят по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.

Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки вносят:

а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;

б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую вносят по 10 мкл ДНК соответствующей пробы, полученной но п. 7.1 (включая пробу ВК-);

в) в пробирку положительный контроль ПЦР (К+) 10 мкл ПКО MANNHEIMIA.

6. Проведение реакции ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией

Помещают подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки прибора «Rotor-Genc Q». Параметры температурно-временного режима амплификации на приборе «Rotor-Gene Q» указаны таблице 3.

7. Интерпретация результатов анализа

Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору и в соответствии с Приложениями 1, 2 и 3 к Инструкции.

Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).

Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.

Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- (на канале ROX/Orange Mannheimia haemolytica) и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- (на любом из каналов) свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа для всех проб считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации.

Образцы, для которых по каналу FAM/Green значение Ct отсутствует или превышает 35 цикл (и при этом но каналу ROX/Orange отсутствует значение Ct) требуют повторного проведения исследования с этапа ПЦР. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале FAM/Green указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или па ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции ДНК.

Образец считается положительным (ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) присутствует) если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале ROX/Orange, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл.4). Если для исследуемого образца по каналу ROX/Orange значение Ct определяется позднее 35 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения ДНК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале ROX/Orange более 35), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПЦР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики. В случае получения значения Ct па канале ROX/Orange менее 35 при исследовании повторно взятого от животного материала - образец считать положительным.

Образец считается отрицательным (ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica), отсутствует) если не наблюдается рост сигнала флуоресценции на канале ROX/Orange, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (см. Табл. 4).

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Описана тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Тест-система включает буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

взятых в объемном соотношении 1:1. При этом для положительного контрольного образца использован фрагмент генома возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) со следующей нуклеотидной последовательностью:

а для ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) использован флуоресцентный краситель - ROX/Orange. Изобретение расширяет функциональные возможности и повышает точность при выявлении возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica). 4 табл., 1 пр.

Тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, тест-система для выявления ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) в биологическом материале животных и кормах с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающая буфер для проведения полимеразной цепной реакции, смесь для ее проведения, состоящую из дезоксинуклеозидтрифосфатов, олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентных зондов, специфичных для участка генома животного и для внутреннего контрольного образца; смесь ферментов из ДНК полимеразы с антителами, ингибирующих активность фермента, TAQ POLYMERASE, внутренний контрольный образец в виде суспензии бактериофага 14 с концентрацией 5×10³ фаговых частиц на 1 мкл, отрицательный контрольный образец, представляющий собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома животного и фрагмент генома бактериофага Т4 с нуклеотидной последовательностью:

- прямой праймер

- обратный праймер

- зонд,

взятых в объемном соотношении 1:1, отличающаяся тем, что для положительного контрольного образца использован фрагмент генома возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) со следующей нуклеотидной последовательностью:

при этом для ДНК возбудителя манхеймиоза (Mannheimia haemolytica) использован флуоресцентный краситель - ROX/Orange.