ТРИАМТЕРЕН ИЛИ НОЛАТРЕКСЕД ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЛЕЧЕНИИ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ Российский патент 2024 года по МПК A61K31/517 A61K31/519 A61P3/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к соединениям для применения в лечении и/или профилактики фенилкетонурии.

Уровень техники

Фенилкетонурия (ФКУ), также известная как дефицит фенилаланингидроксилазы, представляет собой редко встречающееся нарушение обмена веществ, характеризующееся нарушением превращения фенилаланина (Phe) в тирозин (Tyr), вследствие чего повышается уровень фенилаланина в крови. Фенилаланин представляет собой аминокислоту, получаемую с пищей, например, в составе белков и некоторых искусственных подсластителей. При отсутствии лечения ФКУ происходящее вследствие этого накопление излишков фенилаланина в крови может вызвать физиологические, неврологические и умственные нарушения.

Признаки и симптомы ФКУ варьируют от легких до тяжелых. Наиболее тяжелая форма данного расстройства известна как классическая ФКУ. Младенцы с классической ФКУ выглядят нормально до тех пор, пока им не исполнится несколько месяцев. При отсутствии лечения у этих детей развивается стойкая умственная отсталость. Также часто имеют место судороги, задержка развития, поведенческие нарушения и психические расстройства. Менее тяжелые формы данного заболевания, иногда называемые вариантной ФКУ и не связанной с ФКУ гиперфенилаланинемией, представляют меньший риск повреждения головного мозга. Людям с очень легкими формами заболевания может не потребоваться лечение диетой с низким содержанием фенилаланина.

Младенцы, рожденные от матерей с ФКУ и неконтролируемым уровнем фенилаланина, имеют значительный риск умственной отсталости, поскольку они подвергаются воздействию очень высоких уровней фенилаланина до рождения. Такие младенцы также могут иметь недостаток веса при рождении и расти медленнее, чем другие дети. Другие характерные проблемы со здоровьем включают пороки сердца или иные проблемы с сердцем, микроцефалию и поведенческие нарушения. Женщины с фенилкетонурией и неконтролируемым уровнем фенилаланина также имеют повышенный риск потери беременности.

Мутации в гене PAH вызывают фенилкетонурию, поскольку этот ген отвечает за выработку фенилаланингидроксилазы, которая катализирует пара-гидроксилирование фенилаланина до превращения его в тирозин. В случае если генные мутации снижают активность фенилаланингидроксилазы, получаемый из пищи фенилаланин не перерабатывается эффективно. В результате данная аминокислота может накапливаться до токсичных уровней в крови и других тканях. Поскольку нервные клетки мозга особенно чувствительны к уровню фенилаланина, чрезмерное количество этого вещества может вызвать повреждение мозга.

ФКУ может быть подразделена на классическую ФКУ (примерно 48% случаев), вариантную (или легкую) ФКУ (примерно 24% случаев) и ГФА (гиперфенилаланинемию), не связанную с ФКУ (или легкую ГФА), соответствующую примерно 16% случаев.

Классическая ФКУ - наиболее тяжелая форма заболевания развивается, когда активность фенилаланингидроксилазы сильно снижена или отсутствует. Мутации в гене PAH, позволяющие ферменту сохранять некоторую активность, приводят к развитию более легких форм данного заболевания, таких как вариантная ФКУ или не связанная с ФКУ гиперфенилаланинемия.

Фенилкетонурия считается классической ФКУ, если уровень фенилаланина в крови у субъектов, не получавших лечение, превышает 1200 мкмоль/л, вариантной ФКУ - если уровень фенилаланина в крови у не получавших лечение субъектов составляет от 600 до 1200 мкмоль/л, и не связанной с ФКУ гиперфенилаланинемией (или легкой гиперфенилаланинемией) - если уровень фенилаланина в крови у не получавших лечение субъектов составляет от 120 до 600 мкмоль/л.

На некоторых пациентов с ФКУ положительный эффект оказывает введение BH4, (также известного как (6R)-L-эритро-5,6,7,8-тетрагидробиоптерин или тетрагидробиоптерин, который является важным кофактором при гидроксилировании фенилаланина, катализируемого фенилаланингидроксилазой) в плане того, что уровень фенилаланина в их крови снижается или даже нормализуется при медикаментозном лечении соединением BH4. Процент отзывчивости на лечение соединением BH4 наиболее высок у пациентов с не связанной с ФКУ ГФА или легкой ФКУ, вызванной мутациями PAH, обеспечивающими остаточную активность фермента. Напротив, у пациентов с классической ФКУ процент отзывчивости на лечение ниже.

Поскольку фармакотерапия ФКУ все еще находится на начальном этапе развития, лечение ФКУ сводилось главным образом к регулированию рациона, а именно к ограничению потребления фенилаланина путем сокращения потребления белка естественного происхождения и замене его источником белка, лишенным фенилаланина, или модифицированной низкобелковой пищей. Такого лечения трудно придерживаться на протяжении всей жизни, и несоблюдение диеты является обычным явлением.

Что касается фармакотерапии, то дигидрохлорид сапроптерина, который представляет собой синтетическое соединение дигидрохлоридной соли тетрагидробиоптерина естественного происхождения (BH4), был первым фармакологическим средством для лечения ФКУ и был одобрен FDA (Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов) в 2007 году.

В качестве средства для лечения ФКУ были предложены большие нейтральные аминокислоты (LNAA) по причине их способности блокировать захват фенилаланина из кишечника и через гематоэнцефалический барьер. Однако лечение большими нейтральными аминокислотами в качестве монотерапии беременным женщинам противопоказано, поскольку оно не снижает уровень фенилаланина в крови в достаточной мере до диапазона, безопасного для развития плода.

Кроме того, конъюгированная с полиэтиленгликолем фенилаланинаммиаклиаза (PEG-PAL), по-видимому, является эффективной для снижения уровня фенилаланина в крови, однако сообщалось о некоторых иммунологических реакциях на данное лекарственное средство, и его следует вводить в качестве ежедневной подкожной инъекции. Тем не менее, в 2018 году Palynziq (пегвалиаза-pqpz), состоящий из рекомбинантной фенилаланинаммиаклиазы (rAvPAL), конъюгированной с N-гидроксисукцинимид (NHS)-метоксиполиэтиленгликолем, был одобрен FDA для лечения взрослых, больных ФКУ.

В связи с ограниченным выбором фармакологических средств для лечения ФКУ, а также в связи с побочными эффектами существующих средств, имеется потребность в новых фармакологических средствах, эффективных для лечения ФКУ.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Авторы настоящего изобретения неожиданным образом обнаружили новые фармакологические стратегии лечения фенилкетонурии. Указанные соединения продемонстрировали положительное действие на активность фермента фенилаланингидроксилазы в плане его стабильности и/или активности как у дикого типа, так и у мутантного фермента (Arg261Gln, который является наиболее часто встречающейся мутацией, реагирующей на BH4).

Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к соединению, выбранному из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда и гидрастинина или их фармацевтически приемлемой соли, предпочтительно к триамтерену, нолатрекседу или их фармацевтически приемлемой соли для применения в лечении и/или профилактике фенилкетонурии (ФКУ).

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения, выбранного из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда и гидрастинина или их фармацевтически приемлемой соли, предпочтительно триамтерена, нолатрекседа или их фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики фенилкетонурии (ФКУ).

В еще одном аспекте настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики фенилкетонурии (ФКУ) у субъекта, включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества соединения, выбранного из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда и гидрастинина или их фармацевтически приемлемой соли, предпочтительно триамтерена, нолатрекседа или их фармацевтически приемлемой соли.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к комбинации, содержащей одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда, гидрастинина, буфуралола, валганцикловира, рикобендазола, альбендазола, валацикловира, миноксидила, локсорибина, сапроптерина, сепиаптерина, окситриптана, пириметамина, пегвалиаза, или их фармацевтически приемлемой соли для применения в лечении и/или профилактике фенилкетонурии, где по меньшей мере одно соединение выбрано из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда и гидрастинина или их фармацевтически приемлемой соли, где предпочтительно по меньшей мере одно соединение выбрано из триамтерена и нолатрекседа или их фармацевтически приемлемой соли.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению комбинации, содержащей одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда, гидрастинина, буфуралола, валганцикловира, рикобендазола, альбендазола, валацикловира, миноксидила, локсорибина, сапроптерина, сепиаптерина, окситриптана, пириметамина, пегвалиазы или их фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики фенилкетонурии (ФКУ), где по меньшей мере одно соединение выбрано из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда и гидрастинина или их фармацевтически приемлемой соли, где предпочтительно по меньшей мере одно соединение выбрано из группы, состоящей из триамтерена и нолатрекседа или их фармацевтически приемлемой соли.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения и/или профилактики фенилкетонурии (ФКУ) у субъекта, включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества комбинации, содержащей одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда, гидрастинина, буфуралола, валганцикловира, рикобендазола, альбендазола, валацикловира, миноксидила, локсорибина, сапроптерина, сепиаптерина, окситриптана, пириметамина, пегвалиазы или их фармацевтически приемлемой соли, в которой по меньшей мере одно соединение выбрано из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда и гидрастинина или их фармацевтически приемлемой соли, где предпочтительно по меньшей мере одно соединение выбрано из группы, состоящей из триамтерена и нолатрекседа или их фармацевтически приемлемой соли.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте настоящее изобретение относится к соединению, выбранному из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда и гидрастинина или их фармацевтически приемлемой соли, предпочтительно к триамтерену, нолатрекседу или их фармацевтически приемлемой соли для применения в лечении и/или профилактике фенилкетонурии (ФКУ).

Настоящее изобретение также относится к применению соединения, выбранного из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда и гидрастинина или их фармацевтически приемлемой соли, предпочтительно триамтерена, нолатрекседа или их фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики фенилкетонурии (ФКУ).

Настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики фенилкетонурии (PKU) у субъекта, включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества соединения, выбранного из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда и гидрастинина или их фармацевтически приемлемой соли, предпочтительно триамтерена, нолатрекседа или их фармацевтически приемлемой соли.

В настоящем изобретении также раскрыто соединение, выбранное из группы, состоящей из буфуралола, валганцикловира, рикобендазола, альбендазола, валацикловира, миноксидила и локсорибина или их фармацевтически приемлемой соли для применения в лечении и/или профилактике фенилкетонурии.

В настоящем изобретении также раскрыто применение соединения, выбранного из группы, состоящей из буфуралола, валганцикловира, рикобендазола, альбендазола, валацикловира, миноксидила и локсорибина или их фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики фенилкетонурии (ФКУ).

Настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики фенилкетонурии (ФКУ) у субъекта, включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества соединения, выбранного из группы, состоящей из буфуралола, валганцикловира, рикобендазола, альбендазола, валацикловира, миноксидила и локсорибина или их фармацевтически приемлемой соли.

Термин «лечение» в контексте настоящего описания означает реверсирование, облегчение течения, подавление прогрессирования заболевания или патологического состояния, к которому применяется данный термин, либо одного или более симптомов данного заболевания или патологического состояния, как например снижение уровня фенилаланина в крови по отношению к уровню до начала лечения.

Термины «предотвращение» и «профилактика» в контексте настоящего документа означает предотвращение или подавление появления одного или более симптомов заболевания или патологического состояния, к которому применяется данный термин, например, подавление повышения уровня фенилаланина в крови выше 120 мкмоль/л.

В предпочтительном варианте реализации соединения, раскрытые в настоящем документе, применяют для лечения ФКУ.

Триамтерен или 2,4,7-триамино-6-фенилптеридин имеет химическую структуру, представленную ниже.

Данное соединение было разработано в качестве мочегонного средства. Данное соединение имеется в продаже или может быть синтезировано с помощью соответствующего способа получения, например, такого как способ, раскрытый в GB 982360.

Нолатрексед или 2-амино-6-метил-5-(4-пиридилтио)-4(3H)-хиназолинон имеет химическую структуру, представленную ниже.

Данное соединение было разработано в качестве противоопухолевого средства, в частности, для лечения гепатоцеллюлярной карциномы. Данное соединение имеется в продаже или может быть синтезировано при помощи соответствующего способа получения, например, такого как описанный в патенте США 5430148 (нолатрексед соответствует соединению 14А из настоящего документа).

Султоприд или N-[(1-этил-2-пирролидинил)метил]-5-(этилсульфонил)-о-анисамид имеет химическую структуру, представленную ниже.

Данное соединение было разработано в качестве антидепрессанта. Данное соединение имеется в продаже или может быть синтезировано с помощью соответствующего способа получения, например, такого, как описанный в CN 1706825 A.

Гидрастинин или 6-метил-7,8-дигидро-5H-[1,3]диоксоло[4,5-g]изохинолин-5-ол имеет химическую структуру, представленную ниже.

Данное соединение было разработано в качестве кардиотонического и кровоостанавливающего средства. Данное соединение имеется в продаже или может быть синтезировано при помощи соответствующего способа получения, например, такого как раскрытый в GB 14120.

Буфуралол или 2-(трет-бутиламино)-1-(7-этил-1-бензофуран-2-ил)этан-1-ол имеет химическую структуру, представленную ниже.

Данное соединение было разработано в качестве антагониста бета-адренорецепторов и имеется в свободной продаже. Его используют преимущественно в виде гидрохлоридной соли. Данное соединение можно применять либо в рацемической форме, либо в виде (S)- или (R)-энантиомеров, предпочтительно в виде (S)-энантиомера.

Валганцикловир или [2-[(2-амино-6-оксо-3H-пурин-9-ил)метокси]-3-гидроксипропил] (2S)-2-амино-3-метилбутаноат имеет химическую структуру, представленную ниже.

Данное соединение было разработано в качестве противовирусного средства, используемого для лечения цитомегаловирусной инфекции у субъектов с ВИЧ/СПИДом или после трансплантации органов, и имеется в свободной продаже. Данное соединение используют преимущественно в виде гидрохлоридной соли.

Рикобендазол или метил[5-(пропан-1-сульфинил)-1H-бензоимидазол-2-ил]-карбамат имеет химическую структуру, представленную ниже.

Данное соединение было разработано в качестве глистогонного средства и имеется в свободной продаже. Данное соединение используют преимущественно в форме свободного основания. Рикобендазол является одним из ключевых метаболитов альбендазола или метилового эфира (5-(пропилтио)-1H-бензимидазол-2-ил)карбаминовой кислоты. Альбендазол имеет химическую структуру, представленную ниже.

Альбендазол также был разработан в качестве глистогонного средства и имеется в свободной продаже. Данное соединение можно применять в качестве пролекарства рикобендазола и его используют преимущественно в форме свободного основания.

Валацикловир или 2-[(2-амино-6-оксо-3H-пурин-9-ил)метокси]этил (2S)-2-амино-3-метилбутаноат имеет химическую структуру, представленную ниже.

Данное соединение было разработано в качестве противовирусного средства, используемого для лечения герпетической инфекции, и имеется в свободной продаже. Данное соединение используют преимущественно в виде гидрохлоридной соли.

Миноксидил или 2,6-диамино-4-(пиперидин-1-ил) пиримидин-1-оксид имеет химическую структуру, представленную ниже.

Данное соединение было разработано для лечения гипертонии и выпадения волос и имеется в свободной продаже. Данное соединение используют преимущественно в форме свободного основания.

Локсорибин или 2-амино-9-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-дигидрокси-5-(гидроксиметил)оксолан-2-ил]-7-проп-2-енил-3H-пурин-6,8-дион имеет химическую структуру, представленную ниже.

Данное соединение обладает иммуностимулирующей и иммуномодулирующей активностью и имеется в свободной продаже. Данное соединение используют преимущественно в форме свободного основания.

Термин «фармацевтически приемлемый» относится к химическим соединениям и композициям, которые являются физиологически переносимыми и обычно не вызывают аллергической или какой-либо аналогичной нежелательной реакции, такой как расстройство желудка, головокружение и т.п. при введении человеку. Предпочтительно в контексте настоящего документа термин «фармацевтически приемлемый» означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата, либо внесенный в реестр Фармакопеи США или другой общепризнанной фармакопеи для применения на животных и, более конкретно, на людях.

Кроме того, термин «фармацевтически приемлемая соль» относится к какой-либо соли, которая при введении реципиенту способна обеспечить наличие (напрямую или опосредованно) соединения в соответствии с описанием в настоящем документе. Например, фармацевтически приемлемые соли соединений, представленных в настоящем документе, могут представлять собой соли присоединения кислоты, соли присоединения основания или соли металлов, а также они могут быть синтезированы из исходного соединения, содержащего основной или кислотный компонент, обычными химическими способами. Обычно такие соли получают, например, в результате реакции свободных кислотных или основных форм указанных соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде либо в органическом растворителе или в их смеси. Как правило, предпочтительными являются неводные среды, такие как эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Примеры солей присоединения кислоты включают соли присоединения минеральных кислот, например, такие как гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, сульфат, нитрат, фосфат, а также соли присоединения органических кислот, например, такие как, ацетат, малеат, фумарат, цитрат, оксалат, сукцинат, тартрат, малат, манделат, метансульфонат и п-толуолсульфонат. Примеры солей присоединения щелочных металлов включают неорганические соли, например, такие как аммоний, а также органические соли щелочных металлов, например, такие как этилендиамин, этаноламин, N,N-диалкилентаноламин, триэтаноламин, глюкамин и соли основных аминокислот. Примеры солей металлов включают, например, соли натрия, калия, кальция, магния, алюминия и лития.

В другом конкретном варианте реализации соединение для применения согласно настоящему изобретению представляет собой триамтерен или его фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно триамтерен (т.е. свободное основание триамтерена).

В конкретном варианте реализации соединение для применения согласно настоящему изобретению представляет собой нолатрексед или его фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно дигидрохлорид нолатрекседа.

В другом конкретном варианте реализации соединение для применения согласно настоящему изобретению представляет собой сульфоприд или его фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно гидрохлорид сульфоприда.

В еще одном конкретном варианте реализации соединение для применения согласно настоящему изобретению представляет собой гидрастинин или его фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно гидрохлорид гидрастинина.

В еще одном конкретном варианте реализации фенилкетонурия выбрана из вариантной фенилкетонурии, не связанной с фенилкетонурией (или легкой) гиперфенилаланинемии и классической фенилкетонурии; предпочтительно - выбрана из вариантной фенилкетонурии и не связанной с фенилкетонурией (или легкой) гиперфенилаланинемии; еще более предпочтительно фенилкетонурия представляет собой вариантную фенилкетонурию.

В еще одном конкретном варианте реализации различных аспектов настоящего изобретения субъекты, страдающие фенилкетонурией, экспрессируют одну или более разновидностей фермента PAH, выбранных из группы, состоящей из R261Q, R408W, IVS10, E390G, D415N, R241H, I306V, L348V, V388M, R158Q, Y414C, A300S, R297H, L48S, I65T, V245A, V106A, A403V, E280K, R252W, P281L, S349P и IVS12; предпочтительно - R261Q, R408W, IVS10, E390G, D415N, R241H, I306V, L348V, V388M, R158Q, Y414C, A300S, R297H, L48S, I65T, V245A, V106A и IVS12; более предпочтительно - из группы, состоящей из R261Q, R408W, IVS10, E390G, D415N, R241H, I306V, L348V, V388M, R158Q, Y414C, A300S, R297H, L48S и I65T; еще более предпочтительно - R261Q.

Номенклатурное наименование, используемое для вышеперечисленных мутаций, состоит из первой буквы, обозначающей аминокислоту (используется однобуквенный код аминокислоты) в человеческом ферменте PAH дикого типа, числа, обозначающего ее положение в аминокислотной последовательности человеческого фермента PAH дикого типа, и последней буквы, обозначающей аминокислоту, расположенную в данном положении в мутированном ферменте PAH; к примеру, R261Q означает, что аргинин (R) в положении 261 замещен глутамином (Q). R408W означает, что аргинин (R) в положении 408 замещен триптофаном (W). E390G означает, что глутамат (E) в положении 390 замещен глицином (G). D415N означает, что аспартат (D) в положении 415 замещен аспарагином (N). R241H означает, что аргинин (R) в положении 241 замещен гистидином (H). I306V означает, что изолейцин (I) в положении 306 замещен валином (V). L348V означает, что лейцин (L) в положении 348 замещен валином (V). V388M означает, что валин (V) в положении 388 замещен метионином (M). R158Q означает, что аргинин (R) в положении 158 замещен глутамином (Q). Y414C означает, что тирозин (Y) в положении 414 замещен цистеином (C). A300S означает, что аланин (A) в положении 300 замещен серином (S). R297H означает, что аргинин (R) в положении 297 замещен гистидином (H). L48S означает, что лейцин (L) в положении 48 замещен серином (S). I65T означает, что изолейцин (I) в положении 65 замещен треонином (T). V245A означает, что валин (V) в положении 245 замещен аланином (A). V106A означает, что валин (V) в положении 106 замещен аланином (A). A403V означает, что аланин (A) в положении 403 замещен валином (V). E280K означает, что глутамат (E) в положении 280 замещен лизином (K). R252W означает, что аргинин (R) в положении 252 замещен триптофаном (W). P281L означает, что пролин (P) в положении 281 замешен лейцином (L). S349P означает, что серин (S) в положении 349 замещен пролином (P).

Мутация IVS10 создает новый акцепторный сайт сплайсинга в интроне 10, вызывая аберрантный сплайсинг, в результате чего происходит транскрипт с 9 нуклеотидами, вставленным между нормальными последовательностями экзона 10 и экзона 11. Это соответствует белку с тремя дополнительными аминокислотами (Gly-Leu-Gln), вставленными между остатками Q355 и Y356.

Мутация IVS12 соответствует замещению GT на AT на 5-праймовом сайте донора сплайсинга интрона 12, что приводит к пропуску предыдущего экзона во время сплайсинга РНК. Соответствующая информационная РНК демонстрирует внутреннюю делецию из 116 оснований, точно соответствующую экзону 12, которая обусловливает синтез усеченного белка, лишенного 52 С-концевых аминокислот. Человеческий фермент PAH дикого типа имеет следующую последовательность, представленную в базе данных UniProt, запись P00439 (редакция 237 от 11 декабря 2019 г.):

MSTAVLENPGLGRKLSDFGQETSYIEDNCNQNGAISLIFSLKEEVGALAKVLRLFEENDVNLTHIESRPSRLKKDEYEFFTHLDKRSLPALTNIIKILRHDIGATVHELSRDKKKDTVPWFPRTIQELDRFANQILSYGAELDADHPGFKDPVYRARRKQFADIAYNYRHGQPIPRVEYMEEEKKTWGTVFKTLKSLYKTHACYEYNHIFPLLEKYCGFHEDNIPQLEDVSQFLQTCTGFRLRPVAGLLSSRDFLGGLAFRVFHCTQYIRHGSKPMYTPEPDICHELLGHVPLFSDRSFAQFSQEIGLASLGAPDEYIEKLATIYWFTVEFGLCKQGDSIKAYGAGLLSSFGELQYCLSEKPKLLPLELEKTAIQNYTVTEFQPLYYVAESFNDAKEKVRNFAATIPRPFSVRYDPYTQRIEVLDNTQQLKILADSINSEIGILCSALQKIK (SEQ ID NO: 1)

Соединения для применения согласно настоящему изобретению можно вводить любым подходящим путем (через), таким как оральный (например, пероральный, сублингвальный и т.д.), парентеральный (например, подкожный, внутримышечный, внутривенный и т.п.), вагинальный, ректальный, назальный, местный, через глаза и др., предпочтительно - пероральным или парентеральным, более предпочтительно - пероральным путем.

В частности, соединения для применения согласно изобретению вводятся в форме фармацевтической композиции, которая содержит соответствующее (активное) соединение и один или более фармацевтически приемлемых наполнителей.

Термин «фармацевтически приемлемый наполнитель» относится к носителю, разбавителю или адъюванту, который вводят вместе с активным ингредиентом. Подобные фармацевтические наполнители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. В качестве носителей предпочтительно используют воду или водные растворы солей и водные растворы декстрозы и глицерина, в частности для инъекционных растворов. Подходящие фармацевтические носители известны специалистам в данной области техники.

Фармацевтически приемлемый наполнитель, необходимый для производства желаемой фармацевтической композиции по настоящему изобретению, будет зависеть, помимо прочих факторов, от выбранного пути введения. Указанные фармацевтические композиции могут быть получены обычными способами, известными специалистам в данной области техники.

Соединения для применения согласно настоящему изобретению можно вводить в «терапевтически эффективном количестве», то есть в нетоксичном, но достаточном количестве соответствующего соединения для обеспечения желаемого эффекта. Количество, которое является «эффективным», будет варьировать для разных субъектов в зависимости от возраста и общего состояния индивида, конкретного вводимого соединения и т.п. Таким образом, не всегда возможно указать точное «терапевтически эффективное количество». Тем не менее, любой рядовой специалист в данной области в каком-либо отдельном случае может определить подходящее количество обычным опытным путем.

Соединения для применения согласно настоящему изобретению обычно вводят один или более раз в сутки, например 1, 2, 3 или 4 раза в сутки в стандартных общих суточных дозах в зависимости от конкретного соединения и тяжести заболевания, и могут быть легко определены квалифицированным специалистом. К примеру, стандартные общие суточные дозы сульфоприда или его фармацевтически приемлемой соли варьируют в диапазоне от 0,1 до 18000 мг/сутки (в пересчете на свободное основание сульфоприда), предпочтительно от 0,1 до 1800 мг/сутки, более предпочтительно от 1 до 1800 мг/сутки. Стандартные общие суточные дозы нолатрекседа или его фармацевтически приемлемой соли, вводимые перорально, варьируют в диапазоне от 0,2 до 14000 мг/сутки (в пересчете на свободное основание нолатрекседа), предпочтительно от 0,2 до 1400 мг/сутки, более предпочтительно - от 1 до 1400 мг/сутки. Стандартные общие суточные дозы нолатрекседа или его фармацевтически приемлемой соли, вводимые парентерально, варьируют в диапазоне от 0,1 до 8000 мг/м²/сутки (в пересчете на свободное основание нолатрекседа), предпочтительно от 0,1 до 800 мг/м²/сутки, более предпочтительно - от 1 до 800 мг/м²/сутки. Стандартные общие суточные дозы триамтерена или его фармацевтически приемлемой соли варьируют в диапазоне от 0,1 до 10000 мг/сутки (в пересчете на свободное основание триамтерена), предпочтительно от 0,1 до 300 мг/сутки, более предпочтительно - от 1 до 300 мг/сутки. Стандартные общие суточные дозы гидрастина или его фармацевтически приемлемой соли варьируют в диапазоне от 0,1 до 5000 мг/сутки (в пересчете на свободное основание гидрастина), предпочтительно от 0,1 до 500 мг/сутки, более предпочтительно - от 1 до 500 мг/сутки. Стандартные общие суточные дозы буфуралола или его фармацевтически приемлемой соли варьируют в диапазоне от 0,1 до 1200 мг/сутки (в пересчете на свободное основание буфуралола), предпочтительно от 0,1 до 120 мг/сутки, более предпочтительно - от 1 до 120 мг/сутки. Стандартные общие суточные дозы валганцикловира или его фармацевтически приемлемой соли варьируют в диапазоне от 0,1 до 18000 мг/сутки (в пересчете на свободное основание валганцикловира), предпочтительно от 0,1 до 1800 мг/сутки, более предпочтительно - от 1 до 1800 мг/сутки. Стандартные общие суточные дозы альбендазола или рикобендазола или их фармацевтически приемлемой соли варьируют в диапазоне от 0,1 до 4000 мг/сутки (в пересчете на свободное основание рикобендазола или альбендазола), предпочтительно от 0,1 до 400 мг/сутки, более предпочтительно - от 1 до 400 мг/сутки. Стандартные общие суточные дозы валацикловира или его фармацевтически приемлемой соли варьируют в диапазоне от 0,1 до 20000 мг/сутки (в пересчете на свободное основание валацикловира), предпочтительно от 0,1 до 2000 мг/сутки, более предпочтительно - от 1 до 2000 мг/сутки. Стандартные общие суточные дозы миноксидила или его фармацевтически приемлемой соли варьируют в диапазоне от 0,1 до 1000 мг/сутки (в пересчете на свободное основание миноксидила), предпочтительно от 0,1 до 100 мг/сутки, более предпочтительно - от 1 до 100 мг/сутки. Стандартные общие суточные дозы локсорибина или его фармацевтически приемлемой соли варьируют в диапазоне от 0,1 до 100 мг/сутки (в пересчете на свободное основание локсорибина), предпочтительно от 0,1 до 10 мг/сутки, более предпочтительно - от 1 до 10 мг/сутки.

Фармацевтические композиции могут быть получены стандартными методами, как например те, которые описаны или ссылки на которые содержатся в Фармакопеях Испании и США и аналогичных справочных текстах.

Термин «субъект» относится к млекопитающему, например человеку.

Соединения для применения согласно настоящему изобретению можно вводить в качестве единственного активного ингредиента или в комбинации с другими активными ингредиентами. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения соединения используют в качестве единственного активного ингредиента. В другом конкретном варианте реализации соединения используют в сочетании с другими активными ингредиентами.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к комбинации, содержащей одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда, гидрастинина, буфуралола, валганцикловира, рикобендазола, альбендазола, валацикловира, миноксидила, локсорибина, сапроптерина, окситриптана, пириметамина, пегвалиазы или их фармацевтически приемлемой соли для применения в лечении и/или профилактике фенилкетонурии, в которой по меньшей мере одно соединение выбрано из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда и гидрастинина или их фармацевтически приемлемой соли, где предпочтительно по меньшей мере одно соединение выбрано из группы, состоящей из триамтерена и нолатрекседа или их фармацевтически приемлемой соли.

Настоящее изобретение также относится к применению комбинации, содержащей одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда, гидрастинина, буфуралола, валганцикловира, рикобендазола, альбендазола, валацикловира, миноксидила, локсорибина, сапроптерина, окситриптана, пириметамина, пегвалиазы или их фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики фенилкетонурии (ФКУ), причем по меньшей мере одно соединение выбрано из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда и гидрастинина или их фармацевтически приемлемой соли, где предпочтительно по меньшей мере одно соединение выбрано из группы, состоящей из триамтерена и нолатрекседа или их фармацевтически приемлемой соли.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или профилактики фенилкетонурии (ФКУ) у субъекта, включающему в себя введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества комбинации, содержащей одно или более соединений, выбранных из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда, гидрастинина, буфуралола, валганцикловира, рикобендазола, альбендазола, валацикловира, миноксидила, локсорибина, сапроптерина, окситриптана, пириметамина, пегвалиазы или их фармацевтически приемлемой соли, в которой по меньшей мере одно соединение выбрано из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда и гидрастинина или их фармацевтически приемлемой соли, где предпочтительно по меньшей мере одно соединение выбрано из группы, состоящей из триамтерена и нолатрекседа или их фармацевтически приемлемой соли.

Термин «комбинация» относится к продукту, содержащему одно или более определенных соединений в одной композиции или в нескольких композициях (или единицах), и в этом случае соответствующие соединения распределены между несколькими композициями. В предпочтительном варианте реализации комбинация относится к нескольким композициям, в частности, содержащим одну композицию (или единицу) на одно соединение (соединение в соответствии с определением выше) комбинации. Выражение «один или более» применительно к характеристике комбинации относится по меньшей мере к одному, предпочтительно к 1, 2, 3, 4 или 5 соединениям, более предпочтительно - к 1, 2 или 3 соединениям, еще более предпочтительно - к 1 или 2 соединениям.

Если комбинация представляет собой единую композицию, соединения, содержащиеся в комбинации, всегда вводят одновременно.

Если комбинация состоит из нескольких композиций (или единиц), каждая из которых содержит по крайней мере одно из соединений комбинации, композиции (или единицы) можно вводить одновременно, последовательно или раздельно.

Одновременное введение означает, что соединения или композиции (или единицы) вводят в одно и то же время.

Последовательное введение означает, что соединения или композиции (или единицы) вводят в разное время в хронологическом порядке.

Раздельное введение означает, что соединения или композиции (или единицы) вводят в разное время независимо друг от друга.

Триамтерен, нолатрексед, сульфоприд, гидрастинин, буфуралол, валганцикловир, рикобендазол, альбендазол, валацикловир, миноксидил, локсорибин, включая их фармацевтически приемлемые соли, были подробно описаны выше.

Сапроптерин или (-)-(6R)-2-амино-6-((1R,2S)-1,2-дигидроксипропил)-5,6,7,8-тетрагидро-4(3H)-птеридинон имеет химическую структуру, представленную ниже.

Данное соединение было разработано для лечения гиперфенилаланинемии у пациентов с фенилкетонурией и/или дефицитом тетрагидробиоптерина и имеется в свободной продаже. Данное соединение используют преимущественно в виде гидрохлоридной соли, в частности дигидрохлоридной соли.

Сепиаптерин или S-(-)-2-амино-7,8-дигидро-6-(2-гидрокси-1-оксопропил)-4(1H)-птеридинон имеет химическую структуру, представленную ниже.

Данное соединение является стабильным предшественником тетрагидробиоптерина и внутри клеток превращается в указанное соединение. Данное соединение имеется в свободной продаже. Сепиаптерин используют преимущественно в качестве свободного основания.

Окситриптан или (2S)-2-амино-3-(5-гидрокси-1H-индол-3-ил)пропановая кислота имеет химическую структуру, представленную ниже.

Данное соединение имеется в продаже на некоторых рынках (Тайвань) и используется для лечения ФКУ. Окситриптан в настоящее время находится в разработке как антидепрессант и средство для подавления аппетита.

Пириметамин или 5-(4-хлорфенил)-6-этилпиримидин-2,4-диамин имеет химическую структуру, представленную ниже.

Данное соединение является противопаразитарным средством, используемым для лечения токсоплазмоза, и имеется в свободной продаже. Ранее его использовали для лечения малярии, но было продемонстрировано, что он оказывает некоторый эффект при лечении фенилкетонурии. Данное соединение используют преимущественно в виде свободного основания.

Пегвалиаза представляет собой пегилированную рекомбинантную фенилаланинаммиаклиазу, которая превращает фенилаланин в безвредные метаболиты: транс-коричную кислоту и аммиак, снижая уровень фенилаланина. Данный продукт используют для лечения ФКУ и он имеется в свободной продаже.

Комбинация содержит по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда и гидрастинина или их фармацевтически приемлемой соли, предпочтительно по меньшей одно соединение, выбранное из группы, состоящей из триамтерена и нолатрекседа или фармацевтически приемлемой соли.

В предпочтительном варианте реализации комбинация содержит по меньшей мере триамтерен или его фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно триамтерен (т.е. свободное основание триамтерена). Соответственно, комбинация содержит триамтерен или его фармацевтически приемлемую соль (предпочтительно свободное основание триамтерена) и одно или более (предпочтительно одно) соединение, выбранное из нолатрекседа, сульфоприда, гидрастинина, буфуралола, валганцикловира, рикобендазола, альбендазола, валацикловира, миноксидила, локсорибина, сепиаптерина, окситриптана, пириметамина, пегвалиазы или их фармацевтически приемлемой соли.

В другом предпочтительном варианте реализации комбинация содержит по меньшей мере нолатрексед или его фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно дигидрохлорид нолатрекседа. Соответственно, комбинация содержит нолатрексед или его фармацевтически приемлемую соль (предпочтительно дигидрохлорид нолатрекседа) и одно или более (предпочтительно одно) соединений, выбранных из триамтерена, сульфоприда, гидрастинина, буфуралола, валганцикловира, рикобендазола, альбендазола, валацикловира, миноксидила, локсорибина, сапроптерина, сепиаптерина, окситриптана, пириметамина, пегвалиазы или их фармацевтически приемлемой соли.

В другом предпочтительном варианте реализации комбинация содержит по меньшей мере сульфоприд или его фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно гидрохлорид сульфоприда. Соответственно, комбинация содержит сульфоприд или его фармацевтически приемлемую соль (предпочтительно гидрохлорид сульфоприда) и одно или более (предпочтительно одно) соединений, выбранных из триамтерена, нолатрекседа, гидрастинина, буфуралола, валганцикловира, рикобендазола, альбендазола, валацикловира, миноксидила, локсорибина, сепиаптерина, окситриптана, пириметамина, пегвалиазы или их фармацевтически приемлемой соли.

В другом предпочтительном варианте реализации комбинация содержит гидрастинин или его фармацевтически приемлемую соль, предпочтительно гидрохлорид гидрастинина. Соответственно, комбинация содержит гидрастинин или его фармацевтически приемлемую соль (предпочтительно гидрохлорид гидрастинина) и одно или более (предпочтительно одно) соединений, выбранных из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда, буфуралола, валганцикловира, рикобендазола, альбендазола, валацикловира, миноксидила, локсорибина, сепиаптерина, окситриптана, пириметамина, пегвалиазы или их фармацевтически приемлемой соли.

В частности, комбинации для применения согласно настоящему изобретению вводят в виде фармацевтических композиций, которые содержат соответствующие (активные) соединения и фармацевтически приемлемый наполнитель, как было определено ранее.

Комбинации для применения согласно настоящему изобретению обычно будут вводить один или более раз в сутки, например 1, 2, 3 или 4 раза в сутки в стандартных общих суточных дозах в зависимости от конкретного соединения и тяжести заболевания, и могут быть легко определены квалифицированным специалистом.

Соединения и комбинации для применения в соответствии с настоящим изобретением используют преимущественно в сочетании с диетой с ограничением фенилаланина, в которой потребление фенилаланина частично или полностью исключается путем ограничения потребления натурального белка и обеспечения вместо него заменителем белка, в котором отсутствует фенилаланин, но который обогащен тирозином.

В предпочтительном варианте реализации фенилкетонурия выбрана из вариантной фенилкетонурии, не связанной с фенилкетонурией (или легкой) гиперфенилаланинемии и классической фенилкетонурии; предпочтительно фенилкетонурия выбрана из вариантной фенилкетонурии и не связанной с фенилкетонурией (или легкой) гиперфенилаланинемии; более предпочтительно фенилкетонурия представляет собой вариантную фенилкетонурию.

В конкретном варианте реализации субъекты, страдающие фенилкетонурией, экспрессируют одну или более разновидностей фермента PAH, выбранных из группы, состоящей из R261Q, R408W, IVS10, E390G, D415N, R241H, I306V, L348V, V388M, R158Q, Y414C, A300S, R297H, L48S, I65T, V245A, V106A, A403V, E280K, R252W, P281L, S349P и IVS12; предпочтительно R261Q, R408W, IVS10, E390G, D415N, R241H, I306V, L348V, V388M, R158Q, Y414C, A300S, R297H, L48S, I65T, V245A, V106A и IVS12; более предпочтительно из группы, состоящей из R261Q, R408W, IVS10, E390G, D415N, R241H, I306V, L348V, V388M, R158Q, Y414C, A300S, R297H, L48S и I65T; еще более предпочтительно - R261Q. Указанные разновидности были определены ранее.

Нижеследующие примеры представляют конкретные варианты реализации настоящего изобретения. Они не предназначены для ограничения каким-либо образом объема настоящего изобретения, определенного в настоящем описании.

Примеры

Материалы и методы

1. Анализ изменения термостабильности

В работе и др. (Biochemistry, 2002, 41 (24), 7573-7585) показано, что термическая денатурация hPAH происходит в три этапа: (i) развертывание четырех регуляторных доменов, которое отвечает за низкотемпературный калориметрический переход (ii) развертывание двух (из четырех) каталитических доменов, ответственных за высокотемпературный переход; и (iii) необратимая денатурация белка. Наиболее важным доменом для стабилизации является регуляторный домен.

Таким образом, с целью изучить влияние соединений на термостабильность целевого белка, был проведен анализ изменения термостабильности (также называемый дифференциальной сканирующей флуориметрией (DSF)) [Niesen F.H. et al., Nat Protoc., 2007, 2(9), 2212-2221; Gersting S.W. et al., Human Molecular Genetics, 2010, 19(10), 2039-2049; and Gersting S.W. et al., J. Biol Chem. 2010, 285(40), 30686-30697]. DSF контролирует тепловое разворачивание белков в присутствии флуоресцентного красителя (SYPRO Orange; λexc=465 нм, λem=610 нм) и выполняется с помощью прибора для ПЦР в режиме реального времени (Applied BioSystems 7000HT Fast Real-Time PCR System). Считается, что соединения, повышающие средние точки термической денатурации (Tm), связывают и стабилизируют белок.

Вкратце, очищенные белки дикого типа или Arg261Gln (который является наиболее часто встречающейся мутацией, реагирующей на BH4) (разбавленные в 20 мМ NaHEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин-этансульфоната натрия), pH 7,0 и 200 мМ NaCl, 2 мМ DTT (дитиотреитол) до концентрации 2 мг/мл) использовали при конечной концентрация белка 0,2 мг/мл на образец. Соединения тестировали при конечной концентрации 30 мкМ. Контроль, не содержащий соединение, (NCC) использовали в соответствии с растворителем соединения при конечной концентрации 2% (H₂O, ДМСО, этанол, метанол). В качестве положительного контроля использовали природный кофактор 6R-L-эритро-5,6,7,8-тетрагидробиоптерин (BH4, номер CAS 69056-38-8), стабилизированный в 100 мМ дитиотреитола (DTT), в конечной концентрации 43 мкМ. Чтобы исключить неспецифическое воздействие соединения на краситель, добавляли контроль, не содержащий белков (NPC) (буфер, соединение, краситель). Измерение проводили в двух повторениях, и образцы денатурировали путем сканирования в диапазоне температур от 20 до 75°C со скоростью сканирования 0,5°C/мин.

Данные нормализовали, и соответствующие значения T_m рассчитывали с помощью двухфазного уравнения для определения температур, при которых происходит 50%-ная денатурация (программное обеспечение GraphPadPrism). Для определения воздействия каждого конкретного соединения на термостабильность целевого белка использовали эталонную T_m (NCC) для расчета разницы температур между белком, обработанным соединением, и необработанным белком (T_m-T_mNCC) из повторений, чтобы обеспечить смещение средних точек перехода (ΔT_m1 and ΔT_m2). T_m1 и T_m2 представляют собой две разные средние точки перехода процесса разворачивания белка, поскольку тетрамерный белок PAH разворачивается в два этапа из-за его доменов. Изменение T_m1 на 2°C отражает соответствующее повышение термостабильности регулирующего домена и, таким образом, считается положительным результатом.

2. Анализ активности фермента фенилаланингидроксилазы

Данный анализ проводили на культуре клеток с целью проанализировать активность фермента в присутствии соединений. Вкратце, конструкции PAH дикого типа или PAH Arg261Gln в течение короткого времени экспрессировались в клетках линии COS7 на 96-луночном планшете, отражающем генотип PAH (клеточная линия COS7 не имеет эндогенного PAH). Клетки обрабатывали соединениями при конечной концентрации 10 мкМ и анализировали ферментативную активность PAH через 48 часов после трансфекции. Действие соединений на остаточную ферментативную активность определяли в сравнении с необработанными клетками (NCC, только конечные 0,1% растворителя соединений). Для нормализации клеточного фонового сигнала нетрансфицированные клетки (контроль NT) обрабатывали соединением или растворителем в равной степени в течение 48 часов. В качестве положительного контроля авторы изобретения использовали сепиаптерин - стабильный предшественник BH4 (номер CAS 17094-01-8), стабилизированный в 100 мМ DTT, в конечной концентрации 5 мкМ.

Активность PAH определяли при 25°C, как было описано выше (Gersting, S.W., J. Biol. Chem., 2010, 285(40), 30686-30697) с некоторыми изменениями. Стандартная смесь содержала 22,35 мМ NaHEPES, pH 7,0, 2 ед./мкл мг/мл каталазы, 10 мкМ cульфата железа(II)-аммония и 1 мМ L-Phe (L-фенилаланин). Анализируемую смесь и фермент клеточной культуры предварительно инкубировали в течение 5 минут, и реакцию инициировали добавлением 75 мкМ BH4 (стабилизированного в 100 мМ дитиотреитола). Реакция протекала в течение 60 минут и была остановлена добавлением уксусной кислоты. Количество полученного L-тирозина определяли и количественно оценивали с помощью ВЭЖХ, проводимой в трех повторностях.

Действие соединения на активность фермента PAH рассчитывали в трех повторностях следующим образом: вначале вычитали исходные данные нетрансфицированных клеток из трансфицированных клеток (обработанных или NCC (контроля без соединения)), а затем определяли процент обработанных (соединением) по сравнению с NCC. Активность фермента, превышающая 100%, показывает повышение активности фермента по отношению к NCC.

ВЭЖХ проводили при следующих лабораторных условиях:

1) Оборудование:

ВЭЖХ: UltiMate 3000 (Dionex)

Колонка: ODS-2 Hypersil™; 50×4,6 мм; размер частиц 3 мкм; Thermo Scientific (Кат. №31603-054630)

Предколонки: Accucore XL C18, 4 мкм, 10×4 мм; Thermo Scientific (Кат. №74104-014001)

2) Рабочий буфер для ВЭЖХ PAH (pH 4,6):

15,7 мл NH₃, 20 мл уксусной кислоты доведенные до 1 л деионизированной H₂O (при необходимости pH корректируется при помощи уксусной кислоты)

3) Нормы для тирозина:

60 мкМ, 30 мкМ, 15 мкМ, 7,5 мкМ, 3,75 мкМ тирозина в 0,1 М HCl

4) Рабочие условия:

Флуоресцентное обнаружение тирозина: возбуждение 275 нм, испускание 305 нм с помощью хроматографа UltiMate 3000 RS

Детектор флуоресценции (Dionex)

Элюент: Рабочий буфер для ВЭЖХ PAH

Поток: 2 мл/мин

Продолжительность рабочего цикла (эталоны): 1 минута

Продолжительность рабочего цикла (образец PAH): 2,5 минуты

Элюирование пика тирозина: около 0,7 минут

Во время рабочего цикла образцы содержатся в автоматическом пробоотборнике при 4°C.

В полости колонки поддерживается 25°C.

3. Остаточное количество белка фенилаланингидроксилазы

Анализ остаточного количества белка PAH основывался на методе, описанном в Gersting S.W. et al., Human Molecular Genetics, 2010, 19 (10), 2039-2049 с некоторыми изменениями.

Определение остаточного количества белка PAH производили методом дот-блоттинга при помощи лизатов, полученных из клеточной культуры, где трансфицированные на короткое время клетки линии COS-7 (с PAH дикого типа или разновидностью PAH) подвергались действию соединений в течение 48 часов. Эксперимент проводили на тех же образцах, которые использовали для определения активности ферментов.

2 мкл лизата по каплям наносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану сушили на воздухе при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем на 40 минут залили 5%-ным раствором молока в TBS-Tween (смесь трис-буферного солевого раствора и полисорбата) комнатной температуры. Мембрану инкубировали с мышиным первичным моноклональным антителом, специфичным к PAH (Millipore, Кат. № MAB5278, разведение 1:1000 в 5%-ном растворе молока в TBS-Tween) в течение ночи при 4°C. Затем мембрану промывали (3×10 минут в TBS-Tween) и инкубировали с вторичным антителом, конъюгированным с HRP (противомышиное антитело; Santa Cruz Botechnology, Inc., Кат. № sc-2005; разведение 1:1000 в 5%-ном растворе молока в TBS-Tween) с последующей тщательной промывкой в TBS-Tween (3×10 минут) и дистиллированной воде (1×10 минут). Блоты визуализировали с помощью субстрата Pierce™ ECL (ThermoFisher Scientific, Кат. №32106), а хемилюминесценцию отслеживали с помощью системы визуализации DIANA III или системы визуализации ChemiDoc™ MP (BioRad). Для анализа влияния соединения на количество белка PAH провели денситометрический анализ с помощью программного обеспечения ImageJ.

Действие соединения на количество белка PAH определяли в трех повторностях. При определении активности фермента исходные данные нетрансфицированных клеток (NT) вычитали из трансфицированных клеток (NCC или обработанных соединением). На следующем этапе вычисляли изменение значений NCC по сравнению с клетками, обработанными соединением. Остаточное количество белка, превышающее 100%, показывает повышение стабильности фермента по отношению к NCC.

4. Изотермическая титрационная калориметрия

Изотермическая титрационная калориметрия (ITC) представляет собой физический метод количественного определения, используемый для определения аффинности связывания небольших молекул с белками или иными более крупными молекулами [Freyer M.W. and Lewis E.A., Methods in Cell Biology, 2008, Том 4, глава 4, стр. 79-113]. Данное измерение определяет изменения тепла, выделяемого или поглощаемого при взаимодействии молекул, генерирует кинетику связывания и термодинамический профиль молекулярного взаимодействия.

Определяются следующие параметры:

KD (равновесная константа диссоциации), N (стехиометрия взаимодействия (моль лиганда/моль комплекса)), ΔH (изменение энтальпии), ΔG (энергия Гиббса), T (температура) и ΔS (изменение энтропии).

Эксперименты с ITC проводили при 25°C с использованием микрокалориметра MicroCal PEAQ-ITC (Malvern). Белки PAH получали в буфере HEPES (HEPES 20 мМ Hepes, 0,2 М NaCl, 1 мМ DTT, pH 7,0), содержащем 5% ДМСО для приведения в соответствие с конечной концентрацией ДМСО в растворах соединений. Используемую концентрацию белка (30 мкМ) определяли за счет поглощения ультрафиолета (УФ) при 280 нм. Соединения (500 мМ) подготавливали, используя тот же самый буфер. Двенадцать инъекций по 3 мкл смеси соединение/лиганд титровали в ячейку с образцом (содержащую белок) в течение 31 минуты при скорости перемешивания 750 об/мин. Данные корректировали по отношению к базовым значениям путем вычитания исходных данных, полученных при равнозначных инъекциях соединения в буферный раствор. Кривые титрования анализировали с помощью аналитической программы MicroCal PEAQ-ITC (версия 1.1.0.1262, Malvern Instruments Ltd.) используя модель, за которую принимается набор идентичных участков связывания, где общая теплота раствора рассчитывается следующим образом:

где n - количество сайтов связывания, M_t - общая концентрация белков в клетке, ΔH - мольная теплота связывания лиганда, X_t - общая концентрация лиганда и K - константа связывания (K=1/KD). Тепло, выделяемое на каждую инъекцию (i), ΔQ(i), рассчитывается в соответствии с приведенным ниже уравнением, в котором компенсируется объем, прибавляемый при каждой инъекции (ΔVi). V₀ - первоначальный объем в ячейке.

Параметры n, K и ΔH определяют посредством нелинейной аппроксимации по методу наименьших квадратов с использованием алгоритма Левенберга-Марквардта.

5. Тестируемые соединения

Триамтерен (Santa Cruz Biotechnology), нолатретекса дигикрохлорид (Carbosynth), сульфоприда гидрохлорид (Carbosynth), гидрастинина гидрохлорид (Santa Cruz Biotechnology), буфуралола гидрохлорид (Santa Cruz Biotechnology), S-буфуралола гидрохлорид (Santa Cruz Biotechnology), локсорибин (Tocris, Biogen), валганцикловира гидрохлорид (Santa Cruz Biotechnology), валацикловира гидрохлорид (Santa Cruz Biotechnology) и миноксидил (Sigma Aldrich) тестировали в соответствии с одним или несколькими анализами, описанными выше. В качестве контрольных соединений использовали сепиаптерин (Santa Cruz Biotechnology) или BH4 (Carbosynth).

Результаты

Пример 1. Анализ изменения термостабильности

Определяли смещения средних точек перехода 1 и 2 (ΔT_m1 и ΔT_m2) обработанных соединением (30 мкМ) целевых белков PAH дикого типа (PAH ДТ) и Arg261Gln (R261Q PAH). В качестве положительного контроля использовали 6R-L-эритро-5,6,7,8-тетрагидробиоптерин (BH4) (43 мкМ). Результаты представлены в таблице ниже.

PAH ДТ PAH R261Q Соединение ΔT_m1 ΔT_m2 ΔT_m1 ΔT_m2 Буфуралол HCl 1,62 -0,09 2,24 - S-Буфуралол HCl 1,05 0,24 3,73 0,92 Рикобендазол -0,48 2,57 2,19 3,39 Триамтерен 0,33 3,23 2,21 2,82 Локсорибин 3,57 - - - Гидрастинин HCl -0,49 6,10 2,46 0,04 BH4 0,20 1,88 2,54 12,17

Результаты показывают, что данные соединения способны стабилизировать фермент с такой же эффективностью, что и природный кофактор BH4, которые в исследованиях термостабильности демонстрируют более высокую стабилизирующую активность в отношении мутантного PAH, чем в отношении белка дикого типа. Для применения в лечении ФКУ наиболее подходящими результатами являются результаты по мутантному белку и, в частности, по стабилизации регуляторного домена (T_m1).

Пример 2. Анализ активности фермента фенилаланингидроксилазы

Определяли влияние соединений на активность фермента PAH в клетках, временно экспрессирующих PAH дикого типа (PAH ДТ) или Arg261Gln (R261Q), в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице ниже. Данные представляют собой среднее значение и стандартное отклонение (SD) процента образования L-тирозина в клетках, обработанных соединением (10 мкМ), по сравнению с необработанными клетками (NCC). В качестве положительного контроля использовали сепиаптерин (5 мкМ).

PAH ДТ PAH R261Q Соединение Среднее
значение
[% NCC] СО
[% NCC] Среднее
значение
[% NCC] СО
[% NCC] Нолатрексед 2HCl 284,15 55,25 531,60 52,69 Триамтерен 118,98 2,13 161,48 32,08 Сульфоприд HCl 104,71 11,29 131,23 21,70 Сепиаптерин 297,14 9,76 2089,79 44,50

Результаты показывают, что обработка вышеуказанными соединениями значительно увеличивает ферментативную активность PAH дикого типа и мутантного PAH, экспрессируемых в клетках линии COS7, хотя и в меньшей степени, чем сепиаптерин, использованный в качестве положительного контроля.

Пример 3. Остаточное количество белка фенилаланингидроксилазы

Определяли влияние соединений на уровень белка PAH в клетках, временно экспрессирующих PAH дикого типа (PAH ДТ) или Arg261Gln (R261Q), в течение 48 часов. Результаты представлены в таблице ниже. Данные представляют собой среднее значение и стандартное отклонение (SD) процента сигнала иммунных блотов PAH клеток, обработанных соединением (10 мкМ), по сравнению с необработанными клетками (NCC). В качестве положительного контроля использовали сепиаптерин (5 мкМ).

PAH ДТ PAH R261Q Экспермент Соединение Среднее
значение
[% NCC] СО
[% NCC] Среднее
значение
[% NCC] СО
[% NCC] 1 Валганцикловир HCl 138,45 29,29 141,23 7,76 1 Рикобендазол 153,70 21,55 104,50 25,91 1 Валацикловир HCl 146,25 10,26 103,81 10,15 1 Миноксидил 126,74 14,05 96,11 4,07 1 Гидрастин HCl 164,12 27,62 141,21 16,23 1 Сепиаптерин 87,02 16,17 238,55 55,98 2 Нолатрексед 2HCl 108,45 4,93 255,58 15,87 2 Триамтерен 110,05 4,34 129,86 9,45 2 Сепиаптерин 106,44 8,45 310,19 20,09

Результаты показывают, что обработка вышеуказанными соединениями значительно повышает уровень белка PAH дикого типа и мутантного PAH, экспрессируемых в клетках линии COS7, что свидетельствует о повышении стабильности белка PAH или синтеза белка.

Пример 4. Изотермическая титрационная калориметрия

Проведен анализ и получены данные изотермической калориметрии при титровании триамтерена и гидрохлорида гидрастинина в PAH дикого типа (PAH ДТ). В качестве положительного контроля использовали BH4. Результаты представлены в таблице ниже.

Соединение KD
(мкМ) N
(сайты) ΔH
(кДж/моль) ΔG
(кДж/моль) -TΔS
(кДж/моль) Триамтерен 3,03±0,00 0,726±0,00 -23,2±0,7 -31,5 -8,32 Гидрастинин HCl 2,99±3,2 1,310±0,2 9,58±2,3 -31,6 -41,1 BH4 40,7±14,1 0,936±0,3 -74,9±33,1 -25,1 49,8

Результаты показывают, что триамтерен и гидрохлорид гидрастинина с высокой аффинностью связываются с рекомбинантным PAH при Kd в низком микромолярном диапазоне.

Изобретение относится к применению соединения, выбранного из группы, состоящей из триамтерена и нолатрекседа или их фармацевтически приемлемой соли, а также комбинации указанных соединений с другими активными ингредиентами, выбранными из сульфоприда, гидрастинина, буфуралола, валганцикловира, рикобендазола, альбендазола, валацикловира, миноксидила, локсорибина, сапроптерина, сепиаптерина, окситриптана, пириметамина, пегвалиазы или их фармацевтически приемлемой соли, в лечении и/или профилактике фенилкетонурии и для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики фенилкетонурии. Применение группы изобретений позволяет эффективно лечить и/или предупреждать фенилкетонурию. 4 н. и 18 з.п. ф-лы, 4 пр.

1. Применение соединения, выбранного из группы, состоящей из триамтерена и нолатрекседа или их фармацевтически приемлемой соли, в лечении и/или профилактике фенилкетонурии.

2. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанное соединение представляет собой триамтерен или его фармацевтически приемлемую соль.

3. Применение по п. 2, отличающееся тем, что указанное соединение представляет собой триамтерен.

4. Применение по п. 1, отличающееся тем, что указанное соединение представляет собой нолатрексед или его фармацевтически приемлемую соль.

5. Применение по п. 4, отличающееся тем, что указанное соединение представляет собой дигидрохлорид нолатрекседа.

6. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что фенилкетонурия выбрана из вариантной фенилкетонурии, не связанной с фенилкетонурией гиперфенилаланинемии и классической фенилкетонурии.

7. Применение по п. 6, отличающееся тем, что фенилкетонурия представляет собой вариантную фенилкетонурию.

8. Применение соединения, выбранного из группы, состоящей из триамтерена и нолатрекседа или их фармацевтически приемлемой соли, для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики фенилкетонурии.

9. Применение по п. 8, отличающееся тем, что указанное соединение представляет собой триамтерен или его фармацевтически приемлемую соль.

10. Применение по п. 9, отличающееся тем, что указанное соединение представляет собой триамтерен.

11. Применение по п. 8, отличающееся тем, что указанное соединение представляет собой нолатрексед или его фармацевтически приемлемую соль.

12. Применение по п. 11, отличающееся тем, что указанное соединение представляет собой дигидрохлорид нолатрекседа.

13. Применение по любому из пп. 8-12, отличающееся тем, что фенилкетонурия выбрана из вариантной фенилкетонурии, не связанной с фенилкетонурией гиперфенилаланинемии и классической фенилкетонурии.

14. Применение по п. 13, отличающееся тем, что фенилкетонурия представляет собой вариантную фенилкетонурию.

15. Применение комбинации, содержащей два или более соединений, выбранных из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда, гидрастинина, буфуралола, валганцикловира, рикобендазола, альбендазола, валацикловира, миноксидила, локсорибина, сапроптерина, сепиаптерина, окситриптана, пириметамина, пегвалиазы или их фармацевтически приемлемой соли в лечении и/или профилактике фенилкетонурии, причем по меньшей мере одно соединение выбрано из группы, состоящей из триамтерена и нолатрекседа или их фармацевтически приемлемой соли.

16. Применение комбинации по п. 15, отличающееся тем, что указанная комбинация содержит по меньшей мере одно соединение, как определено в любом из пп. 2-5.

17. Применение комбинации по п. 15 или 16, отличающееся тем, что фенилкетонурия выбрана из вариантной фенилкетонурии, не связанной с фенилкетонурией гиперфенилаланинемии и классической фенилкетонурии.

18. Применение комбинации по п. 17, отличающееся тем, что фенилкетонурия представляет собой вариантную фенилкетонурию.

19. Применение комбинации, содержащей два или более соединений, выбранных из группы, состоящей из триамтерена, нолатрекседа, сульфоприда, гидрастинина, буфуралола, валганцикловира, рикобендазола, альбендазола, валацикловира, миноксидила, локсорибина, сапроптерина, сепиаптерина, окситриптана, пириметамина, пегвалиазы или их фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения фенилкетонурии (ФКУ), причем по меньшей мере одно соединение выбрано из группы, состоящей из триамтерена и нолатрекседа или их фармацевтически приемлемой соли.

20. Применение комбинации по п. 19, отличающееся тем, что указанная комбинация содержит по меньшей мере одно соединение, как определено в любом из пп. 2-5.

21. Применение комбинации по любому из пп. 19 или 20, отличающееся тем, что фенилкетонурия выбрана из вариантной фенилкетонурии, не связанной с фенилкетонурией гиперфенилаланинемии и классической фенилкетонурии.

22. Применение комбинации по п. 21, отличающееся тем, что фенилкетонурия представляет собой вариантную фенилкетонурию.