ПОЛУЧЕНИЕ УЛУЧШЕННОЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ PAH ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТЯЖЕЛОЙ PKU С ПОМОЩЬЮ ГЕННОЙ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ, НАПРАВЛЕННОЙ НА ПЕЧЕНЬ Российский патент 2025 года по МПК C12N15/52 A61K38/44 C12N15/86 C12N9/00 

[1] Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 62/744944, поданной 12 октября 2018 года, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ПРЕДСТАВЛЕНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ТЕКСТОВОМ ФАЙЛЕ ASCII

[2] Содержание нижеследующего представленного текстового файла ASCII включено в данный документ с помощью ссылки во всей своей полноте: машиночитаемая форма (CRF) перечня последовательностей (название файла: 159792016640SEQLIST.TXT, дата составления: 16 октября 2019 г., размер: 33 Кб).

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[3] Настоящее изобретение относится к вариантам полипептидов фенилаланингидроксилазы. В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к композициям и способам лечения фенилкетонурии с использованием генной терапии.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[4] Фенилкетонурия (PKU) представляет собой генетически обусловленный дефицит печеночного фермента, представляющего собой фенилаланингидроксилазу (PAH), который катализирует гидроксилирование фенилаланина (Phe) до тирозина (Tyr). Это заболевание является наиболее распространенным врожденным нарушением метаболизма аминокислот с общей заболеваемостью 1:10-15000 в Северной Америке, и его выявляют в рамках программ скрининга новорожденных в большинстве развитых стран. В отсутствие какого-либо лечения тяжелая форма PKU приводит к крайне повышенным уровням Phe в крови, что оказывает нейротоксическое действие и ассоциировано с тяжелой умственной отсталостью (Kochhar 2012, Ho 2014, Blau 2015). Затрагиваемый белок, представляющий собой PAH, является многодоменным белком, состоящим из N-концевого регуляторного (1-117), центрального каталитического (118-410) и C-концевого тетрамеризационного (411-452) доменов (Flydal 2013). На сегодняшний день более 560 вызывающих заболевание мутаций были картированы в каждом домене, причем каталитическая область является наиболее часто затрагиваемым сайтом (Erlandsen 2003). Гомомультимерный фермент подвергается сложной регуляции с фосфорилированием и аллостерической активацией за счет связывания субстрата Phe с N-концевым доменом, который точно регулирует активность фермента PAH, путем изменения различных конформационных и мультимеризационных состояния фермента (Knappskog 1996, Jaffe 2013, Arturo 2016).

[5] Текущее лечение фенилкетонурии представляет собой соблюдаемое в течение всей жизни ограничение потребления Phe с пищей с использованием низкобелковой диеты и жидкой медицинской смеси (Kochhar 2012, Ho 2014, Blau 2015). Несмотря на свою эффективность, низкие вкусовые качества продуктов лечебного питания и строгие ограничения в отношении выбора продуктов питания затрудняют соблюдение диеты, а несоблюдение режима неуклонно возрастает в течение детского возраста, и к концу подросткового возраста почти у 80% пациентов уровень Phe в крови превышает рекомендованный (Waisbren 2007, Thomas 2017). Также появляются доказательства того, что, несмотря на надлежащее соблюдение диеты с ограничением потребления Phe, многие пациенты испытывают дефицит различных нейрокогнитивных и нейропсихиатрических функций, а также среди них наблюдается высокая заболеваемость синдромом дефицита внимания с гиперактивностью (ADHD). Хотя причины этого неясны, возможные объяснения включают дисбаланс аминокислот в головном мозге, пищевая недостаточность определенных витаминов и микроэлементов, а также колебания уровней Phe в крови, которые обычно поддерживаются в стабильном состоянии за счет активности PAH в печени (Cleary 2013, Gonzales 2016, Vogel 2017). Интересно отметить, что лечение пациентов с более легкими формами PKU с помощью синтетической формы кофактора тетрагидробиоптерина (BH4) (сапроптерина дигидрохлорида) оказалось эффективным не только в отношении снижения уровней Phe в крови, но также продемонстрировало улучшение в отношении неврологических исходов, такое как уменьшение симптомов ADHD (Burton 2015). Данная терапия усиливает остаточную активность фермента PAH, действуя в качестве фармакологического шаперона, и, следовательно, может обеспечить частичную коррекцию генетического дефекта, обеспечивая нормальную активность PAH, регулируемую с помощью Phe (Blau 2015). Другой недавно одобренный вид терапии состоит из заместительной ферментной терапии с использованием пегилированной формы бактериальной фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL), которая метаболизирует Phe в транс-коричную кислоту. Этот вид терапии обеспечивает значительное снижение уровней Phe в крови, но, по-видимому, менее эффективен в отношении неврологических конечных точек (Longo 2014). Остается неясным, может ли этот или любые другие виды терапии, основанные в основном на снижении уровней Phe в крови в отсутствие коррекции функции PAH как регулятора системных уровней Phe и продуцента Tyr, решить когнитивные и нейропсихиатрические проблемы, наблюдаемые даже у пациентов с PKU, соблюдающих диету.

[6] Все литературные источники, цитируемые в данном документе, в том числе патентные заявки и публикации, включены с помощью ссылки во всей своей полноте.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[7] Настоящее изобретение основано, по меньшей мере частично, на открытии авторами настоящего изобретения улучшенных вариантов hPAH, и в частности варианта-1 (V1), который предусматривает четыре аминокислотные замены, приводящие к улучшенной стабильности белка и активности фермента по сравнению с эндогенной hPAH. Доставка кДНК, кодирующей этот вариант hPAH-V1, в печень с использованием клинически значимых доз rAAV улучшала показатели различных относящихся к заболеванию конечных точек у мышей PAH^enu2, являющихся моделью PKU у человека, и обеспечивала более высокую эффективность, чем обеспечиваемая немодифицированной hPAH. Таким образом, векторы на основе rAAV, кодирующие этот новый вариант, могут проложить путь для генной терапии PKU, обеспечивая эффективность при сниженных дозах вектора.

[8] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен вариант полипептида фенилаланингидроксилазы (PAH), предусматривающий две аминокислотные замены, где аминокислотные замены находятся в сайтах полипептида человеческой PAH дикого типа, выбранных из M180, K199, S250 и G256. В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен вариант полипептида фенилаланингидроксилазы (PAH), предусматривающий три аминокислотные замены, где аминокислотные замены находятся в сайтах полипептида человеческой PAH дикого типа, выбранных из M180, K199, S250 и G256. В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен вариант полипептида фенилаланингидроксилазы (PAH), предусматривающий четыре аминокислотные замены в сайтах M180, K199, S250 и G256 полипептида человеческой PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная замена предусматривает одну или несколько из M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная замена предусматривает K199P, S250P и G256A; M180T, S250P и G256A; M180T, K199P и G256A или M180T, K199P и S250P. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная замена предусматривает M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH дополнительно предусматривает аминокислотные замены H264P, G272A, G272P, P275L, P279Q, G272P и P275L или T323R и F327T. В некоторых вариантах осуществления полипептид человеческой PAH дикого типа содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH представляет собой полипептид человеческой PAH. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH содержит аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере приблизительно 80% идентичны аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH дополнительно предусматривает одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из G33A, G46A, G46P, G103A, G139A, G139P, G148A, G188A, G218A, G239A, G247A, G257A, G272A, G289A, G307A, G312A, G332A, G337A, G344A, G352A, и G442A, в полипептиде человеческой PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH дополнительно предусматривает одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из P9G, G10V, G12S, K184R, K192R, S196A, Y206H, H220R, Q336E, E360D, I374C, N376E, N401T, I421V, I441V, S446H, и добавление S в положении 453 в полипептиде человеческой PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH дополнительно предусматривает одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из F240W, A246P, G247A, Y268W, C284F, T323R, F327Y, E319P, I306(Y, F), K113P, G188A, F191Y, T193R, Y206H, G337P, и N376P, в полипептиде человеческой PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из G33A, G46A, G46P, G103A, G139A, G139P, G148A, G188A, G218A, G239A, G247A, G257A, G272A, G289A, G307A, G312A, G332A, G337A, G344A, G352A, и G442A, в полипептиде человеческой PAH дикого типа.

[9] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен вариант полипептида PAH, где вариант полипептида PAH предусматривает одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из P9G, G10V, G12S, K184R, K192R, S196A, Y206H, H220R, Q336E, E360D, I374C, N376E, N401T, I421V, I441V, S446H, и добавление S в положении 453 в полипептиде человеческой PAH дикого типа. В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен вариант полипептида PAH, предусматривающий одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из F240W, A246P, G247A, Y268W, C284F, T323R, F327Y, E319P, I306(Y, F), K113P, G188A, F191Y, T193R, Y206H, G337P, и N376P, в полипептиде человеческой PAH дикого типа.

[10] В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает N-концевое усечение. В некоторых вариантах осуществления N-концевое усечение предусматривает усечение N-концевого регуляторного домена. В некоторых вариантах осуществления N-концевое усечение предусматривает усечение аминокислотных остатков 1-102 полипептида PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает C-концевое усечение. В некоторых вариантах осуществления C-концевое усечение предусматривает усечение тетрамеризационного домена. В некоторых вариантах осуществления C-концевое усечение предусматривает усечение аминокислотных остатков 429-452 полипептида PAH дикого типа В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH содержит аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам 103-428 полипептида PAH дикого типа.

[11] В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает одну или несколько аминокислотных замен для устранения потенциальных сайтов расщепления протеазой. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько аминокислотных замен для устранения потенциальных сайтов расщепления протеазой расположены в положениях 270-295 и/или 380-405 полипептида PAH дикого типа.

[12] В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH слит с полипептидом, нацеливающимся на печень. В некоторых вариантах осуществления полипептид, нацеливающийся на печень, представлен HGF или его фрагментами или гликопротеинами, которые связываются с асиалогликопротеиновым рецептором гепатоцитов. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH является пегилированным и/или нитрозилированным. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает аминокислотную замену I374C, где остаток Cys в положении 374 является нитрозилированным.

[13] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлена композиция, содержащая вариант полипептида PAH, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

[14] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH, функционально связана с промотором. В некоторых вариантах осуществления промотор выбран из немедленно-раннего промотора цитомегаловируса (CMV), LTR RSV, LTR MoMLV, промотора гена фосфоглицераткиназы-1 (PGK), промотора вируса обезьян 40 (SV40), промотора CK6, промотора гена транстиретина (TTR), промотора mTTR482, промотора mA1MB2-mTTR482, промотора TK, тетрациклин-чувствительного промотора (TRE), промотора HBV, промотора hAAT, промотора LSP, промотора LP1, химерного промотора, специфического в отношении печени (LSP), промотора E2F, промотора гена теломеразы (hTERT); составного промотора энхансер цитомегаловируса/промотор гена бета-актина курицы/промотор гена β-глобина кролика (CAG), промотора гена фактора элонгации 1-альфа (EF1-альфа), промотора гена β-глюкуронидазы человека, промотора гена β-актина курицы (CBA), модифицированного промотора гена β-актина курицы (CBA) или SEQ ID NO:17, ретровирусного LTR-промотора вируса саркомы Рауса (RSV), промотора гена дигидрофолатредуктазы и промотора гена 13-актина. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор LP1 или промотор mA1MB2-mTTR482. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота дополнительно содержит сигнал полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста, сигнал полиаденилирования SV40 или сигнал полиаденилирования TK HSV. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота дополнительно содержит интрон. В некоторых вариантах осуществления интрон представляет собой гибридный интрон генов β-актина курицы (CBA)/β-глобина кролика. В некоторых вариантах осуществления интрон представляет собой модифицированный гибридный интрон генов β-актина курицы (CBA)/β-глобина кролика под SEQ ID NO:15. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота дополнительно содержит один или несколько ITR. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота дополнительно содержит спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты оптимизирована с удалением последовательностей ATG. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой спейсерную последовательность интрона A1AT под SEQ ID NO:16.

[15] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид человеческой PAH, где нуклеиновая кислота является кодон-оптимизированной. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты на по меньшей мере 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:14. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:14. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота представляет собой мРНК. В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлена композиция, содержащая нуклеиновую кислоту, описанную в данном документе. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

[16] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту, описанную в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV). В некоторых вариантах осуществления вектор на основе rAAV содержит нуклеиновую кислоту, описанную в данном документе, которая фланкирована одной или несколькими последовательностями инвертированного концевого повтора (ITR) AAV. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота фланкирована двумя ITR AAV. В некоторых вариантах осуществления ITR AAV представляют собой ITR AAV, предусматривающие ITR серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ,, AAV козы, AAV крупного рогатого скота или AAV мыши. В некоторых вариантах осуществления ITR AAV представляют собой ITR AAV2. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе rAAV содержит в направлении от 5'- к 3'-концу ITR AAV2, промотор, интрон, нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид PAH, спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты, сигнал полиаденилирования и ITR AAV2. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор m1A1MB2-mTTR482 или промотор LP1. В некоторых вариантах осуществления интрон представляет собой гибридный интрон генов β-актина курицы (CBA)/β-глобина кролика. В некоторых вариантах осуществления полипептид PAH представляет собой вариант полипептида PAH, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид PAH, является кодон-оптимизированной нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты из интрона гена альфа-1-антитрипсина человека. В некоторых вариантах осуществления интрон гена альфа-1-антитрипсина человека был мутирован с удалением последовательностей ATG. В некоторых вариантах осуществления сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой самокомплементарный вектор. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PAH, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность, комплементарную последовательности полипептида PAH, где первая последовательность нуклеиновой кислоты может образовывать внутринитевые пары оснований со второй последовательностью нуклеиновой кислоты на протяжении большей части или всей ее длины. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая последовательность нуклеиновой кислоты соединены мутантным ITR AAV, где мутантный ITR AAV предусматривает делецию D-области и предусматривает мутацию последовательности концевого разрешения.

[17] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлена частица rAAV, содержащая вектор на основе rAAV, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит капсид серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K,, AAV козы, химерного AAV1/AAV2, AAV крупного рогатого скота, AAV мыши или rAAV2/HBoV1. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит сконструированный капсид AAV. В некоторых вариантах осуществления сконструированный капсид AAV представляет собой капсид DJ или капсид LK03. В некоторых вариантах осуществления ITR и капсид вирусной частицы rAAV получены из одного и того же серотипа AAV. В некоторых вариантах осуществления ITR и капсид вирусных частиц rAAV получены из разных серотипов AAV. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица rAAV содержит капсид AAV8. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица rAAV содержит капсид AAV8, и при этом вектор содержит ITR AAV2.

[18] В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит капсид, который характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности c капсидом серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, AAV козы, химерного AAV1/AAV2, AAV крупного рогатого скота, AAV мыши или rAAV2/HBoV1, как например по меньшей мере 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит капсид, который характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с капсидом серотипа AAV1, как например по меньшей мере 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит капсид, который характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с капсидом серотипа AAV2, как например по меньшей мере 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит капсид, который характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с капсидом серотипа AAV3, как например по меньшей мере 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит капсид, который характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с капсидом серотипа AAV4, как например по меньшей мере 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит капсид, который характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с капсидом серотипа AAV5, как например по меньшей мере 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит капсид, который характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с капсидом серотипа AAV6, как например по меньшей мере 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит капсид, который характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с капсидом серотипа AAV7, как например по меньшей мере 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит капсид, который характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с капсидом серотипа AAV8, как например по меньшей мере 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит капсид, который характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с капсидом серотипа AAV9, как например по меньшей мере 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит капсид, который характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с капсидом серотипа AAV11, как например по меньшей мере 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит капсид, который характеризуется по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с капсидом серотипа AAV12, как например по меньшей мере 87%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% идентичностью последовательности.

[19] В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит гибридный капсид. В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид представляет собой гибридный капсид AAV1/AAV6, AAV2/AAV6, AAV3/AAV6, AAV4/AAV6, AAV5/AAV6, AAV7/AAV6, AAV8/AAV6, AAV9/AAV6, AAV10/AAV6, AAV11/AAV6, AAV12/AAV6, AAV1/AAV8, AAV2/AAV8, AAV3/AAV8, AAV4/AAV8, AAV5/AAV8, AAV7/AAV8, AAV9/AAV8, AAV10/AAV8, AAV11/AAV8, AAV12/AAV8, или AAV1/AAV6/AAV8. В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид представляет собой гибридный капсид AAV8/AAV6. В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид представляет собой гибридный капсид AAV1/AAV6/AAV8.

[20] В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит гибридный капсид. В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид представляет собой гибридный капсид AAV1/AAV6, AAV2/AAV6, AAV3/AAV6, AAV4/AAV6, AAV5/AAV6, AAV7/AAV6, AAV8/AAV6, AAV9/AAV6, AAV10/AAV6, AAV11/AAV6, AAV12/AAV6, AAV1/AAV8, AAV2/AAV8, AAV3/AAV8, AAV4/AAV8, AAV5/AAV8, AAV7/AAV8, AAV9/AAV8, AAV10/AAV8, AAV11/AAV8, AAV12/AAV8, или AAV1/AAV6/AAV8. В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид представляет собой гибридный капсид AAV8/AAV6. В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид представляет собой гибридный капсид AAV1/AAV6/AAV8.

[21] В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с частью последовательности капсида AAV1, как например по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с частью последовательности капсида AAV2, как например по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с частью последовательности капсида AAV3, как например по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с частью последовательности капсида AAV4, как например по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с частью последовательности капсида AAV5, как например по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с частью последовательности капсида AAV6, как например по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с частью последовательности капсида AAV7, как например по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с частью последовательности капсида AAV8, как например по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с частью последовательности капсида AAV9, как например по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с частью последовательности капсида AAV10, как например по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с частью последовательности капсида AAV12, как например по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления гибридный капсид содержит аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с частью последовательности капсида AAV8, как например по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью последовательности. В некоторых вариантах осуществления часть содержит по меньшей мере 100 аминокислот, как например по меньшей мере 150, 200, 250, 300, 350 или 400 аминокислот.

[22] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлена композиция, содержащая частицу rAAV, описанную в данном документе. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

[23] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлена клетка, содержащая выделенную нуклеиновую кислоту, описанную в данном документе. В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен способ получения варианта полипептида PAH, при этом способ включает культивирование описанной выше клетки в условиях, обеспечивающих продуцирование варианта полипептида PAH. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию очистки варианта полипептида PAH.

[24] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму варианта полипептида PAH, описанного в данном документе, или композиции, описанной в данном документе. В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида PAH, описанный в данном документе, или нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе. В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму вектора на основе rAAV, описанного в данном документе. В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму частицы rAAV, описанной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлен способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму композиции, описанной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлен способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму клетки, описанной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления у индивидуума отсутствует активность PAH.

[25] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен способ снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму варианта полипептида PAH, описанного в данном документе. В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен способ снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида PAH, описанный в данном документе, или нуклеиновой кислоты, описанной в данном документе. В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен способ снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму вектора на основе rAAV, описанного в данном документе. В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен способ снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму частицы rAAV, описанной в данном документе. В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен способ снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму композиции, описанной в данном документе. В некоторых вариантах осуществления уровень фенилаланина в крови у индивидуума до лечения является повышенным по сравнению с уровнем фенилаланина в крови у подобранных по принципу паритетности контрольных индивидуумов. В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен способ снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму клетки, описанной в данном документе.

[26] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, вектор на основе rAAV, частица rAAV, композиция или клетка вводятся внутривенно, внутриартериально, внутрипеченочно, внутрипортально, внутрибрюшинно или подкожно. В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют в комбинации с другим видом терапии. В некоторых вариантах осуществления другой вид терапии представляет собой лечение с помощью тетрагидробиоптерина, лечение с помощью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) или пегилированной PAL или диету с ограничением потребления фенилаланина.

[27] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен способ получения полипептида PAH, включающий культивирование описанной в данном документе клетки в условиях, обеспечивающих продуцирование полипептида PAH. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает очистку полипептида PAH.

[28] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлен набор, содержащий вариант полипептида PAH, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлен набор, содержащий нуклеиновую кислоту, описанную в данном документе, вектор на основе rAAV, описанный в данном документе, частицу rAAV, описанную в данном документе, или композицию, описанную в данном документе. В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит инструкции по применению, буферы и/или фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества и/или флаконы, ампулы и/или шприцы.

[29] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлена кассета экспрессии для обеспечения экспрессии трансгена в клетке печени, где кассета экспрессии содержит трансген, функционально связанный с промотором и энхансером, при этом промотор предусматривает промотор гена транстиретина мыши (mTTR), а энхансер предусматривает один или два модифицированных энхансера гена протромбина (pPrT2), один или два модифицированных энхансера гена альфа-1-микробикунина (mA1MB2), модифицированный энхансер гена альбумина мыши (mEalb), энхансер II вируса гепатита B (HE11) или энхансер CRM8. В некоторых вариантах осуществления промотор mTTR представляет собой промотор mTTR482. В некоторых вариантах осуществления энхансер расположен со стороны 5'-конца относительно промотора mTTR.

[30] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлена кассета экспрессии для обеспечения экспрессии трансгена в клетке печени, где кассета экспрессии содержит трансген, функционально связанный с промотором и 3'-элементом, при этом промотор предусматривает промотор гена транстиретина мыши (mTTR), а 3'-элемент представляет собой 3'-элемент гена альбумина (3'Alb) или 3'-элемент гена альбумина, связанный с участком прикрепления к ядерному скелету/матриксу (SMAR) гена альфа-1-антитрипсина человека (3'AlbSMAR). В некоторых вариантах осуществления промотор mTTR представляет собой промотор mTTR482. В некоторых вариантах осуществления 3'-элемент расположен со стороны 3'-конца относительно трансгена.

[31] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлена кассета экспрессии для обеспечения экспрессии трансгена в клетке печени, где кассета экспрессии содержит трансген, функционально связанный с промотором, и энхансером, и 3'-элементом, при этом промотор предусматривает промотор гена транстиретина мыши (mTTR), а энхансер предусматривает один или два модифицированных энхансера гена протромбина (pPrT2), один или два модифицированных энхансера гена альфа-1-микробикунина (mA1MB2), модифицированный энхансер гена альбумина мыши (mEalb), энхансер II вируса гепатита B (HE11) или энхансер CRM8; и при этом 3'-элемент представляет собой 3'-элемент гена альбумина (3'Alb) или 3'-элемент гена альбумина, связанный с участком прикрепления к ядерному скелету/матриксу (SMAR) гена альфа-1-антитрипсина человека (3'AlbSMAR). В некоторых вариантах осуществления промотор mTTR представляет собой промотор mTTR482. В некоторых вариантах осуществления энхансер расположен со стороны 5'-конца относительно промотора mTTR. В некоторых вариантах осуществления 3'-элемент расположен со стороны 3'-конца относительно трансгена.

[32] В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии дополнительно содержит интрон. В некоторых вариантах осуществления интрон представляет собой гибридный интрон генов β-актина курицы/β-глобина кролика. В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии дополнительно содержит сигнал полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста.

[33] В некоторых вариантах осуществления трансген кодирует полипептид PAH или вариант полипептида PAH. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлен вектор, содержащий кассету экспрессии, описанную в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).

[34] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлен вектор на основе rAAV, содержащий кассету экспрессии, описанную в данном документе, фланкированную одной или несколькими последовательностями инвертированного концевого повтора (ITR) AAV. В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии фланкирована двумя ITR AAV. В некоторых вариантах осуществления ITR AAV представляют собой ITR AAV, предусматривающие ITR серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ,, AAV козы, AAV крупного рогатого скота или AAV мыши. В некоторых вариантах осуществления ITR AAV представляют собой ITR AAV2.

[35] В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой самокомплементарный вектор. В некоторых вариантах осуществления вектор содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PAH, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность, комплементарную последовательности полипептида PAH, где первая последовательность нуклеиновой кислоты может образовывать внутринитевые пары оснований со второй последовательностью нуклеиновой кислоты на протяжении большей части или всей ее длины. В некоторых вариантах осуществления первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая последовательность нуклеиновой кислоты соединены мутантным ITR AAV, где мутантный ITR AAV предусматривает делецию D-области и предусматривает мутацию последовательности концевого разрешения.

[36] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлена частица rAAV, содержащая вектор на основе rAAV, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит капсид серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K,, AAV козы, химерного AAV1/AAV2, AAV крупного рогатого скота, AAV мыши или rAAV2/HBoV1. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица AAV содержит сконструированный капсид AAV. В некоторых вариантах осуществления сконструированный капсид AAV представляет собой капсид DJ или капсид LK03. В некоторых вариантах осуществления ITR и капсид вирусной частицы rAAV получены из одного и того же серотипа AAV. В некоторых вариантах осуществления ITR и капсид вирусных частиц rAAV получены из разных серотипов AAV. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлена композиция, содержащая частицу rAAV, описанную в данном документе. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[37] На фиг. 1A-1C показана оптимизация специфичного для печени промотора. На фиг. 1А показано схематическое изображение превирусных плазмидных конструкций. Конструкция mTTR482 (№ 1) была модифицирована путем добавления различных специфичных для печени энхансерных элементов (конструкции № 2-6) или ассоциированных со стабильностью 3'-элементов (конструкции № 7-8). Для сравнения использовали конструкцию, содержащую промотор CBA. Все конструкции содержали фланкирующие ITR, гибридный интрон и репортерный ген SEAP. Затем конструкциями трансфицировали клетки Huh7 (фиг. 1B) или клетки HepG2 (фиг. 1C). Уровни активности секретируемой SEAP измеряли через 72 часа после трансфекции и нормализовали по уровням b-галактозидазы из котрансфицированной плазмиды LacZ. Каждая оценка предусматривала n=3-4/плазмиды.

[38] На фиг. 2А и 2В показана оценка специфичных для печени промоторов по продуцированию SEAP in vivo. На фиг. 2А показаны уровни SEAP у нормальных мышей C57BL/6. На фиг. 2B показаны уровни SEAP у мышей PAH^enu2. В обоих экспериментах плазмидные векторы доставляли путем инъекции большого объема, и активность SEAP измеряли в плазме крови в различные моменты времени. Каждая группа обработки содержала n=3-6 животных.

[39] На фиг. 3A-3D показано сравнение эффективности специфичного для печени промотора у мышей PAH^enu2. Векторы rAAV8, экспрессирующие mPAH под контролем sc-LP1- или ss-A1MB2-mTTR-промотора (лидерные), вводили самцам мышей PAH^enu2 в количестве 4e10 (L) или 1e11 (M) VG/мышь. На фиг. 3А показаны уровни Phe в крови в течение 56-дневного периода. Уровни представляют собой средние значения для n=8/группа, за исключением наивных животных при n=2. На фиг. 3B показаны уровни Phe в крови в день 56. Показаны уровни Phe в плазме крови у животных, обработанных с помощью двух конструкций, вводимых в количестве 4e10 или 1e11 VG/мышь, или у необработанных животных. На фиг. 3C показаны уровни Tyr в крови. Уровни измеряли до введения вектора (перед введением), а также через 7 и 56 дней после введения вектора. Каждое значение представляет собой среднее значение для n=8/группа. На фиг. 3D показано количество геномов вектора в печени в день 56. Количество копий вектора определяли с помощью qPCR, и показано среднее значение для n=5/группа.

[40] На фиг. 4A-4D показан анализ головного мозга мышей PAH^enu2. Пять животных из необработанной группы, мышей PAH^enu2 из групп обработки конструкцией ss-mA1MB2-mTTR (лидерные) (4e10 и 1e11 vg/мышь) и обработки sc-LP1 (1e11 vg/мышь) умерщвляли через 56 дней после обработки, проводили перфузиию с помощью PBS и извлекали головной мозг каждой мыши для анализа. Мышей Balb/C использовали в качестве контроля дикого типа (WT). На фиг. 4А показаны уровни Phe в головном мозге. На фиг. 4B показана корреляция уровней Phe в крови и головном мозге. На фиг. 4С показаны уровни дофамина в головном мозге. На фиг. 4D показаны уровни серотонина в головном мозге. Все значения представляют собой среднее значение для n=5/группа (за исключением n=2 для необработанных мышей PAH^enu2). Исследование осуществляли, как описано на фиг. 3A-3C.

[41] На фиг. 5А и 5В показана оптимизация кодонов кДНК человеческой PAH. кДНК, кодирующую FLAG-меченную hPAH, встраивали в экспрессионную плазмиду mTTR482-hPAH-BGHpA. Продуцирование hPAH анализировали как in vitro, так и in vivo. На фиг. 5A показаны уровни FLAG-hPAH в клетках Huh7. Проводили трансфекцию плазмидами, и лизаты клеток получали через 48 часов. Уровни белка PAH в клеточных лизатах анализировали с помощью вестерн-блоттинга. На фиг. 5B показаны уровни FLAG-hPAH в печени мышей C57BL/6. Плазмиды вводили с помощью гидродинамических инъекций, и печень собирали через 24 часа. Уровни FLAG-меченного hPAH количественно определяли в лизатах печени с помощью FLAG-ELISA и нормализовали по общему белку. Значения представляют собой среднее значение для n=4-5 животных/группа. Сокращения: C - плазмида отрицательного контроля; GS - Genscript, GA - GeneArt, GS CpG - последовательность Genscript с удаленными CpG; немодифиц. - исходная последовательность ДНК hPAH; наивные - необработанные животные.

[42] На фиг. 6А представлены результаты вестерн-блоттинга, демонстрирующие экспрессию человеческой фенилаланингидроксилазы (hPAH) и мышиной фенилаланингидроксилазы (mPAH) под контролем различных промоторов (mTTR482, CBA и LP1). Экспрессионными плазмидами трансфицировали клетки Huh7, и лизаты клеток анализировали через два дня в отношении уровней FLAG-PAH с использованием антитела к FLAG.

[43] На фиг. 6B представлены результаты вестерн-блоттинга, демонстрирующие сравнение экспрессии полноразмерной (FL) и дважды усеченной (DT) человеческой и мышиной PAH in vitro. Анализ выполнялся, как на фиг. 6А.

[44] Фиг. 6C представляет собой сравнение уровней белков hPAH и mPAH как для полноразмерных (FL), так и для дважды усеченных (DT) форм. Количественное определение FLAG-меченных белков с помощью ELISA проводили в отношении лизатов клеток Huh7 после трансфекции экспрессионными плазмидами.

[45] Фиг. 6D представляет собой сравнение уровней мРНК hPAH и mPAH. Анализ РНК с помощью qPCR проводили в отношении материала, использованного на фиг. 6C.

[46] На фиг. 6E представлены результаты вестерн-блоттинга, демонстрирующие анализ очищенных hPAH и mPAH (обе из которых были получены в виде полноразмерных и дважды усеченных форм). Белки очищали на FLAG-аффинной колонке и прогоняли через гель для SDS-PAGE с последующим обнаружением с помощью антитела к FLAG.

[47] На фиг. 6F показана эффективность векторов на основе rAAV8, кодирующих hPAH или mPAH, в мышиной модели PKU. Как hPAH, так и mPAH экспрессировались из самокомплементарных векторов с промотором LP1 (sc-LP1). Эффективность измеряли как снижение уровней Phe в крови после однократной в/в инъекции мышам PAH^enu2.

[48] На фиг. 7A-7C показано получение конструкций на основе мышиной/человеческой гибридной PAH. На фиг. 7А показано схематическое изображение конструкций на основе мышиной/человеческой гибридной PAH. Обозначены области, происходящие из человеческой (зеленый цвет) и мышиной (серый свет) PAH. На фиг. 7B показан эффект замены N-концевой области hPAH в отношении уровней экспрессии белка. На фиг. 7C показан эффект изменений в C-концевой области hPAH в отношении уровней экспрессии белка. Эксперименты проводили путем трансфекции клеток 293T плазмидами с кассетами экспрессии CBA-PAH. Через 48 часов клетки собирали для количественного определения FLAG-PAH с помощью FLAG ELISA.

[49] На фиг. 8A и 8B показан скрининг вариантов hPAH с двойным усечением (hPAH-DT) in vitro. На фиг. 8А показаны уровни экспрессии белка для вариантов белка hPAH, экспрессируемых плазмидой (№1-№8). На фиг. 8B показаны уровни активности PAH для вариантов белка hPAH, экспрессируемых плазмидой. Клетки 293 трансфицировали всеми вариантами, а их экспрессия осуществлялась из плазмиды с промотором CBA. Представлено сравнение результатов для плазмид с вариантами с результатами для аналогичных плазмид, экспрессирующих человеческую или мышиную PAH.

[50] На фиг. 9A-9C показаны характеристики производных hPAH-V1-DT в отношении продуцирования PAH in vitro. На фиг. 9A показаны уровни активности PAH для производных hPAH-V1-DT. На фиг. 9B показаны уровни белка PAH для производных hPAH-V1-DT. На фиг. 9C показана специфическая активность PAH для производных hPAH-V1-DT. Результаты основаны на анализе клеточных лизатов трансфицированных клеток 293.

[51] На фиг. 10A-10C показан повторный анализ производных hPAH-V1-DT в отношении продуцирования PAH in vitro. На фиг. 10A показаны уровни активности PAH для выбранных производных hPAH-V1-DT. На фиг. 10B показаны уровни белка PAH для производных hPAH-V1-DT. На фиг. 10C показана специфическая активность PAH для производных hPAH-V1-DT. Данные были получены, как описано на фиг. 8A и 8B. На фиг. 10D показана активность PAH для трех версий варианта-1 с двойной мутацией. Данные были получены, как описано на фиг. 8A и 8B.

[52] На фиг. 11A-11C показано сравнение in vitro полноразмерной hPAH-V1 с мышиной PAH (mPAH) и человеческой PAH (hPAH). Фиг. 11А представляет собой вестерн-блот-анализ экспрессии белка. На фиг. 11B показаны уровни белка PAH согласно результатам FLAG-ELISA. На фиг. 11C показаны уровни активности PAH. Данные были получены путем трансфекции Huh7 экспрессионными плазмидами, характеризующимися специфичным для печени промотором A1MB2-mTTR482 и кодирующими полноразмерные белки PAH, с последующим анализом клеточных лизатов. M обозначает маркерную полосу.

[53] На фиг. 12A-12C показано сравнение эффективности векторов на основе rAAV, экспрессирующих полноразмерную hPAH-V1, с таковой для мышиной и человеческой PAH у мышей PAH^enu2. На фиг. 12A показаны уровни фенилаланина в крови. На фиг. 12B показаны уровни тирозина в крови. На фиг. 12C показаны уровни метаболитов фенилаланина в крови. P-значения обозначены следующим образом: * предусматривает P < 0,05), ** предусматривает P < 0,01, *** предусматривает P < 0,001. Все группы обработки предусматривали обработку вектором на основе AAV8, экспрессирующим FLAG-меченную PAH под контролем специфичного для печени промотора. Векторы вводили путем в/в введения в дозе 3e11 (hPAH, hPAH-V1 и mPAH) или 1e12 (hPAH и hPAH-V1) vg/мышь в день 0. Наивных мышей PAH^enu2 и гетерозиготных мышей (HET) использовали в качестве отрицательного и положительного контролей соответственно.

[54] На фиг. 13A-13C показано количественное определение геномов вектора на основе rAAV и уровней 3x-FLAG-PAH в печени. На фиг. 13A показаны уровни белка PAH. На фиг. 13B показаны уровни активности PAH. На фиг. 13С показано количество копий генома вектора в печени. Эксперимент проводили, как описано на фиг. 12A-12C, и печень собирали через 69 дней после введения вектора. На каждой панели показаны данные для групп обработки 3e11 VG/мышь (hPAH, hPAH-V1 и mPAH) и групп обработки 1e12 vg/мышь (hPAH, hPAH-V1). P-значение, обозначенное с помощью ***, предусматривает P < 0,001.

[55] На фиг. 14A-14D показано количественное определение уровней различных аминокислот в головном мозге. На фиг. 14A показаны уровни фенилаланина в головном мозге. На фиг. 14B показаны уровни тирозина в головном мозге. На фиг. 14C показана корреляция между уровнями фенилаланина в крови и головном мозге. На фиг. 14D показаны уровни триптофана в головном мозге. Эксперимент проводили, как описано на фиг. 12A-12C. Показанные данные представлены для групп обработки, получавших дозу 3e11 VG/мышь (n=5/группа) (день 69). P-значение, обозначенное с помощью ***, предусматривает P < 0,001.

[56] На фиг. 15A-15D показаны уровни нейротрансмиттеров в головном мозге. На фиг. 15A показаны уровни дофамина в головном мозге. На фиг. 15B показаны уровни DOPAC, являющейся метаболитом дофамина, в головном мозге. На фиг. 15C показаны уровни серотонина в головном мозге. На фиг. 15D показаны уровни HIAA, являющейся метаболитом серотонина, в головном мозге. Эксперимент проводили, как описано на фиг. 12A-12C, а значения представлены для когорт, получавших 3e11 VG/мышь (день 69). P-значение обозначено следующим образом: ** предусматривает P < 0,01, а *** предусматривает P < 0,001.

[57] На фиг. 16A-16B показано сравнение геномов вектора A1MB2-mTTR-hPAV-V1 размером 3,8 и 4,6 т. о. в отношении эффективности. На фиг. 16A показано схематическое изображение векторов. На фиг. 16B показано тестирование эффективности у мышей PAH^enu2. Векторы на основе AAV8, экспрессирующие hPAH-V1 под контролем специфичного для печени промотора (лидерные), вводили один раз в количестве 1e11 vg/мышь, и эффективность измеряли по уровням Phe в крови. Эти векторы также сравнивали с векторами размером 4,6 т. о. с hPAH-V1 без N-концевой метки (тестировали при количествах 1e11 и 3e11 vg/мышь).

[58] На фиг. 17A-17C показано сравнение in vivo продуцирования hPAH-V1 и hPAH в печени приматов, отличных от человека, после доставки с помощью векторов на основе rAAV. На фиг. 17А показаны уровни содержания геномов вектора на основе rAAV в печени каждого отдельного животного. На фиг. 17B показаны уровни мРНК, полученной из вектора, в печени и селезенке каждого обработанного животного. Уровни мРНК нормализовали по копиям генома вектора у каждого животного. На фиг. 17С показано обнаружение FLAG-меченного белка PAH в гомогенатах печени. Равную загрузку лизата подтверждали с помощью обнаружения белка "домашнего хозяйства" GAPDH. Эксперимент проводили путем в/в введения 5e12 vg/кг векторов на основе rAAV, экспрессирующих FLAG-меченную PAH или PAH-V1 под контролем промотора A1MB2-mTTR. Образцы ткани собирали через 2 недели для анализа геномов вектора, мРНК, полученной из вектора, и белка PAH в печени.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[59] В некоторых аспектах в настоящем изобретении, описанном в данном документе, представлен вариант полипептида человеческой PAH (hPAH-V1), предусматривающий по меньшей мере две-четыре аминокислотные замены, которые обеспечивают более высокие уровни содержания и/или активности белка PAH in vitro и in vivo по сравнению с hPAH дикого типа. В других аспектах в настоящем изобретении, описанном в данном документе, представлен улучшенный вариант человеческой PAH (hPAH-V1), предусматривающий по меньшей мере две, три или четыре аминокислотные замены, которые обеспечивают более высокие уровни содержания и/или активности белка PAH in vitro и in vivo по сравнению с hPAH дикого типа. В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлена нуклеиновая кислота, кодирующая указанные варианты человеческой PAH. В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлены кассеты экспрессии, векторы на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) и вирусные частицы, а также фармацевтические композиции, предусматривающие вариант полипептида PAH по настоящему изобретению. В дополнительных аспектах в настоящем изобретении представлены способы лечения фенилкетонурии (PKU); например, посредством увеличения активности PAH, увеличения транспорта тирозина и триптофана в головной мозг и нормализации уровней нейромедиаторов головного мозга, включая дофамин и серотонин. В других дополнительных аспектах в настоящем изобретении представлены наборы для лечения PKU у индивидуума с помощью варианта PAH по настоящему изобретению.

I. Общие методики

[60] Методики и процедуры, описанные или упоминаемые в данном документе, как правило, хорошо известны и часто используются специалистами в данной области техники с использованием традиционной методологии, как например широко используемые методики, описанные в Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 4^th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2012); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., 2003); серии Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds., 1995); Antibodies, A Laboratory Manual (Harlow and Lane, eds., 1988); Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (R.I. Freshney, 6^th ed., J. Wiley and Sons, 2010); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., Academic Press, 1998); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, Plenum Press, 1998); Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., J. Wiley and Sons, 1993-8); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1996); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., J. Wiley and Sons, 2002); Immunobiology (C.A. Janeway et al., 2004); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995) и Cancer: Principles and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 2011).

II. Определения

[61] Термин "вектор", используемый в данном документе, относится к рекомбинантной плазмиде или вирусу, которые содержат нуклеиновую кислоту, подлежащую доставке в клетку-хозяина либо in vitro, либо in vivo.

[62] Термины "полинуклеотид" или "нуклеиновая кислота", используемые в данном документе, относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, предусматривающей либо рибонуклеотиды, либо дезоксирибонуклеотиды. Таким образом, данный термин включает без ограничения одно-, двух- или многонитевые ДНК или РНК, геномную ДНК, cDNA, гибриды ДНК-РНК или полимер, содержащий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически или биохимически модифицированные, неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания. Остов полинуклеотида может содержать сахара и фосфатные группы (которые обычно могут обнаруживаться в РНК или ДНК) или модифицированные либо замещенные сахарные или фосфатные группы. Как альтернатива, остов полинуклеотида может предусматривать полимер из синтетических субъединиц, таких как фосфорамидаты, и таким образом может представлять собой олигодезоксинуклеозидный фосфорамидат (P-NH₂) или смешанный олигомер фосфорамидата-сложного фосфодиэфира. Кроме того, двухнитевой полинуклеотид можно получить из однонитевого полинуклеотидного продукта химического синтеза либо путем синтеза комплементарной нити и гибридизации нитей в соответствующих условиях, либо путем синтеза комплементарной нити de novo с использованием ДНК-полимеразы с соответствующим праймером.

[63] Термины "полипептид" и "белок" используются взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков и не ограничены минимальной длиной. Такие полимеры из аминокислотных остатков могут содержать природные или неприродные аминокислотные остатки и включают без ограничения пептиды, олигопептиды, димеры, тримеры и мультимеры из аминокислотных остатков. Данным определением охватываются как полноразмерные белки, так и их фрагменты. Термины включают также постэкспрессионные модификации полипептида, например, гликозилирование, сиалирование, ацетилирование, фосфорилирование и т. п. Кроме того, для целей настоящего изобретения термин "полипептид" относится к белку, который содержит модификации, такие как делеции, добавления и замены (обычно консервативные по своей природе), в нативной последовательности, при условии, что белок сохраняет требуемую активность. Эти модификации могут быть преднамеренными, как например полученными с помощью сайт-направленного мутагенеза, или могут быть случайными, как например возникшими вследствие мутаций у хозяев, которые продуцируют белки, или ошибок, обусловленных ПЦР-амплификацией.

[64] Термин "рекомбинантный вирусный вектор" относится к рекомбинантному полинуклеотидному вектору, содержащему одну или несколько гетерологичных последовательностей (т. е. последовательность нуклеиновой кислоты, не происходящую от вируса). В случае векторов на основе рекомбинантного AAV рекомбинантную нуклеиновую кислоту фланкируют с помощью по меньшей мере одной, а в некоторых вариантах осуществления двух последовательностей инвертированных концевых повторов (ITR).

[65] "Вектор на основе рекомбинантного AAV (вектор на основе rAAV)" относится к полинуклеотидному вектору, содержащему одну или несколько гетерологичных последовательностей (т. е. последовательность нуклеиновой кислоты, не происходящую из AAV), которые фланкированы по меньшей мере одной, а в определенных вариантах осуществления двумя последовательностями инвертированных концевых повторов (ITR) AAV. Такие векторы на основе rAAV могут реплицироваться и упаковываться в инфекционные вирусные частицы, когда они находятся в клетке-хозяине, которая была инфицирована подходящим вирусом-помощником (или которая экспрессирует подходящие хелперные функциональные элементы) и которая экспрессирует продукты генов rep и cap AAV (т. е. белки Rep и Cap AAV). Если вектор на основе rAAV встроен в более крупный полинуклеотид (например, в хромосому или в другой вектор, такой как плазмида, применяемая для клонирования или трансфекции), то вектор на основе rAAV можно обозначить как "провектор", который может быть "восстановлен" посредством репликации и заключения в капсид в присутствии упаковывающих функциональных элементов и подходящих функциональных элементов помощника AAV. Вектор на основе rAAV может находиться в любой из множества форм, включая без ограничения плазмиды, линейные искусственные хромосомы, образующие комплексы с липидами, инкапсулированные в липосомах и заключенные в капсид вирусной частицы, в частности частицы AAV. Вектор на основе rAAV может быть упакован в капсид вируса AAV с получением "частицы рекомбинантного аденоассоциированного вируса (частица rAAV)".

[66] "Гетерологичный" означает полученный из объекта, генотипически отличающегося от остальной части объекта, с которым его сравнивают или в который его вводят или встраивают. Например, полинуклеотид, введенный посредством методик генетической инженерии в клетку другого типа, является гетерологичным полинуклеотидом (и при экспрессии может кодировать гетерологичный полипептид). Подобным образом, последовательность, характерная для клетки (например, ген или его часть), встроенная в вирусный вектор, является гетерологичной нуклеотидной последовательностью по отношению к вектору.

[67] Термин "трансген" относится к полинуклеотиду, вводимому в клетку и способному к транскрипции в РНК и необязательно к трансляции и/или экспрессии в соответствующих условиях. В некоторых аспектах он придает требуемое свойство клетке, в которую он был введен, или иным образом приводит к требуемому терапевтическому или диагностическому эффекту.

[68] "Промотор гена β-актина курицы (CBA)" относится к полинуклеотидной последовательности, полученной из гена β-актина курицы (например, бета-актина Gallus gallus, представленного геном с ID 396526 в GenBank Entrez). Применяемый в данном документе термин "промотор гена β-актина курицы" может относиться к промотору, содержащему ранний энхансерный элемент цитомегаловируса (CMV), промотор и первый экзон и интрон гена β-актина курицы и акцепторный сайт сплайсинга гена бета-глобина кролика, как например последовательности, описанные в Miyazaki, J. et al. (1989) Gene 79(2):269-77. Применяемый в данном документе термин "промотор CAG" может применяться взаимозаменяемо. Применяемый в данном документе термин "ранний энхансер CMV/промотор гена бета-актина курицы (CAG)" может использоваться взаимозаменяемо.

[69] Термины "геномные частицы (gp)", "геномные эквиваленты" или "копии генома", используемые в отношении вирусного титра, относятся к числу вирионов, содержащих ДНК-геном рекомбинантного AAV, вне зависимости от инфекционности или функциональности. Число геномных частиц в конкретном препарате на основе векторов можно измерять с помощью процедур, таких как описанные в примерах в данном документе или, например, в Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039; Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278.

[70] Применяемый в данном документе термин "геном вектора (vg)" может относиться к одному или нескольким полинуклеотидам, содержащим набор полинуклеотидных последовательностей вектора, например вирусного вектора. Геном вектора может быть заключен в капсид вирусной частицы. В зависимости от конкретного вирусного вектора, геном вектора может содержать однонитевую ДНК, двухнитевую ДНК, или однонитевую РНК, или двухнитевую РНК. Геном вектора может содержать эндогенные последовательности, ассоциированные с конкретным вирусным вектором, и/или любые гетерологичные последовательности, встроенные в конкретный вирусный вектор посредством рекомбинантных методик. Например, геном вектора на основе рекомбинантного AAV может содержать по меньшей мере одну последовательность ITR, фланкирующую промотор, спейсерный фрагмент, последовательность, представляющую интерес (например, средства для RNAi), и последовательность полиаденилирования. Полный геном вектора может содержать полную совокупность полинуклеотидных последовательностей вектора. В некоторых вариантах осуществления титр нуклеиновых кислот вирусного вектора можно измерять в единицах vg/мл. Способы, подходящие для измерения данного титра, известны из уровня техники (например, количественная ПЦР).

[71] Термины "инфекционная единица (iu)", "инфекционная частица" или "единица репликации", используемые в отношении вирусного титра, относятся к числу инфекционных и репликационно компетентных частиц, представляющих собой вектор на основе рекомбинантного AAV, как измерено с помощью анализа инфекционных центров, также известного как анализ центров репликации, описанного например в McLaughlin et al. (1988) J. Virol., 62:1963-1973.

[72] Термин "трансдуцирующая единица (tu)", используемый в отношении вирусного титра, относится к числу инфекционных частиц, представляющих собой вектор на основе рекомбинантного AAV, которые приводят к получению функционального трансгенного продукта, измеряемому в функциональных анализах, таких как описанные в примерах в данном документе или, например, в Xiao et al. (1997) Exp. Neurobiol., 144:113-124 или в Fisher et al. (1996) J. Virol., 70:520-532 (анализ LFU).

[73] Последовательность "инвертированных концевых повторов" или "ITR" является термином, хорошо известным в уровне техники, и относится к относительно коротким последовательностям, встречающимся на концах вирусных геномов, которые имеют противоположную ориентацию.

[74] Хорошо известный из уровня техники термин последовательность "инвертированного концевого повтора (ITR) AAV" обозначает последовательность из примерно 145 нуклеотидов, которая присутствует на обоих концах нативного однонитевого генома AAV. Крайние 125 нуклеотидов ITR могут присутствовать в любой из двух альтернативных ориентаций, что обуславливает гетерогенность между различными геномами AAV и между двумя концами одного генома AAV. Крайние 125 нуклеотидов также содержат несколько более коротких областей самокомплементарности (обозначаемых как A-, A'-, B-, B'-, C-, C'- и D-области), которые обеспечивают возможность образования внутринитевого спаривания оснований в пределах данной части ITR.

[75] "Последовательность концевого разрешения" или "trs" представляет собой последовательность в D-области ITR AAV, которая отщепляется белками rep AAV в ходе репликации вирусной ДНК. Мутантная последовательность концевого разрешения устойчива к отщеплению белками rep AAV.

[76] "Хелперные функциональные элементы AAV" относятся к функциональным элементам, которые обеспечивают возможность репликации и упаковки AAV в клетке-хозяине. Хелперные функциональные элементы AAV могут быть представлены любой из множества форм, в том числе без ограничения вирусом-помощником или генами вируса-помощника, которые способствуют репликации и упаковке AAV. Из уровня техники известны другие функциональные элементы помощника AAV, такие как генотоксичные средства.

[77] Термин "вирус-помощник" для AAV относится к вирусу, который обеспечивает возможность репликации и упаковки AAV (который является дефектным парвовирусом) в клетке-хозяине. Вирус-помощник обеспечивает "хелперные функциональные элементы", которые обеспечивают возможность репликации AAV. Было идентифицировано множество таких вирусов-помощников, в том числе аденовирусы, герпесвирусы и поксвирусы, такие как вирус осповакцины и бакуловирус. Аденовирусы охватывают множество различных подгрупп, однако наиболее широко применяется аденовирус 5 типа подгруппы C (Ad5). Многочисленные аденовирусы человека, млекопитающих, отличных от человека, и птиц, известны и доступны из депозитариев, таких как ATCC. Вирусы семейства герпесвирусов, которые также доступны из депозитариев, таких как ATCC, включают, например, вирусы простого герпеса (HSV), вирусы Эпштейна-Барр (EBV), цитомегаловирусы (CMV) и вирусы псевдобешенства (PRV). Примеры аденовирусных хелперных функциональных элементов для репликации AAV включают функциональные элементы E1A, функциональные элементы E1B, функциональные элементы E2A, функциональные элементы VA и функциональные элементы E4orf6. Бакуловирусы, доступные из депозитариев, включают вирус ядерного полиэдроза Autographa californica.

[78] Считается, что препарат на основе rAAV "по существу не содержит" вируса-помощника, если соотношение инфекционных частиц AAV и инфекционных частиц вируса-помощника составляет по меньшей мере приблизительно 10²:1; по меньшей мере приблизительно 10⁴:1, по меньшей мере приблизительно 10⁶:1 или по меньшей мере приблизительно 10⁸:1 или больше. В некоторых вариантах осуществления препараты также не содержат эквивалентных количеств белков вируса-помощника (т. е. белков, которые присутствовали бы в результате такого уровня вируса-помощника, если бы вышеуказанные частицы вируса-помощника, представляющие собой инородные включения, присутствовали в разрушенной форме). Контаминацию вирусными и/или клеточными белками можно в целом наблюдать по наличию окрашенных Кумасси полос на гелях SDS (например, появлению полос, отличных от соответствующих капсидным белкам AAV VP1, VP2 и VP3).

[79] Термин "процентная (%) идентичность последовательностей" относительно эталонной полипептидной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты определяется как процентная доля аминокислотных остатков или нуклеотидов в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам или нуклеотидам в эталонной полипептидной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты после выравнивания последовательностей и, при необходимости, введения гэпов для достижения максимальной процентной идентичности последовательностей, и не учитывая любые консервативные замены как часть идентичности последовательностей. Выравнивание для целей определения процентной идентичности аминокислотных последовательностей или последовательностей нуклеиновых кислот может быть достигнуто различными способами, которые находятся в пределах компетенции специалиста в данной области техники, например с помощью общедоступных компьютерных программ, например описанных в Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Supp. 30, раздел 7.7.18, таблица 7.7.1, и в том числе программного обеспечения BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Предпочтительной программой выравнивания является ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Пенсильвания). Специалисты в данной области техники способны определить соответствующие параметры для оценки выравнивания, в том числе любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по полной длине сравниваемых последовательностей. Для целей данного документа % идентичность аминокислотной последовательности, которой характеризуется конкретная аминокислотная последовательность А по отношению к, с или в сравнении с конкретной аминокислотной последовательностью В (что в качестве альтернативы можно перефразировать как конкретная аминокислотная последовательность A, которая характеризуется или обладает определенной % идентичностью аминокислотной последовательности по отношению к, с или в сравнении с конкретной аминокислотной последовательностью), рассчитывается следующим образом: 100 умножить на частное от X/Y, где X представляет собой число аминокислотных остатков, учитываемых в качестве идентичных совпадений программой для выравнивания последовательностей при осуществлении данной программой выравнивания A и B, и где Y представляет собой общее число аминокислотных остатков в B. Следует принимать во внимание, что если длина аминокислотной последовательности A не равна длине аминокислотной последовательности B, то % идентичность аминокислотной последовательности A по отношению к B не будет равна % идентичности аминокислотной последовательности B по отношению к A. Для целей данного документа % идентичность последовательности нуклеиновой кислоты, которой характеризуется конкретная последовательность нуклеиновой кислоты C по отношению к, с или в сравнении с конкретной последовательностью нуклеиновой кислоты D (что в качестве альтернативы можно перефразировать как данная последовательность нуклеиновой кислоты C, которая характеризуется или обладает определенной % идентичностью последовательности нуклеиновой кислоты по отношению к, с или в сравнении с конкретной последовательностью нуклеиновой кислоты D), рассчитывается следующим образом: 100 умножить на частное от W/Z, где W представляет собой число нуклеотидов, учитываемых в качестве идентичных совпадений программой для выравнивания последовательностей при осуществлении данной программой выравнивания C и D, и где Z представляет собой общее число нуклеотидов в D. Следует принимать во внимание, что если длина последовательности нуклеиновой кислоты C не равна длине последовательности нуклеиновой кислоты D, то % идентичность последовательности нуклеиновой кислоты C по отношению к D не будет равна % идентичности последовательности нуклеиновой кислоты D по отношению к C.

[80] Термин "выделенная" молекула (например, нуклеиновая кислота или белок) или клетка означает, что она была идентифицирована и отделена и/или извлечена из компонента своего природного окружения.

[81] Термин "эффективное количество" представляет собой количество, достаточное для достижения благоприятных или требуемых результатов, в том числе клинических результатов (например, уменьшения интенсивности симптомов, достижения клинических конечных точек и т. п.). Эффективное количество можно вводить за одно или несколько введений. Применительно к болезненному состоянию, эффективным количеством является количество, достаточное для уменьшения интенсивности, стабилизации или задержки развития заболевания.

[82] "Индивидуум" или "субъект" представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают без ограничения одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и отличных от человека приматов, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых вариантах осуществления индивидуум или субъект является человеком.

[83] Применяемый в данном документе термин "лечение" представляет собой подход для получения благоприятных или требуемых клинических результатов. Для целей настоящего изобретения благоприятные или требуемые клинические результаты включают без ограничения облегчение симптомов, уменьшение степени тяжести заболевания, стабилизацию (например, отсутствие ухудшения) болезненного состояния, предупреждение распространения (например, метастазирования) заболевания, задержку или замедление прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности или временное ослабление проявлений болезненного состояния и ремиссию (как частичную, так и полную), как выявляемые, так и невыявляемые. Термин "лечение" может означать также продление выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемостью в случае неполучения лечения.

[84] Применяемый в данном документе термин "профилактическое лечение" относится к лечению, при котором у индивидуума известно или подозревается наличие или имеется риск наличия нарушения, однако не проявляются симптомы или проявляются минимальные симптомы нарушения. Индивидуума, подвергаемого профилактическому лечению, можно подвергать лечению до начала проявления симптомов.

[85] Используемый в данном документе термин "фенилаланингидроксилаза (PAH)" представляет собой фермент (EC 1.14.16.1), который катализирует гидроксилирование ароматической боковой цепи фенилаланина с образованием тирозина. PAH представляет собой монооксигеназу, которая использует тетрагидробиоптерин (BH4, птеридиновый кофактор) и негемовое железо для катализа. В ходе реакции молекулярный кислород гетеролитически расщепляется с последовательным включением одного атома кислорода в BH4 и субстрат, представляющий собой фенилаланин. Гидроксилирование фенилаланина до тирозина является лимитирующей стадией скорости катаболизма фенилаланина, и дефицит активности этого фермента приводит к аутосомно-рецессивному нарушению, представляющему собой фенилкетонурию. PAH также может обозначаться как PH, PKU или PKU1. PAH представляет собой многодоменный белок, состоящий из N-концевого регуляторного (1-117), центрального каталитического (118-410) и C-концевого тетрамеризационного (411-452) доменов. Человеческая PAH представлена в GenBank; например, NM_000277, NM_00877, NM_001354304, NP_000268, NP_032803, NP_001341233, AAA60082.1, AAH26251.1, AAC51772.1 и AAL78816.1 (GI: 18765885). Пример человеческой PAH представлен под SEQ ID NO:1.

[86] Используемое в данном документе выражение "фенилкетонурия (PKU)" относится к генетически обусловленному дефициту печеночного фермента фенилаланингидроксилазы (PAH). В отсутствие какого-либо лечения тяжелая форма PKU приводит к крайне повышенным уровням Phe в крови, что оказывает нейротоксическое действие и ассоциировано с тяжелой умственной отсталостью.

[87] "Промотор mTTR" относится к полинуклеотидной последовательности, полученной из гена транстиретина мыши. Пример промотора mTTR, представляющего собой mTTR482, приведен у Kyostio-Moore (2016) и Nambiar (2017).

[88] "Модифицированный энхансер гена протромбина (mPrT2)" относится к двум копиям полинуклеотидной последовательности, полученной из гена протромбина человека. Пример энхансера mPrT2 приведен у (McEachern 2006, Jacobs 2008). Пример последовательности mPrT2 представлен под SEQ ID NO:7.

[89] "Модифицированный альфа-1-микробикунин (mA1MB2)" относится к двум копиям полинуклеотидной последовательности, полученной из гена альфа-1-микроглобулина/бикунина человека. Пример mA1MB2 представляет собой энхансер, приведенный у (McEachern 2006, Jacobs 2008). Пример последовательности mA1MB2 представлен под SEQ ID NO:8.

[90] "Модифицированный энхансер гена альбумина мыши (mEalb)" относится к полинуклеотидной последовательности, полученной из гена альбумина мыши. Пример энхансера mEalb приведен у (Kramer 2003). Пример последовательности mEalb представлен под SEQ ID NO:9.

[91] "Энхансер II вируса гепатита B (HE11)" относится к полинуклеотидной последовательности, полученной из вируса гепатита B, расположенной выше местоположения промотора PreCore. Пример энхансера hEII приведен у (Kramer 2003). Пример последовательности hEII представлен под SEQ ID NO:10.

[92] "CRM8" относится к действующему в цис-положении регуляторному модулю, полученному из полинуклеотидной последовательности гена Serpina1 человека (Chuah 2014). Пример последовательности CRM8 представлен под SEQ ID NO:11.

[93] "Alb 3'" относится к полинуклеотидной последовательности, расположенной со стороны 3'-конца относительно кодирующей области гена альбумина человека. Пример Alb 3'-элемента приведен у Wooddell (2008). Пример последовательности Alb 3' представлен под SEQ ID NO:12. "Alb3'/SMAR" относится к Alb3', связанному с участком прикрепления к ядерному скелету/матриксу гена альфа-1-антитрипсина человека (AF156542). Пример последовательности Alb3'/SMAR представлен под SEQ ID NO:13.

[94] Ссылка на термин "приблизительно" в отношении значения или параметра в данном документе включает (и описывает) варианты осуществления, которые направлены на данное значение или параметр per se. Например, описание, относящееся к "приблизительно X", включает описание "X".

[95] Формы единственного числа, используемые в данном документе, включают ссылки на множественное число, если не указано иное.

[96] Понятно, что аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения, описанные в данном документе, включают "содержащие", "состоящие из" и/или "состоящие по сути из" аспекты и варианты осуществления.

III. Варианты PAH

[97] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлены варианты полипептидов PAH, которые при экспрессии у индивидуума обеспечивают более высокие уровни экспрессии и/или активности PAH. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает по меньшей мере две аминокислотные замены, где аминокислотные замены находятся в сайтах полипептида человеческой PAH дикого типа, выбранных из M180, K199, S250, S251, H264, G256, G272, G275, P279, T323 и F327. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает по меньшей мере две аминокислотные замены в сайтах H264 и G275. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает по меньшей мере три аминокислотные замены, где аминокислотные замены находятся в сайтах полипептида человеческой PAH дикого типа, выбранных из M180, K199, S250 и G256. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает четыре аминокислотные замены в сайтах M180, K199, S250 и G256 полипептида человеческой PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает пять аминокислотных замен в сайтах M180, K199, S250, S251, G256, G272 и P279. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает шесть аминокислотных замен в сайтах M180, K199, S250, G256, T323 и F327. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает по меньшей мере две аминокислотные замены H264P и G275H. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает по меньшей мере три аминокислотные замены, выбранные из M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает аминокислотную замену, предусматривающую K199P, S250P и G256A; M180T, S250P и G256A; M180T, K199P и G256A или M180T, K199P и S250P. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH дополнительно предусматривает аминокислотные замены H264P, G272A, G272P, P275L, P279Q, G272P и P275L или аминокислотные замены T323R и F327T. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH представляет собой любой из вариантов полипептидов PAH, представленных в таблицах 1-3. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает аминокислотные замены M180T, K199P, S250P и G256A, а также предусматривает дополнительные аминокислотные замены при сохранении по меньшей мере приблизительного уровня фенилаланингидроксилазной активности PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления положение аминокислотных замен основано на полипептиде человеческой PAH дикого типа; например на полипептиде человеческой PAH, содержащем аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1.

[98] В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH представляет собой полипептид человеческой PAH. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH содержит аминокислотные последовательности, которые являются идентичными на любую из величин, составляющих по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99%, аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотные последовательности, которые являются идентичными на любую из величин, составляющих по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99%, аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:3, характеризуется уровнем фенилаланингидроксилазной активности, составляющим по меньшей мере приблизительно 25%, 50%, 75%, 100% или более чем 100% от ее уровня для PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотные последовательности, которые являются идентичными на любую из величин, составляющих по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99%, аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:3, характеризуется уровнем фенилаланингидроксилазной активности, составляющим по меньшей мере приблизительно 25%, 50%, 75%, 100% или более чем 100% от ее уровня для PAH дикого типа под SEQ ID NO:1.

[99] В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH представляет собой усеченный полипептид PAH, который сохраняет фенилаланингидроксилазную активность. В некоторых вариантах осуществления усеченный полипептид PAH предусматривает N-концевое усечение. В некоторых вариантах осуществления N-концевое усечение представляет собой усечение части или всего N-концевого регуляторного домена. В некоторых вариантах осуществления N-концевое усечение представляет собой делецию участка от аминокислотного остатка 1 до приблизительно аминокислотного остатка 102 в полипептиде человеческой PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления усеченный полипептид PAH предусматривает C-концевое усечение. В некоторых вариантах осуществления C-концевое усечение представляет собой усечение части или всего тетрамеризационного домена. В некоторых вариантах осуществления C-концевое усечение представляет собой делецию участка аминокислотных остатков от приблизительно 429 до 452 в полипептиде человеческой PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает N-концевое усечение и C-концевое усечение. В некоторых вариантах осуществления усеченный полипептид PAH предусматривает усечение части или всей N-концевой регуляторной последовательности и части или всего тетрамеризационного домена. В некоторых вариантах осуществления усеченный полипептид PAH предусматривает делецию участка от аминокислотного остатка 1 до приблизительно аминокислотного остатка 102 и от приблизительно 429 до приблизительно 452 в полипептиде человеческой PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH содержит аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам от приблизительно 102 до приблизительно 428 в полипептиде PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH содержит аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам от 102 до 428 в полипептиде PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления усеченный полипептид PAH дополнительно предусматривает четыре аминокислотные замены в сайтах M180, K199, S250 и G256 полипептида человеческой PAH дикого типа (например, полипептида PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления усеченный полипептид PAH предусматривает четыре аминокислотные замены, выбранные из M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления усеченный вариант полипептида PAH дополнительно предусматривает любую из комбинаций аминокислотных замен, представленных в таблицах 1-3. В некоторых вариантах осуществления усеченный полипептид PAH характеризуется уровнем фенилаланингидроксилазной активности, составляющим по меньшей мере приблизительно 25%, 50%, 75%, 100% или более чем 100% от ее уровня для PAH дикого типа (например, полипептида PAH под SEQ ID NO:1).

[100] В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает одну или несколько аминокислотных замен в одном или нескольких из следующих сайтов: G33, G46, G103, G139, G148, G188, G218, G239, G247, G257, G272, G289, G307, G312, G332, G337, G344, G352, или G442. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает одну из следующих аминокислотных замен: G33A, G46(A, P), G103A, G139(A, P), G148A, G188A, G218A, G239A, G247A, G257A, G272A, G289A, G307A, G312A, G332A, G337A, G344A, G352A, или G442A. В некоторых вариантах осуществления вариант № 1 полипептида PAH дополнительно предусматривает одну или несколько аминокислотных замен в одном или нескольких из следующих сайтов: G33, G46, G103, G139, G148, G188, G218, G239, G247, G257, G272, G289, G307, G312, G332, G337, G344, G352, или G442. В некоторых вариантах осуществления вариант № 1 полипептида PAH предусматривает одну или несколько из следующих аминокислотных замен: G33A, G46(A, P), G103A, G139(A, P), G148A, G188A, G218A, G239A, G247A, G257A, G272A, G289A, G307A, G312A, G332A, G337A, G344A, G352A, или G442A.

[101] В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH (например, вариант № 1 полипептида PAH) предусматривает одну или несколько из следующих аминокислотных замен: P9G, G10V, G12S, K184R, K192R, S196A, Y206H, H220R, Q336E, E360D, I374C, N376E, N401T, I421V, I441V, S446H. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH (например, вариант № 1) дополнительно содержит остаток серина (Ser453) на С-конце человеческой PAH.

[102] В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH (например, вариант № 1 полипептида PAH) предусматривает одну или несколько из следующих аминокислотных замен: F240W, A246P, G247A, Y268W, C284F, T323R, F327Y, E319P, I306(Y, F), K113P, G188A, F191Y, T193R, Y206H, G337P, N376P.

[103] В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH (например, вариант № 1 полипептида PAH) предусматривает любые аминокислотные замены для устранения потенциальных сайтов расщепления протеазой. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные замены для устранения потенциальных сайтов расщепления протеазой находятся в пределах фрагментов PAH 270-295 и 380-405.

[104] В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH (например, вариант № 1 полипептида PAH) содержит посттрансляционные модификации для повышения стабильности человеческой PAH. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH содержит посттрансляционную модификацию, как например пегилирование и варианты нитрозилирования остатков Cys, в частности I374C, с помощью внешних нитрозилирующих средств.

III. Нуклеиновые кислоты

[105] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлена нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH, который при экспрессии у индивидуума обеспечивает более высокие уровни активности PAH. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий по меньшей мере три аминокислотные замены, где аминокислотные замены находятся в сайтах полипептида человеческой PAH дикого типа, выбранных из M180, K199, S250 и G256. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий четыре аминокислотные замены в сайтах M180, K199, S250 и G256 полипептида человеческой PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий по меньшей мере три аминокислотные замены, выбранные из M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий аминокислотные замены M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий аминокислотную замену, предусматривающую K199P, S250P и G256A; M180T, S250P и G256A; M180T, K199P и G256A или M180T, K199P и S250P. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий аминокислотные замены M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, дополнительно предусматривающий аминокислотные замены H264P, G272A, G272P, P275L, P279Q, G272P и P275L или аминокислотные замены T323R и F327T. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, представляющий собой любой из вариантов полипептидов PAH, представленных в таблицах 1-3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий аминокислотные замены M180T, K199P, S250P и G256A, а также предусматривающий дополнительные аминокислотные замены при сохранении по меньшей мере приблизительного уровня фенилаланингидроксилазной активности PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления положение аминокислотных замен, кодируемых нуклеиновой кислотой, основано на полипептиде человеческой PAH дикого типа; например на полипептиде человеческой PAH, содержащем аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1.

[106] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида человеческой PAH. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотные последовательности, которые являются идентичными на любую из величин, составляющих по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99%, аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотные последовательности, которые являются идентичными на любую из величин, составляющих по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99%, аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:3, а также характеризующийся уровнем фенилаланингидроксилазной активности, составляющим по меньшей мере приблизительно 25%, 50%, 75%, 100% или более чем 100% от ее уровня для PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотные последовательности, которые являются идентичными на любую из величин, составляющих по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99%, аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:3, а также характеризующийся уровнем фенилаланингидроксилазной активности, составляющим по меньшей мере приблизительно 25%, 50%, 75%, 100% или более чем 100% от ее уровня для PAH дикого типа под SEQ ID NO:1.

[107] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, представляющий собой усеченный полипептид PAH, который сохраняет фенилаланингидроксилазную активность. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует усеченный полипептид PAH, предусматривающий N-концевое усечение. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует наличие N-концевого усечения, представляющего собой усечение части или всего N-концевого регуляторного домена. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует наличие N-концевого усечения, предусматривающего делецию участка от аминокислотного остатка 1 до приблизительно аминокислотного остатка 102 в полипептиде человеческой PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует усеченный полипептид PAH, предусматривающий C-концевое усечение. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует наличие C-концевого усечения, представляющего собой усечение части или всего тетрамеризационного домена. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует наличие C-концевого усечения, предусматривающего делецию участка аминокислотных остатков от приблизительно 429 до 452 в полипептиде человеческой PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий N-концевое усечение и C-концевое усечение. В некоторых вариантах осуществления усеченный полипептид PAH предусматривает усечение части или всей N-концевой регуляторной последовательности и части или всего тетрамеризационного домена. В некоторых вариантах осуществления усеченный полипептид PAH предусматривает делецию участка от аминокислотного остатка 1 до приблизительно аминокислотного остатка 102 и от приблизительно 429 до приблизительно 452 в полипептиде человеческой PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам от приблизительно 102 до приблизительно 428 в полипептиде PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам от 102 до 428 в полипептиде PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует усеченный полипептид PAH, дополнительно предусматривающий четыре аминокислотные замены в сайтах M180, K199, S250 и G256 полипептида человеческой PAH дикого типа (например, полипептида PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует усеченный полипептид PAH, предусматривающий четыре аминокислотные замены, выбранные из M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует усеченный вариант полипептида PAH, дополнительно предусматривающий любую из комбинаций аминокислотных замен, представленных в таблицах 1-3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует усеченный полипептид PAH, характеризующийся уровнем фенилаланингидроксилазной активности, составляющим по меньшей мере приблизительно 25%, 50%, 75%, 100% или более чем 100% от ее уровня для PAH дикого типа (например, полипептида PAH под SEQ ID NO:1).

[108] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH, функционально связана с промотором. В некоторых вариантах осуществления промотор выбран из немедленно-раннего промотора цитомегаловируса (CMV), LTR RSV, LTR MoMLV, промотора гена фосфоглицераткиназы-1 (PGK), промотора вируса обезьян 40 (SV40), промотора CK6, промотора гена транстиретина мыши (mTTR), промотора mTTR482, промотора mA1MB2-mTTR482, промотора TK, тетрациклин-чувствительного промотора (TRE), промотора HBV, промотора hAAT, промотора LSP, промотора LP1, химерного промотора, специфического в отношении печени (LSP), промотора E2F, промотора гена теломеразы (hTERT); составного промотора энхансер цитомегаловируса/промотор гена бета-актина курицы/промотор гена β-глобина кролика (CAG), промотора гена фактора элонгации 1-альфа (EF1-альфа), промотора гена β-глюкуронидазы человека, промотора гена β-актина курицы (CBA), ретровирусного LTR-промотора вируса саркомы Рауса (RSV), промотора гена дигидрофолатредуктазы и промотора гена 13-актина. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор LP1 или промотор mA1MB2-mTTR482.

[109] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота дополнительно содержит сигнал полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста, сигнал полиаденилирования SV40 или pA TK HSV. В некоторых вариантах осуществления сигнал полиаденилирования представляет собой синтетический сигнал полиаденилирования, как описано в Levitt, N et al. (1989), Genes Develop. 3:1019-1025.

[110] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота дополнительно содержит интрон. Различные интроны для применения в настоящем изобретении известны специалистам в данной области техники и включают интрон MVM, усеченный интрон 1 F IX, SD β-глобина/SA тяжелой нити иммуноглобина, SD аденовируса/SA иммуноглобина, поздние SD/SA SV40 (19S/16S) и SD гибридного аденовируса/SA IgG. (Wu et al. 2008, Kurachi et al., 1995, Choi et al. 2014, Wong et al., 1985, Yew et al. 1997, Huang and Gorman (1990). В некоторых вариантах осуществления интрон представляет собой гибридный интрон генов β-актина курицы (CBA)/β-глобина кролика. В некоторых вариантах осуществления интрон представляет собой гибридный промотор и интрон генов β-актина курицы (CBA)/β-глобина кролика, где все сайты ATG удалены для минимизации ложных сайтов начала трансляции (SEQ ID NO:15).

[111] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота может содержать (одну или несколько) спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты может предусматривать последовательность, которая кодирует репортерный полипептид. Специалисту в данной области техники будет понятно, что спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты может быть расположена в различных областях нуклеиновой кислоты и может состоять из непрерывной последовательности (например, одной спейсерной последовательности нуклеиновой кислоты в одном положении) или множества последовательностей (например, более чем одной спейсерной последовательности нуклеиновой кислоты в более чем одном положении (например, 2 положениях, 3 положениях и т. д.) в пределах нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты может быть расположена ниже последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида PAH. В вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты может быть расположена выше последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида PAH (например, между промотором и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида PAH). Специалистам в данной области техники также будет понятно, что в качестве спейсерной последовательности нуклеиновой кислоты могут применяться разнообразные нуклеиновые кислоты. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты содержит всю или часть спейсерной последовательности альфа-1-антитрипсина человека (AAT) или спейсерной последовательности C16 P1 из хромосомы 16, клона P1 (C16 человека). В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность содержит весь или часть гена. Например, спейсерная последовательность содержит часть последовательности AAT человека. Специалисту в данной области техники будет понятно, что различные части гена (например, последовательность AAT человека) могут использоваться как фрагмент спейсерной последовательности. Например, фрагмент спейсерной последовательности может быть получен из 5'-конца гена, 3'-конца гена, средины гена, некодирующей части гена (например, интрона), кодирующей области гена (например, экзона) или смеси некодирующих и кодирующих частей гена. Специалисту в данной области техники также будет понятно, что всю или часть спейсерной последовательности можно применять в качестве спейсерной последовательности. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность модифицирована с удалением внутренних кодонов ATG. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность содержит нуклеотидную последовательность под SEQ ID NO:16.

[112] В некоторых вариантах осуществления выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид человеческой PAH, является кодон-оптимизированной. В некоторых вариантах осуществления выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид человеческой PAH, является кодон-оптимизированной для обеспечения экспрессии в конкретной клетке, такой как эукариотическая клетка. Эукариотические клетки могут быть клетками, относящимися к конкретному организму или полученными из низ него, как например млекопитающее, включая без ограничения человека, мышь, крысу, кролика, собаку или примата, отличного от человека. В целом, оптимизация кодонов относится к процедуре модификации последовательности нуклеиновой кислоты для обеспечения улучшенной экспрессии в клетках-хозяевах, представляющих интерес, путем замены по меньшей мере одного кодона нативной последовательности кодонами, которые более часто или чаще всего используются в генах этой клетки-хозяина, при сохранении нативной аминокислотной последовательности. Различные виды демонстрируют специфическую склонность к определенным кодонам для конкретной аминокислоты. Таблицы использования кодонов легко доступны, например, в "Codon Usage Database", и эти таблицы можно адаптировать посредством ряда способов (см., например, Nakamura, Y. et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:292). Также доступны компьютерные алгоритмы для оптимизации кодонов определенной последовательности для обеспечения экспрессии в конкретной клетке-хозяине, такие как Gene Forge (Aptagen; Якобус, Пенсильвания), DNA2.0, GeneArt (GA) или Genscript (GS) и алгоритм GS в сочетании с уменьшением содержания CpG. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид PAH, является кодон-оптимизированной с использованием алгоритма GA. В некоторых вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты на по меньшей мере 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:14. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:14.

IV. Специфические в отношении печени кассеты экспрессии

[113] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлены кассеты экспрессии для обеспечения экспрессии трансгена в клетке печени, где кассета экспрессии содержит трансген, функционально связанный с промотором и энхансером, при этом промотор предусматривает промотор гена транстиретина мыши (mTTR), а энхансер предусматривает один или два модифицированных энхансера гена протромбина (mPrT2), один или два модифицированных энхансера гена альфа-1-микробикунина (mA1MB2), модифицированный энхансер гена альбумина мыши (mEalb), энхансер II вируса гепатита B (HE11) или энхансер CRM8. В некоторых вариантах осуществления промотор mTTR представляет собой промотор mTTR482. В некоторых вариантах осуществления энхансер расположен со стороны 5'-конца относительно промотора mTTR. В некоторых вариантах осуществления трансген кодирует вариант полипептида PAH, описанный в данном документе.

[114] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлены кассеты экспрессии для обеспечения экспрессии трансгена в клетке печени, где кассета экспрессии содержит трансген, функционально связанный с промотором и 3'-элементом, при этом промотор предусматривает промотор гена транстиретина мыши (mTTR), а 3'-элемент представляет собой 3'-элемент гена альбумина (3'Alb) или 3'-элемент гена альбумина, связанный с участком прикрепления к ядерному скелету/матриксу (SMAR) гена альфа-1-антитрипсина человека (3'AlbSMAR). В некоторых вариантах осуществления промотор mTTR представляет собой промотор mTTR482. В некоторых вариантах осуществления 3'-элемент расположен со стороны 3'-конца относительно трансгена. В некоторых вариантах осуществления трансген кодирует вариант полипептида PAH, описанный в данном документе.

[115] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлены кассеты экспрессии для обеспечения экспрессии трансгена в клетке печени, где кассета экспрессии содержит трансген, функционально связанный с промотором, и энхансером, и 3'-элементом, при этом промотор предусматривает промотор гена транстиретина мыши (mTTR), а энхансер предусматривает один или два модифицированных энхансера гена протромбина (mPrT2), один или два модифицированных энхансера гена альфа-1-микробикунина (mA1MB2), модифицированный энхансер гена альбумина мыши (mEalb), энхансер II вируса гепатита B (HE11) или энхансер CRM8; и при этом 3'-элемент представляет собой 3'-элемент гена альбумина (3'Alb) или 3'-элемент гена альбумина, связанный с участком прикрепления к ядерному скелету/матриксу (SMAR) гена альфа-1-антитрипсина человека (3'AlbSMAR). В некоторых вариантах осуществления промотор mTTR представляет собой промотор mTTR482. В некоторых вариантах осуществления энхансер расположен со стороны 5'-конца относительно промотора mTTR. В некоторых вариантах осуществления 3'-элемент расположен со стороны 3'-конца относительно трансгена. В некоторых вариантах осуществления трансген кодирует вариант полипептида PAH, описанный в данном документе.

[116] В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии дополнительно содержит интрон. В некоторых вариантах осуществления интрон представляет собой интрон MVM, усеченный интрон 1 F IX, SD β-глобина/SA тяжелой нити иммуноглобина, SD аденовируса/SA иммуноглобина, поздние SD/SA SV40 (19S/16S) и SD гибридного аденовируса/SA IgG. В некоторых вариантах осуществления интрон представляет собой гибридный интрон генов β-актина курицы (CBA)/β-глобина кролика.

[117] В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии дополнительно содержит сигнал полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста, сигнал полиаденилирования SV40 или pA TK HSV.

[118] В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии встроена в вектор. В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии встроена в вирусный вектор. В некоторых вариантах осуществления вирусный вектор представляет собой вектор на основе rAAV, описанный в данном документе.

V. Векторы и вирусные частицы

[119] В определенных аспектах нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH, содержится в векторе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предполагает использование рекомбинантного вирусного генома для введения последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих вариант полипептида PAH, для упаковки в вирусную частицу, например вирусную частицу, описанную ниже. Рекомбинантный вирусный геном может содержать любой элемент для осуществления экспрессии варианта полипептида PAH, например промотор, ITR, элемент связывания рибосомы, терминатор, энхансер, селективный маркер, интрон, сигнал поли-А и/или точку начала репликации. Иллюстративные элементы вирусного генома и способы доставки вирусных частиц описаны более подробно ниже.

Невирусные системы доставки

[120] Общепринятые способы невирусного переноса генов также можно использовать для введения нуклеиновых кислот в клетки или ткани-мишени. Невирусные векторные системы доставки включают ДНК-плазмиды, "оголенную" нуклеиновую кислоту и нуклеиновую кислоту в комплексе с системой доставки. Например, вектор может находиться в комплексе с липидом (например, катионным или нейтральным липидом), липосомой, поликатионом, наночастицей или средством, которое усиливает поступление нуклеиновой кислоты в клетку. Вектор может находиться в комплексе со средством, подходящим для любого из способов доставки, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота содержит один или несколько вирусных ITR (например, ITR AAV).

Вирусные частицы

[121] В некоторых вариантах осуществления вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант полипептида PAH, представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), вектор на основе рекомбинантного аденовируса, вектор на основе рекомбинантного лентивируса или вектор на основе рекомбинантного вируса простого герпеса (HSV).

Частицы rAAV

[122] В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного AAV (rAAV). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH, фланкирована одной или несколькими последовательностями инвертированного концевого повтора (ITR) AAV. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой частицу рекомбинантного AAV, содержащую нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант полипептида PAH, фланкированную одним или двумя ITR. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH, фланкирована двумя ITR AAV.

[123] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH по настоящему изобретению, предусматривает функционально связанные компоненты, расположенные в направлении транскрипции, последовательности контроля, в том числе последовательности инициации и терминации транскрипции, с образованием, таким образом, кассеты экспрессии. Кассета экспрессии фланкирована на 5'- и 3'-конце по меньшей мере одной функциональной последовательностью ITR AAV. Под "функциональными последовательностями ITR AAV" подразумевается, что последовательности ITR функционируют надлежащим образом для обеспечения спасения, репликации и упаковки вириона AAV. См. Davidson et al., PNAS, 2000, 97(7)3428-32; Passini et al., J. Virol., 2003, 77(12):7034-40 и Pechan et al., Gene Ther., 2009, 16:10-16, все из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Для практического осуществления некоторых аспектов настоящего изобретения рекомбинантные векторы содержат по меньшей мере все из последовательностей AAV, необходимых для обеспечения заключения в капсид, и физические структуры для обеспечения инфицирования rAAV. ITR AAV для применения в векторах по настоящему изобретению не обязательно должны характеризоваться нуклеотидной последовательностью дикого типа (например, описанную в Kotin, Hum. Gene Ther., 1994, 5:793-801), и они могут быть изменены посредством вставки, делеции или замены нуклеотидов, или ITR AAV могут быть получены из любого из нескольких серотипов AAV. На сегодняшний день известно более 40 серотипов AAV, и продолжают идентифицировать новые серотипы и варианты существующих серотипов. См. Gao et al., PNAS, 2002, 99(18): 11854-6; Gao et al., PNAS, 2003, 100(10):6081-6; и Bossis et al., J. Virol., 2003, 77(12):6799-810.

[124] Применение AAV любого серотипа рассматривается в пределах объема настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления вектор на основе rAAV представляет собой вектор, полученный из серотипа AAV, в том числе без ограничения ITR AAV представляют собой ITR AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV козы, AAV крупного рогатого скота или AAV мыши и т. п. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV содержит ITR, относящийся к ITR AAV, представляющего собой AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV козы, AAV крупного рогатого скота или AAV мыши и т. п. В определенных вариантах осуществления ITR AAV представляют собой ITR AAV2.

[125] В некоторых вариантах осуществления вектор может содержать спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты может кодировать зеленый флуоресцентный белок. В некоторых вариантах осуществления спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты может быть расположена со стороны 3'-конца относительно нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида PAH по настоящему изобретению.

[126] В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлены вирусные частицы, содержащие рекомбинантный самокомплементарный геном. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой самокомплементарный вектор. Вирусные частицы AAV с самокомплементарными геномами и способы применения самокомплементарных геномов AAV описаны в патентах США № 6596535; 7125717; 7765583; 7785888; 7790154; 7846729; 8093054 и 8361457; а также в Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. Благодаря своим частично комплементарным последовательностям (например, комплементарным кодирующим и некодирующим нитям трансгена), rAAV, предусматривающий самокомплементарный геном, будет быстро образовывать двухнитевую молекулу ДНК. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлена вирусная частица AAV, содержащую геном AAV, где геном rAAV содержит первую гетерологичную полинуклеотидную последовательность (например, кодирующую нить варианта полипептида PAH по настоящему изобретению) и вторую гетерологичную полинуклеотидную последовательность (например, некодирующую или антисмысловую нить варианта полипептида PAH по настоящему изобретению), при этом первая гетерологичная полинуклеотидная последовательность может образовывать вутринитевые пары оснований со второй полинуклеотидной последовательностью на протяжении большей части или всей ее длины.

[127] В некоторых вариантах осуществления первая гетерологичная полинуклеотидная последовательность и вторая гетерологичная полинуклеотидная последовательность соединены с помощью последовательности, которая способствует внутринитевому спариванию оснований, например шпилечная структура ДНК. Шпилечные структуры известны в данной области техники, например в молекулах siRNA. В некоторых вариантах осуществления первая гетерологичная полинуклеотидная последовательность и вторая гетерологичная полинуклеотидная последовательность связаны с помощью мутантного ITR (например, правого ITR). Мутантный ITR предусматривает делецию D-области, содержащей последовательность концевого разрешения. В результате, при репликации вирусного генома AAV белки rep не будут расщеплять вирусный геном по мутантному ITR, и в связи с этим в вирусный капсид будет упакован рекомбинантный вирусный геном, содержащий следующее в порядке от 5'- к 3'-концу: ITR AAV, первую гетерологичную полинуклеотидную последовательность, в том числе регуляторные последовательности, мутантный ITR AAV, второй гетерологичный полинуклеотид в обратной ориентации по отношению к первому гетерологичному полинуклеотиду и третий ITR AAV.

[128] В некоторых вариантах осуществления первая гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты и вторая гетерологичная последовательность нуклеиновой кислоты соединены с помощью мутантного ITR (например, правого ITR). В некоторых вариантах осуществления ITR содержит полинуклеотидную последовательность 5'-CACTCCCTCTCTGCGCGCT

CGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCG - 3' (SEQ ID NO:17). Мутантный ITR предусматривает делецию D-области, содержащей последовательность концевого разрешения. В результате, при репликации вирусного генома AAV белки rep не будут расщеплять вирусный геном по мутантному ITR, и в связи с этим в вирусный капсид будет упакован рекомбинантный вирусный геном, содержащий следующее в порядке от 5'- к 3'-концу: ITR AAV, первую гетерологичную полинуклеотидную последовательность, в том числе регуляторные последовательности, мутантный ITR AAV, второй гетерологичный полинуклеотид в обратной ориентации по отношению к первому гетерологичному полинуклеотиду и третий ITR AAV.

[129] В некоторых вариантах осуществления вектор заключен в капсид вирусной частицы. В некоторых вариантах осуществления вирусная частица представляет собой рекомбинантную вирусную частицу AAV, содержащую вектор на основе рекомбинантного AAV. Для оптимизации трансдукции конкретных клеток-мишеней или для нацеливания на определенные типы клеток в пределах конкретной ткани-мишени (например, ткани глаза) применяют различные серотипы AAV. Частица rAAV может содержать белки вируса и нуклеиновые кислоты вируса одного и того же серотипа или смешанного серотипа. Например, в некоторых вариантах осуществления частица rAAV может содержать капсидные белки AAV2 по настоящему изобретению и по меньшей мере один ITR AAV2, или она может содержать капсидные белки AAV2 и по меньшей мере один ITR AAV1. В данном документе для получения частицы rAAV предусматривается любая комбинация серотипов AAV, как если бы каждая комбинация была описана в данном документе в явной форме. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлены частицы rAAV, содержащие капсид AAV2 по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлены частицы rAAV, содержащие капсид AAVrh8R по настоящему изобретению.

[130] В некоторых вариантах осуществления частицы rAAV содержат капсид AAV1, капсид AAV2, капсид AAV3, капсид AAV4, капсид AAV5, капсид AAV6 (например, капсид AAV6 дикого типа или вариант капсида AAV6, такой как ShH10, как описано в публикации заявки на патент США № 2012/0164106, опубликованной до выдачи патента), капсид AAV7, капсид AAV8, капсид AAVrh8, капсид AAVrh8R, капсид AAV9 (например, капсид AAV9 дикого типа или модифицированный капсид AAV9, как описано в публикации заявки на патент США № 2013/0323226, опубликованной до выдачи патента), капсид AAV10, капсид AAVrh10, капсид AAV11, капсид AAV12, капсид с мутацией по тирозину, капсид с мутацией, влияющей на связывание с гепарином, капсид AAV2R471A, капсид AAVAAV2/2-7m8, капсид AAV DJ (например, капсид AAV-DJ/8, капсид AAV-DJ/9 или любые другие капсиды, описанные в публикации заявки на патент США 2012/0066783, опубликованной до выдачи патента), капсид AAV2 N587A, капсид AAV2 E548A, капсид AAV2 N708A, капсид AAV V708K, капсид AAV козы, капсид химерного AAV1/AAV2, капсид AAV крупного рогатого скота, капсид AAV мыши, капсид rAAV2/HBoV1 или капсид AAV, описанный в патенте США № 8283151 или в Международной публикации № WO/2003/042397. В некоторых вариантах осуществления мутантный капсидный белок сохраняет способность образовывать капсид AAV. В некоторых вариантах осуществления частица rAAV содержит капсид AAV5, мутантный по тирозину (Zhong L. et al., (2008) Proc Natl Acad Sci USA 105(22):7827-7832. В дополнительных вариантах осуществления частица rAAV содержит капсидные белки AAV определенного серотипа из клад A-F (Gao, et al., J. Virol. 2004, 78(12):6381). В некоторых вариантах осуществления частица rAAV содержит капсидный белок AAV1 или его мутант. В других вариантах осуществления частица rAAV содержит капсидный белок AAV2 или его мутант. В некоторых вариантах осуществления серотип AAV представляет собой AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10 или AAVrh10. В некоторых вариантах осуществления частица rAAV содержит капсид AAV серотипа 1 (AAV1). В некоторых вариантах осуществления частица rAAV содержит капсид AAV серотипа 2 (AAV2). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная вирусная частица AAV содержит капсид AAV1, AAV2, AAV8, AAVrh8R, AAV9 и/или AAVrh10. В некоторых вариантах осуществления капсид AAV1, AAV2, AAV8, AAVrh8R, AAV9 и/или AAVrh10 содержит мутацию по тирозину или мутацию, влияющую на связывание с гепараном, например как описано ниже. В некоторых вариантах осуществления капсид представляет собой капсид, нацеливающийся на печень; например без ограничения капсид LK03, капсид HSC15 или капсид 17. В некоторых вариантах осуществления капсид представляет собой сконструированный капсид AAV (например, полученный путем "перетасовки" генов капсид). Примеры сконструированных капсидов AAV включают без ограничения DJ (Grimm D et al., J Virol. 2008, 82:5887-911), LK03 (Lisowski L et al., Nature, 2014, 506:382-6) и HSC15 и HSC17 (Smith LJ et al., Mol Ther, 2014 Sep;22(9):1625-34).

[131] Известно, что капсид AAV (например, AAV2, AAV8 и т. д.) содержит три капсидных белка: VP1, VP2 и VP3. Эти белки содержат значительные количества перекрывающихся аминокислотных последовательностей и уникальные N-концевые последовательности. Капсид AAV2 содержит 60 субъединиц, расположенных в соответствии с икосаэдрической симметрией (Xie, Q., et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(16):10405-10). Было обнаружено, что VP1, VP2 и VP3 присутствуют в соотношении 1:1:10.

[132] В некоторых вариантах осуществления частица rAAV содержит a) капсид rAAV, содержащий капсидные белки rAAV, предусматривающие одну или несколько аминокислотных замен в одном или нескольких положениях, в которых происходит взаимодействие с гепарансульфатсодержащим протеогликаном, и b) вектор на основе rAAV, содержащий гетерологичную нуклеиновую кислоту и по меньшей мере один инвертированный концевой повтор AAV.

[133] В некоторых вариантах осуществления частицы rAAV предусматривают одну или несколько аминокислотных замен в капсидных белках, которые ослабляют или устраняют связывание частицы rAAV с гепарансульфатсодержащим протеогликаном, и/или где одна или несколько аминокислотных замен находятся в положениях 484, 487, 532, 585 или 588, нумерация которых приведена согласно нумерации VP1 AAV2. Как используется в данном документе, "нумерация приведена согласно VP1 AAV2" относится к аминокислоте упомянутого капсидного белка, соответствующей упомянутой аминокислоте VP1 AAV2. Например, если одна или несколько аминокислотных замен находятся в положениях 347, 350, 390, 395, 448, 451, 484, 487, 527, 532, 585 и/или 588, нумерация которых приведена согласно VP1 AAV2, то одна или несколько аминокислотных замен, выполненных в отношении аминокислоты(аминокислот) упомянутого капсидного белка, соответствуют аминокислотам 347, 350, 390, 395, 448, 451, 484, 487, 527, 532, 585 и/или 588 VP1 AAV2. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько аминокислотных замен находятся в положениях 484, 487, 532, 585 или 588 VP1 AAV2. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько аминокислотных замен находятся в положениях 484, 487, 532, 585 или 588 VP1 AAV3, нумерация которых приведена согласно VP1 AAV2. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько аминокислотных замен находятся в положениях 485, 488, 528, 533, 586 или 589, нумерация которых приведена согласно нумерации VP1 AAVrh8R. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько аминокислот в положении(-ях), соответствующем(-их) аминокислотам 585 и/или 588 (нумерация которых приведена согласно VP1 AAV2), заменены аргининовыми остатками (например, S586 и/или T589 для AAV1 или AAV6; S586 и/или A589 для AAV9; A586 и/или T589 для AAVrh8R; Q588 и/или T591 для AAV8 и Q588 и/или A591 для AAVrh10). В других вариантах осуществления одна или несколько аминокислот (например, аргинин или лизин) в положении(-ях), соответствующем(-их) аминокислотам 484, 487, 527 и/или 532 (нумерация которых приведена согласно VP1 AAV2), заменены аминокислотой(-ами), не являющейся(-имися) положительно заряженной(-ыми), как например аланин (например, R485, R488, K528 и/или K533 для AAV1 или AAV6; R485, R488, K528 и/или R533 для AAV9 или AAVrh8R и R487, R490, K530 и/или R535 для AAV8 или AAVrh10).

Получение частиц AAV

[134] Из уровня техники известны многочисленные способы получения векторов на основе rAAV, в том числе трансфекция, получение стабильных линий клеток и применение систем продуцирования на основе инфекционных гибридных вирусов, которые включают гибриды аденовирус-AAV, гибриды вирус герпеса-AAV (Conway, JE et al., (1997) J. Virology 71(11):8780-8789) и гибриды бакуловирус-AAV (Urabe, M. et al., (2002) Human Gene Therapy 13(16):1935-1943; Kotin, R. (2011) Hum Mol Genet. 20(R1): R2-R6). Для получения вирусных частиц rAAV всем культурам для продуцирования rAAV необходимы: 1) подходящие клетки-хозяева, 2) подходящий функциональный элемент вируса-помощника, 3) гены rep и cap AAV и продукты генов; 4) нуклеиновая кислота (такая как терапевтическая нуклеиновая кислота), фланкированная по меньшей мере одной из последовательностей ITR AAV (например, генома AAV, кодирующего вариант полипептида PAH); и 5) подходящая среда и компоненты среды для поддержания продуцирования rAAV. В некоторых вариантах осуществления подходящая клетка-хозяин представляет собой клетку-хозяина, полученную от примата. В некоторых вариантах осуществления подходящая клетка-хозяин представлена линиями клеток, полученными от человека, такими как клетки HeLa, A549, 293 или Perc.6. В некоторых вариантах осуществления подходящий функциональный элемент вируса-помощника обеспечивается аденовирусом дикого типа или мутантным аденовирусом (таким как термочувствительный аденовирус), вирусом герпеса (HSV), бакуловирусом или плазмидной конструкцией, обеспечивающей функциональные элементы помощника. В некоторых вариантах осуществления продукты генов rep и cap AAV могут происходить из AAV любого серотипа. В целом, но не обязательно, продукт гена rep AAV относится к тому же серотипу, что и ITR из генома вектора на основе rAAV, при условии, что продукты гена rep могут обеспечивать возможность репликации и упаковки генома rAAV. Для получения векторов на основе rAAV можно применять подходящие среды, известные из уровня техники. Эти среды включают без ограничения среды, производимые Hyclone Laboratories и JRH, в том числе модифицированную среду Игла (MEM), среду Игла, модифицированную по Дульбекко (DMEM), изготавливаемые по заказу составы, такие как описанные в патенте США № 6566118, и среду Sf-900 II SFM, описанную в патенте США № 6723551, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, в особенности в отношении изготавливаемых по заказу составов сред для применения в получении рекомбинантных векторов на основе AAV. В некоторых вариантах осуществления функциональные элементы помощника AAV представлены аденовирусом или HSV. В некоторых вариантах осуществления функциональные элементы помощника AAV представлены бакуловирусом, и клетка-хозяин представляет собой клетку насекомого (например, клетки Spodoptera frugiperda (Sf9)).

[135] Один способ получения частиц rAAV представляет собой способ тройной трансфекции. Вкратце, плазмиду, содержащую ген rep и ген капсида, вместе с аденовирусной плазмидой-помощником можно ввести путем трансфекции (например, с применением способа с использованием фосфата кальция) в линию клеток (например, клетки HEK-293), и вирус можно собирать и необязательно очищать. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления частица rAAV была получена с помощью введения путем тройной трансфекции нуклеиновой кислоты, кодирующей вектор на основе rAAV, нуклеиновой кислоты, кодирующей rep и cap AAV, и нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональные элементы вируса-помощника AAV, в клетку-хозяина, при этом введение путем трансфекции нуклеиновых кислот в клетки-хозяева приводит к получению клетки-хозяина, способной продуцировать частицы rAAV.

[136] В некоторых вариантах осуществления частицы rAAV можно получить с помощью способа с использованием линии клеток-продуцентов (см. Martin et al., (2013) Human Gene Therapy Methods 24:253-269; публикацию заявки на патент США № US2004/0224411, опубликованную до выдачи патента; и Liu, X.L. et al. (1999) Gene Ther. 6:293-299). Вкратце, линию клеток (например, линию клеток HeLa, 293, A549 или Perc.6) можно стабильно трансфицировать плазмидой, содержащей ген rep, ген капсидного белка и геном вектора, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты с гетерологичным промотором (например, варианта полипептида PAH). Линии клеток можно подвергать скринингу для отбора лидерного клона для продуцирования rAAV, который можно затем размножать в производственном биореакторе и инфицировать вирусом-помощником (например, аденовирусом или HSV) для инициации продуцирования rAAV. Вирус можно затем собирать, аденовирус можно инактивировать (например, под действием тепла) и/или удалять, а частицы rAAV можно очищать. В связи с этим, в некоторых вариантах осуществления частицу rAAV получали с помощью линии клеток-продуцентов, содержащих одну или несколько из нуклеиновой кислоты, кодирующей вектор на основе rAAV, нуклеиновой кислоты, кодирующей rep и cap AAV, и нуклеиновой кислоты, кодирующей функциональные элементы вируса-помощника AAV. Как описано в данном документе, способ с использованием линии клеток-продуцентов может быть преимущественным для получения частиц rAAV с увеличенным в размере геномом по сравнению со способом тройной трансфекции.

[137] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая гены rep и cap AAV, и/или геном rAAV стабильно поддерживаются в линии клеток-продуцентов. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту, кодирующую гены rep и cap AAV, и/или геном rAAV вводят в линию клеток с помощью одной или нескольких плазмид с получением линии клеток-продуцентов. В некоторых вариантах осуществления rep AAV, cap AAV и геном rAAV вводят в клетку с помощью одной и той же плазмиды. В других вариантах осуществления rep AAV, cap AAV и геном rAAV вводят в клетку с помощью разных плазмид. В некоторых вариантах осуществления линия клеток, стабильно трансфицированная плазмидой, поддерживает плазмиду в течение нескольких пассажей линии клеток (например, 5, 10, 20, 30, 40, 50 или более чем 50 пассажей клетки). Например, плазмида(-ы) может(могут) реплицироваться при делении клетки, или плазмида(-ы) может(могут) интегрироваться в геном клетки. Было идентифицировано множество последовательностей, которые обеспечивают возможность автономной репликации плазмиды в клетке (например, клетке человека) (см., например, Krysan, P.J. et al. (1989) Mol. Cell Biol. 9:1026-1033). В некоторых вариантах осуществления плазмида(-ы) может(могут) содержать селектируемый маркер (например, маркер устойчивости к антибиотикам), который обеспечивает возможность отбора клеток, сохраняющих плазмиду. Селектируемые маркеры, обычно используемые в клетках млекопитающих, включают без ограничения бластицидин, G418, гигромицин B, зеоцин, пуромицин и их производные. Способы введения нуклеиновых кислот в клетку известны из уровня техники и включают без ограничения вирусную трансдукцию, катионную трансфекцию (например, с использованием катионного полимера, такого как DEAE-декстран, или катионного липида, такого как липофектамин), трансфекцию с использованием фосфата кальция, микроинъекцию, бомбардировку частицами, электропорацию и трансфекцию с использованием наночастиц (для более подробной информации см., например, Kim, T.K. and Eberwine, J.H. (2010) Anal. Bioanal. Chem. 397:3173-3178).

[138] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая гены rep и cap AAV, и/или геном rAAV стабильно интегрированы в геном линии клеток-продуцентов. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту, кодирующую гены rep и cap AAV, и/или геном rAAV вводят в линию клеток с помощью одной или нескольких плазмид с получением линии клеток-продуцентов. В некоторых вариантах осуществления rep AAV, cap AAV и геном rAAV вводят в клетку с помощью одной и той же плазмиды. В других вариантах осуществления rep AAV, cap AAV и геном rAAV вводят в клетку с помощью разных плазмид. В некоторых вариантах осуществления плазмида(-ы) может(могут) содержать селектируемый маркер (например, маркер устойчивости к антибиотикам), который обеспечивает возможность отбора клеток, сохраняющих плазмиду. Способы стабильной интеграции нуклеиновых кислот в ряд различных линий клеток-хозяев известны из уровня техники. Например, повторный отбор (например, посредством применения селектируемого маркера) можно использовать для отбора клеток, содержащих интегрированную нуклеиновую кислоту, содержащую селектируемый маркер (и гены cap и rep AAV и/или геном rAAV). В других вариантах осуществления нуклеиновые кислоты могут интегрироваться в линию клеток сайт-специфичным образом с получением линии клеток-продуцентов. Несколько систем сайт-специфичной рекомбинации известны из уровня техники, такие как FLP/FRT (см., например, O'Gorman, S. et al. (1991) Science 251:1351-1355), Cre/loxP (см., например, Sauer, B. and Henderson, N. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5166-5170) и phi C31-att (см., например, Groth, A.C. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97:5995-6000).

[139] В некоторых вариантах осуществления линия клеток-продуцентов получена из линии клеток приматов (например, линии клеток отличных от человека приматов, такой как линия клеток Vero или FRhL-2). В некоторых вариантах осуществления линия клеток получена из линии клеток человека. В некоторых вариантах осуществления линия клеток-продуцентов получена из клеток HeLa, 293, A549 или PERC.6® (Crucell). Например, перед введением и/или стабильным поддержанием/интеграцией нуклеиновой кислоты, кодирующей гены rep и cap AAV, и/или увеличенного в размере генома rAAV в линию клеток для получения линии клеток-продуцентов линия клеток представляет собой линию клеток HeLa, 293, A549 или PERC.6® (Crucell) или их производную.

[140] В некоторых вариантах осуществления линия клеток-продуцентов адаптирована для роста в суспензии. Как известно из уровня техники, субстратзависимые клетки, как правило, не способны расти в суспензии без субстрата, такого как гранулы-микроносители. Адаптация линии клеток к росту в суспензии может предусматривать, например, выращивание линии клеток в культурах с постоянным перемешиванием с помощью перемешивающей лопасти, применение культуральной среды, не содержащей ионов кальция и магния, с целью предотвращения агрегации (и необязательно противовспенивающего средства), применение сосуда для культивирования, покрытого силиконизирующим соединением, и отбор клеток в культуре (а не в больших скоплениях или на стенках сосуда) при каждом пассаже. Для дополнительного описания см., например, документ ATCC с часто задаваемыми вопросами (доступен на www.atcc.org/Global/FAQs/9/1/Adapting%20a%20monolayer%20cell%20line%20to%20suspension-40.aspx) и ссылки, цитируемые в нем.

[141] В некоторых аспектах представлен способ получения любой частицы rAAV, раскрытой в данном документе, включающий (a) культивирование клетки-хозяина в условиях, которые обеспечивают получение частиц rAAV, где клетка-хозяин содержит (i) один или несколько генов AAV, обеспечивающих упаковку, при этом каждый указанный ген AAV, обеспечивающий упаковку, кодирует белок AAV, участвующий в репликации и/или заключении в капсид; (ii) провектор на основе rAAV, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую гетерологичную нуклеиновую кислоту, как описано в данном документе, фланкированную по меньшей мере одним ITR AAV, и (iii) хелперный функциональный элемент AAV; и (b) извлечение частиц rAAV, продуцируемых клеткой-хозяином. В некоторых вариантах осуществления указанный по меньшей мере один ITR AAV выбран из группы, состоящей из ITR серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12,, AAV козы, AAV крупного рогатого скота или AAV мыши и т. п. Например, в некоторых вариантах осуществления серотип AAV представляет собой AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10 или AAVrh10. В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота в AAV содержит ITR AAV2. В некоторых вариантах осуществления указанный белок, участвующий в заключении в капсид, выбран из группы, состоящей из капсидных белков серотипов AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV V708K, AAV козы, химерного AAV1/AAV2, AAV крупного рогатого скота, AAV мыши, rAAV2/HBoV1 или их мутантов. В некоторых вариантах осуществления белок, участвующий в заключении в капсид, представляет собой белок капсида AAV8. В некоторых вариантах осуществления частицы rAAV содержат капсид AAV8 и рекомбинантный геном, содержащий ITR AAV2 и нуклеиновую кислоту, кодирующую терапевтический трансген/нуклеиновую кислоту (например, нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант полипептида PAH).

[142] Подходящие культуральные среды для продуцирования rAAV по настоящему изобретению могут быть дополнены сывороткой крови или рекомбинантными белками, полученными из сыворотки крови, на уровне 0,5% - 20% (об./об. или вес/об.). Альтернативно, как известно из уровня техники, векторы на основе rAAV можно получать в бессывороточных условиях, которые также могут называться средой, не содержащей продуктов животного происхождения. Специалист в данной области техники может понять, что коммерческие или оригинальные среды, разработанные для способствования продуцированию векторов на основе rAAV, также могут быть дополнены одним или несколькими компонентами для культур клеток, известными из уровня техники, включающими без ограничения глюкозу, витамины, аминокислоты и/или факторы роста, в целях повышения титра rAAV в культурах для продуцирования.

[143] Культуры для продуцирования rAAV можно выращивать при различных условиях (в широком диапазоне температур, в течение различных промежутков времени и т. п.), подходящих для конкретной используемой клетки-хозяина. Как известно из уровня техники, культуры для продуцирования rAAV включают культуры, зависимые от прикрепления, которые можно культивировать в подходящих сосудах для культур, зависимых от прикрепления, таких как, например, роллерные флаконы, фильтры с полыми волокнами, микроносители и биореакторы с уплотненным слоем или псевдоожиженным слоем. Культуры для продуцирования векторов на основе rAAV также могут предусматривать клетки-хозяева, адаптированные к суспензии, такие как клетки HeLa, 293 и SF-9, которые можно культивировать разнообразными способами, в том числе, например, во флаконах с перемешиванием, биореакторах с механическим перемешиванием и одноразовых системах, таких как система в виде мешка Wave.

[144] Частицы, представляющие собой вектор на основе rAAV по настоящему изобретению, можно собирать из культур для продуцирования rAAV посредством лизиса клеток-хозяев в культуре для продуцирования или посредством сбора отработанной среды из культуры для продуцирования, при условии, что клетки культивируют при условиях, которые, как известно из уровня техники, вызывают высвобождение частиц rAAV в среду из интактных клеток, как более подробно описано в патенте США № 6566118). Подходящие способы лизиса клеток также известны из уровня техники и включают, например, несколько циклов замораживания/размораживания, обработку ультразвуком, микрофлюидизацию и обработку химическими веществами, такими как детергенты и/или протеазы.

[145] В дополнительном варианте осуществления частицы rAAV подвергают очистке. Термин "очищенный", используемый в данном документе, подразумевает препарат на основе частиц rAAV, в котором отсутствуют по меньшей мере некоторые другие компоненты, которые могут также присутствовать в среде, где частицы rAAV находятся в естественном состоянии или из которой они изначально получены. Таким образом, например, выделенные частицы rAAV можно получать с использованием методики очистки для обогащения ими исходной смеси, такой как лизат культуры или надосадочная жидкость культуры для продуцирования. Обогащение можно измерять с помощью множества способов, таких как, например, по доле устойчивых к ДНКазе частиц (DRP) или по числу копий генома (gc), присутствующих в растворе, или по инфекционности, либо его можно измерять по отношению ко второму потенциально мешающему веществу, присутствующему в исходной смеси, такому как загрязняющие вещества, в том числе загрязняющие вещества из культуры для продуцирования или загрязняющие вещества, образуемые в ходе продуцирования, включающие в себя вирус-помощник, компоненты среды и т. п.

[146] В некоторых вариантах осуществления сбор культуры для продуцирования rAAV очищают от примесей с удалением дебриса клеток-хозяев. В некоторых вариантах осуществления сбор культуры для продуцирования очищают от примесей путем фильтрации через серию пористых фильтров, включающих, например, модульный фильтр Millipore Millistak+ HC марки DOHC, модульный фильтр Millipore Millistak+ HC марки A1HC и фильтр с размером пор 0,2 мкм Opticap XL1O с гидрофильной мембраной фильтра Millipore Express SHC. Очистку от примесей также можно осуществлять с помощью ряда других стандартных методик, известных из уровня техники, таких как центрифугирование или фильтрация через любой фильтр из ацетата целлюлозы с размером пор 0,2 мкм или больше, известный из уровня техники.

[147] В некоторых вариантах осуществления сбор культуры для продуцирования rAAV дополнительно обрабатывают с помощью Benzonase® с целью расщепления любой высокомолекулярной ДНК, присутствующей в культуре для продуцирования. В некоторых вариантах осуществления расщепление с помощью Benzonase® осуществляют в стандартных условиях, известных из уровня техники, в том числе, например, при конечной концентрации 1-2,5 единиц Benzonase®/мл, при температуре, варьирующейся в диапазоне от температуры окружающей среды до 37°C, в течение периода времени от 30 минут до нескольких часов.

[148] Частицы rAAV можно выделять или очищать с использованием одной или нескольких следующих стадий очистки: равновесного центрифугирования; проточной анионообменной фильтрации; тангенциальной поточной фильтрации (TFF) для концентрирования частиц rAAV; захвата rAAV посредством хроматографии на апатите; термоинактивации вируса-помощника; захвата rAAV посредством хроматографии гидрофобных взаимодействий; замены буфера посредством эксклюзионной хроматографии (SEC); нанофильтрации и захвата rAAV посредством анионообменной хроматографии, катионообменной хроматографии или аффинной хроматографии. Эти стадии можно применять в отдельности, в различных комбинациях или в разном порядке. В некоторых вариантах осуществления способ включает все стадии в порядке, описанном ниже. Способы очистки частиц rAAV приведены, например, в Xiao et al., (1998) Journal of Virology 72:2224-2232; патентах США №№ 6989264 и 8137948; а также WO 2010/148143.

VI. Способы лечения

[149] Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к способам лечения фенилкетонурии и/или снижения уровней фенилаланина у нуждающегося в этом индивидуума. Фенилкетонурия (PKU) обусловлена дефицитом фенилаланингидроксилазы (PAH), что приводит к повышенным уровням Phe в крови, которые токсичны для головного мозга и впоследствии приводят к тяжелым психическим расстройствам без лечения. Существующая в настоящая время терапия посредством ограничения потребления Phe с пищей продемонстрировала эффективность, однако несоблюдение режима подростками и взрослыми является серьезной проблемой.

[150] Усилия по лечению PKU были затруднены из-за низкой активности человеческой PAH, получаемой из векторов для генной терапии. Настоящие способы частично основаны на открытии вариантов полипептидов PAH с улучшенной стабильностью белка и ферментативной активностью по сравнению с полипептидом эндогенной человеческой PAH. Лечение PKU с помощью генной терапии с использованием вектора на основе rAAV, кодирующего варианты полипептидов PAH, описанные в данном документе, приводит к лучшему снижению уровней Phe в крови и головном мозге по сравнению с вектором, кодирующим эндогенную человеческую PAH. Кроме того, несмотря на то, что как hPAH, так и hPAH-V1 улучшали транспорт Tyr и Trp в головной мозг, только у животных, которых обрабатывали вариантом PAH, имелись нормализованные уровни нейромедиаторов головного мозга, включая дофамин и серотонин, что указывает на различную чувствительность применительно к затрагиваемой Phe функции.

[151] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлены способы лечения PKU, включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму терапевтически эффективного количества варианта полипептида PAH, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает по меньшей мере три аминокислотные замены, где аминокислотные замены находятся в сайтах полипептида человеческой PAH дикого типа, выбранных из M180, K199, S250 и G256. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает четыре аминокислотные замены в сайтах M180, K199, S250 и G256 полипептида человеческой PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает по меньшей мере три аминокислотные замены, выбранные из M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает аминокислотные замены M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает аминокислотную замену, предусматривающую K199P, S250P и G256A; M180T, S250P и G256A; M180T, K199P и G256A или M180T, K199P и S250P. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает аминокислотные замены M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH дополнительно предусматривает аминокислотные замены H264P, G272A, G272P, P275L, P279Q, G272P и P275L или аминокислотные замены T323R и F327T. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH представляет собой любой из вариантов полипептидов PAH, представленных в таблицах 1-3. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH предусматривает аминокислотные замены M180T, K199P, S250P и G256A, а также предусматривает дополнительные аминокислотные замены при сохранении по меньшей мере приблизительного уровня фенилаланингидроксилазной активности PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления положение аминокислотных замен основано на полипептиде человеческой PAH дикого типа; например на полипептиде человеческой PAH, содержащем аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH представляет собой слитый полипептид. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH представляет собой слитый полипептид, являющийся слитым с пептидом, нацеливающимся на ткань. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH представляет собой слитый полипептид, являющийся слитым с полипептидом, нацеливающимся на печень. Примеры полипептидов, нацеливающихся на печень, включают без ограничения фрагменты фактора роста гепатоцитов человека (Eavri and Lorberboum-Galkski, J Biol Chem 2007, 282:23402-23409) или гликопротеины, которые связываются с асиалогликопротеиновым рецептором гепатоцитов (Huang, et al., Bioconjugate Chemistry 2017, 28:283-295).

[152] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлены способы лечения PKU посредством введения эффективного количества варианта полипептида PAH по настоящему изобретению. Вариант полипептида PAH можно вводить в конкретную представляющую интерес ткань или можно вводить системно. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество варианта полипептида PAH можно вводить парентерально. Парентеральные пути введения могут включать без ограничения внутривенный, внутрибрюшинный, внутрикостный, внутриартериальный, интрацеребральный, внутримышечный, интратекальный, подкожный, интрацеребровентрикулярный, внутрипеченочный и т. д. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество варианта полипептида PAH можно вводить посредством одного пути введения. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество варианта полипептида PAH можно вводить посредством комбинации из более чем одного пути введения. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество варианта полипептида PAH вводят в один участок. В других вариантах осуществления эффективное количество варианта полипептида PAH можно вводить в более чем один участок.

[153] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлены способы лечения PKU, включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты (например, ДНК или мРНК), кодирующей вариант полипептида PAH, описанного в данном документе. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий по меньшей мере три аминокислотные замены, где аминокислотные замены находятся в сайтах полипептида человеческой PAH дикого типа, выбранных из M180, K199, S250 и G256. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий четыре аминокислотные замены в сайтах M180, K199, S250 и G256 полипептида человеческой PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий по меньшей мере три аминокислотные замены, выбранные из M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий аминокислотные замены M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий аминокислотную замену, предусматривающую K199P, S250P и G256A; M180T, S250P и G256A; M180T, K199P и G256A или M180T, K199P и S250P. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий аминокислотные замены M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, дополнительно предусматривающий аминокислотные замены H264P, G272A, G272P, P275L, P279Q, G272P и P275L или аминокислотные замены T323R и F327T. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, представляющий собой любой из вариантов полипептидов PAH, представленных в таблицах 1-3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий аминокислотные замены M180T, K199P, S250P и G256A, а также предусматривающий дополнительные аминокислотные замены при сохранении по меньшей мере приблизительного уровня фенилаланингидроксилазной активности PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления положение аминокислотных замен, кодируемых нуклеиновой кислотой, основано на полипептиде человеческой PAH дикого типа; например на полипептиде человеческой PAH, содержащем аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1.

[154] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида человеческой PAH. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотные последовательности, которые являются идентичными на любую из величин, составляющих по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99%, аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотные последовательности, которые являются идентичными на любую из величин, составляющих по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99%, аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:3, а также характеризующийся уровнем фенилаланингидроксилазной активности, составляющим по меньшей мере приблизительно 25%, 50%, 75%, 100% или более чем 100% от ее уровня для PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотные последовательности, которые являются идентичными на любую из величин, составляющих по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99%, аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:3, а также характеризующийся уровнем фенилаланингидроксилазной активности, составляющим по меньшей мере приблизительно 25%, 50%, 75%, 100% или более чем 100% от ее уровня для PAH дикого типа под SEQ ID NO:1. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH, представляет собой ДНК. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH, представляет собой РНК (например, мРНК).

[155] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, представляющий собой усеченный полипептид PAH, который сохраняет фенилаланингидроксилазную активность. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует усеченный полипептид PAH, предусматривающий N-концевое усечение. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует наличие N-концевого усечения, представляющего собой усечение части или всего N-концевого регуляторного домена. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует наличие N-концевого усечения, предусматривающего делецию участка от аминокислотного остатка 1 до приблизительно аминокислотного остатка 102 в полипептиде человеческой PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует усеченный полипептид PAH, предусматривающий C-концевое усечение. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует наличие C-концевого усечения, представляющего собой усечение части или всего тетрамеризационного домена. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует наличие C-концевого усечения, предусматривающего делецию участка аминокислотных остатков от приблизительно 429 до 452 в полипептиде человеческой PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий N-концевое усечение и C-концевое усечение. В некоторых вариантах осуществления усеченный полипептид PAH предусматривает усечение части или всей N-концевой регуляторной последовательности и части или всего тетрамеризационного домена. В некоторых вариантах осуществления усеченный полипептид PAH предусматривает делецию участка от аминокислотного остатка 1 до приблизительно аминокислотного остатка 102 и от приблизительно 429 до приблизительно 452 в полипептиде человеческой PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам от приблизительно 102 до приблизительно 428 в полипептиде PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам от 102 до 428 в полипептиде PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует усеченный полипептид PAH, дополнительно предусматривающий четыре аминокислотные замены в сайтах M180, K199, S250 и G256 полипептида человеческой PAH дикого типа (например, полипептида PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует усеченный полипептид PAH, предусматривающий четыре аминокислотные замены, выбранные из M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует усеченный вариант полипептида PAH, дополнительно предусматривающий любую из комбинаций аминокислотных замен, представленных в таблицах 1-3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота кодирует усеченный полипептид PAH, характеризующийся уровнем фенилаланингидроксилазной активности, составляющим по меньшей мере приблизительно 25%, 50%, 75%, 100% или более чем 100% от ее уровня для PAH дикого типа (например, полипептида PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH, кодирует слитый полипептид, являющийся слитым с пептидом, нацеливающимся на ткань. В некоторых вариантах осуществления вариант полипептида PAH представляет собой слитый полипептид, являющийся слитым с пептидом, нацеливающимся на печень. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH, представляет собой ДНК. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH, представляет собой РНК (например, мРНК).

[156] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлены способы лечения PKU посредством введения эффективного количества нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида PAH по настоящему изобретению. Нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант полипептида PAH, можно вводить в конкретную представляющую интерес ткань или можно вводить системно. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида PAH, можно вводить парентерально. Парентеральные пути введения могут включать без ограничения внутривенный, внутрибрюшинный, внутрикостный, внутриартериальный, интрацеребральный, внутримышечный, интратекальный, подкожный, интрацеребровентрикулярный, внутрипеченочный и т. д. В некоторых вариантах осуществления для экспрессии варианта PAH в тканях за пределами печени может потребоваться присутствие кофактора BH4 (например, доставляемого системно или совместно экспрессируемого нуклеиновой кислотой), Ding et al., Mol Ther 2008, 16:673-681. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида PAH, можно вводить посредством одного пути введения. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида PAH, можно вводить посредством комбинации из более чем одного пути введения. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида PAH, вводят в один участок. В других вариантах осуществления эффективное количество варианта полипептида PAH можно вводить в более чем один участок. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH, представляет собой ДНК. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH, представляет собой РНК (например, мРНК).

[157] В некоторых аспектах настоящего изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH, доставляется индивидууму с помощью вирусного вектора. Вирусные векторы для генной терапии известны в данной области техники. В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлены способы лечения PKU посредством введения эффективного количества лентивирусной частицы, кодирующей вариант полипептида PAH по настоящему изобретению. В некоторых аспектах в настоящем изобретении представлены способы лечения PKU путем введения эффективного количества частицы rAAV, кодирующей вариант полипептида PAH по настоящему изобретению. При этом rAAV можно вводить в конкретную представляющую интерес ткань, или ее можно вводить системно. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество rAAV можно вводить парентерально. Парентеральные пути введения могут включать без ограничения внутривенный, внутрибрюшинный, внутрикостный, внутриартериальный, интрацеребральный, внутримышечный, интратекальный, подкожный, интрацеребровентрикулярный, внутрипеченочный и т. д. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество rAAV можно вводить посредством одного пути введения. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество rAAV можно вводить посредством комбинации более чем одного пути введения. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество rAAV вводят в один участок. В других вариантах осуществления эффективное количество rAAV можно вводить в более чем один участок.

[158] Эффективное количество rAAV (в некоторых вариантах осуществления в форме частиц) вводят в зависимости от целей лечения. Например, если при низкой процентной доле трансдукции можно достичь требуемого терапевтического эффекта, то целью лечения обычно является соответствие данному уровню трансдукции или его превышение. В некоторых случаях данного уровня трансдукции можно достичь путем трансдукции лишь приблизительно 1-5% клеток-мишеней требуемого типа ткани, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 20% клеток требуемого типа ткани, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 50%, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 80%, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 95%, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 99% клеток требуемого типа ткани. Композицию на основе rAAV можно вводить с помощью осуществления одного или нескольких введений, осуществляемых в ходе одной и той же процедуры или разделенных несколькими днями, неделями, месяцами или годами. Можно применять один или несколько из путей введения, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления для лечения человека можно применять несколько векторов.

[159] Способы идентификации клеток, трансдуцированных вирусными частицами AAV, известны из уровня техники; например, для выявления трансдукции вирусными частицами, например вирусными частицами, содержащими капсид rAAV с одной или несколькими аминокислотными заменами, можно применять иммуногистохимический анализ или маркер, такой как усиленный зеленый флуоресцентный белок.

[160] В некоторых вариантах осуществления эффективное количество частиц rAAV вводят в более чем один участок одновременно или последовательно. В других вариантах осуществления эффективное количество частиц rAAV вводят в один участок более одного раза (например, повторно). В некоторых вариантах осуществления многократные инъекции вирусных частиц rAAV осуществляют с интервалом не более чем один час, два часа, три часа, четыре часа, пять часов, шесть часов, девять часов, двенадцать часов или 24 часа.

[161] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлен способ лечения человека с PKU путем введения эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей вектор на основе рекомбинантного вируса, кодирующий вариант полипептида PAH по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит одно или несколько фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ.

[162] В некоторых вариантах осуществления способы включают введение эффективного количества фармацевтической композиции, содержащей рекомбинантный вирусный вектор, кодирующий вариант полипептида PAH по настоящему изобретению, для лечения PKU у нуждающегося в этом индивидуума. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет любое из по меньшей мере приблизительно 5 × 10¹², 6 × 10¹², 7 × 10¹², 8 × 10¹², 9 × 10¹², 10 × 10¹², 11 × 10¹², 15 × 10¹², 20 × 10¹², 25 × 10¹², 30 × 10¹², или 50 × 10¹² копий генома/мл. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет любое из приблизительно 5 × 10¹²-6 × 10¹², 6 × 1012-7 × 10¹², 7 × 10¹²-8 × 10¹², 8 × 10¹²-9 × 10¹², 9 × 10¹²-10 × 10¹², 10 × 10¹²-11 × 10¹², 11 × 10¹²-15 × 10¹², 15 × 10¹²-20 × 10¹², 20 × 10¹²-25 × 10¹², 25 × 10¹²-30 × 10¹², 30 × 10¹²-50 × 10¹² , или 50 × 10¹²-100 × 10¹² копий генома/мл. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет любое из приблизительно 5 × 10¹²-10 × 10¹², 10 × 10¹²-25 × 10¹², или 25 × 10¹²-50 × 10¹² копий генома/мл. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет любое из по меньшей мере приблизительно 5 × 10⁹, 6 × 10⁹, 7 × 10⁹, 8 × 10⁹, 9 × 10⁹, 10 × 10⁹, 11 × 10⁹, 15 × 10⁹, 20 × 10⁹, 25 × 10⁹, 30 × 10⁹, или 50 × 10⁹ трансдуцирующих единиц/мл. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет любое из приблизительно 5 × 10⁹-6 × 10⁹, 6 × 10⁹-7 × 10⁹, 7 × 10⁹-8 × 10⁹, 8 × 10⁹-9 × 10⁹, 9 × 10⁹-10 × 10⁹, 10 × 10⁹-11 × 10⁹, 11 × 10⁹-15 × 10⁹, 15 × 10⁹-20 × 10⁹, 20 × 10⁹-25 × 10⁹, 25 × 10⁹-30 × 10⁹, 30 × 10^9-50 × 10⁹ или 50 × 10⁹-100 × 10⁹ трансдуцирующих единиц/мл. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет любое из приблизительно 5 × 10⁹-10 × 10⁹, 10 × 10⁹-15 × 10⁹, 15 × 10⁹-25 × 10⁹, или 25 × 10⁹-50 × 10⁹ трансдуцирующих единиц/мл. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет любое из по меньшей мере приблизительно 5 × 10¹⁰, 6 × 10¹⁰, 7 × 10¹⁰, 8 × 10¹⁰, 9 × 10¹⁰, 10 × 10¹⁰, 11 × 10¹⁰, 15 × 10¹⁰, 20 × 10¹⁰, 25 × 10¹⁰, 30 × 10¹⁰, 40 × 10¹⁰, или 50 × 10¹⁰ инфекционных единиц/мл. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет по меньшей мере приблизительно 5 × 10¹⁰-6 × 10¹⁰, 6 × 10¹⁰-7 × 10¹⁰, 7 × 10¹⁰-8 × 10¹⁰, 8 × 10¹⁰-9 × 10¹⁰, 9 × 10¹⁰-10 × 10¹⁰, 10 × 10¹⁰-11 × 10¹⁰, 11 × 10¹⁰-15 × 10¹⁰, 15 × 10¹⁰-20 × 10¹⁰, 20 × 10¹⁰-25 × 10¹⁰, 25 × 10¹⁰-30 × 10¹⁰, 30 × 10¹⁰-40 × 10¹⁰, 40 × 10¹⁰-50 × 10¹⁰, или 50 × 10¹⁰-100 × 10¹⁰ инфекционных единиц/мл. В некоторых вариантах осуществления значение вирусного титра вирусных частиц (например, частиц rAAV) составляет любое из по меньшей мере приблизительно 5 × 10¹⁰-10 × 10¹⁰, 10 × 10¹⁰-15 × 10¹⁰, 15 × 10¹⁰-25 × 10¹⁰, или 25 × 10¹⁰-50 × 10¹⁰ инфекционных единиц/мл.

[163] В некоторых вариантах осуществления доза вирусных частиц, вводимых индивидууму, составляет по меньшей мере любое из значений от приблизительно 1×10⁸ до приблизительно 6×10¹³ копий генома/кг веса тела. В некоторых вариантах осуществления доза вирусных частиц, вводимых индивидууму, составляет любое из значений от приблизительно 1×10⁸ до приблизительно 6×10¹³ копий генома/кг веса тела.

[164] В некоторых вариантах осуществления общее количество вирусных частиц, вводимых индивидууму, составляет по меньшей мере любое из значений от приблизительно 1×10⁹ до приблизительно 1×10¹⁴ копий генома. В некоторых вариантах осуществления общее количество вирусных частиц, вводимых индивидууму, составляет любое из значений от приблизительно 1×10⁹ до приблизительно 1×10¹⁴ копий генома.

[165] Композиции по настоящему изобретению (например, рекомбинантные вирусные частицы, содержащие вектор, кодирующий вариант полипептида PAH по настоящему изобретению) можно применять либо отдельно, либо в комбинации с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами для лечения PKU. Интервал между последовательными введениями может измеряться в сроках, составляющих по меньшей мере (или, в качестве альтернативы, менее чем) минуты, часы или дни.

[166] Эффективное количество rAAV (в некоторых вариантах осуществления в форме частиц) вводят в зависимости от целей лечения. Например, если при низкой процентной доле трансдукции можно достичь требуемого терапевтического эффекта, то целью лечения обычно является соответствие данному уровню трансдукции или его превышение. В некоторых случаях этого уровня трансдукции можно достичь путем трансдукции лишь приблизительно 1-5% клеток-мишеней, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 20% клеток требуемого типа ткани, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 50%, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 80%, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 95%, в некоторых вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 99% клеток требуемого типа ткани. Композицию на основе rAAV можно вводить с помощью осуществления одного или нескольких введений, осуществляемых в ходе одной и той же процедуры или разделенных несколькими днями, неделями, месяцами или годами. В некоторых вариантах осуществления несколько векторов можно применять для лечения млекопитающего (например, человека).

[167] В некоторых вариантах осуществления композицию на основе rAAV по настоящему изобретению можно применять для введения человеку. В некоторых вариантах осуществления композицию на основе rAAV по настоящему изобретению можно применять для введения лицам детского возраста. Не желая ограничиваться теорией, поскольку природа многих из симптомов PKU связана с развитием (например, тяжелые психические расстройства), особенно преимущественным может являться лечение PKU, которое начинают как можно в более раннем возрасте. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество rAAV (в некоторых вариантах осуществления в форме частиц) вводят пациенту в возрасте менее одного месяца, менее двух месяцев, менее трех месяцев, менее четырех месяцев, менее пяти месяцев, менее шести месяцев, менее семи месяцев, менее восьми месяцев, менее девяти месяцев, менее десяти месяцев, менее одиннадцати месяцев, менее одного года, менее 13 месяцев, менее 14 месяцев, менее 15 месяцев, менее 16 месяцев, менее 17 месяцев, менее 18 месяцев, менее 19 месяцев, менее 20 месяцев, менее 21 месяца, менее 22 месяцев, менее двух лет или менее трех лет.

[168] В некоторых вариантах осуществления композицию на основе rAAV по настоящему изобретению можно применять для введения совершеннолетнему молодому человеку. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество rAAV (в некоторых вариантах осуществления в форме частиц) вводят пациенту в возрасте менее 12 лет, менее 13 лет, менее 14 лет, менее 15 лет, менее 16 лет, менее 17 лет, менее 18 лет, менее 19 лет, менее 20 лет, менее 21 года, менее 22 лет, менее 23 лет, менее 24 лет или менее 25 лет.

[169] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлены способы лечения PKU, включающие введение нуждающемуся в этом индивидууму терапевтически эффективного количества клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант полипептида PAH, описанный в данном документе. В некоторых вариантах осуществления клетка содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант полипептида PAH, предусматривающий по меньшей мере три аминокислотные замены, где аминокислотные замены находятся в сайтах полипептида человеческой PAH дикого типа, выбранных из M180, K199, S250 и G256. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий четыре аминокислотные замены в сайтах M180, K199, S250 и G256 полипептида человеческой PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий по меньшей мере три аминокислотные замены, выбранные из M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий аминокислотные замены M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий аминокислотную замену, предусматривающую K199P, S250P и G256A; M180T, S250P и G256A; M180T, K199P и G256A или M180T, K199P и S250P. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий аминокислотные замены M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует вариант полипептида PAH, дополнительно предусматривающий аминокислотные замены H264P, G272A, G272P, P275L, P279Q, G272P и P275L или аминокислотные замены T323R и F327T. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует вариант полипептида PAH, представляющий собой любой из вариантов полипептидов PAH, представленных в таблицах 1-3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий аминокислотные замены M180T, K199P, S250P и G256A, а также предусматривающий дополнительные аминокислотные замены при сохранении по меньшей мере приблизительного уровня фенилаланингидроксилазной активности PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления положение аминокислотных замен, кодируемых нуклеиновой кислотой в клетке, основано на полипептиде человеческой PAH дикого типа; например на полипептиде человеческой PAH, содержащем аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1.

[170] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует вариант полипептида человеческой PAH. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотные последовательности, которые являются идентичными на любую из величин, составляющих по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99%, аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотные последовательности, которые являются идентичными на любую из величин, составляющих по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99%, аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:3, а также характеризующийся уровнем фенилаланингидроксилазной активности, составляющим по меньшей мере приблизительно 25%, 50%, 75%, 100% или более чем 100% от ее уровня для PAH дикого типа. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотные последовательности, которые являются идентичными на любую из величин, составляющих по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99%, аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:3, а также характеризующийся уровнем фенилаланингидроксилазной активности, составляющим по меньшей мере приблизительно 25%, 50%, 75%, 100% или более чем 100% от ее уровня для PAH дикого типа под SEQ ID NO:1.

[171] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует вариант полипептида PAH, представляющий собой усеченный полипептид PAH, который сохраняет фенилаланингидроксилазную активность. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует усеченный полипептид PAH, предусматривающий N-концевое усечение. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует наличие N-концевого усечения, представляющего собой усечение части или всего N-концевого регуляторного домена. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует наличие N-концевого усечения, предусматривающего делецию участка от аминокислотного остатка 1 до приблизительно аминокислотного остатка 102 в полипептиде человеческой PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует усеченный полипептид PAH, предусматривающий C-концевое усечение. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует наличие C-концевого усечения, представляющего собой усечение части или всего тетрамеризационного домена. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует наличие C-концевого усечения, предусматривающего делецию участка аминокислотных остатков от приблизительно 429 до 452 в полипептиде человеческой PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует вариант полипептида PAH, предусматривающий N-концевое усечение и C-концевое усечение. В некоторых вариантах осуществления усеченный полипептид PAH предусматривает усечение части или всей N-концевой регуляторной последовательности и части или всего тетрамеризационного домена. В некоторых вариантах осуществления усеченный полипептид PAH предусматривает делецию участка от аминокислотного остатка 1 до приблизительно аминокислотного остатка 102 и от приблизительно 429 до приблизительно 452 в полипептиде человеческой PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам от приблизительно 102 до приблизительно 428 в полипептиде PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует вариант полипептида PAH, содержащий аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам от 102 до 428 в полипептиде PAH дикого типа (например, полипептиде PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует усеченный полипептид PAH, дополнительно предусматривающий четыре аминокислотные замены в сайтах M180, K199, S250 и G256 полипептида человеческой PAH дикого типа (например, полипептида PAH под SEQ ID NO:1). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует усеченный полипептид PAH, предусматривающий четыре аминокислотные замены, выбранные из M180T, K199P, S250P и G256A. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует усеченный вариант полипептида PAH, дополнительно предусматривающий любую из комбинаций аминокислотных замен, представленных в таблицах 1-3. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота в клетке кодирует усеченный полипептид PAH, характеризующийся уровнем фенилаланингидроксилазной активности, составляющим по меньшей мере приблизительно 25%, 50%, 75%, 100% или более чем 100% от ее уровня для PAH дикого типа (например, полипептида PAH под SEQ ID NO:1).

[172] В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлены способы лечения PKU посредством введения эффективного количества клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант полипептида PAH по настоящему изобретению. Клетки, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант полипептида PAH, можно вводить в конкретную представляющую интерес ткань или можно вводить системно. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант полипептида PAH, можно вводить парентерально. Парентеральные пути введения могут включать без ограничения внутривенный, внутрибрюшинный, внутрикостный, внутриартериальный, интрацеребральный, внутримышечный, интратекальный, подкожный, интрацеребровентрикулярный, внутрипеченочный и т. д. В некоторых вариантах осуществления клетки инкапсулированы или находятся в устройстве. В некоторых вариантах осуществления для экспрессирующих PAH клеток, находящихся за пределами печени, может потребоваться экзогенно добавленный или совместно экспрессируемый кофактор BH4. В некоторых вариантах осуществления клетки инкапсулированы или находятся в устройстве, которое дополнительно содержит BH4. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество клеток, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант полипептида PAH, можно вводить посредством одного пути введения. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида PAH, можно вводить посредством комбинации из более чем одного пути введения. В некоторых вариантах осуществления эффективное количество нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида PAH, вводят в один участок. В других вариантах осуществления эффективное количество варианта полипептида PAH можно вводить в более чем один участок.

[173] В некоторых вариантах осуществления клетки, содержащие нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант полипептида PAH, представляют собой гепатоцит, мышечную клетку, фибробласт, эндотелиальную клетку, эпителиальную клетку, клетку крови, клетку костного мозга, стволовую клетку или индуцированную плюрипотентную стволовую клетку. В некоторых вариантах осуществления клетка дополнительно содержит экзогенно добавленный кофактор BH4 и/или совместно экспрессируемый кофактор BH4.

[174] В некоторых вариантах осуществления клетка представлена линией клеток (например, линией клеток CHO, линией клеток HeLa и т. д.). В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении представлены способы получения варианта полипептида PAH, включающие культивирование клетки, содержащей нуклеиновую кислоту, кодирующую вариант полипептида PAH (например, вектор экспрессии, кодирующий вариант полипептида PAH), в условиях, обеспечивающих продуцирование варианта полипептида PAH. В некоторых вариантах осуществления способ получения варианта полипептида PAH дополнительно включает одну или несколько стадий очистки варианта полипептида PAH.

VII. Наборы или изделия

[175] Варианты полипептидов PAH, нуклеиновые кислоты, векторы на основе rAAV, частицы и/или фармацевтические композиции, описанные в данном документе, могут содержаться в наборе или изделии, например, разработанном для применения в одном из способов по настоящему изобретению, описанных в данном документе.

[176] Как правило, система содержит канюлю, один или несколько шприцев (например, 1, 2, 3, 4 или больше) и одну или несколько жидкостей (например, 1, 2, 3, 4 или больше), подходящих для применения в способах по настоящему изобретению.

[177] Шприц может представлять собой любой подходящий шприц, при условии, что его можно соединить с канюлей для доставки жидкости. В некоторых вариантах осуществления система содержит один шприц. В некоторых вариантах осуществления система содержит два шприца. В некоторых вариантах осуществления система содержит три шприца. В некоторых вариантах осуществления система содержит четыре или более шприцов. Жидкости, подходящие для применения в способах по настоящему изобретению, включают жидкости, описанные в данном документе, например, одну или несколько жидкостей, каждая из которых содержит эффективное количество одного или нескольких векторов, описанных в данном документе, и одну или несколько жидкостей, содержащих одно или несколько терапевтических средств.

[178] В некоторых вариантах осуществления набор содержит одну жидкость (например, фармацевтически приемлемую жидкость, содержащую эффективное количество вектора). В некоторых вариантах осуществления набор содержит 2 жидкости. В некоторых вариантах осуществления набор содержит 3 жидкости. В некоторых вариантах осуществления набор содержит 4 или больше жидкостей. Жидкость может включать разбавитель, буфер, вспомогательное вещество или любую другую жидкость, описанную в данном документе или известную из уровня техники, подходящую для доставки, разбавления, стабилизации, забуферивания или транспортировки иным образом композиции, содержащей вариант полипептида PAH или вектор на основе rAAV по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления набор содержит один или несколько буферов, например водный pH-буферный раствор. Примеры буферов могут включать без ограничения фосфатный, цитратный, трис-, HEPES и другие буферы на основе органических кислот.

[179] В некоторых вариантах осуществления набор содержит контейнер. Подходящие контейнеры могут включать, например, ампулы, пакеты, шприцы и флаконы. Контейнер может быть изготовлен из одного или нескольких материалов, таких как стекло, металл или пластик. В некоторых вариантах осуществления контейнер используют для хранения композиции на основе rAAV по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления контейнер может также содержать жидкость и/или другое терапевтическое средство.

[180] В некоторых вариантах осуществления набор содержит дополнительное терапевтическое средство совместно с композицией на основе rAAV по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления композиция на основе rAAV и дополнительное терапевтическое средство могут быть смешаны. В некоторых вариантах осуществления композиция на основе rAAV и дополнительное терапевтическое средство могут храниться раздельно. В некоторых вариантах осуществления композиция на основе rAAV и дополнительное терапевтическое средство могут находиться в одном и том же контейнере. В некоторых вариантах осуществления композиция на основе rAAV и дополнительное терапевтическое средство могут находиться в разных контейнерах. В некоторых вариантах осуществления композицию на основе rAAV и дополнительное терапевтическое средство можно вводить одновременно. В некоторых вариантах осуществления композицию на основе rAAV и дополнительное терапевтическое средство можно вводить в один и тот же день. В некоторых вариантах осуществления композицию на основе rAAV можно вводить в течение одного дня, двух дней, трех дней, четырех дней, пяти дней, шести дней, семи дней, двух недель, трех недель, четырех недель, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев, пяти месяцев или шести месяцев относительно введения дополнительного терапевтического средства.

[181] В некоторых вариантах осуществления набор содержит терапевтическое средство, которое временно подавляет иммунную систему перед введением AAV. В некоторых вариантах осуществления иммунную систему пациентов временно подавляют незадолго до и после проведения инъекции вируса с целью подавления Т-клеточного ответа на частицы AAV (см., например, Ferreira et al., Hum. Gene Ther. 25:180-188, 2014). В некоторых вариантах осуществления набор дополнительно предусматривает циклоспорин, микофенолата мофетил и/или метилпреднизолон.

[182] Частицы rAAV и/или композиции на их основе по настоящему изобретению можно дополнительно упаковывать в наборы, содержащие инструкции по применению. В некоторых вариантах осуществления наборы дополнительно содержат устройство для доставки (например, для любого типа парентерального введения, описанного в данном документе) композиций на основе частиц rAAV. В некоторых вариантах осуществления инструкции по применению предусматривают инструкции в соответствии с одним из способов, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления инструкции напечатаны на этикетке, предоставляемой с контейнером (например, прикрепленной к нему). В некоторых вариантах осуществления инструкции по применению предусматривают инструкции по введению индивидууму (например, человеку) эффективного количества частиц rAAV, например, для лечения PKU у индивидуума.

VIII. Иллюстративные варианты осуществления

[183] Вариант осуществления 1. Вариант полипептида фенилаланингидроксилазы (PAH), предусматривающий две аминокислотные замены, где аминокислотные замены находятся в сайтах полипептида человеческой PAH дикого типа, выбранных из M180, K199, S250 и G256.

[184] Вариант осуществления 2. Вариант полипептида фенилаланингидроксилазы (PAH), предусматривающий три аминокислотные замены, где аминокислотные замены находятся в сайтах полипептида человеческой PAH дикого типа, выбранных из M180, K199, S250 и G256.

[185] Вариант осуществления 3. Вариант полипептида фенилаланингидроксилазы (PAH), предусматривающий четыре аминокислотные замены в сайтах M180, K199, S250 и G256 полипептида человеческой PAH дикого типа.

[186] Вариант осуществления 4. Вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-3, где аминокислотная замена предусматривает одну или несколько из M180T, K199P, S250P и G256A.

[187] Вариант осуществления 5. Вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-4, где аминокислотная замена предусматривает K199P, S250P и G256A; M180T, S250P и G256A; M180T, K199P и G256A или M180T, K199P и S250P.

[188] Вариант осуществления 6. Вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-5, где аминокислотная замена предусматривает M180T, K199P, S250P и G256A.

[189] Вариант осуществления 7. Вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-6, где вариант полипептида PAH дополнительно предусматривает аминокислотные замены H264P, G272A, G272P, P275L, P279Q, G272P и P275L или T323R и F327T.

[190] Вариант осуществления 8. Вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-7, где полипептид человеческой PAH дикого типа содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1.

[191] Вариант осуществления 9. Вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-8, где вариант полипептида PAH представляет собой полипептид человеческой PAH.

[192] Вариант осуществления 10. Вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-9, где вариант полипептида PAH содержит аминокислотные последовательности, которые на по меньшей мере приблизительно 80% идентичны аминокислотной последовательности под SEQ ID NO:3.

[193] Вариант осуществления 11. Вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-6, где вариант полипептида PAH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3.

[194] Вариант осуществления 12. Вариант PAH по любому из вариантов осуществления 1-11, где вариант полипептида PAH дополнительно предусматривает одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из G33A, G46A, G46P, G103A, G139A, G139P, G148A, G188A, G218A, G239A, G247A, G257A, G272A, G289A, G307A, G312A, G332A, G337A, G344A, G352A, и G442A, в полипептиде человеческой PAH дикого типа.

[195] Вариант осуществления 13. Вариант PAH по любому из вариантов осуществления 1-12, где вариант полипептида PAH дополнительно предусматривает одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из P9G, G10V, G12S, K184R, K192R, S196A, Y206H, H220R, Q336E, E360D, I374C, N376E, N401T, I421V, I441V, S446H,, и добавление S в положении 453 в полипептиде человеческой PAH дикого типа.

[196] Вариант осуществления 14. Вариант PAH по любому из вариантов осуществления 1-13, где вариант полипептида PAH дополнительно предусматривает одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из F240W, A246P, G247A, Y268W, C284F, T323R, F327Y, E319P, I306(Y, F), K113P, G188A, F191Y, T193R, Y206H, G337P и N376P, в полипептиде человеческой PAH дикого типа.

[197] Вариант осуществления 15. Вариант полипептида PAH, где вариант полипептида PAH предусматривает одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из G33A, G46A, G46P, G103A, G139A, G139P, G148A, G188A, G218A, G239A, G247A, G257A, G272A, G289A, G307A, G312A, G332A, G337A, G344A, G352A, и G442A, в полипептиде человеческой PAH дикого типа.

[198] Вариант осуществления 16. Вариант полипептида PAH, где вариант полипептида PAH предусматривает одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из P9G, G10V, G12S, K184R, K192R, S196A, Y206H, H220R, Q336E, E360D, I374C, N376E, N401T, I421V, I441V, S446H,, и добавление S в положении 453 в полипептиде человеческой PAH дикого типа.

[199] Вариант осуществления 17. Вариант полипептида PAH, где вариант полипептида PAH предусматривает одну или несколько аминокислотных замен, выбранных из F240W, A246P, G247A, Y268W, C284F, T323R, F327Y, E319P, I306(Y, F), K113P, G188A, F191Y, T193R, Y206H, G337P, и N376P, в полипептиде человеческой PAH дикого типа.

[200] Вариант осуществления 18. Вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-17, где вариант полипептида PAH предусматривает N-концевое усечение.

[201] Вариант осуществления 19. Вариант полипептида PAH по варианту осуществления 18, где N-концевое усечение предусматривает усечение N-концевого регуляторного домена.

[202] Вариант осуществления 20. Вариант полипептида PAH по вариантам осуществления 18 или 19, где N-концевое усечение предусматривает усечение аминокислотных остатков 1-102 полипептида PAH дикого типа.

[203] Вариант осуществления 21. Вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-20, где вариант полипептида PAH предусматривает C-концевое усечение.

[204] Вариант осуществления 22. Вариант полипептида PAH по варианту осуществления 21, где C-концевое усечение предусматривает усечение тетрамеризационного домена.

[205] Вариант осуществления 23. Вариант полипептида PAH по вариантам осуществления 21 или 22, где C-концевое усечение предусматривает усечение аминокислотных остатков 429-452 полипептида PAH дикого типа.

[206] Вариант осуществления 24. Вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-23, где вариант полипептида PAH содержит аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам 103-428 полипептида PAH дикого типа.

[207] Вариант осуществления 25. Вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-24, где вариант полипептида PAH предусматривает одну или несколько аминокислотных замен для устранения потенциальных сайтов расщепления протеазой.

[208] Вариант осуществления 26. Вариант полипептида PAH по варианту осуществления 25, где одна или несколько аминокислотных замен для устранения потенциальных сайтов расщепления протеазой расположены в положениях 270-295 и/или 380-405 полипептида PAH дикого типа.

[209] Вариант осуществления 27. Вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-26, где вариант полипептида PAH слит с полипептидом, нацеливающимся на печень.

[210] Вариант осуществления 28. Вариант полипептида PAH по варианту осуществления 27, где полипептид, нацеливающийся на печень, представлен HGF или его фрагментами или гликопротеинами, которые связываются с асиалогликопротеиновым рецептором гепатоцитов.

[211] Вариант осуществления 29. Вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-25, где вариант полипептида PAH является пегилированным и/или нитрозилированным.

[212] Вариант осуществления 30. Вариант полипептида PAH по варианту осуществления 26, где вариант полипептида PAH предусматривает аминокислотную замену I374C, при этом остаток Cys в положении 374 является нитрозилированным.

[213] Вариант осуществления 31. Композиция, содержащая вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-30.

[214] Вариант осуществления 32. Композиция по варианту осуществления 31, где композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

[215] Вариант осуществления 33. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-30.

[216] Вариант осуществления 34. Выделенная нуклеиновая кислота по варианту осуществления 33, где нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида PAH, функционально связана с промотором.

[217] Вариант осуществления 35. Выделенная нуклеиновая кислота по варианту осуществления 34, где промотор выбран из немедленно-раннего промотора цитомегаловируса (CMV), LTR RSV, LTR MoMLV, промотора гена фосфоглицераткиназы-1 (PGK), промотора вируса обезьян 40 (SV40), промотора CK6, промотора гена транстиретина (TTR), промотора mTTR482, промотора mA1MB2-mTTR482, промотора TK, тетрациклин-чувствительного промотора (TRE), промотора HBV, промотора hAAT, промотора LSP, промотора LP1, химерного промотора, специфического в отношении печени (LSP), промотора E2F, промотора гена теломеразы (hTERT); составного промотора энхансер цитомегаловируса/промотор гена бета-актина курицы/промотор гена β-глобина кролика (CAG), промотора гена фактора элонгации 1-альфа (EF1-альфа), промотора гена β-глюкуронидазы человека, промотора гена β-актина курицы (CBA), модифицированного промотора гена β-актина курицы (CBA) или SEQ ID NO:17, ретровирусного LTR-промотора вируса саркомы Рауса (RSV), промотора гена дигидрофолатредуктазы и промотора гена 13-актина.

[218] Вариант осуществления 36. Выделенная нуклеиновая кислота по варианту осуществления 34 или 35, где промотор представляет собой промотор LP1 или промотор mA1MB2-mTTR482.

[219] Вариант осуществления 37. Выделенная нуклеиновая кислота по любому из вариантов осуществления 33-36, где нуклеиновая кислота дополнительно содержит сигнал полиаденилирования.

[220] Вариант осуществления 38. Выделенная нуклеиновая кислота по варианту осуществления 37, где сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста, сигнал полиаденилирования SV40 или pA TK HSV.

[221] Вариант осуществления 39. Выделенная нуклеиновая кислота по любому из вариантов осуществления 33-38, где нуклеиновая кислота дополнительно содержит интрон.

[222] Вариант осуществления 40. Выделенная нуклеиновая кислота по варианту осуществления 39, где интрон представляет собой гибридный интрон генов β-актина курицы (CBA)/β-глобина кролика.

[223] Вариант осуществления 41. Выделенная нуклеиновая кислота по варианту осуществления 39, где интрон представляет собой модифицированный гибридный интрон генов β-актина курицы (CBA)/β-глобина кролика под SEQ ID NO:15.

[224] Вариант осуществления 42. Выделенная нуклеиновая кислота по любому из вариантов осуществления 33-41, где нуклеиновая кислота дополнительно содержит один или несколько ITR.

[225] Вариант осуществления 43. Выделенная нуклеиновая кислота по любому из вариантов осуществления 33-42, где нуклеиновая кислота дополнительно содержит спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты.

[226] Вариант осуществления 44. Выделенная нуклеиновая кислота по варианту осуществления 43, где спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты оптимизирована с удалением последовательностей ATG.

[227] Вариант осуществления 45. Выделенная нуклеиновая кислота по варианту осуществления 44, где спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой спейсерную последовательность интрона A1AT под SEQ ID NO:16.

[228] Вариант осуществления 46. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид человеческой PAH, где нуклеиновая кислота является кодон-оптимизированной.

[229] Вариант осуществления 47. Выделенная нуклеиновая кислота по варианту осуществления 46, где последовательность нуклеиновой кислоты на по меньшей мере 80% идентична последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:14.

[230] Вариант осуществления 48. Выделенная нуклеиновая кислота по варианту осуществления 46, где нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO:14.

[231] Вариант осуществления 49. Выделенная нуклеиновая кислота по варианту осуществления 33, где нуклеиновая кислота представляет собой мРНК.

[232] Вариант осуществления 50. Композиция, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из вариантов осуществления 33-49.

[233] Вариант осуществления 51. Композиция по варианту осуществления 50, где композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

[234] Вариант осуществления 52. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из вариантов осуществления 33-49.

[235] Вариант осуществления 53. Вектор по варианту осуществления 52, где вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).

[236] Вариант осуществления 54. Вектор на основе rAAV, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из вариантов осуществления 33-41 или 43-49, фланкированную одной или несколькими последовательностями инвертированного концевого повтора (ITR) AAV.

[237] Вариант осуществления 55. Вектор на основе rAAV по варианту осуществления 54, где нуклеиновая кислота по любому из вариантов осуществления 33-48 фланкирована двумя ITR AAV.

[238] Вариант осуществления 56. Вектор на основе rAAV по варианту осуществления 54 или 55, где ITR AAV представляют собой ITR AAV, предусматривающие ITR серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV козы, AAV крупного рогатого скота или AAV мыши.

[239] Вариант осуществления 57. Вектор на основе rAAV по любому из вариантов осуществления 54-56, где ITR AAV представляют собой ITR AAV2.

[240] Вариант осуществления 58. Вектор на основе rAAV по варианту осуществления 57, где вектор на основе rAAV содержит в направлении от 5'- к 3'-концу ITR AAV2, промотор, интрон, нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид PAH, спейсерную последовательность нуклеиновой кислоты, сигнал полиаденилирования и ITR AAV2.

[241] Вариант осуществления 59. Вектор на основе rAAV по варианту осуществления 58, где промотор представляет собой промотор m1A1MB2-mTTR482 или промотор LP1.

[242] Вариант осуществления 60. Вектор на основе rAAV по варианту осуществления 58 или 59, где интрон представляет собой гибридный интрон генов β-актина курицы (CBA)/β-глобина кролика.

[243] Вариант осуществления 61. Вектор на основе rAAV по любому из вариантов осуществления 58-59, где полипептид PAH представляет собой вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-30.

[244] Вариант осуществления 62. Вектор на основе rAAV по любому из вариантов осуществления 58-60, где нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид PAH, представляет собой кодон-оптимизированную нуклеиновую кислоту по любому из вариантов осуществления 46-48.

[245] Вариант осуществления 63. Вектор на основе rAAV по любому из вариантов осуществления 58-62, где спейсерная последовательность нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты из интрона гена альфа-1-антитрипсина человека.

[246] Вариант осуществления 64. Вектор на основе rAAV по варианту осуществления 63, где интрон гена альфа-1-антитрипсина человека был мутирован с удалением последовательностей ATG.

[247] Вариант осуществления 65. Вектор на основе rAAV по любому из вариантов осуществления 58-64, где сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста.

[248] Вариант осуществления 66. Вектор на основе rAAV по любому из вариантов осуществления 53-65, где вектор представляет собой самокомплементарный вектор.

[249] Вариант осуществления 67. Вектор на основе rAAV по варианту осуществления 66, где вектор содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PAH, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность, комплементарную последовательности полипептида PAH, при этом первая последовательность нуклеиновой кислоты может образовывать внутринитевые пары оснований со второй последовательностью нуклеиновой кислоты на протяжении большей части или всей ее длины.

[250] Вариант осуществления 68. Вектор на основе rAAV по варианту осуществления 67, где первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая последовательность нуклеиновой кислоты соединены мутантным ITR AAV, при этом мутантный ITR AAV предусматривает делецию D-области и предусматривает мутацию последовательности концевого разрешения.

[251] Вариант осуществления 69. Частица rAAV, содержащая вектор на основе rAAV по любому из вариантов осуществления 53-68.

[252] Вариант осуществления 70. Частица rAAV по варианту осуществления 69, где вирусная частица AAV содержит капсид серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, AAV козы, химерного AAV1/AAV2, AAV крупного рогатого скота, AAV мыши или rAAV2/HBoV1.

[253] Вариант осуществления 71. Частица rAAV по варианту осуществления 69, где вирусная частица AAV содержит сконструированный капсид AAV.

[254] Вариант осуществления 72. Частица rAAV по варианту осуществления 71, где сконструированный капсид AAV представляет собой капсид DJ или капсид LK03.

[255] Вариант осуществления 73. Частица rAAV по варианту осуществления 69 или варианту осуществления 70, где ITR и капсид вирусной частицы rAAV получены из одного и того же серотипа AAV.

[256] Вариант осуществления 74. Частица rAAV по варианту осуществления 69 или 70, где ITR и капсид вирусных частиц rAAV получены из разных серотипов AAV.

[257] Вариант осуществления 75. Частица rAAV по любому из вариантов осуществления 69-70 или 73-74, где вирусная частица rAAV содержит капсид AAV8.

[258] Вариант осуществления 76. Частица rAAV по варианту осуществления 74, где вирусная частица rAAV содержит капсид AAV8, и где вектор содержит ITR AAV2.

[259] Вариант осуществления 77. Композиция, содержащая частицу rAAV по любому из вариантов осуществления 69-76.

[260] Вариант осуществления 78. Композиция по варианту осуществления 77, где композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

[261] Вариант осуществления 79. Клетка, содержащая нуклеиновую кислоту по любому из вариантов осуществления 33-49, или вектор по п. 52 или п. 53, или вектор на основе rAAV по любому из вариантов осуществления 54-68.

[262] Вариант осуществления 80. Способ получения варианта полипептида PAH, при этом способ включает культивирование клетки по варианту осуществления 79 в условиях, обеспечивающих продуцирование варианта полипептида PAH.

[263] Вариант осуществления 81. Способ по варианту осуществления 80, дополнительно включающий стадию очистки варианта полипептида PAH.

[264] Вариант осуществления 82. Способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму варианта полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-30 или композиции по варианту осуществления 31 или 32.

[265] Вариант осуществления 83. Способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-30, или нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 33, 34 или 49.

[266] Вариант осуществления 84. Способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму вектора на основе rAAV по любому из вариантов осуществления 53-68.

[267] Вариант осуществления 85. Способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму частицы rAAV по любому из вариантов осуществления 69-76.

[268] Вариант осуществления 86. Способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму композиции по варианту осуществления 31, 32, 50, 51, 77 или 78.

[269] Вариант осуществления 87. Способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму клетки по варианту осуществления 79.

[270] Вариант осуществления 88. Способ по любому из вариантов осуществления 82-87, где у индивидуума отсутствует активность PAH.

[271] Вариант осуществления 89. Способ снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму варианта полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-30 или композиции по п. 31 или п. 32.

[272] Вариант осуществления 90. Способ снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-30, или нуклеиновой кислоты по варианту осуществления 33, 34 или 49.

[273] Вариант осуществления 91. Способ снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму вектора на основе rAAV по любому из вариантов осуществления 53-68.

[274] Вариант осуществления 92. Способ снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму частицы rAAV по любому из вариантов осуществления 69-76.

[275] Вариант осуществления 93. Способ снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму композиции по варианту осуществления 31, 32, 50, 51, 77 или 78.

[276] Вариант осуществления 94. Способ снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму клетки по варианту осуществления 79.

[277] Вариант осуществления 95. Способ по любому из вариантов осуществления 89-94, где уровень фенилаланина в крови у индивидуума до лечения является повышенным по сравнению с уровнем фенилаланина в крови у подобранных по принципу паритетности контрольных идивидуумов.

[278] Вариант осуществления 96. Способ по любому из вариантов осуществления 82-95, где вариант полипептида PAH, нуклеиновую кислоту, вектор на основе rAAV, частицу rAAV, композицию или клетку вводят внутривенно, внутриартериально, внутрипеченочно, внутрипортально, внутрибрюшинно или подкожно.

[279] Вариант осуществления 97. Способ по любому из вариантов осуществления 82-96, где введение осуществляют в комбинации с другим видом терапии.

[280] Вариант осуществления 98. Способ по варианту осуществления 97, где другой вид терапии представляет собой лечение с помощью тетрагидробиоптерина, лечение с помощью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) или пегилированной PAL или диету с ограничением потребления фенилаланина.

[281] Вариант осуществления 99. Способ получения полипептида PAH, включающий культивирование клетки по варианту осуществления 79 в условиях, обеспечивающих продуцирование полипептида PAH.

[282] Вариант осуществления 100. Способ по варианту осуществления 99, дополнительно включающий очистку полипептида PAH.

[283] Вариант осуществления 101. Набор, содержащий вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-24.

[284] Вариант осуществления 102. Набор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из вариантов осуществления 33-46, вектор на основе rAAV по любому из вариантов осуществления 53-68, частицу rAAV по любому из вариантов осуществления 69-76 или композицию по варианту осуществления 77 или 78.

[285] Вариант осуществления 103. Набор по варианту осуществления 101 или 102, где набор дополнительно содержит инструкции по применению, буферы и/или фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества и/или флаконы, ампулы и/или шприцы.

[286] Вариант осуществления 104. Кассета экспрессии для обеспечения экспрессии трансгена в клетке печени, где кассета экспрессии содержит трансген, функционально связанный с промотором и энхансером, при этом промотор предусматривает промотор гена транстиретина мыши (mTTR), а энхансер предусматривает один или два модифицированных энхансера гена протромбина (pPrT2), один или два модифицированных энхансера гена альфа-1-микробикунина (mA1MB2), модифицированный энхансер гена альбумина мыши (mEalb), энхансер II вируса гепатита B (HE11) или энхансер CRM8.

[287] Вариант осуществления 105. Кассета экспрессии по варианту осуществления 104, где промотор mTTR представляет собой промотор mTTR482.

[288] Вариант осуществления 106. Кассета экспрессии по варианту осуществления 104 или 105, где энхансер расположен со стороны 5'-конца относительно промотора mTTR.

[289] Вариант осуществления 107. Кассета экспрессии для обеспечения экспрессии трансгена в клетке печени, где кассета экспрессии содержит трансген, функционально связанный с промотором и 3'-элементом, при этом промотор предусматривает промотор гена транстиретина мыши (mTTR), а 3'-элемент представляет собой 3'-элемент гена альбумина (3'Alb) или 3'-элемент гена альбумина, связанный с участком прикрепления к ядерному скелету/матриксу (SMAR) гена альфа-1-антитрипсина человека (3'AlbSMAR).

[290] Вариант осуществления 108. Кассета экспрессии по варианту осуществления 107, где промотор mTTR представляет собой промотор mTTR482.

[291] Вариант осуществления 109. Кассета экспрессии по варианту осуществления 107 или 108, где 3'-элемент расположен со стороны 3'-конца относительно трансгена.

[292] Вариант осуществления 110. Кассета экспрессии для обеспечения экспрессии трансгена в клетке печени, где кассета экспрессии содержит трансген, функционально связанный с промотором, и энхансером, и 3'-элементом, при этом промотор предусматривает промотор гена транстиретина мыши (mTTR), а энхансер предусматривает один или два модифицированных энхансера гена протромбина (pPrT2), один или два модифицированных энхансера гена альфа-1-микробикунина (mA1MB2), модифицированный энхансер гена альбумина мыши (mEalb), энхансер II вируса гепатита B (HE11) или энхансер CRM8; и при этом 3'-элемент представляет собой 3'-элемент гена альбумина (3'Alb) или 3'-элемент гена альбумина, связанный с участком прикрепления к ядерному скелету/матриксу (SMAR) гена альфа-1-антитрипсина человека (3'AlbSMAR).

[293] Вариант осуществления 111. Кассета экспрессии по варианту осуществления 110, где промотор mTTR представляет собой промотор mTTR482.

[294] Вариант осуществления 112. Кассета экспрессии по варианту осуществления 110 или 111, где энхансер расположен со стороны 5'-конца относительно промотора mTTR.

[295] Вариант осуществления 113. Кассета экспрессии по любому из вариантов осуществления 110-112, где 3'-элемент расположен со стороны 3'-конца относительно трансгена.

[296] Вариант осуществления 114. Кассета экспрессии по любому из вариантов осуществления 104-113, где кассета экспрессии дополнительно содержит интрон.

[297] Вариант осуществления 115. Кассета экспрессии по варианту осуществления 114, где интрон представляет собой гибридный интрон генов β-актина курицы/β-глобина кролика.

[298] Вариант осуществления 116. Кассета экспрессии по любому из вариантов осуществления 104-115, где кассета экспрессии дополнительно содержит сигнал полиаденилирования.

[299] Вариант осуществления 117. Кассета экспрессии по варианту осуществления 116, где сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста.

[300] Вариант осуществления 118. Кассета экспрессии по любому из вариантов осуществления 104-117, где трансген кодирует полипептид PAH или вариант полипептида PAH.

[301] Вариант осуществления 119. Кассета экспрессии по варианту осуществления 118, где вариант полипептида PAH представляет собой вариант полипептида PAH по любому из вариантов осуществления 1-30.

[302] Вариант осуществления 120. Вектор, содержащий кассету экспрессии по любому из вариантов осуществления 104-119.

[303] Вариант осуществления 121. Вектор по варианту осуществления 120, где вектор представляет собой вектор на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV).

[304] Вариант осуществления 122. Вектор на основе rAAV, содержащий кассету экспрессии по любому из вариантов осуществления 104-119, фланкированную одной или несколькими последовательностями инвертированного концевого повтора (ITR) AAV.

[305] Вариант осуществления 123. Вектор на основе rAAV по варианту осуществления 122, где кассета экспрессии по любому из вариантов осуществления 104-118 фланкирована двумя ITR AAV.

[306] Вариант осуществления 124. Вектор на основе rAAV по варианту осуществления 122 или 123, где ITR AAV представляют собой ITR AAV, предусматривающие ITR серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV козы, AAV крупного рогатого скота или AAV мыши.

[307] Вариант осуществления 125. Вектор на основе rAAV по любому из вариантов осуществления 122-124, где ITR AAV представляют собой ITR AAV2.

[308] Вариант осуществления 126. Вектор на основе rAAV по любому из вариантов осуществления 122-125, где вектор представляет собой самокомплементарный вектор.

[309] Вариант осуществления 127. Вектор на основе rAAV по варианту осуществления 126, где вектор содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PAH, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность, комплементарную последовательности полипептида PAH, при этом первая последовательность нуклеиновой кислоты может образовывать внутринитевые пары оснований со второй последовательностью нуклеиновой кислоты на протяжении большей части или всей ее длины.

[310] Вариант осуществления 128. Вектор на основе rAAV по варианту осуществления 127, где первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая последовательность нуклеиновой кислоты соединены мутантным ITR AAV, при этом мутантный ITR AAV предусматривает делецию D-области и предусматривает мутацию последовательности концевого разрешения.

[311] Вариант осуществления 129. Частица rAAV, содержащая вектор на основе rAAV по любому из вариантов осуществления 122-127.

[312] Вариант осуществления 130. Частица rAAV по варианту осуществления 129, где вирусная частица AAV содержит капсид серотипа AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, AAV козы, химерного AAV1/AAV2, AAV крупного рогатого скота, AAV мыши или rAAV2/HBoV1.

[313] Вариант осуществления 131. Частица rAAV по варианту осуществления 130, где вирусная частица AAV содержит сконструированный капсид AAV.

[314] Вариант осуществления 132. Частица rAAV по варианту осуществления 131, где сконструированный капсид AAV представляет собой капсид DJ или капсид LK03.

[315] Вариант осуществления 133. Частица rAAV по варианту осуществления 131 или 132, где ITR и капсид вирусной частицы rAAV получены из одного и того же серотипа AAV.

[316] Вариант осуществления 134. Частица rAAV по варианту осуществления 131 или 132, где ITR и капсид вирусных частиц rAAV получены из разных серотипов AAV.

[317] Вариант осуществления 135. Композиция, содержащая частицу rAAV по любому из вариантов осуществления 129-134.

[318] Вариант осуществления 136. Композиция по варианту осуществления 135, где композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

[319] Вариант осуществления 137. Клетка, содержащая кассету экспрессии по любому из вариантов осуществления 104-119 или вектор по любому из вариантов осуществления 120-128.

[320] Вариант осуществления 138. Способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму кассеты экспрессии по любому из вариантов осуществления 104-119.

[321] Вариант осуществления 139. Способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму вектора на основе rAAV по любому из вариантов осуществления 122-128.

[322] Вариант осуществления 140. Способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму частицы rAAV по любому из вариантов осуществления 129-134.

[323] Вариант осуществления 141. Способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму композиции по варианту осуществления 135 или 136.

[324] Вариант осуществления 142. Способ лечения фенилкетонурии у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму клетки по варианту осуществления 137.

[325] Вариант осуществления 143. Способ по любому из вариантов осуществления 138-142, где у индивидуума отсутствует активность PAH.

[326] Вариант осуществления 144. Способ снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму кассеты экспрессии по любому из вариантов осуществления 104-119.

[327] Вариант осуществления 145. Способ снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму вектора на основе rAAV по любому из вариантов осуществления 122-128.

[328] Вариант осуществления 146. Способ снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму частицы rAAV по любому из вариантов осуществления 129-134.

[329] Вариант осуществления 147. Способ снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму композиции по варианту осуществления 135 или 136.

[330] Вариант осуществления 148. Способ снижения уровня фенилаланина в крови у нуждающегося в этом индивидуума, включающий введение индивидууму клетки по варианту осуществления 137.

[331] Вариант осуществления 149. Способ по любому из вариантов осуществления 144-148, где уровень фенилаланина в крови у индивидуума до лечения является повышенным по сравнению с уровнем фенилаланина в крови у подобранных по принципу паритетности контрольных идивидуумов.

[332] Вариант осуществления 150. Способ по любому из вариантов осуществления 138-149, где нуклеиновую кислоту, вектор на основе rAAV, частицу rAAV, композицию или клетку вводят внутривенно, внутриартериально, внутрипеченочно, внутрипортально, внутрибрюшинно или подкожно.

[333] Вариант осуществления 151. Способ по любому из вариантов осуществления 138-150, где введение осуществляют в комбинации с другим видом терапии.

[334] Вариант осуществления 152. Способ по варианту осуществления 151, где другой вид терапии представляет собой лечение с помощью тетрагидробиоптерина, лечение с помощью фенилаланин-аммиак-лиазы (PAL) или пегилированной PAL или диету с ограничением потребления фенилаланина.

[335] Вариант осуществления 153. Набор, содержащий кассету экспрессии по любому из вариантов осуществления 104-119, вектор на основе rAAV по любому из вариантов осуществления 122-128, частицу rAAV по любому из вариантов осуществления 129-134 или композицию по варианту осуществления 135 или 136.

[336] Вариант осуществления 154. Набор по варианту осуществления 153, где набор дополнительно содержит инструкции по применению, буферы и/или фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества и/или флаконы, ампулы и/или шприцы.

ПРИМЕРЫ

[337] Настоящее изобретение будет более понятным со ссылкой на следующие примеры. Тем не менее, их не следует истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Понятно, что описанные в данном документе примеры и варианты осуществления служат только в качестве иллюстрации, и что различные модификации или изменения с их учетом будут понятны специалистам в данной области техники, и они должны быть включены в сущность и содержание данной заявки, а также объем прилагаемых вариантов осуществления.

Пример 1. Получение специфической в отношении печени кассеты экспрессии

[338] Следующее исследование проводили для разработки конструкции с сильной экспрессией для обеспечения экспрессии трансгена в печени индивидуума.

Материалы и способы для примеров 1-3

Конструирование кассет экспрессии PAH и векторов на основе rAAV

[339] С целью увеличения силы специфичного для печени промотора для дополнительных модификаций использовали плазмиду mTTR482-HI-hFVIII-BGHpA, содержащую промотор гена транстиретина мыши (mTTR), эндогенный энхансер mTTR и сайт полиаденилирования (pA) бычьего гормона роста (BGH) (Kyostio-Moore 2016, Nambiar 2017). В этой плазмиде кДНК FVIII заменяли на кДНК, кодирующую секретируемую эмбриональную щелочную фосфатазу (SEAP), а существующий интрон заменяли гибридным интроном генов b-актина курицы (CBA)/бета-глобина кролика размером 1069 п. о. Различные последовательности специфичных для печени энхансеров встраивали выше местоположения энхансера mTTR482. Они включали модифицированный энхансер гена протромбина (mPrT2, две копии), модифицированный энхансер гена альфа-1-микробикунина (mA1MB2, две копии) (McEachern 2006, Jacobs 2008), модифицированный энхансер гена альбумина мыши (mEalb) (Kramer 2003), энхансер II вируса гепатита B (E11) (Kramer 2003) и CRM8 (Chuah 2014). Кроме того, два 3'-элемента, полученных из гена альбумина (Alb 3') (Wooddell 2008) и гена альбумина плюс SMAR-элемент A1AT1 человека (AF156542) (Alb3'/SMAR), тестировали и встраивали ниже местоположения pA BGH (фиг. 1A). Модификации некоторых энхансеров заключались в изменении сайтов связывания печеночного ядерного фактора (HNF) 3 и 4 на последовательность с более высокой аффинностью, осуществляемые по аналогии с теми, что выполняли для mTTR482 ранее (Nambiar 2017; приложение 1).

[340] Для получения плазмидных кассет экспрессии человеческой или мышиной PAH соответствующие кДНК, кодирующие полноразмерную PAH (аминокислоты 1-452), встраивали в три экспрессионные плазмиды. Эти плазмиды содержали специфические в отношении печени (LP1; Nathwani 2011) промоторы A1MB2-mTTR482 или CBA, последовательности гибридного интрона и pA (pA BGH или вируса обезьян 40 [SV40]) (Nathwani 2011, Kyostio-Moore 2016). Все экспрессионные плазмиды содержали фланкирующие ITR AAV2. mTTR482 (Nambiar 2017) использовали в качестве остова для оценки различных кДНК, кодирующих hPAH. Четыре кодон-оптимизированные кДНК получали с помощью алгоритмов из DNA2.0, GeneArt (GA) или Genscript (GS) и алгоритма GS в сочетании с уменьшением содержания CpG. В каждой экспрессионной плазмиде белок PAH метили N-концевым 3xFLAG-пептидом длиной 22 аминокислоты (MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK (SEQ ID NO:18)) с целью обеспечения обнаружения и количественного определения.

[341] Выбранные плазмиды, содержащие ITR AAV2, со специфичным для печени промотором, гибридным интроном, кДНК PAH и BGHpA использовали для получения вектора на основе rAAV. Векторы на основе rAAV с капсидом серотипа AAV8 получали с использованием способа тройной трансфекции с последующей очисткой с помощью CsCl2 ( Центр генной терапии Университета штата Массачусетс). Партии векторов количественно определяли с помощью qPCR в отношении BGHpA (Nambiar 2017).

Культуры клеток in vitro

[342] Все реагенты для тканевых культур получали от Irvine Scientific (Санта-Ана, Калифорния, США) или Invitrogen. Для транзиентной трансфекции клетки 293 или клетки карциномы печени человека (Huh7 или HepG2) (8 × 10⁵ клеток/лунка) высевали в 6-луночные чашки в среду Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) и 10 мл/л Pen Strep (10 единиц/мл пенициллина и 10 мкг/мл стрептомицина). Плазмиды (2 мкг) трансфицировали с использованием Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Клеточные лизаты или культуральные среды собирали для анализа PAH или активности SEAP, соответственно, 48 или 72 часа спустя.

Количественное определение активности SEAP

[343] Собирали кондиционированные среды или сыворотку крови, и образцы нагревали при 65°C в течение 30 мин для инактивации эндогенных щелочных фосфатаз. Активность SEAP измеряли с использованием реагентов Alkaline Phosphatase (ALP)-SL (Sekisui Diagnostics), и образцы инкубировали в течение периода от 10 мин до 2 часов с последующим считыванием показателя поглощения при 405 нм. Щелочную фосфатазу человека HPAP использовали в качестве стандарта (Calbiochem). Активность SEAP выражали в мкг/мл путем деления значения для образца на коэффициент преобразования 0,103 мЕд/нг.

Количественное определение белка PAH и активности

[344] Лизаты цельных клеток получали через 48 часов путем лизирования клеток в буфере для лизиса или в буфере RIPA. Кроме того, в некоторых экспериментах для усиления лизиса клеток использовали обработку ультразвуком или фрагментацию. После оттаивания лизаты центрифугировали при 14000 g в течение 30 мин перед проведением анализов. Показатели количественного определения уровней слитого с FLAG белка измеряли с помощью FLAG ELISA (SE002-flag; ABSbio) в соответствии с инструкциями производителя и с использованием либо стандарта из набора, либо самостоятельно очищенного 3xFLAG-mPAH-FL в качестве стандарта белка. Образцы in vivo нормализовали по общему содержанию белка, измеренному с помощью набора для анализа белка с использованием BCA (Pierce). Ферментативную активность белков PAH измеряли, как описано ранее в Yew et al. 2013 с небольшими модификациями. Вестерн-блоттинг для обнаружения PAH выполняли с использованием антитела к hPAH (LS-C344145; LSBio) или антитела к FLAG (F1804; Sigma), используя стандартные протоколы.

Исследования in vivo

[345] Колония мышей BTBR-PAH^enu2/J поддерживалась в Taconic (McDonald 1996). Гомозиготных (HOM) и гетерозиготных (HET) самцов мышей получали в возрасте 8-12 недель и содержали и поддерживали в соответствии с гуманными руководствами по уходу за животными и их использованию. Для анализа экспрессионных плазмид посредством SEAP плазмиды (10 мкг/мышь) в стерильном физиологическом растворе вводили путем гидродинамических инъекций большого объема в хвостовые вены мышей C57BL/6 с минимальным значением n=8 на испытуемое вещество. Рекомбинантные векторы на основе AAV8 вводили внутривенно через хвостовую вену (6-10 животных/обработка). В большинстве исследований животных умерщвляли через 8-10 недель с помощью изофлурановой анестезии. Цельную кровь собирали через ретроорбитальный синус в пробирки для сбора с EDTA, центрифугировали и хранили замороженными до проведения анализа. Некоторым животным перед сбором ткани перфузировали PBS через левый желудочек сердца. Образцы печени собирали и замораживали до проведения анализа. Для анализов головного мозга весь головной мозг извлекали из черепа, взвешивали, сагиттально разрезали и замораживали при -80°C до проведения анализа.

Анализы крови и тканей

[346] Уровни Phe и Tyr в плазме крови анализировали с помощью UHPLC-MS/MS с использованием мультиплексной системы Transcend II LX4, оснащенной Dionex Ultimate 3000 HPLC (Thermo Fisher, Уолтем, Массачусетс, США), комбинированной с трехквадрупольным масс-спектрометром API 4000 (AB SCIEX, Фреймингем, Массачусетс, США). L-Phe и L-Tyr (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) использовали для получения стандартных растворов, и меченые L-Phe-13C9, 15N и L-Tyr-13C9, 15N (Sigma-Aldrich) использовали в качестве внутренних стандартов. MS/MS-обнаружение проводили в режиме положительных ионов. Анализ выполняли с использованием колонки Acquity BEH C18 (1,7 мкм, 2,1 × 30 мм) с градиентным разделением, которое включало удерживание в течение 10 с при 98% подвижной фазе A (0,1% муравьиной кислоты в воде) с последующим градиентом 2-45% подвижной фазы B (0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле) в течение 30 с, увеличение до 75% B в течение 15 секунд, промывку в течение 10 с при 75% B и повторное уравновешивание при 98% A в течение 1 мин при скорости потока 0,5 мл/мин. В соответствии с MS/MS переходы были следующими: 166,1/120,1 для Phe, 182,1/136,1 для Tyr, 176,1/129,1 для меченого Phe и 192,1/145,1 для меченого Tyr.

[347] Для количественного определения нейромедиаторов головного мозга образцы головного мозга обрабатывали, как описано, с небольшими модификациями (Kankaanpaa 2001). Вкратце, половину сагиттально разрезанного головного мозга, перфузированного с помощью PBS, гомогенизировали в ледяном буфере для лизиса (1 мМ щавелевой кислоты, 3 мМ цистеина, 0,1 М уксусной кислоты) с Bead Ruptor 24 (Omni) при 4,85 м/с в течение 20 секунд при 4°С. Образцы центрифугировали при 14K в течение 10 мин, а затем супернатант замораживали. В гомогенатах головного мозга (200 мг/мл) затем количественно определяли уровни L-допы, дофамина, гомованиллиновой кислоты (HVA), серотонина, 5-гидрокситриптофана (5-HTP), 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-HIAA) и норэпинефрина посредством UPLC-MS/MS с использованием Acquity UPLC (Waters Corporation, Милфорд, Массачусетс, США), комбинированной с трехквадрупольным масс-спектрометром API 5000 (AB SCIEX, Фрамингем, Массачусетс, США). Для повышения стабильности нейромедиатора в качестве буфера для разбавления образца использовали 300 нг/мл цистеина в 0,1% муравьиной кислоты (FA) и ацетонитриле. Стандарты для каждого аналита (Sigma-Aldrich) и стандартные растворы получали аналогично образцам, как описано выше. MS/MS-обнаружение проводили в режиме положительных ионов (HVA обнаруживали в режиме отрицательных ионов). Анализ выполняли с использованием колонки Acquity HSS C18 SB (1,7 мкм, 2,1×100 мм) с градиентным разделением, которое включало удерживание в течение 0,5 мин при 98% подвижной фазе A (0,1% FA в воде) с последующим градиентом 2-40% подвижной фазы B (0,1% FA в ацетонитриле) в течение 3,5 мин, увеличение до 95% B в течение 0,1 мин, промывку в течение 0,5 мин при 95% B и повторное уравновешивание при 98% A в течение 2,4 мин при скорости потока 0,5 мл/мин. В соответствии с MS/MS переходы в режиме положительных ионов были следующими: 198/152 для L-допы, 177/160,1 для серотонина, 154/137,1 для дофамина, 192/146 для 5-HIAA, 170,1/107 для норэпинефрина, 221,1/201 для 5-HTP. Обнаружение HVA проводили в режиме отрицательных ионов, аналогично способу, описанному выше, за исключением того, что была исключена начальная фаза удержания градиента. В соответствии с MS/MS переход для HVA в режиме отрицательных ионов составлял 181,1/137,1. Уровни выражали в мкг/мл гомогената или мкМ. Уровни Phe и Tyr в головном мозге количественно определяли, как описано в вышеприведенном разделе.

[348] Для образцов печени количественно определяли количество геномов вектора, активность PAH и уровни белка. Копии геномов вектора количественно определяли с помощью qPCR (Martin 2013). Количественное определение FLAG-меченного белка проводили следующим образом. Образцы печени гомогенизировали в пробирках с гранулами (15-340-153; Fisher Scientific) в 1-кратном буфере PBS или RIPA с 1-кратным количеством ингибиторов протеаз при 5,65 об/мин при 4°C в течение 20-30 с в гомогенизаторе (Bead Ruptor 24; Omni). Образцы центрифугировали при 14000 g при 4°C в течение 30 мин. Затем супернатанты использовали для количественного определения PAH с помощью анализа FLAG ELISA и нормализовали по общему белку (набор для анализа белка с использованием BCA; Pierce). Определение активности белка PAH в гомогенатах печени проводили, как описано выше.

Результаты

[349] Ранее был описан промотор печени mTTR482, содержащий коровой промотор гена транстиретина мыши и его 5'-энхансерный элемент с модификациями сайтов связывания HNF-3 и -4 (Nambiar 2016). Целью настоящего исследования являлось дальнейшее увеличение силы промотора. К кассетам экспрессии добавляли различные энхансеры, специфические для печени, выше местоположения данного промотора или ассоциированные со стабильностью 3'-элементы ниже местоположения pA BGH, а затем измеряли уровни секретируемой щелочной фосфатазы (SEAP) в качестве репортера в двух линиях клеток печени человека in vitro (фиг. 1A). Для обеих клеточных линии случаи транзиентной трансфекции клеток Huh7 и HepG2 плазмидами с SEAP показали, что кассета экспрессии с энхансером mA1MB2 (№ 3) приводила к самым высоким уровням SEAP в культуральной среде, и они были примерно в 2 раза выше, чем для исходной конструкции на основе mTTR482 (фиг. 1B, 1C). Оценка in vivo превирусных плазмид, введенных с помощью гидродинамических инъекций нормальным мышам C57BL/6, также продемонстрировала наивысшую и наиболее устойчивую экспрессию SEAP для плазмиды, содержащей энхансер mA1MB2. Уровни SEAP были в 2,8, 4,4, 4 и 3,6 раза выше, чем у животных, которых обрабатывали исходной плазмидой mTTR482-SEAP в дни 1, 7, 14 и 28 соответственно (фиг. 2A). Превирусную плазмиду mTTR482 с энхансером mA1MB2 и без него оценивали на мышах PAH^enu2 (фиг. 2B). Плазмида, содержащая энхансер mA1MB2, устойчиво продуцировала в 2 раза более высокие уровни SEAP в плазме крови, чем полученные с помощью исходной конструкции на основе mTTR482. Хотя SEAP стабильно секретировалась в течение 28-дневного исследования, уровни SEAP были примерно в 10 раз ниже у мышей с PKU, чем полученные при применении этих плазмид у мышей C57Bl/6. На основании этих данных промотор mA1MB2-mTTR482 был выбран в качестве кандидата специфичного для печени промотора.

Пример 2. Сравнение оптимизированного специфичного для печени промотора с промотором LP1 у мышей PAH^enu2

[350] Чтобы проверить оптимизированный специфичный для печени промотор авторов настоящего изобретения на модели заболевания PKU, получали вектор AAV8/mA1MB2-mPAH, и сравнили его с AAV8/scLP1-mPAH, сопоставимым с вектором, используемым в Yagi et al. (2011). Оба вектора вводили внутривенно в двух разных дозах (4e10 и 1e11, VG/мышь), и проводили измерение уровней Phe в крови. При обеих дозах вектор mA1MB2-mTTR482 был более эффективным в отношении снижения уровней Phe в крови по сравнению с вектором sc-LP1 (фиг. 3A, 3B). Оба вектора повышали уровни Tyr в крови при использовании более высокой дозы (1e11 vg/мышь); причем повышение обнаруживали уже в день 7 (первое измерение после введения), и уровень сохранялся повышенным до дня 56 (конец исследования) (фиг. 3C). Хотя увеличение Tyr в крови также обнаруживали у животных, которых обрабатывали более низкими дозами, эти уровни существенно не отличались от значений, имеющихся у соответствующих животных до обработки. Количественное определение геномов вирусного вектора в печени показало, что количество копий VG было в 2-3 раза выше в случае самокомплементарного вектора в день 56 (фиг. 3D).

[351] Поскольку уровни Phe в головном мозге являются основной причиной патологии, измеряли уровни Phe в головном мозге. При дозе 1e11 только конструкция на основе mA1MB2-mTTR482 обеспечивала низкие уровни Phe в головном мозге, аналогичные таковым в головном мозге животных дикого типа (HET) (фиг. 4A). Снижение уровней Phe в головном мозге характеризовалось высокой корреляцией с уровнями Phe, измеренными в крови (фиг. 4B). Анализ уровней нейротрансмиттеров в головном мозге продемонстрировал сопоставимое повышение дофамина для обеих конструкций (фиг. 4C). Аналогичная эффективность наблюдалась также в случае конструкции на основе mA1MB2-mTTR482 при более низкой (4e10) дозе. Количественное определение серотонина в головном мозге продемонстрировало, что значительно большее количество серотонина вырабатывалось при обработке с использованием конструкции на основе mA1MB2-mTTR482 по сравнению с таковым в случае вектора sc-LP1 (фиг. 4D). В целом, эффективное снижение уровней Phe в крови с помощью конструкции на основе mA1MB2-mTTR482 приводило к устойчивому снижению уровней Phe в головном мозге и последующему усилению синтеза дофамина и серотонина в головном мозге обработанных животных.

Пример 3. Оценка продуцирования hPAH из кодон-оптимизированной кДНК hPAH

[352] Предыдущие опубликованные исследования показали низкую эффективность векторов на основе rAAV, кодирующих hPAH, у мышей PAH^enu2. Чтобы проверить, можно ли получить улучшенную эффективность с помощью hPAH с усиленным продуцированием, тестировали эффект использования различных кодонов. Для этой цели получали четыре различных кодон-оптимизированных кДНК hPAH на основе разных алгоритмов. Полученные последовательности встраивали ниже местоположения промотора mTTR482, и уровни белка hPAH оценивали in vitro и in vivo. Трансфекция клеток Huh7 человека плазмидами показала небольшие различия между кДНК hPAH (все в пределах 2-кратного изменения) (фиг. 5A). В случае доставки экспрессионных плазмид в печень нормальных мышей C57BL/6 посредством гидродинамической инъекции наблюдали гораздо большие различия между конструкциями (фиг. 5B). В частности, экспрессионная плазмида с кДНК hPAH, полученная с помощью алгоритма GA, обеспечивала в результате в 7 раз более высокий уровень обнаружения FLAG-меченного белка в лизатах печени, чем плазмида с эндогенной немодифицированной (немодифиц.) последовательностью. Исходя из этого, кДНК человека, полученную с помощью алгоритма GA, использовали для последующих исследований.

Пример 4. Сравнение человеческой PAH и мышиной PAH in vitro и in vivo

Способы

Получение плазмидных векторов и рекомбинантных AAV.

[353] Получение специфических в отношении печени промоторов (LP1 и mTTR482), гибридного интрона, сайтов полиаденилирования (бычьего гормона роста [BGH] и вируса обезьян 40 [SV40]) известно в данной области техники и описано у Nathwani (2012) и Nambiar (2017). Конструировали различные плазмидные векторы со специфическим в отношении печени промотором или промотором гена b-актина курицы (CBA), гибридным интроном, кДНК, кодирующими полноразмерную (FL) человеческую (h) или мышиную (m) PAH, и поли-A BGH. Также получали кассеты экспрессии с дважды усеченными формами mPAH и hPAH (DT; аминокислоты 103-428) или с различными гибридными конструкциями. Аминокислотные модификации в hPAH-DT и mPAH оценивали для плазмидных векторов с промотором CBA, гибридным интроном, PAH-DT и поли-A BGH. Аминокислотные изменения в вариантах (V) аминокислотной последовательности PAH-DT получали путем синтеза измененной последовательности ДНК или внесения изменений посредством сайт-направленного мутагенеза (Genscript). Большинство конструкций содержало последовательность, кодирующую N-концевой 3xFLAG-пептид длиной 22 аминокислоты (MDYKDHDG DYKDHDI DYKDDDDK (SEQ ID NO:18)), находящийся выше местоположения кДНК PAH, с целью обеспечения обнаружения и количественного определения.

[354] Выбранные кодирующие PAH плазмидные векторы со специфическим в отношении печени промотором (LP1 или mA1MB2-mTTR482), гибридным интроном генов β-актина курицы (CBA)/β-глобина кролика размером 1069 п. о., кДНК, представляющей собой кДНК hPAH (или ее вариант), и BGHpA субклонировали в плазмиды, содержащие ITR AAV2. Конечная векторная конструкция hPAH-V1 дополнительно содержала модифицированный интрон с удаленными ATG и "филлерную" последовательность из интрона альфа-1-антитрипсина (с уменьшенным содержанием ATG) размером 0,9 т. о. для увеличения размера генома вектора до 4,6 т. о. Все векторы на основе rAAV получали с капсидом серотипа AAV8 с использованием метода тройной трансфекции с последующей очисткой с помощью CsCl₂. Партии векторов количественно определяли с помощью qPCR в отношении BGHpA (Martin 2013).

Очистка белков PAH

[355] Процедуры транзиентной трансфекции клеток Expi293F (LifeTechnologies) выполняли с использованием набора Expi293F Expression system kit (LifeTechnologies) в условиях бессывороточной суспензионной культуры в соответствии с инструкциями производителя. Для процедур трансфекции использовали экспрессионные плазмиды pCBA-PAH-BGHpA, кодирующие 3xFLAG-меченные hPAH, hPAH-V1 и mPAH в виде FL- или DT-форм. Клетки центрифугировали, и лизаты цельных клеток получали в буфере для лизиса (50 мМ Трис-HCl, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA и 1% Triton Х-100). Flag-меченные белки PAH очищали с использованием FLAG-аффинной колонки (аффинный гель M2 ANTI-FLAG; Sigma-Aldrich). Белки элюировали, используя либо 0,1 М глицин-HCl, pH 3,5, либо 100 мкг/мл FLAG-пептида в TBS (Sigma-Aldrich). Белки ресуспендировали в 50 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 150 мМ NaCl (некоторые партии дополнительно содержали 10% маннита для повышения стабильности, Nascimento 2010). Белки анализировали посредством SDS-PAGE в предусматривающем 4-12% Tris-BIS-MES геле и окрашивали кумасси синим. Белки также анализировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием антител к FLAG-пептиду или белку PAH.

Количественное определение белка PAH и уровней активности

[356] Транзиентную трансфекцию клеток HEK293T плазмидами, содержащими кассеты экспрессии FLAG-меченной PAH, выполняли с использованием Lipofectamine 2000 (LifeTechnologies). Лизаты цельных клеток получали через 48 часов путем лизирования клеток в буфере для лизиса или в буфере RIPA (Pierce/ThermoFisher). Кроме того, в некоторых экспериментах для усиления лизиса клеток использовали обработку ультразвуком или фрагментацию. После оттаивания лизаты центрифугировали при 14000 g в течение 30 мин перед проведением анализов. Показатели количественного определения уровней слитого с FLAG белка измеряли с помощью FLAG ELISA (SE002-flag; ABSbio) в соответствии с инструкциями производителя и с использованием либо стандарта из набора, либо самостоятельно очищенного 3xFLAG-mPAH-FL в качестве стандарта белка. Ферментативную активность белков PAH измеряли, как описано ранее (Yew 2013), с небольшими модификациями. Вестерн-блоттинг для обнаружения PAH выполняли с использованием антитела к hPAH (LSBio) или антитела к FLAG (Sigma) с использованием стандартных протоколов, известных в данной области техники.

Результаты

[357] Продуцирование белков человеческой и мышиной PAH оценивали в клетках Huh7 и 293 in vitro. Для количественного определения продуцирования hPAH и mPAH N-концевую 3xFLAG-метку включали во все экспрессируемые белки. Данные продемонстрировали низкие уровни hPAH в лизатах цельных клеток Huh7 по сравнению с уровнями mPAH, и они не зависели от используемой кассеты экспрессии (фиг. 6A). Был продемонстрирован более низкий уровень продуцирования hPAH для полноразмерной (FL, 1-452) и дважды усеченной (DT) версии hPAH по сравнению с таковым для mPAH (фиг. 6B, 6C). Версия DT представляет собой укороченную и конститутивно активную форму PAH, состоящую из аминокислот 103-428 и, следовательно, характеризующуюся отсутствием как N-концевого регуляторного домена, так и C-концевого тетрамеризационного домена PAH.

[358] Количественное определение мРНК для каждой конструкции показало сопоставимые уровни транскриптов, указывая на то, что различия в уровнях белков hPAH и mPAH являются посттранскрипционными эффектами (фиг. 6D). После проведения очистки hPAH и mPAH (FL- и DT-форм) с использованием FLAG-аффинной колонки человеческая PAH (как FL-, так и DT-формы) продемонстрировала очень четкую картину деградации, которую не наблюдали для мышиной PAH (фиг. 6E).

[359] Векторы rAAV8/sc-LP1, кодирующие человеческую и mPAH, тестировали на мышах PAH^enu2. Животные, обработанные с помощью вектора, кодирующего mPAH, продемонстрировали нормальные уровни Phe в крови, в то время как очень небольшое снижение уровней Phe в крови наблюдали у мышей, обработанных сопоставимой дозой кодирующего hPAH вектора (фиг. 6F). Эффективность вектора sc-LP1, кодирующего mPAH, была продемонстрирована ранее (Yagi 2011).

[360] В совокупности эти данные продемонстрировали, что эндогенная форма hPAH была менее эффективной, чем mPAH, и что это коррелировало с низкими показателями продуцирования/стабильности белка hPAH, наблюдаемыми in vitro.

Пример 5. Получение улучшенных вариантов человеческой PAH

[361] Получали гибридные конструкции на основе hPAH, содержащие N-концевые или C-концевые последовательности различной длины, полученные из mPAH (фиг. 7A). Эти конструкции тестировали в отношении продуцирования FLAG-меченного белка in vitro, и они продемонстрировали, что ни замена N-конца, ни замена C-конца hPAH соответствующими мышиными последовательностями не улучшала уровни белка (фиг. 7B, 7C). Следовательно, область, содержащая каталитический центр (103-448), DT), являлась ответственной за стабильность mPAH.

[362] Для повышения стабильности коровой области hPAH в остов hPAH-DT вносили различные модификации. Различные аминокислотные модификации вносили в последовательность hPAH с использованием остова hPAH-DT. Аминокислотные замены моделировали на основе аминокислотных последовательностей PAH представителей других видов, включая мышь, курицу и бактерии (таблица 1). Все конструкции также содержали метку 3x-FLAG на гибком N-конце. Человеческие варианты (V; V1-13) экспрессировали в клетках 293 in vitro, и в лизатах цельных клеток количественно определяли уровни белка PAH и активность, а также сравнивали их с таковыми для DT-версий hPAH и mPAH (фиг. 8A). Количественное определение белка показало, что некоторые варианты hPAH, такие как V1, V5 (одна дополнительная замена по сравнению с V1) и V8 (две аминокислотных замены в отличие от V1), характеризовались повышенными уровнями белка по сравнению с немодифицированной hPAH. Однако, когда эти варианты протестировали в отношении активности фермента PAH, только V1 характеризовался значительно улучшенной активностью PAH (фиг. 8B). V1 предусматривал четыре аминокислотные замены, расположенные в трех различных частях каталитического домена, представляющие собой M180T, K199P, S250P и G256A. В конструкциях V9-13 каких-либо изменений не наблюдалось (данные не представлены).

Таблица 1. Описание вариантов человеческой PAH

Описание Замены Вариант № 1 M180T, K199P, S250P, G256A Вариант № 2 M180T, K199P, S250P, G256A, G188A, G307A Вариант № 3 M180T, K199P, S250P, G256A, E228P, N376P Вариант № 4 M180T, K199P, S250P, G256A, E228P, L369P, N376P Вариант № 5 M180T, K199P, S250P, G256A, S251D Вариант № 6 E228P, L369P, N376P Вариант № 7 G272P, P279Q, P275L Вариант № 8 H264P, G275H Вариант № 9 C344T Вариант № 10 M180T, L192R, S196A, T206H, H220R, N376E Вариант № 11 M180T, K199P, S250P, G256A, G188A, G192R, S196A, T206H, H220R, N376E Вариант № 12 L114E, D116N Вариант № 13 L114E, D116N, M180T, G192R, S196A, T206H, H220R, N376E Вариант № 14 M180T Вариант № 15 K199P Вариант № 16 S250P Вариант № 17 G256A Вариант № 18 K199P, S250P, G256A Вариант № 19 M180T, S250P, G256A Вариант № 20 M180T, K199P, G256A Вариант № 21 M180T, K199P, S250P

[363] Получали дополнительные производные V1. Первый набор предусматривал конструкции с заменой только одной аминокислоты (V14-17, таблица 1). Результаты относительно активности PAH показали, что все они характеризовались низкими уровнями PAH и активностью, сопоставимыми с немодифицированной hPAH, и, следовательно, это указывало на то, что ни одна из этих замен сама по себе не обеспечивала улучшение (фиг. 9A-9C, 10A-10C). Второй набор конструкций представлял собой производные V1, в которых одна из четырех аминокислот была обратно заменена на аминокислоту из человеческой последовательности дикого типа.

Таблица 2. Производные варианта-1 человеческой PAH

Описание Замены Вариант № 22 M180T, K199P, S250P, G256A, H264P Вариант № 23 M180T, K199P, S250P, G256A, G272A Вариант № 24 M180T, K199P, S250P, G256A, G272P Вариант № 25 M180T, K199P, S250P, G256A, P275L Вариант № 26 M180T, K199P, S250P, G256A, P279Q Вариант № 27 M180T, K199P, S250P, G256A, G272P, P275L Вариант № 28 M180T, K199P, S250P, G256A, T323R, F327T Вариант № 29 M180T, G256A Вариант № 30 K199P, G256A Вариант № 31 S250P, G256A

[364] Затем определяли, являлись ли три аминокислотные замены достаточными (V18-21). Лучший из этих вариантов, представляющий собой V20 без замены S250P, характеризовался примерно 67% активности V1 (фиг. 9A). Интересно отметить, что этот вариант, несмотря на наличие у него более низкой общей ферментативной активности ввиду снижения уровней белка PAH, характеризовался в 2 раза улучшенной специфической активностью по сравнению с исходным V1 (фиг. 9B, 9C).

[365] Также тестировали набор производных варианта-1 человеческой PAH с двумя мутациями. В отличие от серии с одной мутацией (V14-17), получали некоторое улучшение активности для V29 и V30 с двумя мутациями, однако не в такой степени, как для V1 (фиг. 10D).

[366] Для дальнейшего улучшения V1 вносили дополнительные замены, некоторые из которых были разработаны для повышения специфической активности (V22-28, таблица 2). Хотя ни одна из этих замен не повышала общую активность PAH, некоторые модификации, тем не менее, повышали уровни белка PAH или его специфическую активность. Например, V23 характеризовался в 2 раза большим уровнем белка PAH, чем обеспечиваемый hPAH-V1.

[367] "Обратный" мутагенез для mPAH выполняли путем последовательной одновременной замены двух или трех остатков на те, которые присутствуют в hPAH в пределах области 103-428. Тестирование активности пяти конструкций, охватывающих эту область, показало, что ни одно из этих изменений не приводило к снижению продуцирования mPAH до уровней, наблюдаемых для hPAH (данные не показаны).

Таблица 3. Варианты мышиной PAH

Описание Замены Мышиный вариант № 1 E114K, N116D, T180M Мышиный вариант № 2 R184K, R192K, A196S Мышиный вариант № 3 H206Y, R220H, E336Q Мышиный вариант № 4 D360E, C374I, E376N Мышиный вариант № 5 T401N, V421I

[368] Конструировали кассету экспрессии, кодирующую наиболее эффективный вариант (V1), представленный в виде полноразмерного белка и экспрессируемый под контролем промотора A1MB2-mTTR. Эту конструкцию сравнивали с сопоставимыми экспрессионными плазмидами с мышиной и hPAH в отношении продуцирования и активности белка PAH после трансфекции плазмид клетками Huh7. Данные продемонстрировали примерно 10-кратное увеличение продуцирования и активности белка PAH для hPAH-V1 по сравнению с эндогенной hPAH (фиг. 11A-11C). Все белки PAH характеризовались сопоставимым соотношением активности и уровня белка, что указывает на в целом аналогичную специфическую активность.

[369] В совокупности данные продемонстрировали возможность улучшения характеристик человеческой PAH за счет аминокислотных замен (например, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных замен), все из которых способствовали наблюдаемому улучшению.

Пример 6. Коррекция гиперфенилаланинемии с помощью PAH-V1

Способы

Анализы крови и тканей

[370] Анализы головного мозга и тканей осуществляли, как описано в примерах 1-3.

Эксперименты на животных

[371] Эксперименты на животных проводили, как описано в примерах 1-3.

Результаты

[372] Для тестирования эффективности модифицированной hPAH in vivo получали вектор на основе rAAV8, кодирующий hPAH-V1, а также аналогичные векторы с мышиной PAH или hPAH (все в виде FL-версий). Вектор, экспрессирующий hPAH-V1, продемонстрировал быстрое снижение уровней Phe в крови, а также увеличение Tyr в крови в модели PKU на мышах PAH^enu2 (фиг. 12A, 12B). Подобный эффект наблюдали в отношении уровней различных метаболитов Phe, измеренных в крови (фиг. 12C). В целом модифицированная hPAH-V1 являлась более эффективной в отношении всех этих конечных точек по сравнению с эндогенной hPAH. Повышенная эффективность hPAH-V1 непосредственно коррелировала с улучшением в отношении уровней и активности белка PAH в печени (фиг. 13A, 13B). Все группы обработки характеризовались сопоставимыми количествами копий генома вектора в печени (фиг. 13C).

[373] Анализировали различные конечные точки применительно к головному мозгу (выполняли для групп обработки 3e11 VG/мышь). Данные продемонстрировали значительное снижение уровней Phe и повышение уровней Tyr в головном мозге у обработанных мышей по сравнению с таковыми у наивных мышей PAH^enu2 (фиг. 14A, 14B). Изменения уровней Phe в головном мозге характеризовались выраженной корреляцией со снижением уровней Phe в крови, а также продемонстрировали лучший контроль Phe в группе обработки hPAH-V1 (фиг. 14C). Поскольку все аминокислоты Phe, Tyr и Trp используют один и тот же крупный переносчик нейтральных аминокислот (LAT1), аналогичное улучшение наблюдали в отношении уровней Trp в головном мозге (фиг. 14D). Как hPAH, так и hPAH-V1 обеспечивали сопоставимое повышение уровней этих аминокислот в головном мозге.

[374] Измеряли уровни нейротрансмиттеров дофамина и серотонина в головном мозге, а также уровни их метаболитов в головном мозге у обработанных мышей. Данные продемонстрировали значительно более высокое повышение уровней этих нейротрансмиттеров у животных, обработанных с помощью hPAH-V1, по сравнению с животными, обработанными с помощью hPAH (фиг. 15A-15D).

[375] В целом, улучшенные свойства белка hPAH-V1 обуславливали повышенную способность снижать уровни Phe в крови и головном мозге, а также повышать уровни Tyr и нейротрансмиттеров в головном мозге. Поскольку в печени имелись сопоставимые уровни содержания геномов вектора, данные указывают на достижение более высокой эффективности с помощью вектора, кодирующего hPAH-V1.

[376] Получали геном размером 4,6 т. о. для вектора, кодирующего промотор mA1MB2-mTTR482/hPAH-V1. В дополнение к спейсерной последовательности, введенной ниже местоположения pA BGH, в этом геноме отсутствовали последовательности "ATG" в последовательности интрона (фиг. 16A). При тестировании данного вектора на мышах PAH^enu2 наблюдали значительно улучшенную эффективность, измеренную по снижению уровней Phe в крови, по сравнению с исходным вектором размером 3,8 т. о. (фиг. 16B). Этот эксперимент также предусматривал вектор размером 4,6 т. о. без N-концевой метки FLAG, используемой для измерения уровней белка PAH. Данные продемонстрировали, что удаление этой метки не изменило эффективность генома вектора. В целом, модифицированная hPAH-V1 обеспечивает улучшенную эффективность по сравнению с эндогенной hPAH и, следовательно, ожидается, что она обеспечит эффективность при более низкой дозе вектора по сравнению с таковой для вектора, кодирующего hPAH.

Пример 7. Улучшенные уровни белка hPAH-V1 в печени NHP

Материалы и способы

Конструирование рекомбинантных векторов на основе AAV

[377] Получение вектора A1MB2-HI-hPAH и -hPAH-V1 выполняли, как описано в примере 4, за исключением того, что использовали гибридный капсид.

Эксперимент на животных

[378] Самцы макака-крабоеда (Macaca fascicularis) в возрасте от 2 до 3 лет (2-4 кг) получали 10 мл исследуемого вещества путем медленной внутривенной инфузии (1 мл/мин) в подкожную вену. Группы обработки включали группу, получавшую среду-носитель (PBS, n=1), rAAV/hPAH (n=3) и rAAV/hPAH-V1 (n=3). Через две недели животных гуманно умерщвляли, и различные ткани собирали и замораживали при -80°C до проведения анализа.

Количественное определение геномов вектора, мРНК и белка PAH

[379] Число копий геномов вектора и полученных из вектора мРНК в печени и селезенке количественно определяли с помощью qPCR с использованием праймеров/зондов для pA BGH, как описано в примере 1-3. Уровни белка человеческой PAH в гомогенатах печени анализировали с помощью вестерн-блоттинга в отношении наличия FLAG-метки, как описано в примере 1-3.

Результаты

[380] Для тестирования функциональности промотора A1MB2-mTTR в печени NHP уровни продуцирования как для мРНК, так и для PAH оценивали через два после доставки вектора. В среднем сопоставимые уровни вектора и полученной из вектора мРНК обнаруживали в печени у всех животных, обработанных с помощью вектора (нормализованные по копиям генома вектора) (фиг. 17A, B). Специфичность экспрессии в отношении печени анализировали путем сравнения векторной мРНК в печени и селезенке (уровни мРНК являлись нормализованными по копиям генома вектора в обеих тканях), и при этом наблюдали более высокое соотношение транскрипт/VG для печени по сравнению с таковым для селезенки (фиг. 17B). Трансдукцию также оценивали путем тестирования с обнаружением в печени FLAG-меченного белка PAH, полученного из вектора. Все животные, обработанные с помощью вектора, кодирующего PAH-V1, продемонстрировали наличие hPAH-V1 правильного размера в печени. Напротив, у животных, обработанных с помощью вектора, кодирующего hPAH, обнаруживали небольшое количество белка hPAH или его отсутствие (фиг. 17C). Поскольку как количество геномов вектора, так и уровни мРНК были сопоставимы в обеих группах обработки, эти результаты указывают на лучшую стабильность белка hPAH-V1 в печени NHP. Эти наблюдения были аналогичны исследованиям, проведенным на мышах, а также исследованиям in vitro с использованием линий клеток печени человека, что указывает на превосходство hPAH-V1 во всех тест-системах.

ССЫЛКИ

Kochhar JS, et al., Drug Deliv Transl Res 2012, 2:223-237.

Ho G, Christodoulou J. Transl Pediatr 2014, 4:49-62.

Blau N, Longo N. Expert Opin Pharmacother 2015, 16:791-800.

Flydal MI, Martinez A. IUBMB Life 2013, 65:341-349.

Erlandsen H, et al., Pediatrics 2003, 112:1557-1565.

Knappskog PM, et al., Eur J Biochem 1996, 242:813-821.

Jaffe E, et al., Arch Biochem Biophys 2013, 530:73-82.

Arturo EC, et al., PNAS 2016, 113:2394-2399.

Waisbren SE, et al., Mol Genet Metab 2007, 92:63-70.

Thomas J, et al., J Inborn Errors Metabolism & Screening 5:1-9.

Cleary M, et al., Mol Gen Metab 2013, 110:418-423.

Gonzales MJ, et al., SeminPediatr Neurol 2016, 23:332-340.

Vogel KR, et al., J Inherit Metab Dis 2017, 40:227-235.

Burton B, et al., Mol Gen Metab 2015, 114:415-424.

Longo N, et al., Lancet 2014, 384:37-44.

Mochizuki S, et al., Gene Ther 2004, 11:1081-1086.

Ding Z, et al., Gene Therapy 2006, 13:587-593.

Harding CO, et al., Gene Therapy 2006, 13:457-462.

Yagi H, et al., J Gene Med 2011, 13:114-122.

Yagi H, et al., NeuroReport 2012, 23:30-34.

Winn SR, et al., Mol Gen Metabolism 2018, 123:6-20.

Oh H-J, et al., Pediatric Research 2004, 56:278-284.

Nathwani AC, et al., Blood 2006, 107:2653-2661.

Nambiar B, et al., Hum Gene Ther Methods 2017, 28:23-38.

Martin J, et al., Hum Gene Ther Methods 2013;24:253-269.

Yew NS et al., Mol Gen Metab 2013, 109:339-344.

McDonald JD, Charlton CK. Genomics 1996, 39:402-405.

Kyostio-Moore S, et al., Mol Ther Methods Clin Dev 2016, 3:16006.

Nascimento C, et al., Appl Biochem Biotechnol 2010, 162:192-207.

Baker RE, Shiman R. J Biol Chem 19: 9633-9639.

Ledley FD, et al., Biochem J 1990, 267:399-406.

Aquado C, et al., FEBs Letters 2006, 580:1697-1701.

Doskeland AP, Flatmark T. Biochim Biophys Acta 2001, 1547:379-386.

Solstad T, Flatmark T. Eur J Biochem 2000, 267:6302-6310.

Andersen OA, et al., J Mol Bio 2002, 320:1095-1108.

Erlandsen H, et al., J Mol Bio 2002, 320:645-661

Ziegler RJ, et al., Mol Ther 2007, 15:492-500.

Finn JD, et al., Blood 2010, 116:5842-5848.

George LA, et al., N Eng J Med 2017, 377:2215-2227.

Walter JH, et al., The Lancet 2002, 360:55-56.

Anderson PJ, Leuzzi V. Mol Gen Metab 2010, 99:S3-S9.

Garcia MI, et al., Mol Gen Metab 2017, 11:54-58.

Harding CO, et al., Mol Genet Metab 2018, March 31 (abstract)

Thomas J, et al., Mol Genet Metab 2018, March 18 (abstract).

McEachern KA, et al., J Gene Med 2006, 8:719-729.

Jacobs F, et al., Gene Ther 2008, 15:594-603.

Kramer MG, et al., Mol Ther 2003, 7:375-385.

Chuah MK, et al., Mol Ther 2014, 9:1605-1613.

Wooddell CI, et al., Gene Med 2008, 10:551-563.

Nathwani AC, et al., NEJM 2011, 365:2357-2365.

Jiang, H, et al., Blood 2006;108:107-115.

Park JW, et al., Exp Mol Med 2010, 42:105-115.

Charron CE, Lewin AS, Laipis PJ. Mol Ther 2004, 9:S334.

Grimm D, et al., J Virol. 2008, 82:5887-911.

Lisowski L, et al., Nature, 2014, 506:382-6.

Smith LJ, et al., Mol Ther. 2014 Sep;22(9):1625-34.

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Человеческая фенилаланингидроксилаза (GenBank AAA60082.1 и AAC51772.1) - аминокислотная последовательность

MSTAVLENPGLGRKLSDFGQETSYIEDNCNQNGAISLIFSLKEEVGALAKVLRLFEENDVNLTHIESRPS

RLKKDEYEFFTHLDKRSLPALTNIIKILRHDIGATVHELSRDKKKDTVPWFPRTIQELDRFANQILSYGA

ELDADHPGFKDPVYRARRKQFADIAYNYRHGQPIPRVEYMEEEKKTWGTVFKTLKSLYKTHACYEYNHIF

PLLEKYCGFHEDNIPQLEDVSQFLQTCTGFRLRPVAGLLSSRDFLGGLAFRVFHCTQYIRHGSKPMYTPE

PDICHELLGHVPLFSDRSFAQFSQEIGLASLGAPDEYIEKLATIYWFTVEFGLCKQGDSIKAYGAGLLSS

FGELQYCLSEKPKLLPLELEKTAIQNYTVTEFQPLYYVAESFNDAKEKVRNFAATIPRPFSVRYDPYTQR

IEVLDNTQQLKILADSINSEIGILCSALQKIK (SEQ ID NO:1)

Человеческая фенилаланингидроксилаза (GenBank AAH26251.1) - аминокислотная последовательность

MSTAVLENPGLGRKLSDFGQETSYIEDNCNQNGAISLIFSLKEEVGALAKVLRLFEENDVNLTHIESRPS

RLKKDEYEFFTHLDKRSLPALTNIIKILRHDIGATVHELSRDKKKDTVPWFPRTIQELDRFANQILSYGA

ELDADHPGFKDPVYRARRKQFADIAYNYRHGQPIPRVEYMEEGKKTWGTVFKTLKSLYKTHACYEYNHIF

PLLEKYCGFHEDNIPQLEDVSQFLQTCTGFRLRPVAGLLSSRDFLGGLAFRVFHCTQYIRHGSKPMYTPE

PDICHELLGHVPLFSDRSFAQFSQEIGLASLGAPDEYIEKLATIYWFTVEFGLCKQGDSIKAYGAGLLSS

FGELQYCLSEKPKLLPLELEKTAIQNYTVTEFQPLYYVAESFNDAKEKVRNFAATIPRPFSVRYDPYTQR

IEVLDNTQQLKILADSINSEIGILCSALQKIK (SEQ ID NO:2)

Аминокислотная последовательность человеческой PAH-V1 (M180T, K199P, S250P и G256A)

MSTAVLENPGLGRKLSDFGQETSYIEDNCNQNGAISLIFSLKEEVGALAKVLRLFEENDVNLTHIESRPS

RLKKDEYEFFTHLDKRSLPALTNIIKILRHDIGATVHELSRDKKKDTVPWFPRTIQELDRFANQILSYGA

ELDADHPGFKDPVYRARRKQFADIAYNYRHGQPIPRVEYTEEEKKTWGTVFKTLKSLYPTHACYEYNHIF

PLLEKYCGFHEDNIPQLEDVSQFLQTCTGFRLRPVAGLLPSRDFLAGLAFRVFHCTQYIRHGSKPMYTPE

PDICHELLGHVPLFSDRSFAQFSQEIGLASLGAPDEYIEKLATIYWFTVEFGLCKQGDSIKAYGAGLLSS

FGELQYCLSEKPKLLPLELEKTAIQNYTVTEFQPLYYVAESFNDAKEKVRNFAATIPRPFSVRYDPYTQR

IEVLDNTQQLKILADSINSEIGILCSALQKIK (SEQ ID NO:3)

Последовательность ДНК человеческой PAH-V1

ATGAGCACAGCCGTGCTGGAAAACCCCGGCCTGGGCAGAAAGCTGAGCGACTTCGGCCAGGAAACCAGCTACATCGAGGACAACTGCAACCAGAACGGCGCCATCAGCCTGATCTTCAGCCTGAAAGAAGAAGTGGGCGCCCTGGCCAAGGTGCTGCGGCTGTTCGAGGAGAACGACGTGAACCTGACCCACATCGAGAGCCGGCCCAGCAGACTGAAGAAGGACGAGTACGAGTTCTTCACCCACCTGGACAAGCGGAGCCTGCCCGCCCTGACCAACATCATCAAGATCCTGCGGCACGACATCGGCGCCACCGTGCACGAGCTGAGCCGGGACAAGAAAAAGGACACCGTGCCCTGGTTCCCCAGAACCATCCAGGAACTGGACAGATTCGCCAACCAGATCCTGTCCTACGGCGCCGAGCTGGATGCCGACCACCCTGGCTTCAAGGACCCCGTGTACCGGGCCAGACGGAAGCAGTTCGCCGATATCGCCTACAACTACCGGCACGGCCAGCCCATCCCCAGAGTCGAGTACACCGAAGAGGGCAAGAAAACCTGGGGCACCGTGTTCAAGACCCTGAAGTCCCTGTACCCCACCCACGCCTGCTACGAGTACAACCACATCTTCCCACTGCTCGAAAAGTACTGCGGCTTCCACGAGGACAATATCCCTCAGCTGGAGGACGTGTCCCAGTTTCTGCAGACCTGCACCGGCTTCAGACTCAGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGCCCAGCAGAGATTTTCTGGCCGGACTGGCCTTCCGGGTGTTCCACTGCACCCAGTACATCAGACACGGCAGCAAGCCCATGTACACCCCTGAGCCCGACATCTGCCACGAGCTGCTGGGACATGTGCCCCTGTTCAGCGACAGAAGCTTCGCCCAGTTCAGCCAGGAAATCGGCCTGGCCTCTCTGGGCGCTCCCGACGAGTATATCGAGAAGCTGGCCACCATCTACTGGTTCACCGTGGAATTCGGCCTGTGCAAGCAGGGCGACAGCATCAAGGCCTATGGCGCCGGACTCCTGTCCAGCTTCGGCGAGCTGCAGTACTGTCTGAGCGAGAAGCCCAAGCTGCTGCCCCTGGAACTGGAAAAGACCGCCATCCAGAACTACACCGTGACCGAGTTCCAGCCCCTGTACTACGTGGCCGAGAGCTTCAACGACGCCAAAGAAAAAGTGCGGAACTTCGCCGCCACCATCCCTCGGCCCTTCAGCGTCAGATACGACCCCTACACCCAGCGGATCGAGGTGCTGGACAACACACAGCAGCTGAAAATTCTGGCCGACTCCATCAACAGCGAGATCGGCATCCTGTGCAGCGCCCTGCAGAAAATCAAGTGA (SEQ ID NO:4)

Оптимизированная последовательность генома вектора размером 3,8 т. о. (ITR-A1MB2-mTTR-HI-hPAH V1-BGHpA-ITR)

GAGCTCTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTACGCGTGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGATGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCGATATCTACCTGCTGATCGCCCGGCCCCTGTTCAAACATGTCCTAATACTCTGTCGGGGCAAAGGTCGGCAGTAGTTTTCCATCTTACTCAACATCCTCCCAGTGTACGTAGGATCCTGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCGGGGCAAAGGTCGTATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAGCAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAAGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGGGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCATTTCGAAGCCGCCACCATGAGCACAGCCGTGCTGGAAAACCCCGGCCTGGGCAGAAAGCTGAGCGACTTCGGCCAGGAAACCAGCTACATCGAGGACAACTGCAACCAGAACGGCGCCATCAGCCTGATCTTCAGCCTGAAAGAAGAAGTGGGCGCCCTGGCCAAGGTGCTGCGGCTGTTCGAGGAGAACGACGTGAACCTGACCCACATCGAGAGCCGGCCCAGCAGACTGAAGAAGGACGAGTACGAGTTCTTCACCCACCTGGACAAGCGGAGCCTGCCCGCCCTGACCAACATCATCAAGATCCTGCGGCACGACATCGGCGCCACCGTGCACGAGCTGAGCCGGGACAAGAAAAAGGACACCGTGCCCTGGTTCCCCAGAACCATCCAGGAACTGGACAGATTCGCCAACCAGATCCTGTCCTACGGCGCCGAGCTGGATGCCGACCACCCTGGCTTCAAGGACCCCGTGTACCGGGCCAGACGGAAGCAGTTCGCCGATATCGCCTACAACTACCGGCACGGCCAGCCCATCCCCAGAGTCGAGTACACCGAAGAGGGCAAGAAAACCTGGGGCACCGTGTTCAAGACCCTGAAGTCCCTGTACCCCACCCACGCCTGCTACGAGTACAACCACATCTTCCCACTGCTCGAAAAGTACTGCGGCTTCCACGAGGACAATATCCCTCAGCTGGAGGACGTGTCCCAGTTTCTGCAGACCTGCACCGGCTTCAGACTCAGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGCCCAGCAGAGATTTTCTGGCCGGACTGGCCTTCCGGGTGTTCCACTGCACCCAGTACATCAGACACGGCAGCAAGCCCATGTACACCCCTGAGCCCGACATCTGCCACGAGCTGCTGGGACATGTGCCCCTGTTCAGCGACAGAAGCTTCGCCCAGTTCAGCCAGGAAATCGGCCTGGCCTCTCTGGGCGCTCCCGACGAGTATATCGAGAAGCTGGCCACCATCTACTGGTTCACCGTGGAATTCGGCCTGTGCAAGCAGGGCGACAGCATCAAGGCCTATGGCGCCGGACTCCTGTCCAGCTTCGGCGAGCTGCAGTACTGTCTGAGCGAGAAGCCCAAGCTGCTGCCCCTGGAACTGGAAAAGACCGCCATCCAGAACTACACCGTGACCGAGTTCCAGCCCCTGTACTACGTGGCCGAGAGCTTCAACGACGCCAAAGAAAAAGTGCGGAACTTCGCCGCCACCATCCCTCGGCCCTTCAGCGTCAGATACGACCCCTACACCCAGCGGATCGAGGTGCTGGACAACACACAGCAGCTGAAAATTCTGGCCGACTCCATCAACAGCGAGATCGGCATCCTGTGCAGCGCCCTGCAGAAAATCAAGTGACCTAGGTGATCAAGATCTGCTAGCTTAATTAACCCGGGACTAGTGCGGCCGCTCGAGACTAGTCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGTACCAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCC (SEQ ID NO:5)

Оптимизированная последовательность генома вектора размером 4,6 т. о. (ITR-A1MB2-mTTR-HI[без-ATG]-hPAH V1-BGHpA-спейсерная-последовательность-ITR)(4561 п. о.)

TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTTACCGCGTGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGATGGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCGATATCTACCTGCTGATCGCCCGGCCCCTGTTCAAACATGTCCTAATACTCTGTCGGGGCAAAGGTCGGCAGTAGTTTTCCATCTTACTCAACATCCTCCCAGTGTACGTAGGATCCTGTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCGGGGCAAAGGTCGTATTGACTTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTGCTAGCCAATTGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTATTGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAAGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGGGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTTTGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAATTGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCTTGTTCTTGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCATTTCGAAGCCGCCACCATGAGCACAGCCGTGCTGGAAAACCCCGGCCTGGGCAGAAAGCTGAGCGACTTCGGCCAGGAAACCAGCTACATCGAGGACAACTGCAACCAGAACGGCGCCATCAGCCTGATCTTCAGCCTGAAAGAAGAAGTGGGCGCCCTGGCCAAGGTGCTGCGGCTGTTCGAGGAGAACGACGTGAACCTGACCCACATCGAGAGCCGGCCCAGCAGACTGAAGAAGGACGAGTACGAGTTCTTCACCCACCTGGACAAGCGGAGCCTGCCCGCCCTGACCAACATCATCAAGATCCTGCGGCACGACATCGGCGCCACCGTGCACGAGCTGAGCCGGGACAAGAAAAAGGACACCGTGCCCTGGTTCCCCAGAACCATCCAGGAACTGGACAGATTCGCCAACCAGATCCTGTCCTACGGCGCCGAGCTGGATGCCGACCACCCTGGCTTCAAGGACCCCGTGTACCGGGCCAGACGGAAGCAGTTCGCCGATATCGCCTACAACTACCGGCACGGCCAGCCCATCCCCAGAGTCGAGTACACCGAAGAGGGCAAGAAAACCTGGGGCACCGTGTTCAAGACCCTGAAGTCCCTGTACCCCACCCACGCCTGCTACGAGTACAACCACATCTTCCCACTGCTCGAAAAGTACTGCGGCTTCCACGAGGACAATATCCCTCAGCTGGAGGACGTGTCCCAGTTTCTGCAGACCTGCACCGGCTTCAGACTCAGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGCCCAGCAGAGATTTTCTGGCCGGACTGGCCTTCCGGGTGTTCCACTGCACCCAGTACATCAGACACGGCAGCAAGCCCATGTACACCCCTGAGCCCGACATCTGCCACGAGCTGCTGGGACATGTGCCCCTGTTCAGCGACAGAAGCTTCGCCCAGTTCAGCCAGGAAATCGGCCTGGCCTCTCTGGGCGCTCCCGACGAGTATATCGAGAAGCTGGCCACCATCTACTGGTTCACCGTGGAATTCGGCCTGTGCAAGCAGGGCGACAGCATCAAGGCCTATGGCGCCGGACTCCTGTCCAGCTTCGGCGAGCTGCAGTACTGTCTGAGCGAGAAGCCCAAGCTGCTGCCCCTGGAACTGGAAAAGACCGCCATCCAGAACTACACCGTGACCGAGTTCCAGCCCCTGTACTACGTGGCCGAGAGCTTCAACGACGCCAAAGAAAAAGTGCGGAACTTCGCCGCCACCATCCCTCGGCCCTTCAGCGTCAGATACGACCCCTACACCCAGCGGATCGAGGTGCTGGACAACACACAGCAGCTGAAAATTCTGGCCGACTCCATCAACAGCGAGATCGGCATCCTGTGCAGCGCCCTGCAGAAAATCAAGTGAACTAGTCTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATACCGGTCCAGGGGTGAGTGAAGGTTTGGAAGAGTGTAGCAGAATAAGAAACCATGAGTCCCCTCCCTGAGAAGCCCTGAGCCCCCTTGACGACACACATCCCTCGAGGCTCAGCTTCATCATCTGTAAAAGGTGCTGAAACTGACCATCCAAGCTGCCGAAAAAGATTGTGTGGGGATAATTCAAAACTAGAGGAAGATGCAGAATTTCTACATCGTGGCGATGTCAGGCTAAGAGTTGCCATCGTGGCTGTCCATCGATTTTATTGGAATCATATGTTTATTTGAGGGTGTCTTGGATATTACAAATAAATTGTTGGAGCATCAGGCATATTTGGTAATTCTGTCTAAGGCTCCCTGCCCCTTGTTAATTGGCAGCTCAGTTATTCATCCAGGGCAAACATTCTGCTTACTATTCCTGAGAGCTTTCCTCATCCTCTAGATTGGCAGGGGAATTGCAGTTGCCTGAGCAGCCTCCCCTCTGCCATACCAACAGAGCTTCACCATCGAGGCTTGCAGAGTGGACAGGGGCCTCAGGGACCCCTGATCCCAGCTTTCTCATTGGACAGAAGGAGGAGACTGGGGCTGGAGAGGGACCTGGGCCCCCACTAAGGCCACAGCAGAGCCAGGACTTTAGCTGTGCTGACTGCAGCCTGGCTTGCCTCCACTGCCCTCCTTTGCCTCAAGAGCAAGGGAGCCTCAGAGTGGAGGAAGCAGCCCCTGGCCTTGCCTCCCACCTCCCCTCCCCTTTGCTGTTTTCCTGGGACAGTGGGAGCTGGCTTAGATTGCCCTGGGGCCCCCAGGACCCTGGCATTTTAACCCCTCAGGGGCAGGAAGGCAGCCTGAGATACAGAAGAGTCCATCACCTGCTGTATGCCACACACCATCCCCACAGTCGACATTTAAATTAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA (SEQ ID NO:6)

5'- и 3'-последовательности, используемые в специфических в отношении печени кассетах экспрессии

Последовательность модифицированного энхансера PrT2

GCGAGAACTTGTGCCTCCCCGTGTTCCTGACCTTTGACCCTCTGTCCTACTTAGACTAA

TATT GA C T TTGGGTACTGCAAACAGGAAATGGGGGAGGGATTCGATGCGAGAACTTGTG

CCTCCCCGTGTTCCTGACCTTTGACCCTCTGTCCTACTTAGACTAATATTGACTTTGGG

TACTGCAAACAGGAAATGGGGGAGGGA (SEQ ID NO:7)

Подчеркнуто - сайты связывания печеночного ядерного фактора; выделено жирным - изменения, внесенные в полученные сайты связывания с более высокой аффинностью; выделено курсивом - последовательность повтора.

Модифицированный энхансер A1MB2

GGCCCCAGGTTAATTTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTA

CTCTCTCTATTGACTTTGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGACTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACCTTCGATGGCCCCAGGTTAAT

TTTTAAAAAGCAGTCAAAGGTCAAAGTGGCCCTTGGCAGCATTTACTCTCTCTATTGAC

T T TGGTTAATAATCTCAGGAGCACAAACATTCCTGGAGGCAGGAGAAGAAATCAACATCCTGGA

CTTATCCTCTGGGCCTCTCCCCACC (SEQ ID NO:8)

Подчеркнуто - сайты связывания печеночного ядерного фактора; выделено жирным - изменения, внесенные в полученные сайты связывания с более высокой аффинностью; выделено курсивом - последовательность повтора.

Последовательность модифицированного Ealb

GTTCCTAGATTACATTACACATTCTGCAAGCATAGCACAGGTCAAAGTTCAACTTTAATTACTTTCATTTTCTTGTATCCTCACAGCCTAGAAAATAACCTGCGTTACAGCATCCACTCAGTATCCCTTGAGCATGAGGTGACACTACTTAACATAGGGACGAGATGGTACTTTGTGTCTCCTGCTCTGTCAGCAGGGCACTGTACTTGCTGATACCAGGGAATATTGATTTGTAAATACCATCATTCCGAACGTGTTTGCCTTGGCCAGTTTTCCATGTACATGCAGAAAGAAGTTTGGGACTGATCAATACAGTCCTCTGCCTTTAAAGCAATAGGAAAAGGCCAACTTGTCTACGTTTAGTATGTGGCTGTAGA (SEQ ID NO:9)

Подчеркнуто - сайты связывания печеночного ядерного фактора; выделено жирным - изменения, внесенные в полученные сайты связывания с более высокой аффинностью; выделено курсивом - последовательность повтора.

Энхансер HEII

CCATCAGATCCTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCCCAGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCCTACTTCAAAGACTGTGTGTTTAAGGACTGGGAGGAGCTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTATTAGGAGGCTG (SEQ ID NO:10)

Энхансер CRM8

GGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGGTCACCCCAGTTATCGGAGGAGCAAACAGGGGCTAAGTCCAC (SEQ ID NO:11)

Ассоциированный со стабильностью элемент 3'Alb

CTCAATTGGATGACACTAGTCATCACATTTAAAAGCATCTCAGGTAACTATATTTTGAATTTTTTAAAAAAGTAACTATAATAGTTATTATTAAAATAGCAAAGATTGACCATTTCCAAGAGCCATATAGACCAGCACCGACCACTATTCTAAACTATTTATGTATGTAAATATTAGCTTTTAAAATTCTCAAAATAGTTGCTGAGTTGGGAACCACTATTATTTCTATCGATTCAGCAGCCGTAAGTCTAGGACAGGCTTAAATTGTTTTCACTGGTGTAAATTGCAGAAAGATGATCTAAGTAATTTGGCATTTATTTTAATAGGTTTGAAAAACACATGCCATTTTACAAATAAGACTTATATTTGTCCTTTTGTTTTTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAAAGCTTATTCATCTGTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAATCTAATAGAGTGGTACAGCACTGTTATTTTTCAAAGATGTGTTGCTATCCTGAAAATTCTGTAGGTTCTGTGGAAGTTCCAGTGTTCTCTCTTATTCCACTTCGGTAGAGGATTTCTAGTTTCTTGTGGGCTAATTAAATAAATCATTAATACTCTTCTAAGTTATGGATTATAAACATTCAAAATAATATTTTGACATTATGATAATTCTGAATAAAAGAACAAAAACCATGGTATAGGTAAGGAATATAAAACATGGCTTTTACCTTAGAAAAAACAATTCTAAAATTCATATGGAATCAAAAAAGAGCCTGCAGGTACCCT (SEQ ID NO:12)

Ассоциированный со стабильностью элемент 3'alb и SMAR

CTCAATTGGATGACACTAGTCATCACATTTAAAAGCATCTCAGGTAACTATATTTTGAATTTTTTAAAAAAGTAACTATAATAGTTATTATTAAAATAGCAAAGATTGACCATTTCCAAGAGCCATATAGACCAGCACCGACCACTATTCTAAACTATTTATGTATGTAAATATTAGCTTTTAAAATTCTCAAAATAGTTGCTGAGTTGGGAACCACTATTATTTCTATCTACTGTTTTAATTAAAATTATCTCTAAGGCATGTGAACTGGCTGTCTTGGTTTTCATCTGTACTTCATCTGCTACCTCTGTGACCTGAAACATATTTATAATTCCATTAAGCTGTGCATATGATAGATTTATCATATGTATTTTCCTTAAAGGATTTTTGTAAGAACTAATTGAATTGATACCTGTAAAGTCTTTATCACACTACCCAATAAATAATAAATCTCTTTGTTCAGCTCTCTGTTTCTATAAATATGTACCAGTTTTATTGTTTTTAGTGGTAGTGATTTTATTCTCTTTCTATATATATACACACACATGTGTGCATTCATAAATATATACAATTTTTATGAATAAAAAATTATTAGCAATCAATATTGAAAACCACTGATTTTTGTTTATGTGAGCAAACAGCAGATTAAAAGGAATTCCTGCAGATTCAGCAGCCGTAAGTCTAGGACAGGCTTAAATTGTTTTCACTGGTGTAAATTGCAGAAAGATGATCTAAGTAATTTGGCATTTATTTTAATAGGTTTGAAAAACACATGCCATTTTACAAATAAGACTTATATTTGTCCTTTTGTTTTTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAAAAGCTTATTCATCTGTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAATCTAATAGAGTGGTACAGCACTGTTATTTTTCAAAGATGTGTTGCTATCCTGAAAATTCTGTAGGTTCTGTGGAAGTTCCAGTGTTCTCTCTTATTCCACTTCGGTAGAGGATTTCTAGTTTCTTGTGGGCTAATTAAATAAATCATTAATACTCTTCTAAGTTATGGATTATAAACATTCAAAATAATATTTTGACATTATGATAATTCTGAATAAAAGAACAAAAACCATGGTATAGGTAAGGAATATAAAACATGGCTTTTACCTTAGAAAAAACAATTCTAAAATTCATATGGAATCAAAAAAGAGCCTGCAGGTACCCT(SEQ ID NO:13)

Кодон-оптимизированная кДНК человеческой PAH

ATGAGCACAGCCGTGCTGGAAAACCCCGGCCTGGGCAGAAAGCTGAGCGACTTCGGCCAGGAAACCAGCTACATCGAGGACAACTGCAACCAGAACGGCGCCATCAGCCTGATCTTCAGCCTGAAAGAAGAAGTGGGCGCCCTGGCCAAGGTGCTGCGGCTGTTCGAAGAGAACGACGTGAACCTGACCCACATCGAGAGCCGGCCCAGCAGACTGAAGAAGGACGAGTACGAGTTCTTCACCCACCTGGACAAGCGGAGCCTGCCCGCCCTGACCAACATCATCAAGATCCTGCGGCACGACATCGGCGCCACCGTGCACGAGCTGAGCCGGGACAAGAAAAAGGACACCGTGCCCTGGTTCCCCAGAACCATCCAGGAACTGGACAGATTCGCCAACCAGATCCTGTCCTACGGCGCCGAGCTGGATGCCGACCACCCTGGCTTCAAGGACCCCGTGTACCGGGCCAGACGGAAGCAGTTCGCCGATATCGCCTACAACTACCGGCACGGCCAGCCCATCCCCAGAGTCGAGTACATGGAAGAGGGCAAGAAAACCTGGGGCACCGTGTTCAAGACCCTGAAGTCCCTGTACAAGACCCACGCCTGCTACGAGTACAACCACATCTTCCCACTGCTCGAGAAGTACTGCGGCTTCCACGAGGACAATATCCCTCAGCTCGAGGACGTGTCCCAGTTTCTGCAGACCTGCACCGGCTTCAGACTCAGGCCTGTGGCCGGCCTGCTGAGCAGCAGAGATTTTCTGGGCGGACTGGCCTTCCGGGTGTTCCACTGCACCCAGTACATCAGACACGGCAGCAAGCCCATGTACACCCCTGAGCCCGACATCTGCCACGAGCTGCTGGGACATGTGCCCCTGTTCAGCGACAGAAGCTTCGCCCAGTTCAGCCAGGAAATCGGCCTGGCCTCTCTGGGCGCTCCCGACGAGTATATCGAGAAGCTGGCCACCATCTACTGGTTCACCGTGGAATTCGGCCTGTGCAAGCAGGGCGACAGCATCAAGGCCTATGGCGCCGGACTCCTGTCCAGCTTCGGCGAGCTGCAGTACTGTCTGAGCGAGAAGCCCAAGCTGCTGCCCCTGGAACTGGAAAAGACCGCCATCCAGAACTACACCGTGACCGAGTTCCAGCCCCTGTACTACGTGGCCGAGAGCTTCAACGACGCCAAAGAAAAAGTGCGGAACTTCGCCGCCACCATCCCTCGGCCCTTCAGCGTCAGATACGACCCCTACACCCAGCGGATCGAGGTGCTGGACAACACACAGCAGCTGAAAATTCTGGCCGACTCCATCAACAGCGAGATCGGCATCCTGTGCAGCGCCCTGCAGAAAATCAAGTGA (SEQ ID NO:14)

Модифицированный гибридный промотор/интрон генов β-актина курицы (CBA)/β-глобина кролика.

AGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTATTGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAAGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGGGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTTTGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAATTGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCTTGTTCTTGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTC (SEQ ID NO:15)

Выделено жирным=G, A, A, A, A заменены на T с целью устранения ATG (5 замен).

Спейсерная последовательность интрона A1AT размером 0,9 т. о.

CCAGGGGTGAGTGAAGGTTTGGAAGAGTGTAGCAGAATAAGAAACCATGAGTCCCCTCCCTGAGAAGCCCTGAGCCCCCTTGACGACACACATCCCTCGAGGCTCAGCTTCATCATCTGTAAAAGGTGCTGAAACTGACCATCCAAGCTGCCGAAAAAGATTGTGTGGGGATAATTCAAAACTAGAGGAAGATGCAGAATTTCTACATCGTGGCGATGTCAGGCTAAGAGTTGCCATCGTGGCTGTCCATCGATTTTATTGGAATCATATGTTTATTTGAGGGTGTCTTGGATATTACAAATAAATTGTTGGAGCATCAGGCATATTTGGTAATTCTGTCTAAGGCTCCCTGCCCCTTGTTAATTGGCAGCTCAGTTATTCATCCAGGGCAAACATTCTGCTTACTATTCCTGAGAGCTTTCCTCATCCTCTAGATTGGCAGGGGAATTGCAGTTGCCTGAGCAGCCTCCCCTCTGCCATACCAACAGAGCTTCACCATCGAGGCTTGCAGAGTGGACAGGGGCCTCAGGGACCCCTGATCCCAGCTTTCTCATTGGACAGAAGGAGGAGACTGGGGCTGGAGAGGGACCTGGGCCCCCACTAAGGCCACAGCAGAGCCAGGACTTTAGCTGTGCTGACTGCAGCCTGGCTTGCCTCCACTGCCCTCCTTTGCCTCAAGAGCAAGGGAGCCTCAGAGTGGAGGAAGCAGCCCCTGGCCTTGCCTCCCACCTCCCCTCCCCTTTGCTGTTTTCCTGGGACAGTGGGAGCTGGCTTAGATTGCCCTGGGGCCCCCAGGACCCTGGCATTTTAACCCCTCAGGGGCAGGAAGGCAGCCTGAGATACAGAAGAGTCCATCACCTGCTGTATGCCACACACCATCCCCACAGTCGACATTTAAATT (SEQ ID NO:16)

Выделено жирным=7 оснований заменены с целью устранения ATG; во всех случаях A заменен на T.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> GENZYME CORPORATION

<120> ПОЛУЧЕНИЕ УЛУЧШЕННОЙ ЧЕЛОВЕЧЕСКОЙ PAH ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТЯЖЕЛОЙ PKU С ПОМОЩЬЮ

ГЕННОЙ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ, НАПРАВЛЕННОЙ НА ПЕЧЕНЬ

<130> 15979-20166.00

<140> Пока еще не назначен

<141> Одновременно с этим

<150> US 62/744,944

<151> 2018-10-12

<160> 18

<170> FastSEQ для Windows версии 4.0

<210> 1

<211> 452

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ser Thr Ala Val Leu Glu Asn Pro Gly Leu Gly Arg Lys Leu Ser

1. 5 10 15

Asp Phe Gly Gln Glu Thr Ser Tyr Ile Glu Asp Asn Cys Asn Gln Asn

20 25 30

Gly Ala Ile Ser Leu Ile Phe Ser Leu Lys Glu Glu Val Gly Ala Leu

35 40 45

Ala Lys Val Leu Arg Leu Phe Glu Glu Asn Asp Val Asn Leu Thr His

50 55 60

Ile Glu Ser Arg Pro Ser Arg Leu Lys Lys Asp Glu Tyr Glu Phe Phe

65 70 75 80

Thr His Leu Asp Lys Arg Ser Leu Pro Ala Leu Thr Asn Ile Ile Lys

85 90 95

Ile Leu Arg His Asp Ile Gly Ala Thr Val His Glu Leu Ser Arg Asp

100 105 110

Lys Lys Lys Asp Thr Val Pro Trp Phe Pro Arg Thr Ile Gln Glu Leu

115 120 125

Asp Arg Phe Ala Asn Gln Ile Leu Ser Tyr Gly Ala Glu Leu Asp Ala

130 135 140

Asp His Pro Gly Phe Lys Asp Pro Val Tyr Arg Ala Arg Arg Lys Gln

145 150 155 160

Phe Ala Asp Ile Ala Tyr Asn Tyr Arg His Gly Gln Pro Ile Pro Arg

165 170 175

Val Glu Tyr Met Glu Glu Glu Lys Lys Thr Trp Gly Thr Val Phe Lys

180 185 190

Thr Leu Lys Ser Leu Tyr Lys Thr His Ala Cys Tyr Glu Tyr Asn His

195 200 205

Ile Phe Pro Leu Leu Glu Lys Tyr Cys Gly Phe His Glu Asp Asn Ile

210 215 220

Pro Gln Leu Glu Asp Val Ser Gln Phe Leu Gln Thr Cys Thr Gly Phe

225 230 235 240

Arg Leu Arg Pro Val Ala Gly Leu Leu Ser Ser Arg Asp Phe Leu Gly

245 250 255

Gly Leu Ala Phe Arg Val Phe His Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Gly

260 265 270

Ser Lys Pro Met Tyr Thr Pro Glu Pro Asp Ile Cys His Glu Leu Leu

275 280 285

Gly His Val Pro Leu Phe Ser Asp Arg Ser Phe Ala Gln Phe Ser Gln

290 295 300

Glu Ile Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Pro Asp Glu Tyr Ile Glu Lys

305 310 315 320

Leu Ala Thr Ile Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln

325 330 335

Gly Asp Ser Ile Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Phe Gly

340 345 350

Glu Leu Gln Tyr Cys Leu Ser Glu Lys Pro Lys Leu Leu Pro Leu Glu

355 360 365

Leu Glu Lys Thr Ala Ile Gln Asn Tyr Thr Val Thr Glu Phe Gln Pro

370 375 380

Leu Tyr Tyr Val Ala Glu Ser Phe Asn Asp Ala Lys Glu Lys Val Arg

385 390 395 400

Asn Phe Ala Ala Thr Ile Pro Arg Pro Phe Ser Val Arg Tyr Asp Pro

405 410 415

Tyr Thr Gln Arg Ile Glu Val Leu Asp Asn Thr Gln Gln Leu Lys Ile

420 425 430

Leu Ala Asp Ser Ile Asn Ser Glu Ile Gly Ile Leu Cys Ser Ala Leu

435 440 445

Gln Lys Ile Lys

450

<210> 2

<211> 452

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Ser Thr Ala Val Leu Glu Asn Pro Gly Leu Gly Arg Lys Leu Ser

1. 5 10 15

Asp Phe Gly Gln Glu Thr Ser Tyr Ile Glu Asp Asn Cys Asn Gln Asn

20 25 30

Gly Ala Ile Ser Leu Ile Phe Ser Leu Lys Glu Glu Val Gly Ala Leu

35 40 45

Ala Lys Val Leu Arg Leu Phe Glu Glu Asn Asp Val Asn Leu Thr His

50 55 60

Ile Glu Ser Arg Pro Ser Arg Leu Lys Lys Asp Glu Tyr Glu Phe Phe

65 70 75 80

Thr His Leu Asp Lys Arg Ser Leu Pro Ala Leu Thr Asn Ile Ile Lys

85 90 95

Ile Leu Arg His Asp Ile Gly Ala Thr Val His Glu Leu Ser Arg Asp

100 105 110

Lys Lys Lys Asp Thr Val Pro Trp Phe Pro Arg Thr Ile Gln Glu Leu

115 120 125

Asp Arg Phe Ala Asn Gln Ile Leu Ser Tyr Gly Ala Glu Leu Asp Ala

130 135 140

Asp His Pro Gly Phe Lys Asp Pro Val Tyr Arg Ala Arg Arg Lys Gln

145 150 155 160

Phe Ala Asp Ile Ala Tyr Asn Tyr Arg His Gly Gln Pro Ile Pro Arg

165 170 175

Val Glu Tyr Met Glu Glu Gly Lys Lys Thr Trp Gly Thr Val Phe Lys

180 185 190

Thr Leu Lys Ser Leu Tyr Lys Thr His Ala Cys Tyr Glu Tyr Asn His

195 200 205

Ile Phe Pro Leu Leu Glu Lys Tyr Cys Gly Phe His Glu Asp Asn Ile

210 215 220

Pro Gln Leu Glu Asp Val Ser Gln Phe Leu Gln Thr Cys Thr Gly Phe

225 230 235 240

Arg Leu Arg Pro Val Ala Gly Leu Leu Ser Ser Arg Asp Phe Leu Gly

245 250 255

Gly Leu Ala Phe Arg Val Phe His Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Gly

260 265 270

Ser Lys Pro Met Tyr Thr Pro Glu Pro Asp Ile Cys His Glu Leu Leu

275 280 285

Gly His Val Pro Leu Phe Ser Asp Arg Ser Phe Ala Gln Phe Ser Gln

290 295 300

Glu Ile Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Pro Asp Glu Tyr Ile Glu Lys

305 310 315 320

Leu Ala Thr Ile Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln

325 330 335

Gly Asp Ser Ile Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Phe Gly

340 345 350

Glu Leu Gln Tyr Cys Leu Ser Glu Lys Pro Lys Leu Leu Pro Leu Glu

355 360 365

Leu Glu Lys Thr Ala Ile Gln Asn Tyr Thr Val Thr Glu Phe Gln Pro

370 375 380

Leu Tyr Tyr Val Ala Glu Ser Phe Asn Asp Ala Lys Glu Lys Val Arg

385 390 395 400

Asn Phe Ala Ala Thr Ile Pro Arg Pro Phe Ser Val Arg Tyr Asp Pro

405 410 415

Tyr Thr Gln Arg Ile Glu Val Leu Asp Asn Thr Gln Gln Leu Lys Ile

420 425 430

Leu Ala Asp Ser Ile Asn Ser Glu Ile Gly Ile Leu Cys Ser Ala Leu

435 440 445

Gln Lys Ile Lys

450

<210> 3

<211> 452

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 3

Met Ser Thr Ala Val Leu Glu Asn Pro Gly Leu Gly Arg Lys Leu Ser

1. 5 10 15

Asp Phe Gly Gln Glu Thr Ser Tyr Ile Glu Asp Asn Cys Asn Gln Asn

20 25 30

Gly Ala Ile Ser Leu Ile Phe Ser Leu Lys Glu Glu Val Gly Ala Leu

35 40 45

Ala Lys Val Leu Arg Leu Phe Glu Glu Asn Asp Val Asn Leu Thr His

50 55 60

Ile Glu Ser Arg Pro Ser Arg Leu Lys Lys Asp Glu Tyr Glu Phe Phe

65 70 75 80

Thr His Leu Asp Lys Arg Ser Leu Pro Ala Leu Thr Asn Ile Ile Lys

85 90 95

Ile Leu Arg His Asp Ile Gly Ala Thr Val His Glu Leu Ser Arg Asp

100 105 110

Lys Lys Lys Asp Thr Val Pro Trp Phe Pro Arg Thr Ile Gln Glu Leu

115 120 125

Asp Arg Phe Ala Asn Gln Ile Leu Ser Tyr Gly Ala Glu Leu Asp Ala

130 135 140

Asp His Pro Gly Phe Lys Asp Pro Val Tyr Arg Ala Arg Arg Lys Gln

145 150 155 160

Phe Ala Asp Ile Ala Tyr Asn Tyr Arg His Gly Gln Pro Ile Pro Arg

165 170 175

Val Glu Tyr Thr Glu Glu Glu Lys Lys Thr Trp Gly Thr Val Phe Lys

180 185 190

Thr Leu Lys Ser Leu Tyr Pro Thr His Ala Cys Tyr Glu Tyr Asn His

195 200 205

Ile Phe Pro Leu Leu Glu Lys Tyr Cys Gly Phe His Glu Asp Asn Ile

210 215 220

Pro Gln Leu Glu Asp Val Ser Gln Phe Leu Gln Thr Cys Thr Gly Phe

225 230 235 240

Arg Leu Arg Pro Val Ala Gly Leu Leu Pro Ser Arg Asp Phe Leu Ala

245 250 255

Gly Leu Ala Phe Arg Val Phe His Cys Thr Gln Tyr Ile Arg His Gly

260 265 270

Ser Lys Pro Met Tyr Thr Pro Glu Pro Asp Ile Cys His Glu Leu Leu

275 280 285

Gly His Val Pro Leu Phe Ser Asp Arg Ser Phe Ala Gln Phe Ser Gln

290 295 300

Glu Ile Gly Leu Ala Ser Leu Gly Ala Pro Asp Glu Tyr Ile Glu Lys

305 310 315 320

Leu Ala Thr Ile Tyr Trp Phe Thr Val Glu Phe Gly Leu Cys Lys Gln

325 330 335

Gly Asp Ser Ile Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Leu Leu Ser Ser Phe Gly

340 345 350

Glu Leu Gln Tyr Cys Leu Ser Glu Lys Pro Lys Leu Leu Pro Leu Glu

355 360 365

Leu Glu Lys Thr Ala Ile Gln Asn Tyr Thr Val Thr Glu Phe Gln Pro

370 375 380

Leu Tyr Tyr Val Ala Glu Ser Phe Asn Asp Ala Lys Glu Lys Val Arg

385 390 395 400

Asn Phe Ala Ala Thr Ile Pro Arg Pro Phe Ser Val Arg Tyr Asp Pro

405 410 415

Tyr Thr Gln Arg Ile Glu Val Leu Asp Asn Thr Gln Gln Leu Lys Ile

420 425 430

Leu Ala Asp Ser Ile Asn Ser Glu Ile Gly Ile Leu Cys Ser Ala Leu

435 440 445

Gln Lys Ile Lys

450

<210> 4

<211> 1359

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 4

atgagcacag ccgtgctgga aaaccccggc ctgggcagaa agctgagcga cttcggccag 60

gaaaccagct acatcgagga caactgcaac cagaacggcg ccatcagcct gatcttcagc 120

ctgaaagaag aagtgggcgc cctggccaag gtgctgcggc tgttcgagga gaacgacgtg 180

aacctgaccc acatcgagag ccggcccagc agactgaaga aggacgagta cgagttcttc 240

acccacctgg acaagcggag cctgcccgcc ctgaccaaca tcatcaagat cctgcggcac 300

gacatcggcg ccaccgtgca cgagctgagc cgggacaaga aaaaggacac cgtgccctgg 360

ttccccagaa ccatccagga actggacaga ttcgccaacc agatcctgtc ctacggcgcc 420

gagctggatg ccgaccaccc tggcttcaag gaccccgtgt accgggccag acggaagcag 480

ttcgccgata tcgcctacaa ctaccggcac ggccagccca tccccagagt cgagtacacc 540

gaagagggca agaaaacctg gggcaccgtg ttcaagaccc tgaagtccct gtaccccacc 600

cacgcctgct acgagtacaa ccacatcttc ccactgctcg aaaagtactg cggcttccac 660

gaggacaata tccctcagct ggaggacgtg tcccagtttc tgcagacctg caccggcttc 720

agactcaggc ctgtggccgg cctgctgccc agcagagatt ttctggccgg actggccttc 780

cgggtgttcc actgcaccca gtacatcaga cacggcagca agcccatgta cacccctgag 840

cccgacatct gccacgagct gctgggacat gtgcccctgt tcagcgacag aagcttcgcc 900

cagttcagcc aggaaatcgg cctggcctct ctgggcgctc ccgacgagta tatcgagaag 960

ctggccacca tctactggtt caccgtggaa ttcggcctgt gcaagcaggg cgacagcatc 1020

aaggcctatg gcgccggact cctgtccagc ttcggcgagc tgcagtactg tctgagcgag 1080

aagcccaagc tgctgcccct ggaactggaa aagaccgcca tccagaacta caccgtgacc 1140

gagttccagc ccctgtacta cgtggccgag agcttcaacg acgccaaaga aaaagtgcgg 1200

aacttcgccg ccaccatccc tcggcccttc agcgtcagat acgaccccta cacccagcgg 1260

atcgaggtgc tggacaacac acagcagctg aaaattctgg ccgactccat caacagcgag 1320

atcggcatcc tgtgcagcgc cctgcagaaa atcaagtga 1359

<210> 5

<211> 3713

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 5

gagctcttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 60

gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag 120

ggagtggcca actccatcac taggggttcc tacgcgtggc cccaggttaa tttttaaaaa 180

gcagtcaaag gtcaaagtgg cccttggcag catttactct ctctattgac tttggttaat 240

aatctcagga gcacaaacat tcctggaggc aggagaagaa atcaacatcc tggacttatc 300

ctctgggcct ctccccacct tcgatggccc caggttaatt tttaaaaagc agtcaaaggt 360

caaagtggcc cttggcagca tttactctct ctattgactt tggttaataa tctcaggagc 420

acaaacattc ctggaggcag gagaagaaat caacatcctg gacttatcct ctgggcctct 480

ccccaccgat atctacctgc tgatcgcccg gcccctgttc aaacatgtcc taatactctg 540

tcggggcaaa ggtcggcagt agttttccat cttactcaac atcctcccag tgtacgtagg 600

atcctgtctg tctgcacatt tcgtagagcg agtgttccga tactctaatc tcccggggca 660

aaggtcgtat tgacttaggt tacttattct ccttttgttg actaagtcaa taatcagaat 720

cagcaggttt ggagtcagct tggcagggat cagcagcctg ggttggaagg agggggtata 780

aaagcccctt caccaggaga agccgtcaca cagatccaca agctcctgct agcagtcgct 840

gcgcgctgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc gccccggctc 900

tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc tccgggctgt 960

aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt ggctgcgtga aagccttgag 1020

gggctccggg aaggcccttt gtgcgggggg agcggctcgg ggggtgcgtg cgtgtgtgtg 1080

tgcgtgggga gcgccgcgtg cggctccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg ctgcgggcgc 1140

ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcagtgtg cgcgagggga gcggggccgg gggcggtgcc 1200

ccgcggtgcg gggggggctg cgaggggaac aaaggctgcg tgcggggtgt gtgcgtgggg 1260

gggtgagcag ggggtgtggg cgcgtcggtc gggctgcaac cccccctgca cccccctccc 1320

cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtacggggcg tggcgcgggg 1380

ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc ggggccgcct 1440

cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccc ggagcgccgg cggctgtcga 1500

ggcgcggcga gccgcagcca ttgcctttta tggtaatcgt gcgagagggc gcagggactt 1560

cctttgtccc aaatctgtgc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac cccctctagc 1620

gggcgcgggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga gggccttcgt 1680

gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccct ctccagcctc ggggctgtcc gcggggggac 1740

ggctgccttc gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc 1800

tctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac 1860

gtgctggtta ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tcatttcgaa gccgccacca 1920

tgagcacagc cgtgctggaa aaccccggcc tgggcagaaa gctgagcgac ttcggccagg 1980

aaaccagcta catcgaggac aactgcaacc agaacggcgc catcagcctg atcttcagcc 2040

tgaaagaaga agtgggcgcc ctggccaagg tgctgcggct gttcgaggag aacgacgtga 2100

acctgaccca catcgagagc cggcccagca gactgaagaa ggacgagtac gagttcttca 2160

cccacctgga caagcggagc ctgcccgccc tgaccaacat catcaagatc ctgcggcacg 2220

acatcggcgc caccgtgcac gagctgagcc gggacaagaa aaaggacacc gtgccctggt 2280

tccccagaac catccaggaa ctggacagat tcgccaacca gatcctgtcc tacggcgccg 2340

agctggatgc cgaccaccct ggcttcaagg accccgtgta ccgggccaga cggaagcagt 2400

tcgccgatat cgcctacaac taccggcacg gccagcccat ccccagagtc gagtacaccg 2460

aagagggcaa gaaaacctgg ggcaccgtgt tcaagaccct gaagtccctg taccccaccc 2520

acgcctgcta cgagtacaac cacatcttcc cactgctcga aaagtactgc ggcttccacg 2580

aggacaatat ccctcagctg gaggacgtgt cccagtttct gcagacctgc accggcttca 2640

gactcaggcc tgtggccggc ctgctgccca gcagagattt tctggccgga ctggccttcc 2700

gggtgttcca ctgcacccag tacatcagac acggcagcaa gcccatgtac acccctgagc 2760

ccgacatctg ccacgagctg ctgggacatg tgcccctgtt cagcgacaga agcttcgccc 2820

agttcagcca ggaaatcggc ctggcctctc tgggcgctcc cgacgagtat atcgagaagc 2880

tggccaccat ctactggttc accgtggaat tcggcctgtg caagcagggc gacagcatca 2940

aggcctatgg cgccggactc ctgtccagct tcggcgagct gcagtactgt ctgagcgaga 3000

agcccaagct gctgcccctg gaactggaaa agaccgccat ccagaactac accgtgaccg 3060

agttccagcc cctgtactac gtggccgaga gcttcaacga cgccaaagaa aaagtgcgga 3120

acttcgccgc caccatccct cggcccttca gcgtcagata cgacccctac acccagcgga 3180

tcgaggtgct ggacaacaca cagcagctga aaattctggc cgactccatc aacagcgaga 3240

tcggcatcct gtgcagcgcc ctgcagaaaa tcaagtgacc taggtgatca agatctgcta 3300

gcttaattaa cccgggacta gtgcggccgc tcgagactag tctgtgcctt ctagttgcca 3360

gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac 3420

tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat 3480

tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca 3540

tgctggggat gcggtgggct ctatggtacc aggaacccct agtgatggag ttggccactc 3600

cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg 3660

gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg gcc 3713

<210> 6

<211> 4561

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 6

ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc aaagcccggg 60

cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag agagggagtg 120

gccaactcca tcactagggg ttccttaccg cgtggcccca ggttaatttt taaaaagcag 180

tcaaaggtca aagtggccct tggcagcatt tactctctct attgactttg gttaataatc 240

tcaggagcac aaacattcct ggaggcagga gaagaaatca acatcctgga cttatcctct 300

gggcctctcc ccaccttcga tggccccagg ttaattttta aaaagcagtc aaaggtcaaa 360

gtggcccttg gcagcattta ctctctctat tgactttggt taataatctc aggagcacaa 420

acattcctgg aggcaggaga agaaatcaac atcctggact tatcctctgg gcctctcccc 480

accgatatct acctgctgat cgcccggccc ctgttcaaac atgtcctaat actctgtcgg 540

ggcaaaggtc ggcagtagtt ttccatctta ctcaacatcc tcccagtgta cgtaggatcc 600

tgtctgtctg cacatttcgt agagcgagtg ttccgatact ctaatctccc ggggcaaagg 660

tcgtattgac ttaggttact tattctcctt ttgttgacta agtcaataat cagaatcagc 720

aggtttggag tcagcttggc agggatcagc agcctgggtt ggaaggaggg ggtataaaag 780

ccccttcacc aggagaagcc gtcacacaga tccacaagct cctgctagcc aattgagtcg 840

ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc 900

tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga gcgggcggga cggcccttct cctccgggct 960

gtaattagcg cttggtttat tgacggcttg tttcttttct gtggctgcgt gaaagccttg 1020

aggggctccg ggaaggccct ttgtgcgggg ggagcggctc ggggggtgcg tgcgtgtgtg 1080

tgtgcgtggg gagcgccgcg tgcggctccg cgctgcccgg cggctgtgag cgctgcgggc 1140

gcggcgcggg gctttgtgcg ctccgcagtg tgcgcgaggg gagcggggcc gggggcggtg 1200

ccccgcggtg cggggggggc tgcgagggga acaaaggctg cgtgcggggt gtgtgcgtgg 1260

gggggtgagc agggggtgtg ggcgcgtcgg tcgggctgca accccccctg cacccccctc 1320

cccgagttgc tgagcacggc ccggcttcgg gtgcggggct ccgtacgggg cgtggcgcgg 1380

ggctcgccgt gccgggcggg gggtggcggc aggtgggggt gccgggcggg gcggggccgc 1440

ctcgggccgg ggagggctcg ggggaggggc gcggcggccc ccggagcgcc ggcggctgtc 1500

gaggcgcggc gagccgcagc cattgccttt tttggtaatc gtgcgagagg gcgcagggac 1560

ttcctttgtc ccaaatctgt gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta 1620

gcgggcgcgg ggcgaagcgg tgcggcgccg gcaggaagga attgggcggg gagggccttc 1680

gtgcgtcgcc gcgccgccgt ccccttctcc ctctccagcc tcggggctgt ccgcgggggg 1740

acggctgcct tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg 1800

gctctagagc ctctgctaac cttgttcttg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca 1860

acgtgctggt tattgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga attcatttcg aagccgccac 1920

catgagcaca gccgtgctgg aaaaccccgg cctgggcaga aagctgagcg acttcggcca 1980

ggaaaccagc tacatcgagg acaactgcaa ccagaacggc gccatcagcc tgatcttcag 2040

cctgaaagaa gaagtgggcg ccctggccaa ggtgctgcgg ctgttcgagg agaacgacgt 2100

gaacctgacc cacatcgaga gccggcccag cagactgaag aaggacgagt acgagttctt 2160

cacccacctg gacaagcgga gcctgcccgc cctgaccaac atcatcaaga tcctgcggca 2220

cgacatcggc gccaccgtgc acgagctgag ccgggacaag aaaaaggaca ccgtgccctg 2280

gttccccaga accatccagg aactggacag attcgccaac cagatcctgt cctacggcgc 2340

cgagctggat gccgaccacc ctggcttcaa ggaccccgtg taccgggcca gacggaagca 2400

gttcgccgat atcgcctaca actaccggca cggccagccc atccccagag tcgagtacac 2460

cgaagagggc aagaaaacct ggggcaccgt gttcaagacc ctgaagtccc tgtaccccac 2520

ccacgcctgc tacgagtaca accacatctt cccactgctc gaaaagtact gcggcttcca 2580

cgaggacaat atccctcagc tggaggacgt gtcccagttt ctgcagacct gcaccggctt 2640

cagactcagg cctgtggccg gcctgctgcc cagcagagat tttctggccg gactggcctt 2700

ccgggtgttc cactgcaccc agtacatcag acacggcagc aagcccatgt acacccctga 2760

gcccgacatc tgccacgagc tgctgggaca tgtgcccctg ttcagcgaca gaagcttcgc 2820

ccagttcagc caggaaatcg gcctggcctc tctgggcgct cccgacgagt atatcgagaa 2880

gctggccacc atctactggt tcaccgtgga attcggcctg tgcaagcagg gcgacagcat 2940

caaggcctat ggcgccggac tcctgtccag cttcggcgag ctgcagtact gtctgagcga 3000

gaagcccaag ctgctgcccc tggaactgga aaagaccgcc atccagaact acaccgtgac 3060

cgagttccag cccctgtact acgtggccga gagcttcaac gacgccaaag aaaaagtgcg 3120

gaacttcgcc gccaccatcc ctcggccctt cagcgtcaga tacgacccct acacccagcg 3180

gatcgaggtg ctggacaaca cacagcagct gaaaattctg gccgactcca tcaacagcga 3240

gatcggcatc ctgtgcagcg ccctgcagaa aatcaagtga actagtctgt gccttctagt 3300

tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact 3360

cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat 3420

tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc 3480

aggcatgctg gggatgcggt gggctctata ccggtccagg ggtgagtgaa ggtttggaag 3540

agtgtagcag aataagaaac catgagtccc ctccctgaga agccctgagc ccccttgacg 3600

acacacatcc ctcgaggctc agcttcatca tctgtaaaag gtgctgaaac tgaccatcca 3660

agctgccgaa aaagattgtg tggggataat tcaaaactag aggaagatgc agaatttcta 3720

catcgtggcg atgtcaggct aagagttgcc atcgtggctg tccatcgatt ttattggaat 3780

catatgttta tttgagggtg tcttggatat tacaaataaa ttgttggagc atcaggcata 3840

tttggtaatt ctgtctaagg ctccctgccc cttgttaatt ggcagctcag ttattcatcc 3900

agggcaaaca ttctgcttac tattcctgag agctttcctc atcctctaga ttggcagggg 3960

aattgcagtt gcctgagcag cctcccctct gccataccaa cagagcttca ccatcgaggc 4020

ttgcagagtg gacaggggcc tcagggaccc ctgatcccag ctttctcatt ggacagaagg 4080

aggagactgg ggctggagag ggacctgggc ccccactaag gccacagcag agccaggact 4140

ttagctgtgc tgactgcagc ctggcttgcc tccactgccc tcctttgcct caagagcaag 4200

ggagcctcag agtggaggaa gcagcccctg gccttgcctc ccacctcccc tcccctttgc 4260

tgttttcctg ggacagtggg agctggctta gattgccctg gggcccccag gaccctggca 4320

ttttaacccc tcaggggcag gaaggcagcc tgagatacag aagagtccat cacctgctgt 4380

atgccacaca ccatccccac agtcgacatt taaattagga acccctagtg atggagttgg 4440

ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 4500

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 4560

a 4561

<210> 7

<211> 204

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 7

gcgagaactt gtgcctcccc gtgttcctga cctttgaccc tctgtcctac ttagactaat 60

attgactttg ggtactgcaa acaggaaatg ggggagggat tcgatgcgag aacttgtgcc 120

tccccgtgtt cctgaccttt gaccctctgt cctacttaga ctaatattga ctttgggtac 180

tgcaaacagg aaatggggga ggga 204

<210> 8

<211> 330

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 8

ggccccaggt taatttttaa aaagcagtca aaggtcaaag tggcccttgg cagcatttac 60

tctctctatt gactttggtt aataatctca ggagcacaaa cattcctgga ggcaggagaa 120

gaaatcaaca tcctggactt atcctctggg cctctcccca ccttcgatgg ccccaggtta 180

atttttaaaa agcagtcaaa ggtcaaagtg gcccttggca gcatttactc tctctattga 240

ctttggttaa taatctcagg agcacaaaca ttcctggagg caggagaaga aatcaacatc 300

ctggacttat cctctgggcc tctccccacc 330

<210> 9

<211> 377

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 9

gttcctagat tacattacac attctgcaag catagcacag gtcaaagttc aactttaatt 60

actttcattt tcttgtatcc tcacagccta gaaaataacc tgcgttacag catccactca 120

gtatcccttg agcatgaggt gacactactt aacataggga cgagatggta ctttgtgtct 180

cctgctctgt cagcagggca ctgtacttgc tgataccagg gaatattgat ttgtaaatac 240

catcattccg aacgtgtttg ccttggccag ttttccatgt acatgcagaa agaagtttgg 300

gactgatcaa tacagtcctc tgcctttaaa gcaataggaa aaggccaact tgtctacgtt 360

tagtatgtgg ctgtaga 377

<210> 10

<211> 156

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 10

ccatcagatc ctgcccaagg tcttacataa gaggactctt ggactcccag caatgtcaac 60

gaccgacctt gaggcctact tcaaagactg tgtgtttaag gactgggagg agctggggga 120

ggagattagg ttaaaggtct ttgtattagg aggctg 156

<210> 11

<211> 71

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 11

ggggaggctg ctggtgaata ttaaccaagg tcaccccagt tatcggagga gcaaacaggg 60

gctaagtcca c 71

<210> 12

<211> 869

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 12

ctcaattgga tgacactagt catcacattt aaaagcatct caggtaacta tattttgaat 60

tttttaaaaa agtaactata atagttatta ttaaaatagc aaagattgac catttccaag 120

agccatatag accagcaccg accactattc taaactattt atgtatgtaa atattagctt 180

ttaaaattct caaaatagtt gctgagttgg gaaccactat tatttctatc gattcagcag 240

ccgtaagtct aggacaggct taaattgttt tcactggtgt aaattgcaga aagatgatct 300

aagtaatttg gcatttattt taataggttt gaaaaacaca tgccatttta caaataagac 360

ttatatttgt ccttttgttt ttcagcctac catgagaata agagaaagaa aatgaagatc 420

aaaagcttat tcatctgttt ttctttttcg ttggtgtaaa gccaacaccc tgtctaaaaa 480

acataaattt ctttaatcat tttgcctctt ttctctgtgc ttcaattaat aaaaaatgga 540

aagaatctaa tagagtggta cagcactgtt atttttcaaa gatgtgttgc tatcctgaaa 600

attctgtagg ttctgtggaa gttccagtgt tctctcttat tccacttcgg tagaggattt 660

ctagtttctt gtgggctaat taaataaatc attaatactc ttctaagtta tggattataa 720

acattcaaaa taatattttg acattatgat aattctgaat aaaagaacaa aaaccatggt 780

ataggtaagg aatataaaac atggctttta ccttagaaaa aacaattcta aaattcatat 840

ggaatcaaaa aagagcctgc aggtaccct 869

<210> 13

<211> 1302

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 13

ctcaattgga tgacactagt catcacattt aaaagcatct caggtaacta tattttgaat 60

tttttaaaaa agtaactata atagttatta ttaaaatagc aaagattgac catttccaag 120

agccatatag accagcaccg accactattc taaactattt atgtatgtaa atattagctt 180

ttaaaattct caaaatagtt gctgagttgg gaaccactat tatttctatc tactgtttta 240

attaaaatta tctctaaggc atgtgaactg gctgtcttgg ttttcatctg tacttcatct 300

gctacctctg tgacctgaaa catatttata attccattaa gctgtgcata tgatagattt 360

atcatatgta ttttccttaa aggatttttg taagaactaa ttgaattgat acctgtaaag 420

tctttatcac actacccaat aaataataaa tctctttgtt cagctctctg tttctataaa 480

tatgtaccag ttttattgtt tttagtggta gtgattttat tctctttcta tatatataca 540

cacacatgtg tgcattcata aatatataca atttttatga ataaaaaatt attagcaatc 600

aatattgaaa accactgatt tttgtttatg tgagcaaaca gcagattaaa aggaattcct 660

gcagattcag cagccgtaag tctaggacag gcttaaattg ttttcactgg tgtaaattgc 720

agaaagatga tctaagtaat ttggcattta ttttaatagg tttgaaaaac acatgccatt 780

ttacaaataa gacttatatt tgtccttttg tttttcagcc taccatgaga ataagagaaa 840

gaaaatgaag atcaaaagct tattcatctg tttttctttt tcgttggtgt aaagccaaca 900

ccctgtctaa aaaacataaa tttctttaat cattttgcct cttttctctg tgcttcaatt 960

aataaaaaat ggaaagaatc taatagagtg gtacagcact gttatttttc aaagatgtgt 1020

tgctatcctg aaaattctgt aggttctgtg gaagttccag tgttctctct tattccactt 1080

cggtagagga tttctagttt cttgtgggct aattaaataa atcattaata ctcttctaag 1140

ttatggatta taaacattca aaataatatt ttgacattat gataattctg aataaaagaa 1200

caaaaaccat ggtataggta aggaatataa aacatggctt ttaccttaga aaaaacaatt 1260

ctaaaattca tatggaatca aaaaagagcc tgcaggtacc ct 1302

<210> 14

<211> 1359

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 14

atgagcacag ccgtgctgga aaaccccggc ctgggcagaa agctgagcga cttcggccag 60

gaaaccagct acatcgagga caactgcaac cagaacggcg ccatcagcct gatcttcagc 120

ctgaaagaag aagtgggcgc cctggccaag gtgctgcggc tgttcgaaga gaacgacgtg 180

aacctgaccc acatcgagag ccggcccagc agactgaaga aggacgagta cgagttcttc 240

acccacctgg acaagcggag cctgcccgcc ctgaccaaca tcatcaagat cctgcggcac 300

gacatcggcg ccaccgtgca cgagctgagc cgggacaaga aaaaggacac cgtgccctgg 360

ttccccagaa ccatccagga actggacaga ttcgccaacc agatcctgtc ctacggcgcc 420

gagctggatg ccgaccaccc tggcttcaag gaccccgtgt accgggccag acggaagcag 480

ttcgccgata tcgcctacaa ctaccggcac ggccagccca tccccagagt cgagtacatg 540

gaagagggca agaaaacctg gggcaccgtg ttcaagaccc tgaagtccct gtacaagacc 600

cacgcctgct acgagtacaa ccacatcttc ccactgctcg agaagtactg cggcttccac 660

gaggacaata tccctcagct cgaggacgtg tcccagtttc tgcagacctg caccggcttc 720

agactcaggc ctgtggccgg cctgctgagc agcagagatt ttctgggcgg actggccttc 780

cgggtgttcc actgcaccca gtacatcaga cacggcagca agcccatgta cacccctgag 840

cccgacatct gccacgagct gctgggacat gtgcccctgt tcagcgacag aagcttcgcc 900

cagttcagcc aggaaatcgg cctggcctct ctgggcgctc ccgacgagta tatcgagaag 960

ctggccacca tctactggtt caccgtggaa ttcggcctgt gcaagcaggg cgacagcatc 1020

aaggcctatg gcgccggact cctgtccagc ttcggcgagc tgcagtactg tctgagcgag 1080

aagcccaagc tgctgcccct ggaactggaa aagaccgcca tccagaacta caccgtgacc 1140

gagttccagc ccctgtacta cgtggccgag agcttcaacg acgccaaaga aaaagtgcgg 1200

aacttcgccg ccaccatccc tcggcccttc agcgtcagat acgaccccta cacccagcgg 1260

atcgaggtgc tggacaacac acagcagctg aaaattctgg ccgactccat caacagcgag 1320

atcggcatcc tgtgcagcgc cctgcagaaa atcaagtga 1359

<210> 15

<211> 1069

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 15

agtcgctgcg cgctgccttc gccccgtgcc ccgctccgcc gccgcctcgc gccgcccgcc 60

ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc 120

gggctgtaat tagcgcttgg tttattgacg gcttgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag 180

ccttgagggg ctccgggaag gccctttgtg cggggggagc ggctcggggg gtgcgtgcgt 240

gtgtgtgtgc gtggggagcg ccgcgtgcgg ctccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg 300

cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cagtgtgcgc gaggggagcg gggccggggg 360

cggtgccccg cggtgcgggg ggggctgcga ggggaacaaa ggctgcgtgc ggggtgtgtg 420

cgtggggggg tgagcagggg gtgtgggcgc gtcggtcggg ctgcaacccc ccctgcaccc 480

ccctccccga gttgctgagc acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgta cggggcgtgg 540

cgcggggctc gccgtgccgg gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg 600

gccgcctcgg gccggggagg gctcggggga ggggcgcggc ggcccccgga gcgccggcgg 660

ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg ccttttttgg taatcgtgcg agagggcgca 720

gggacttcct ttgtcccaaa tctgtgcgga gccgaaatct gggaggcgcc gccgcacccc 780

ctctagcggg cgcggggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaattgg gcggggaggg 840

ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccctctc cagcctcggg gctgtccgcg 900

gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac 960

cggcggctct agagcctctg ctaaccttgt tcttgccttc ttctttttcc tacagctcct 1020

gggcaacgtg ctggttattg tgctgtctca tcattttggc aaagaattc 1069

<210> 16

<211> 901

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 16

ccaggggtga gtgaaggttt ggaagagtgt agcagaataa gaaaccatga gtcccctccc 60

tgagaagccc tgagccccct tgacgacaca catccctcga ggctcagctt catcatctgt 120

aaaaggtgct gaaactgacc atccaagctg ccgaaaaaga ttgtgtgggg ataattcaaa 180

actagaggaa gatgcagaat ttctacatcg tggcgatgtc aggctaagag ttgccatcgt 240

ggctgtccat cgattttatt ggaatcatat gtttatttga gggtgtcttg gatattacaa 300

ataaattgtt ggagcatcag gcatatttgg taattctgtc taaggctccc tgccccttgt 360

taattggcag ctcagttatt catccagggc aaacattctg cttactattc ctgagagctt 420

tcctcatcct ctagattggc aggggaattg cagttgcctg agcagcctcc cctctgccat 480

accaacagag cttcaccatc gaggcttgca gagtggacag gggcctcagg gacccctgat 540

cccagctttc tcattggaca gaaggaggag actggggctg gagagggacc tgggccccca 600

ctaaggccac agcagagcca ggactttagc tgtgctgact gcagcctggc ttgcctccac 660

tgccctcctt tgcctcaaga gcaagggagc ctcagagtgg aggaagcagc ccctggcctt 720

gcctcccacc tcccctcccc tttgctgttt tcctgggaca gtgggagctg gcttagattg 780

ccctggggcc cccaggaccc tggcatttta acccctcagg ggcaggaagg cagcctgaga 840

tacagaagag tccatcacct gctgtatgcc acacaccatc cccacagtcg acatttaaat 900

t 901

<210> 17

<211> 78

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 17

cactccctct ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccacgc 60

ccgggctttg cccgggcg 78

<210> 18

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 18

Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp

1. 5 10 15

Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

20

<---

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и представляет собой способ лечения фенилкетонурии (PKU) у нуждающегося в этом индивидуума. Кроме того, изобретение касается кассеты экспрессии, вектора, в том числе на основе rAAV, а также набора для обеспечения экспрессии варианта полипептида PAH у нуждающегося в этом индивидуума. Изобретение позволяет обеспечить эффективность лечения фенилкетонурии. 9 н. и 8 з.п. ф-лы, 17 ил., 3 табл., 7 пр.

1. Кассета экспрессии для экспрессии полипептида человеческой фенилаланингидроксилазы (PAH) в клетке печени для лечения фенилкетонурии (PKU), где кассета экспрессии содержит трансген, функционально связанный с промотором и энхансером, где кассета экспрессии содержит от 5' к 3' энхансер, промотор и трансген, где промотор включает промотор транстиретина мыши (mTTR), энхансер включает один или два модифицированных энхансера альфа-1-микрокунина (mA1MB2), и трансген кодирует полипептид человеческой фенилаланингидроксилазы (PAH).

2. Кассета экспрессии по п. 1, где промотор mTTR представляет собой промотор TTR482.

3. Кассета экспрессии по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что кассета экспрессии дополнительно содержит одно или более из:

сигнала полиаденилирования бычьего гормона роста (pA);

модифицированного гибридного интрона β-актина курицы (CBA)/β-глобина кролика с SEQ ID NO: 15;

одного или более ITR; и

спейсерной последовательности интрона A1AT с SEQ ID NO: 16.

4. Кассета экспрессии по любому из пп. 1-3, где один или два энхансера mA1MB2 включают последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 8.

5. Кассета экспрессии по любому из пп. 1-4, где полипептид PAH представляет собой полипептид человеческой PAH дикого типа, включающий аминокислотную последовательность SEQ NO: 1 или SEQ ID NO: 2.

6. Кассета экспрессии по любому из пп. 1-5, где полипептид человеческой PAH кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 14.

7. Вектор, содержащий кассету экспрессии по любому из пп. 1-6, где вектор представляет собой вектор рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), для экспрессии полипептида PAH.

8. Вектор rAAV для экспрессии полипептида PAH, содержащий кассету экспрессии по любому из пп. 1-6, фланкированную двумя последовательностями инвертированного концевого повтора (ITR) AAV, где:

ITR AAV представляют собой ITR серотипов AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV DJ, AAV козы, AAV крупного рогатого скота или AAV мыши.

9. Вектор rAAV по п. 8, где вектор rAAV содержит кассету экспрессии по любому из пп. 1-6, причем вектор rAAV содержит от 5' к 3':

ITR AAV2;

энхансер m1A1MB2;

промотор mTTR482;

гибридный интрон β-актина курицы (CBA)/β-глобина кролика;

нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид человеческой PAH;

спейсерную нуклеиновую кислоту, причем спейсерная нуклеиновая кислота включает нуклеиновую кислоту из интрона гена альфа-1-антитрипсина человека, причем интрон гена альфа-1-антитрипсина человека мутирован путем удаления последовательностей ATG;

сигнал полиаденилирования, причем сигнал полиаденилирования представляет собой сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста; и

ITR AAV2.

10. Вектор rAAV по любому из пп. 7-9, где вектор представляет собой самокомплементарный вектор, причем вектор содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид PAH, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую комплемент полипептида PAH, причем первая последовательность нуклеиновой кислоты может образовывать внутрицепочечные пары оснований со второй последовательностью нуклеиновой кислоты на большей части или по всей ее длине, причем первая последовательность нуклеиновой кислоты и вторая последовательность нуклеиновой кислоты соединены мутантным ITR AAV, причем мутантный ITR AAV включает делецию D-области и включает мутацию последовательности концевого разрешения.

11. Частица rAAV для экспрессии полипептида человеческой фенилаланингидроксилазы (PAH) в клетке печени для лечения фенилкетонурии (PKU), где частица rAAV содержит вектор rAAV по любому из пп. 7-10, где:

а) вирусная частица rAAV включает капсид серотипов AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAVrh8, AAVrh8R, AAV9, AAV10, AAVrh10, AAV11, AAV12, AAV2R471A, AAV2/2-7m8, AAV DJ, AAV2 N587A, AAV2 E548A, AAV2 N708A, AAV2 V708K, AAV козы, химерного AAV1/AAV2, AAV крупного рогатого скота, AAV мыши или rAAV2/HBoV1; или

b) вирусная частица rAAV содержит сконструированный капсид AAV, необязательно капсид DJ или капсид LK03.

12. Композиция для экспрессии полипептида человеческой фенилаланингидроксилазы (PAH) в клетке печени для лечения фенилкетонурии (PKU), где композиция содержит кассету экспрессии по любому из пп. 1-6 или частицу rAAV по п. 11, причем композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

13. Клетка для экспрессии полипептида человеческой фенилаланингидроксилазы (PAH) в клетке печени для лечения фенилкетонурии (PKU), где клетка содержит кассету экспрессии по любому из пп. 1-6 или вектор rAAV по любому из пп. 7-10.

14. Способ получения полипептида PAH, включающий культивирование клетки по п. 13 в условиях для получения полипептида PAH, причем способ дополнительно включает стадию очистки полипептида PAH.

15. Способ лечения фенилкетонурии (PKU) у индивидуума, нуждающегося в этом, включающий введение индивидууму кассеты экспрессии по любому из пп. 1-6, вектора rAAV по любому из пп. 7-10, частицы rAAV по п. 11, клетки по п. 13 или композиции по п. 12, где у индивидуума отсутствует активность PAH, или где уровень фенилаланина в крови у индивидуума до лечения является повышенным по сравнению с уровнем фенилаланина в крови у подобранных по принципу паритетности контрольных индивидуумов.

16. Способ по п. 14, где кассету экспрессии по любому из пп. 1-6, вектор rAAV по любому из пп. 7-10, частицу rAAV по п. 11, композицию по п. 12 или клетку по п. 13 вводят внутривенно, внутриартериально, внутрипеченочно, внутрипортально, внутрибрюшинно или подкожно и/или где введение осуществляется в комбинации с другой терапией, причем другая терапия представляет собой лечение тетрагидрибиоптерином, лечение фенилаланин-аммиаклиазой (PAL) или пегилированным PAL, или диету с ограничением фенилаланина.

17. Набор для экспрессии полипептида PAH, содержащий кассету экспрессии по любому из пп. 1-6, вектор rAAV по любому из пп. 7-10, частицу rAAV по п. 11 или композицию по п. 12, где набор дополнительно содержит инструкции по применению; буферы и/или фармацевтически приемлемые эксципиенты; и/или флаконы, ампулы и/или шприцы.