Набор олигонуклеотидов-праймеров, используемых для идентификации вируса болезни Ньюкасла Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, вирусологии и медицине и может быть использовано для накопления генетического материала вируса болезни Ньюкасла (NDV или Newcastle Disease Virus) и его последующей идентификации.

Вирус болезни Ньюкасла относится к высокопатогенным возбудителям вирусных инфекций, вызывающих 100 % смертность диких птиц и птиц сельскохозяйственного значения с предшествующими респираторными и неврологическими проявлениями заболевания, способен вызывать заболеваемость человека. Данный РНК-содержащий вирус принадлежит к роду Avulavirus 1-го серотипа (Парамиксовирус-1).

Известны олигонуклеотиды-праймеры, модифицированные с учетом известных до 2010 года последовательностей NDV в Европе, и используемые для амплификации и секвенирования F гена NDV во время эпизоотий в Швеции [1].

Недостатком известного решения является специфичность указанного набора только для одного белка вируса болезни Ньюкасла, регионально принадлежащего Европейской части.

В качестве ближайшего аналога (прототипа) принят набор олигонуклеотидов-праймеров, используемых для идентификации вируса болезни Ньюкасла [2].

Однако олигонуклеотиды-праймеры, набор которых описан в прототипе, разработаны опять же только для гена F-белка вируса болезни Ньюкасла.

Проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка набора олигонуклеотидов-праймеров, специфичных в отношении вируса болезни Ньюкасла и позволяющих получить нуклеотидные последовательности всех белков и соответственно сделать полногеномное секвенирование.

Технический результат, проявляющийся при решении поставленной проблемой, выражается в создании набора олигонуклеотидов-праймеров, обладающих следующими свойствами:

- возможность накопления генетического материала вируса болезни Ньюкасла в результате проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) от 500 нуклеотидных пар и более, в зависимости от используемой полимеразы;

- возможность идентификации вируса болезни Ньюкасла путем секвенирования;

- возможность получения нуклеотидных последовательностей генов всех сегментов генома вируса болезни Ньюкасла.

Поставленная проблема решается тем, что набор олигонуклеотидов-праймеров, используемых для идентификации вируса болезни Ньюкасла, содержит прямые и обратные праймеры, характеристики которых приведены в таблице 1.

Таблица 1

Набор олигонуклеотидов-праймеров

Сегмент генома вируса болезни Ньюкасла SEQ ID
и тип праймера Нуклеотидная последовательность праймера Температура отжига
праймера при ПЦР, °С NP NDV-1F 5’-ACCAAACAGAGAATCKGTG-3' 53-55 NDV-11F 5’-GAATCGGTGAGTTACGAT-3' 52 NDV-513F 5’-TMGCAGGRTCTCTCCCTCGG-3' 62-66 NDV-532R 5’-CCGAGGGAGAGAYCCTGCKA-3' 62-66 NDV-1221F 5’-CTCAGGCTCAGGGAAGTAG-3' 60 NDV-1239R 5’-CTACTTCCCTGAGCCTGAG-3' 60 P NDV-2494F 5’-CAGGGCANAGCCAARAC-3' 52-57 NDV-2510R 5’-GTYTTGGCTYTGCCCTG-3' 52-57 NDV-3013F 5’-TRGATGCAGCCAGGTCA-3' 52-55 NDV-3029R 5’-TGACCTGGCTGCATCYA-3' 52-55 М NDV-3538F 5’-CARGCRCGAGCTACTCTC-3' 56-60 NDV-3554R 5’-GAGAGTAGCTCGYGCYTG-3' 56-62 NDV-4096F 5’-GCTCAGTGAYGTGCTCG-3' 55-57 NDV-4112R 5’-CGAGCACRTCACTGAGC-3' 55-57 F NDV-4550F 5’-ATGGGCTCCAAACCTTC-3' 52 NDV-4565R 5’-GAAGGTTTGGAGCCCAT-3' 52 NDV-4940F 5’-CAGCGGCACAGATAACAGC-3' 60 NDV-4959R 5’-GCTGTTATCTGTGCCGCT-3' 56 NDV-5492F 5’-GCCTCAGCACTTGTCCCG-3' 60 F NDV-5975F 5’-GCCTTGGATAGGTTGGCRG-3’ 60-62 NDV-5996R 5’-CYGCCAACCTATCCAAGGC-3' 60 HN NDV-6325F 5’-AYACGGGTAGAACGGTCA-3' 52-54 NDV-6342R 5’-TGACCGTTCTACCCGTRT-3' 54-56 NDV-6854F 5’-AGTGATGTCACRTCATTY-3' 46-52 NDV-6871R 5’-RAATGAYGTGACATCACT-3' 46-52 NDV-7624F 5’-CTCACAGTAGGGACATCY-3' 54-56 NDV-7641R 5’-RGATGTCCCTACTGTGAG-3' 54-56 NDV-8303F 5’-RTCWCTTKATTAAGAAAAAATR-3' 47-52 NDV-8324R 5’-YATTTTTTCTTAATMAAGWGAY-3' 47-52 L NDV-8595F 5’-TCGGRMGGGCAGTRCACCA-3' 60-66 NDV-8613R 5’-TGGTGYACTGCCCKYCCGA-3' 60-66 NDV-9632F 5’-GATACRATATAYGGGAA-3' 42-47 NDV-9648R 5’-TTCCCRTATATYGTATC-3' 42-47 NDV-10194F 5’-ACAGCAATAAGAAACGTA-3' 47 NDV-10211R 5’-TACGTTTCTTATTGCTGT-3' 47 NDV-10767F 5’-TGAAGGATCGTGAAACYA-3' 49-52 NDV-10784R 5’-TRGTTTCACGATCCTTCA-3' 49-52 NDV-11418F 5’-CAGARGAYAATGAGGCAG-3' 52-56 NDV-11435R 5’-CTGCCTCATTRTCYTCTG-3' 52-56 L NDV-12042F 5’-CATCATCYGTGTTRATCT-3' 46-52 NDV-12059R 5’-AGATYAACACRGATGATG-3' 46-52 NDV-12646F 5’-GTTGATTGGCCARTCCGT-3' 54-56 NDV-12663R 5’-ACGGAYTGGCCAATCAAC-3' 54-56 NDV-13234F 5’-CTGAGTATTTACTGTCGG-3' 52 NDV-13253R 5’-CCGACAGTAAATACTCAG-3' 52 NDV-13859F 5’-TATAGGAATCTACARGCG-3' 49-52 NDV-13876R 5’-CGCYTGTAGATTCCTATA-3' 49-52 NDV-14480F 5’-GGRGGACAGCCCGTCCGT-3' 63-65 NDV-14497R 5’-ACGGACGGGCTGTCCYCC-3' 63-65 NDV-15167F 5’-TCACCAAATCTTTGTTTG-3' 47 NDV-15184R 5’-CAAACAAAGATTTGGTGA-3' 47

Другие отличительные признаки и преимущества заявляемого изобретения ясно вытекают из описания, приведенного ниже для иллюстрации и не являющегося ограничительным со ссылками на прилагаемые рисунки, на которых:

на фиг.1 представлена схема сочетания пар прямых и обратных праймеров в отношении сегментов генома вируса болезни Ньюкасла;

на фиг.2 и 3 представлены результаты электрофореза ампликонов кДНК NDV, накопленных в результате проведения ПЦР, описание которых приведено в таблице 2.

На чертежах использованы следующие обозначения:

NP – нуклеотидный белок;

Р – фосфопротеин;

М – матриксный белок;

F – белок слияния;

HN – гемагглютинин-нейраминидаза;

L – полимераза;

kb – тысяч нуклеотидов.

Таблица 2

Описание фигур, на которых изображены результаты электрофореза ампликонов кДНК вируса болезни Ньюкасла

№ № ампликона
кДНК вируса болезни Ньюкасла
на рисунке Пара используемых праймеров (прямой и обратный) Фиг.2 1 NDV-1F и NDV-532R 2 NDV-2494F и NDV-3029R 3 NDV-3013F и NDV-4112R 4 NDV-513F и NDV-1239R 5 NDV-3538F и NDV-4565R 6 NDV-5492F и NDV-6342R 7 NDV-6325F и NDV-6871R 8 NDV-4940F и NDV-6342R 9 NDV-4550F и NDV-4959R Фиг.2 10 NDV-4940F и NDV-5996R 11 NDV-7624F и NDV-8324R 12 NDV-9632F и NDV-10211R 13 NDV-10194F и NDV-10784R 14 NDV-10767F и NDV-11435R 15 NDV-11418F и NDV-12059R 16 NDV-12042F и NDV-12663R 17 NDV-12646F и NDV-13253R 18 NDV-13234F и NDV-13876R Фиг.3 19 NDV-13234F и NDV-14497R 20 NDV-13859F и NDV-14497R 21 NDV-14480F и NDV-15184R

Заявляемый набор олигонуклеотидов-праймеров применяют в соответствии со стандартными методиками и с использованием известного оборудования, процесс состоит из нескольких этапов.

1. На предварительном этапе выделяют РНК вируса болезни Ньюкасла с помощью рекомендованных наборов (например, «Рибо-преп», АмплиСенс®, Россия) и очищают его, проводят реакцию обратной транскрипции (с набором «Реверта-L», АмплиСенс®, Россия) с получением кДНК вируса болезни Ньюкасла.

Методика работы с РНК вируса гриппа давно известна и широко применяется [3].

2. Подготовка к проведению ПЦР.

Методика проведения ПЦР является наиболее часто применяемой для идентификации генетического материала в образцах [4].

Согласно методике проведения полимеразной цепной реакции проводятся следующие подготовительные мероприятия:

- пару праймеров (прямой и обратный) из заявляемого набора берут в реакцию ПЦР учитывая, что разница между температурами их отжига (см. табл. 1) должна составлять не более 6°С;

- определяют значение температуры отжига для пары праймеров, которую берут в реакцию ПЦР.

- подготавливают реактивы для проведения ПЦР и смешивают их в соответствии с протоколом, описанным в таблице 3.

Таблица 3

Протокол смешивания реактивов для проведения ПЦР

Название реактива Количество реактива
(из расчета на 1 пробирку) Taq-полимераза 0,5 µl 10X буфер для Taq-полимеразы 2,5 µl Смесь dNTP (дезоксинуклеозидтрифосфаты) (2мМ) 2,5 µl MgCl₂ (25мМ) 2,5 µl Вода (без РНКаз) 6,5 µl Праймер прямой (F) (1:10) 1,0 µl Праймер обратный (R) (1:10) 1,0 µl Вирусная кДНК 2,5 µl

1. Проведение ПЦР с целью накопления генетического материала вируса болезни Ньюкасла по следующей программе:

1). денатурация при температуре 95°С в течение 5 минут;

2). отжиг: при температуре 95°С в течение 30 секунд, далее при температуре отжига праймеров, определенной на этапе 2.1, в течение 20 секунд и затем при температуре 72°С в течение 1-1,5 минут – повторить 45 циклов;

3). элонгация при температуре 72°С в течение 5 минут.

По итогам ПЦР получают накопленный генетический материал (ампликоны кДНК вируса болезни Ньюкасла).

2. Визуализация накопленного генетического материала (ампликоны кДНК вируса болезни Ньюкасла) путем проведения электрофореза по известной методике [5] в агарозном геле (1,5 % в 10X TBE буфере) с последующей детекцией результатов на электрофореграмме [6].

3. Идентификация вируса болезни Ньюкасла путем секвенирования ампликонов кДНК вируса болезни Ньюкасла с использованием таких известных методов как Sanger, NGS, Nanopore [4].

Пример выполнения

На предварительном этапе выделяли РНК вируса болезни Ньюкасла из образца, выделенного от домашних куриц, погибших во время эпизоотической вспышки на одном из частных подворий города Уссурийск Приморского края в июле 2021 года.

Для этого использовали набор «Рибо-преп», (АмплиСенс®, Россия), выделяли и очищали РНК, затем проводили реакцию обратной транскрипции с набором «Реверта-L» (АмплиСенс®, Россия), с получением кДНК вируса болезни Ньюкасла.

Выбрали пару праймеров NDV-513F и NDV-1239R в соответствии с вышеописанными критериями (см. ампликон № 4 для фиг.2) и определили их температуру отжига – 62 °С.

Подготовили реактивы для проведения ПЦР и смешали их в соответствии с протоколом, описанным в таблице 3 [4].

Провели ПЦР по следующей программе:

1. денатурация при температуре 95°С в течение 5 минут;

2. отжиг: при температуре 95°С в течение 30 секунд, далее при температуре 62°С в течение 20 секунд и затем при температуре 72 °С в течение 1-1,5 минут – повторить 45 циклов;

3. элонгация при температуре 72°С в течение 5 минут.

По итогам ПЦР получили накопленный генетический материал в виде ампликона кДНК вируса болезни Ньюкасла длиной порядка 600 нуклеотидных пар.

Визуализировали указанный ампликон кДНК вируса болезни Ньюкасла путем проведения электрофореза по известной методике [6] в агарозном геле (1,5% агарозы (Диа-М, Россия) в 10X TBE буфере), соответствующая электрофореграмма приведена на фиг.2.

Идентифицировали вирус болезни Ньюкасла путем секвенирования ампликонов кДНК вируса болезни Ньюкасла путем технологии Nanopore (Oxford Nanopore Technologies®, Великобритания) и провели дальнейшую сборку генома с использованием программ Epi2Me Labs и CLC Genomics Workbench.

По итогам исследования было идентифицировано, что образец содержал вариант высокопатогенного штамма NDV, в дальнейшем идентифицированный штамм стал основой для создания заявляемого набора олигонуклеотидов-праймеров [7].

В связи с высокой мутационной изменчивостью NDV необходимо отметить, что заявляемое изобретение позволяет накопить и идентифицировать генетический материал вируса болезни Ньюкасла, близкородственные идентифицированному штамму и/или отдельные белки, гены которых содержит РНК вируса болезни Ньюкасла.

Источники информации

1. Munir M. et al. Whole genome sequencing and characterization of a virulent Newcastle disease virus isolated from an outbreak in Sweden. Virus Genes. 2011. 43:261-271.

2. Патент РФ № 2590718, МПК C12N 15/11, C12N 7/00, C12Q 1/68, дата публикации 10.07.2016 г.

3. Сергеева Е.И., Иванова Е.В., Швалова А.Н., и др. СТРУКТУРА ЗАБОЛЕВАЕМОСТИ РЕСПИРАТОРНЫМИ ВИРУСНЫМИ ИНФЕКЦИЯМИ В Г. НОВОСИБИРСКЕ И НОВОСИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ В ЭПИДЕМИЧЕСКИЙ СЕЗОН 2011–2012 ГГ. // Вестник Российской академии медицинских наук. - 2013. - Т. 68. - №6. - C. 21-25. doi: 10.15690/vramn.v68i6.669.

4. Kary B. Mullis, Fred A. Faloona, Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction// Methods in Enzymology, Academic Press, Volume 155, 1987, Pages 335-350, ISSN 0076-6879, ISBN 9780121820565, https://doi.org/10.1016/0076-6879(87)55023-6.

5. Patrick Wittmeier, Susanne Hummel. Agarose gel electrophoresis to assess PCR product yield: comparison with spectrophotometry, fluorometry and qPCR//BIOTECHNIQUES, March 2022, VOL. 72, NO. 4, Pages 155 – 158, ISSN0736-6205, eISSN1940-9818, https://doi.org/10.2144/btn-2021-0094.

6. Wittmeier P., Hummel S. Agarose gel electrophoresis to assess PCR product yield: comparison with spectrophotometry, fluorometry and qPCR//BIOTECHNIQUES, March 2022, VOL. 72, NO. 4, Pages 155 – 158, ISSN0736-6205, eISSN1940-9818, https://doi.org/10.2144/btn-2021-0094.

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, вирусологии и медицине. Предложен набор олигонуклеотидов-праймеров, используемых для идентификации вируса болезни Ньюкасла. Набор может быть использован для накопления генетического материала вируса болезни Ньюкасла и его последующей идентификации. 3 табл., 1 пр.

Набор олигонуклеотидов-праймеров, используемых для идентификации вируса болезни Ньюкасла, содержащий прямые и обратные праймеры, характеристики которых приведены в таблице 1.