СЛИТЫЙ БЕЛОК TACI-FC И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК A61K38/17 C07K14/705 C07K19/00 A61P37/06 

Область техники

[0001] Настоящее изобретение относится к области слитого белка рецептор стимулятора В-лимфоцитов-антитело для лечения аутоиммунных заболеваний, и более конкретно, к оптимизированному слитому белку TACI-Fc и его применению в производстве лекарственного средства для лечения системной красной волчанки, и схеме дозирования для лечения аутоиммунных заболеваний при его применении.

Уровень техники

[0002] Системная красная волчанка (SLE) представляет собой хроническое мультисистемное аутоиммунное заболевание, характеризующееся аномальной активацией В-лимфоцитов и аномальной дифференцировкой в плазматические клетки и эффекторные клетки памяти с образованием большого количества аутоантител. Это серьезно угрожает здоровью человека. В настоящее время существуют менее специфические терапевтические средства для клинического лечения SLE, и традиционное лечение SLE главным образом основано на глюкокортикоидах и иммунодепрессантах, и кортикостероиды являются основой всех вариантов лечения. Циклофосфамид в настоящее время представляет собой важное лекарственное средство для лечения тяжелого волчаночного нефрита, но его клиническое применение ограничено за счет проявления тяжелых побочных реакций. Кроме того, гидроксихлорохин, одобренный FDA в 1955 г., имеет неудовлетворительный терапевтический эффект.

[0003] Результаты исследований показали, что мыши с нокаутом BLyS имеют пониженный уровень зрелых B-лимфоцитов и пониженное содержание иммуноглобулинов, в то время как у BLyS-трансгенных мышей развиваются волчаночноподобные симптомы, такие как высокая пролиферация B-лимфоцитов, высокие титры аутоантител к dsDNA, протеинурия и отложение иммунных комплексов в почках. На двух мышиных моделях SLE, MRL/lpr и NZB/WF1, в начале заболевания уровни BLyS в сыворотке крови повышаются, что связано с повреждением почек, и блокирование эффекта BLyS может существенно повысить выживаемость мышей с волчаночноподобными симптомами заболевания. В сыворотке и плазме крови некоторых пациентов с SLE уровень и биологическая активность BLyS достоверно выше, чем у здоровых людей. Результаты опытов на животных и экспериментов с тканями людей in vitro дают основание предположить, что сверхэкспрессия BLyS является одним из важных механизмов, участвующих в патогенезе SLE. Следовательно, нацеливание на BLyS и элиминация B-лимфоцитов стали очень многообещающей стратегией лечения SLE.

[0004] В настоящее время биопрепараты, нацеленные на BLyS для лечения SLE, стали горячей точкой исследований. Антагонисты BLyS для лечения SLE могут включать моноклональные антитела к BLyS, слитый белок, состоящий из рецептора BLyS и сегмента IgG-Fc, миметики BLyS, которые могут связываться с BAFF-R, но не могут инициировать передачу сигнала, и антагонистические антитела к рецептору BLyS и т.д.

[0005] Стимуляторы В-лимфоцитов (BLyS) представляют собой новый член суперсемейства TNF, открытый в 1999 г., и в основном они секретируются моноцитами, макрофагами, дендритными клетками и нейтрофилами. BLyS выполняет функции регуляции созревания В-лимфоцитов, способствуя переключению классов иммуноглобулинов, обеспечивая активацию Т-клеток и участвуя в аутоиммунных процессах посредством связывания с его соответствующими рецепторами. BLyS состоит из 285 аминокислот и экспрессируется на клеточной поверхности в виде трансмембранного белка II типа, и растворимый фрагмент размером 17 т.п.н., высвобождаемый после расщепления, обладает биологической активностью и участвует в циркуляции в виде гомотримера. В настоящее время известно три рецептора BLyS: BCMA (антиген созревания В-клеток), BAFF-R (рецептор BAFF, BR3) и TACI (трансмембранный активатор и кальциевый модулятор, и взаимодействующий с циклофилиновым лигандом рецептор, TACI). BAFF-R является специфическим рецептором для BLyS, в то время как TACI и BCMA могут также связываться с APRIL в дополнение к связыванию с BLyS. Три рецептора BLyS играют разные роли при связывании с BLyS. Роль BLyS в активации созревания В-клеток в переходный период у мышей, продлении продолжительности существования зрелых В-клеток у мышей и людей, и содействии активации Т-клеток в основном достигается через BAFF-R. Рецепторы TACI оказывают двойное действие на активацию мышиных В-клеток. С одной стороны, у TACI-дефицитных мышей наблюдается повышенное количество периферических В-клеток, усиленный синтез антигенов, аутоиммунная и даже летальная лимфоидная пролиферация, что позволяет предположить, что TACI является ингибиторным рецептором BLyS. С другой стороны, TACI участвует в иммунном ответе Т-независимого клеточного антигена (TI). BCMA выполняет функцию поддержания выживаемости плазмобластов и способствует презентации антигена зрелыми В-клетками. Поскольку рецептор TACI имеет высокую аффинность как к BLyS, так и к APRIL, то слитый белок TACI-Fc является предпочтительным по сравнению с двумя другими слитыми белками, и, он предпочтителен в качестве структуры лекарственного средства.

[0006] TACI был впервые открыт учеными von Bulow и Bram в Детской исследовательской больнице Св. Джуда, хорошо известном американском академическом учреждении, но более поздние исследования показали, что природная последовательность внеклеточной области TACI имеет проблему подвергаться деградации и не подходит для производства лекарственных средств. С тех пор несколько компаний усовершенствовали исходную молекулу TACI, в том числе известные американские биотехнологические компании Genentech, Amgen и ZymoGenetics. В настоящее время слитый белок TACI, атацицепт, разработанный ZymoGenetics и Merck Serono в Швейцарии, прошел клинические испытания при SLE, ревматоидном артрите, лимфоме и других заболеваниях. Результаты клинического исследования фазы III (NCT00624338) эффективности и безопасности атацицепта для профилактики SLE со средней и тяжелой степенью активности показало, что по сравнению с группой плацебо отсутствовала достоверная разница между дозой 75 мг атацицепта и группой плацебо (58% и 60%; OR 0,89 (0,48, 1,67), p=0,724); однако доза атацицепта 150 мг показала эффективность (43% и 60%; OR 0,49 (0,26, 0,92), p=0,027). Однако смерть двух субъектов в результате пневмонии и легочного кровотечения указала в данном случае на наличие проблем с безопасностью. Судя по клиническим результатам, низкая доза атацицепта не имела эффективности, в то время как высокая доза атацицепта приводила к серьезным проблемам с безопасностью.

[0007] На международном уровне разработка лекарственных средств для лечения SLE протекает негладко. До 9 марта 2011 г. разработанный GSK Blys-специфический ингибитор белимумаб стал первым новым лекарственным средством, одобренным FDA для лечения системной красной волчанки за более чем 50 лет, открыв новую главу в клиническом лечении SLE. Данное лекарственное средство в настоящее время является единственным антителом к Blys, мировые продажи которого составили 473 млн. фунтов в 2018 г. Состав белимумаба для подкожных инъекций по схеме в дозе 200 мг один раз в неделю был одобрен FDA для применения у взрослых пациентов с положительной реакцией на активные аутоантитела при системной красной волчанке (SLE), получающих стандартное лечение. Клинические испытания показали, что белимумаб может значительно снизить показатель активности системной красной волчанки за 52 недели и уменьшить рецидивы заболевания у пациентов с SLE. Результаты показали, что доля пациентов, достигших ремиссии благодаря лечению белимумабом, постепенно увеличивалась во времени, и частота полных ремиссий на 10-м году составила 65,2% (n=126). У пациентов с исходной дозой преднизона выше 7,5 мг/сутки, 32,6% (14/43) из них снизили дозу до ≤7,5 мг/сутки к 10 году; и у пациентов с исходной дозой преднизона ≤7,5 мг/сутки 9,5% (9/95) из них увеличили дозу выше 7,5 мг/сутки к 10 году.

[0008] В CN101323643B и члене ее патентного семейства US8193316B2 показаны выявленные причины деградации природной последовательности TACI, и описано конструирование оптимизированного слитого белка TACI-Fc методами генной инженерии (полное содержание CN101323643B и US8193316B2 включено здесь посредством ссылки), и, в частности, описан слитый белок, состоящий из усеченного TACI и Fc-области иммуноглобулина. Результаты испытаний показывают, что оптимизированный слитый белок TACI-Fc имеет лучшую биологическую активность в подавлении аутоиммунных заболеваний и имеет потенциальные перспективы в лечении аутоиммунных заболеваний, таких как SLE, ревматоидный артрит, оптический нейромиелит (NMO), заболевания спектра оптиконейромиелита (NMOSD) и т.д. Кроме того, в CN102085368B раскрывается применение оптимизированного слитого белка TACI-Fc в производстве лекарственного средства для лечения системной красной волчанки (полное содержание CN102085368B включено здесь посредством ссылки), и доказано, что он имеет хорошую переносимость и безопасность по данным предшествующих экспериментов на животных.

[0009] Современные варианты лечения системной красной волчанки очень ограничены, и существует потребность в разработке нового лечения с лучшим терапевтическим эффектом и без серьезного риска в отношении безопасности. Настоящее изобретение направлено на эту потребность.

Сущность изобретения

[0010] Настоящее изобретение относится к слитому белку, состоящему из усеченного TACI и оптимизированного Fc-фрагмента иммуноглобулина посредством оптимизации последовательности со снижением ADCC и CDC эффектов, который обладает высокой биологической активностью и безопасностью, для лечения заболеваний аутоиммунной системы человека. Слитый белок ингибирует две биологически активные молекулы BLyS и APRIL, блокируя пролиферацию В-лимфоцитов и созревание Т-лимфоцитов, достигая тем самым цели лечения аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка и ревматоидный артрит. Слитый белок содержит аминокислоты 13-118 внеклеточного домена TACI и Fc-фрагмента иммуноглобулина человека. Аминокислоты 13-118 внеклеточного домена TACI представлены аминокислотами 1-106 в SEQ ID NO: 1, или имеют 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более высокую гомологию с аминокислотами 1-106 в SEQ ID NO: 1. Fc-фрагмент человеческого иммуноглобулина представлен аминокислотами 107-333 в SEQ ID NO: 1, или имеет 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более высокую гомологию с аминокислотами 107-333 в SEQ ID NO: 1.

[0011] В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность слитого белка TACI-Fc показана в SEQ ID NO: 1. Белок состоит из аминокислот 13-118 внеклеточного домена TACI и оптимизированного Fc-фрагмента посредством оптимизации со снижением ADCC и CDC эффектов.

[0012] В некоторых вариантах осуществления изобретения пациенты, подлежащие лечению, страдают системной красной волчанкой со средней или тяжелой степенью активности.

[0013] В слитом белке TACI-Fc, показанном в SEQ ID NO: 1, для предотвращения эффектов антителозависимой клеточно-опосредованной токсичности (ADCC) за счет мембраносвязанного BLyS или лиганда А, индуцирующего пролиферацию (APRIL), последовательность Fc-фрагмента, полученного из IgG1, оптимизирована. Аминокислоты 120-123 в CH2 домене Fc-фрагмента мутированы с заменой лейцина (L)-лейцина (L)-глицина (G)-глицина (G) на аланин (A)-глутаминовую кислоту (E)-глицин (G)-аланин (A) со снижением аффинности к Fcy-рецептору. Кроме того, аминокислоты 216-217 в CH2 домене Fc-фрагмента также мутированы с заменой аланина (A)-пролина (P) на серин (S)-серин (S) со снижением связывания или фиксации комплемента, тем самым уменьшая эффект комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC).

[0014] Последовательность SEQ ID NO: 1 является следующей:

001 SRVDQEERFP QGLWTGVAMR SCPEEQYWDP LLGTCMSCKT ICNHQSQRTC

051 AAFCRSLSCR KEQGKFYDHL LRDCISCASI CGQHPKQCAY FCENKLRSPV

101 NLPPELDKTH TCPPCPAPEA EGAPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV

151 DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLHQDWL

201 NGKEYKCKVS NKALPSSIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS

251 LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK

301 SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK

[0015] В жидких препаратах два мономера слитого белка TACI-Fc могут образовывать двухцепочечную структуру за счет образования межцепочечных дисульфидных связей в шарнирной области Fc.

[0016] Слитый белок TACI-Fc по настоящему изобретению можно приготовить с фармацевтически приемлемым носителем в виде лекарственного средства для лечения системной красной волчанки (СКВ) обычными методами, используемыми в данной области.

[0017] Лекарственное средство по настоящему изобретению можно получить в виде различных клинически приемлемых лекарственных форм, включая, не ограничиваясь этим, лиофилизированные препараты или жидкие препараты, которые вводят способами, включающими подкожную инъекцию, внутрибрюшинную инъекцию, внутримышечную инъекцию или внутривенную инъекцию, и предпочтительно подкожную инъекцию.

[0018] В одном аспекте препарат слитого белка TACI-Fc по настоящему изобретению предпочтительно вводят подкожной инъекцией в дозе, выше или равной 60 мг на введение, или 70 мг на введение, или 80 мг на введение. Более предпочтительно доза составляет примерно 50-240 мг на введение, 60-240 мг на введение, 70-240 мг на введение или 80-240 мг на введение, и более предпочтительно 50 мг, 55 мг, 60 мг, 65 мг, 70 мг, 75 мг, 80 мг, 85 мг, 90 мг, 95 мг, 100 мг, 105 мг, 110 мг, 115 мг, 120 мг, 125 мг, 130 мг, 135 мг, 140 мг, 145 мг, 150 мг, 155 мг, 160 мг, 165 мг, 170 мг, 175 мг, 180 мг, 190 мг, 195 мг, 200 мг, 205 мг, 210 мг, 215 мг, 220 мг, 225 мг, 230 мг, 235 мг или 240 мг на введение.

[0019] В некоторых вариантах осуществления слитый белок TACI-Fc по настоящему изобретению вводят пациенту один раз каждые 6-10 суток или 11-14 суток.

[0020] В некоторых вариантах осуществления слитый белок TACI-Fc по настоящему изобретению вводят пациенту один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели или один раз в четыре недели.

[0021] В рамках настоящего изобретения, термин «терапевтически эффективное количество» или «эффективное количество» относится к дозе, достаточной для проявления положительного лечебного эффекта для пациента, которому проводят введение. Фактическое вводимое количество, а также уровень дозы и продолжительность введения будут зависеть от состояния пациента, которого лечат, и тяжести заболевания. Назначение лечения (например, решение о дозировке и т. д.) в конечном итоге определяется терапевтами и врачами других специальностей, обычно с учетом заболевания, подлежащего лечению, индивидуального состояния пациента, места доставки, способа введения и других факторов, известных врачу.

[0022] В некоторых вариантах осуществления слитый белок TACI-Fc по настоящему изобретению вводят пациенту в течение последовательных 12 недель, 24 недель, 36 недель, 48 недель, 60 недель, 72 недель.

[0023] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный слитый белок TACI-Fc по настоящему изобретению имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1.

[0024] В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность рекомбинантного слитого белка TACI-Fc по настоящему изобретению кодирует аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1.

[0025] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к вектору, способному экспрессировать вышеуказанный слитый белок.

[0026] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей вышеуказанный рекомбинантный слитый белок TACI-Fc и фармацевтически приемлемый носитель.

[0027] В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию/слитый белок по настоящему изобретению можно использовать для лечения аутоиммунных заболеваний, включая, не ограничиваясь этим, системную красную волчанку (SLE), ревматоидный артрит (RA), оптический нейромиелит (NMO) и заболевания спектра оптиконейромиелита (NMOSD).

[0028] В некоторых вариантах осуществления системная красная волчанка, при лечении фармацевтической композицией/слитым белком по настоящему изобретению, представляет собой системную красную волчанку с легкой или средней степенью активности или системную красную волчанку со средней или тяжелой степенью активности.

[0029] Дальнейшая структурная оптимизация слитого белка TACI-Fc, описанного в US8193316B2, позволяет получить слитый белок TACI-Fc с существенно повышенной безопасностью, который можно вводить пациенту в более высоких дозах без серьезных рисков в отношении безопасности, которые могут представлять собой угрозу для жизни пациентов. В крупномасштабных клинических испытаниях авторы изобретения обнаружили, что по сравнению с атацицептом, слитый белок TACI-Fc по настоящему изобретению, при введении в эффективной дозе, может минимизировать цитотоксичность слитого белка, снижает побочные реакции, вызываемые у пациентов во время лечения и не имеет серьезных рисков в отношении безопасности, и неожиданно восстанавливает способность к зачатию и вынашиванию плода у некоторых пациентов в результате лечения пациентов с системной красной волчанкой, достигая неожиданных технических эффектов.

[0030] Краткое описание фигур

[0031] На фиг. 1: наложение кривой ADCC эффекта (соотношение эффектор-мишень (E:T) = 10:1) слитого белка TACI-Fc (SEQ ID NO:1) (зеленая, сплошная)/ритуксимаб (красная, полая).

[0032] На фиг. 2: наложение кривой ADCC эффекта (соотношение эффектор-мишень (E:T) = 20:1) слитого белка TACI-Fc (SEQ ID NO:1) (зеленая, сплошная)/ритуксимаб (красная, полая).

Подробное описание изобретения

Пример 1: сравнительный анализ ADCC эффекта слитого белка TACI-Fc (SEQ ID NO:1)

[0033] 1.1 Экспериментальные материалы

Таблица 1 Материалы Производитель Номер партии Среда RPMI 1640 Gibco A10491 Ритуксимаб Roche 10001031283948 96-луночный планшет Costar 3599 Клетки PBMC Hemacare PB009C-1 Набор для определения активности LDH Roche 1164793001 FBS Excellbio FND500 Triton X-100 Solarbio T8200

[0034] 1.2 Принцип эксперимента

[0035] Клетки Raji экспрессируют APRIL на поверхности, и TACI является корецептором APRIL и BLyS. Следовательно, APRIL на поверхности клеток Raji может связываться с TACI-концом слитого белка TACI-Fc (SEQ ID NO: 1). Если Fc-конец слитого белка TACI-Fc (SEQ ID NO: 1) имеет сайт связывания γ-рецептора кристаллизуемого фрагмента (Fcγ-рецептор, FcyR), то он может связываться с FcyR эффекторной клетки и запускать ADCC эффект. Ритуксимаб использовали в качестве положительного контроля в тесте, поскольку ритуксимаб представляет собой моноклональное антитело к кластеру дифференцировки 20 (CD20), способное индуцировать ADCC эффект. Клетки Raji экспрессируют CD20 на поверхности, и, следовательно, ритуксимаб может связываться с CD20 на поверхности клеток Raji, вызывая ADCC эффекты. Результаты экспериментов показаны на фиг. 1 и 2: контрольный ритуксимаб индуцирует ADCC эффект, и степень ингибирования зависит от концентрации. По сравнению с контролем, слитый белок TACI-Fc не индуцирует ADCC эффекта в каждой тестированной концентрации.

[0036] Пример 2: сравнительный анализ CDC эффекта слитого белка TACI-Fc

[0037] 2.1 Экспериментальные материалы

Таблица 2 Материалы Производитель Номер партии Среда RPMI 1640 Gibco A10491 Ритуксимаб Roche 10001031283948 Комплемент сыворотки человека Donor Набор для люминесцентного анализа жизнеспособности клеток Cell titer-glo Promega G7572 Прозрачный 96-луночный планшет с белым дном Costar 3610

[0038] 2.2 Принцип эксперимента

[0039] APRIL на поверхности клеток Raji может связываться с TACI-концом слитого белка TACI-Fc (SEQ ID NO: 1). Если Fc-конец слитого белка TACI-Fc (SEQ ID NO: 1) имеет сайт связывания комплемента, то он может запускать CDC эффект. Ритуксимаб использовали в качестве положительного контроля в тесте, поскольку ритуксимаб может индуцировать CDC эффект. Клетки Raji экспрессируют CD20 на поверхности, и, следовательно, ритуксимаб может связываться с CD20 на поверхности клеток Raji с запуском CDC эффектов. Моноклональные антитела, которые не связываются с клетками Raji, использовали в качестве отрицательного контроля.

[0040] 2.3 Методика эксперимента

[0041] После доведения титра клеток Raji до 10000 клеток/лунку, клетки вносили в 96-луночный планшет и инкубировали в CO₂-инкубаторе в течение 20 мин. Затем добавляли серийные разведения образцов с различными градиентами концентрации, и затем клетки инкубировали в CO₂-инкубаторе в течение 20 мин. Затем добавляли 10% комплемент нормальной человеческой сыворотки и затем клетки инкубировали в CO₂-инкубаторе с в течение 2 ч. Через 10 мин развития окраски с использованием метода АТФ использовали микропланшетный ридер для считывания результатов. После вычитания контрольного значения сыворотки GraphPad Prism 7.00 использовали для построения 4-PL кривой с концентрацией (нг/мл) lg на оси абсцисс и степенью ингибирования (%) на оси ординат. Результаты экспериментов являются следующими:

[0042]

Таблица 3
Результаты оценки CDC эффекта Конечная концентрация (нг/мл) Степень ингибирования % Ритуксимаб Слитый белок TACI-Fc (SEQ ID NO: 1) Отрицательный контроль 30000 38,17 4,88 5,60 3000 24,65 2,01 9,63 300 11,85 9,12 -0,14 30 4,83 1,85 -0,76 3 -0,68 2,27 -0,66

[0043] Результаты эксперимента:

[0044] 1. По сравнению с контрольной группой клеток, каждая группа сывороточного комплемента и контрольная группа лекарственного средства не имеет очевидного эффекта киллинга.

[0045] 2. Группа положительного контроля (10% сывороточный комплемент-ритуксимаб) имеет наиболее высокий уровень ингибирования 40% и обладает значительным зависимым от концентрации эффектом.

[0046] 3. Группа тестирования испытуемого вещества (10% сывороточный комплемент-слитый белок TACI-Fc (SEQ ID NO: 1)) имеет наиболее высокую степень ингибирования на уровне ниже 10% и не имеет эффекта, зависимого от концентрации.

[0047] 4. Группа отрицательного контроля (10% сывороточный комплемент-RC48) имеет наиболее высокую степень ингибирования на уровне ниже 10% и не имеет эффекта, зависимого от концентрации.

[0048] Полученные данные свидетельствуют о том, что ритуксимаб может индуцировать CDC эффект, и степень ингибирования объективно зависит от концентрации, в то время как слитый белок TACI-Fc (SEQ ID NO: 1) по существу не вызывает CDC эффекта.

[0049] Пример 3: клинические испытания эффекта лечения пациентов с системной красной волчанкой

[0050] 1. Целью эксперимента является предварительная оценка безопасности и эффективности слитого белка TACI-Fc (с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1) в стандартной комбинированной терапии по сравнению с плацебо в стандартной комбинированной терапии в лечении пациентов с SLE со средней или тяжелой степенью активности и анализ зависимости доза-эффект для определения базовой дозы для последующих клинических испытаний. Фактическое число субъектов в данном эксперименте составляет 249, и введения у тех, у кого не обнаружено эффекта, прекращают в соответствии со схемой дозирования.

[0051] 2. Критерии включения

[0052] 1. Пациенты с диагнозом активной SLE, которые соответствуют, по меньшей мере, 4 из 11 стандартов SLE, пересмотренных Американским колледжем ревматологии в 1997 году.

[0053] 2. Субъект в возрасте от 18 до 65 лет, мужчина и женщина, без ограничения соотношения полов.

[0054] 3. Стационарные или амбулаторные пациенты с хорошим соблюдением режима лечения и предоставившие форму информированного согласия перед исследованием.

[0055] 4. Субъект с оценкой активности заболевания по шкале SELENA-SLEDAI ≥ 8 баллов во время скринингового периода. Для пациентов с низким уровнем комплемента и/или антител к ds-DNA, оценка клинических симптомов по шкале SELENA-SLEDAI (за исключением низкого уровня комплемента и/или антител к ds-DNA) должна составлять ≥6 баллов.

[0056] 5. Субъекты с положительным серологическим тестом на аутоантитела. Положительный определяется как положительный результат на ANA и/или положительный результат на антитела к двухцепочечной ДНК, определенный четким диапазоном референсных значений в лаборатории исследовательского центра, и критические значения не принимаются.

[0057] 6. Субъекты со стабильной стандартной схемой лечения в течение, по меньшей мере, 30 суток до первого дня (т.е. дня, когда испытуемое лекарственное средство вводят первый раз). Стандартный режим лечения относится к стабильному применению любого из следующих препаратов (по отдельности или в комбинации): кортикостероидов, противомалярийных средств, нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП), других иммунодепрессантов или иммуномодуляторов, включая азатиоприн, микофенолат (включая микофенолата мофетил, микофенолат натрия), циклофосфамид, метотрексат, лефлуномид, такролимус, циклоспорин.

[0058] 3. Критерии исключения

[0059] 1. Субъекты с тяжелым волчаночным нефритом (определяемым по белку в моче > 6 г/24 ч или креатинину в сыворотке > 2,5 мг/дл или 221 мкмоль/л), или которые нуждались в гемодиализе или получали кортикостероиды в высоких дозах (преднизон > 100 мг/сутки или эквивалентно) ≥14 суток в последние 2 месяца.

[0060] 2. Субъекты с заболеванием центральной нервной системы, вызванным SLE или не вызванным SLE (включая эпилепсию, психоз, психоорганический синдром, инсульт, энцефалит, васкулит центральной нервной системы) в последние 2 месяца.

[0061] 3. Субъекты с тяжелыми заболеваниями и болезнями сердца, печени, почек и других важных органов, крови, эндокринной системы в анамнезе; критерии оценки тяжести включают: a. АЛТ или АСТ ≥ 2 раза выше верхней границы нормального диапазона; b. клиренс эндогенного креатинина < 30 мл/мин; c. количество лейкоцитов <2,5×10⁹/л; d. гемоглобин <85 г/л; е. количество тромбоцитов <50×10⁹/л.

[0062] 4. Субъекты, в настоящее время страдающие активным гепатитом или имеющие тяжелое заболевание печени или заболевание в анамнезе. Гепатит B: пациенты с положительным результатом на HBsAg должны быть исключены. Субъекты с отрицательным результатом на HBsAg и положительным результатом на анти-HBc антитела классифицируются в соответствии с тестом на HBV-ДНК, где пациенты с положительным результатом на HBV-ДНК должны быть исключены и не должны быть допущены к участию в исследовании, и пациенты с отрицательным результатом на HBV-ДНК могут быть допущены к участию в исследовании. Гепатит C: пациенты с положительным результатом на антитела к вирусу гепатита C должны быть исключены.

[0063] 5. Пациенты с иммунодефицитом, неконтролируемой тяжелой инфекцией и активной или рецидивирующей язвенной болезнью.

[0064] 6. Беременные женщины, кормящие женщины и мужчины или женщины, у которых запланировано зачатие и беременность в течение последующих 12 месяцев.

[0065] 7. Аллергические реакции: субъект с аллергией на биологические продукты человеческого происхождения в анамнезе.

[0066] 8. Субъекты, которые получали живые вакцины в последний месяц.

[0067] 9. Субъекты, которые участвовали в любом клиническом испытании за 28 суток до первоначального скрининга и/или в пределах 5-кратного периода полувыведения исследуемого соединения (в зависимости от того, что длительнее).

[0068] 10. Субъекты, которые получали препараты, нацеленные на В-клетки, такие как ритуксан или эпализумаб, в течение одного года.

[0069] 11. Субъекты, которые получали ингибиторы фактора некроза опухоли и блокаторы рецепторов интерлейкина в течение одного года.

[0070] 12. Субъекты, которые получали внутривенно гамма-глобулин (IVIG), преднизон ≥ 100 мг/сутки в течение более 14 суток или подвергались плазмообмену в течение одного месяца.

[0071] 13. Субъекты с активными инфекциями (такими как опоясывающий лишай, ВИЧ-инфекция, активный туберкулез и т. д.) в период скрининга.

[0072] 14. Пациенты с психическими заболеваниями с депрессией или суицидальными намерениями.

[0073] 15. Субъекты, которых исследователь считает непригодными для участия в этом испытании.

[0074] IV. Распределение на группы

[0075] Группа лечения испытуемым веществом: рекомбинантный слитый белок TACI-Fc (с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 1) в виде лиофилизированного порошкового препарата; содержание активного вещества: 80 мг на инъекцию; подкожная инъекция, дозировка: 80 мг, 160 мг или 240 мг на введение (указание 80 мг, 160 мг или 240 мг относится к массе слитого белка активного ингредиента TACI-Fc в лиофилизированном порошковом препарате), вводят раз в неделю в течение 48 недель подряд.

[0076] Контрольная группа: миметик рекомбинантного слитого белка TACI-Fc в виде лиофилизированного порошкового препарата, который вводят подкожно один раз в неделю в течение последовательных 48 недель.

[0077] Конкретное распределение на группы является следующим:

[0078]

Таблица 4
Распределение пациентов в каждом центре (рандомизированные пациенты) RC18 240 мг
(N=62) RC18 160 мг
(N=63) RC18 80 мг
(N=62) Плацебо
(N=62) В целом (N=249) Обобщенные данные Скринированный пациент 356 Включенный в исследование пациент 62 63 62 62 249 Пациент с завершением исследования 46 44 45 36 171 FAS 62 63 62 62 249 PPS 48 46 48 50 192 SS 62 63 62 62 249

[0079] FAS: полный набор анализов, относится к ряду допущенных к участию пациентов и потерянных пациентов, но не включает исключенных пациентов.

[0080] PPS: пациенты, которые соответствуют протоколу испытания, имеют хорошее соблюдение режима лечения и завершают исследование в соответствии с требованиями CRF.

[0081] SS: пациенты, которые получают, по меньшей мере, одно лечение и имеют фактические данные, зарегистрированные по показателям безопасности.

[0082] V. Показатели конечной точки

[0083] Методы оценки клинического эффекта испытания являются следующими:

Таблица 5 Показатели первичной конечной точки и время оценки Номер Показатель Время оценки Выбор показателя конечной точки 1 Показатель ответа SLE через 12 месяцев после введения препарата.
Ответ SLE определяется следующим образом:
а. снижение оценки активности заболевания по шкале SELENA-SLEDAI на ≥ 4 балла;
b. отсутствует новое повреждение органа, соответствующее классу А по BILAG, или новое повреждение органа, соответствующее классу В по BILAG, не превышает один; c. Общая оценка врача (PGA) не увеличивается более чем на 0,3 балла от исходного уровня. В общей оценке врача используется 100-мм визуально-аналоговая шкала (VAS) для полной оценки статуса заболевания до и после лечения неделя 48 Показатель эффективности Показатели вторичной конечной точки и время оценки Номер Показатель Время оценки Выбор показателя конечной точки 1 (1) Доля субъектов с оценкой активности заболевания по шкале SELENA-SLEDAI уменьшилась на ≥4 балла после введения препарата. (2) Изменение общей оценки врача по сравнению с исходным уровнем после введения препарата. (3) Доля субъектов с дозой преднизона ≤7,5 мг/сут или снижение дозы на ≥25% от исходного уровня на неделе 44-48 после введения препарата. (4) Изменение показателя серологического теста (IgG, IgA, IgM, общее количество B-клеток (CD19+), анти-dsDNA антитела, комплемент (C3, C4) от исходного уровня неделя 48 Показатель эффективности

[0084] VI. Результаты клинических испытаний

[0085] Данные клинических испытаний, анализированные с помощью FAS (полный набор анализов), показывают, что группа лечения (слитый белок TACI-Fc: SEQ ID NO: 1) имеет значительно более высокий ответ. Конкретные данные являются следующими:

Таблица 6 Терапевтические дозы Эффективность на неделе 48 (SRI4) Группа с дозой 240 мг 75,8%, p <0,0001 Группа с дозой 160 мг 68,3%, p=0,0001 Группа с дозой 80 мг 71,0%, p <0,0001 Контрольная группа 33,9%, p <0,0001

[0086] Оценка по шкале SELENA-SLEDAI на неделе 48 показывает, что у большего числа пациентов в группе лечения (слитый белок TACI-Fc: SEQ ID NO: 1) наблюдается снижение на 4 или более балла (оценка по шкале SELENA-SLEDAI). Детально данные являются следующими: группа с дозой 80 мг (75,8%, p=0,003), группа с дозой 160 мг (77,8%, p=0,001), группа с дозой 240 мг (79,0%, p <0,001) и группа плацебо (50,0%).

[0087] Отсутствовали пациенты с ухудшением показателей PGA, а именно: группа с дозой 80 мг (96,8%, p <0,001), группа с дозой 160 мг (92,1%, p=0,013), группа с дозой 240 мг (96,8%), p <0,001)) и группа плацебо (75,8%).

[0088] Результаты анализа PPS (набор протоколов испытания) и FAS (полный набор анализов) согласуются.

[0089] Данные о клинических нежелательных явлениях (НЯ) и серьезных нежелательных явлениях (СНЯ) являются следующими:

[0090]

Таблица 7
Случаи НЯ и СНЯ Группа Частота случаев НЯ Частота случаев СНЯ Группа с дозой 240 мг 93,5% 12,9% Группа с дозой 160 мг 92,1% 15,9% Группа с дозой 80 мг 90,3% 12,9% Группа с плацебо 82,3% 16,1%

[0091] В группе с дозой 240 мг был один летальный случай, не связанный с исследуемым лекарственным средством. Наиболее частыми побочными эффектами были инфекции верхних дыхательных путей и реакции в месте инъекции.

[0092] Кроме того, во время клинических испытаний было выявлено 11 непредвиденных беременностей в группе лечения TACI-Fc (SEQ ID NO: 1) (4 случая в группе с дозой 240 мг, 3 случая в группе с дозой 160 мг и 4 случая в группе, получавшей дозу 80 мг), в то время как в группе плацебо не было случаев беременности. Из 11 беременностей в 10 случаях было выбрано избирательное прерывание, и в 1 случае - беременность и рождение живого ребенка.

[0093] Следовательно, в группах с тремя дозами рекомбинантного слитого белка TACI-Fc (SEQ ID NO.1) достигаются очень значительные терапевтические эффекты, и испытуемый препарат является безопасным и эффективным, что доказано клиническими данными. Введение пациентам в группе лечения хорошо переносится, и неожиданно может быть восстановлена способность некоторых пациентов к зачатию при лечении пациентов с системной красной волчанкой.

--->

Список последовательностей

<110> REMEGEN CO., LTD.

<120> Слитый белок TACI-FC и его применение

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 333

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<400> 1

Ser Arg Val Asp Gln Glu Glu Arg Phe Pro Gln Gly Leu Trp Thr Gly

1 5 10 15

Val Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro Leu Leu

20 25 30

Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser Gln Arg

35 40 45

Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly

50 55 60

Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile

65 70 75 80

Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu

85 90 95

Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Asp Lys Thr His Thr Cys

100 105 110

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu

115 120 125

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

130 135 140

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

145 150 155 160

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

165 170 175

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

180 185 190

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

195 200 205

Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

210 215 220

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

225 230 235 240

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

245 250 255

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

260 265 270

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

275 280 285

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

290 295 300

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

305 310 315 320

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<---

Группа изобретений относится к применению оптимизированного слитого белка TACI-Fc в способе лечения системной красной волчанки (SLE) и в производстве лекарственного средства для лечения SLE. Лечение SLE предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтического препарата рекомбинантного слитого белка TACI-Fc в дозе 80-240 мг на введение. Рекомбинантный слитый белок TACI-Fc содержит аминокислоты 13-118 внеклеточного домена TACI, которые имеют последовательность, представленную аминокислотами 1-106 в SEQ ID NO: 1, и Fc-фрагмент, имеющий последовательность, представленную аминокислотами 107-333 в SEQ ID NO: 1. Два рекомбинантных слитых белка TACI-Fc образуют двухцепочечную структуру через межцепочечную дисульфидную связь, образованную в шарнирной области Fc. Изобретение снижает побочные реакции, вызываемые у пациентов во время лечения SLE, не имеет серьезных рисков в отношении безопасности и восстанавливает способность к зачатию и вынашиванию плода у некоторых пациентов в результате лечения. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 2 ил., 7 табл., 3 пр.

1. Способ лечения системной красной волчанки (SLE), включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества фармацевтического препарата рекомбинантного слитого белка TACI-Fc в дозе 80-240 мг на введение, где рекомбинантный слитый белок TACI-Fc содержит аминокислоты 13-118 внеклеточного домена TACI и Fc-фрагмент иммуноглобулина человека, где два рекомбинантных слитых белка TACI-Fc образуют двухцепочечную структуру через межцепочечную дисульфидную связь, образованную в шарнирной области Fc в жидком фармацевтическом препарате,

аминокислоты 13-118 внеклеточного домена TACI имеют последовательность, представленную аминокислотами 1-106 в SEQ ID NO: 1,

и где Fc-фрагмент иммуноглобулина человека имеет последовательность, представленную аминокислотами 107-333 в SEQ ID NO: 1.

2. Способ по п.1, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, один раз в неделю, один раз в две недели, один раз в три недели или один раз в четыре недели.

3. Способ по п.2, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, один раз в неделю.

4. Способ по п.1 или 3, где фармацевтический препарат представляет собой лиофилизированный препарат или жидкий препарат.

5. Способ по п.4, где фармацевтический препарат представляет собой лиофилизированный препарат.

6. Способ по п.4, где фармацевтический препарат вводят подкожной инъекцией, внутрибрюшинной инъекцией, внутримышечной инъекцией или внутривенной инъекцией, и предпочтительно подкожной инъекцией.

7. Способ по п.6, где фармацевтический препарат вводят подкожной инъекцией.

8. Способ по любому из пп.1, 3, 5 или 7, где фармацевтический препарат вводят субъекту, нуждающемуся в этом, в течение последовательных 12 недель, 24 недель, 36 недель, 48 недель, 60 недель, 72 недель или более.

9. Способ по п.8, где фармацевтический препарат вводят субъекту, нуждающемуся в этом, в течение последовательных 48 недель или дольше.

10. Способ по п.1, где рекомбинантный слитый белок TACI-Fc имеет последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1.

11. Способ по любому из пп.1-10, где системная красная волчанка представляет собой системную красную волчанку с легкой или средней степенью активности или системную красную волчанку со средней или тяжелой степенью активности.

12. Применение рекомбинантного слитого белка TACI-Fc в производстве лекарственного средства для лечения системной красной волчанки (SLE), где указанный рекомбинантный слитый белок TACI-Fc содержит аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1.