Способ выявления вируса Nipah методом ОТ-ПЦР в реальном времени Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к диагностике инфекционных заболеваний, в частности к проблеме выявления генетических маркеров вируса Nipah.

Инфекция, вызываемая вирусом Nipah, является зоонозной -передаваемой человеку от животных, а также через зараженную еду или от человека человеку. Естественными хозяевами вируса Nipah являются плодоядные летучие мыши семейства Pteropodidae, в частности, виды, принадлежащие роду Pteropus. Видимой болезни среди плодоядных летучих мышей не наблюдается.

Вспышкам инфекции подвержены свиньи и другие домашние животные, такие как лошади, козы, овцы, кошки и собаки. Вирус Nipah отличается высокой контагиозностью среди свиней. Свиньи заразны во время инкубационного периода, который длится от 4 до 14 дней. У инфицированных свиней симптомы могут не появляться, но у некоторых из них развиваются острое лихорадочное заболевание, затрудненное дыхание и неврологические симптомы, такие как дрожь, подергивание и мышечные спазмы. В целом, смертность среди свиней, за исключением молодых особей, является низкой. Эти симптомы не отличаются значительным образом от симптомов других респираторных и неврологических болезней свиней, что затрудняет диагностику и эпидконтроль.

Однако у людей инфекция может протекать в разных формах - от бессимптомной инфекции до острой респираторной инфекции (легкой или тяжелой) и до смертельного энцефалита. Сначала у инфицированных людей развиваются симптомы, включающие повышенную температуру, головную боль, миалгию (мышечную боль), рвоту и боль в горле. За этим могут следовать головокружение, сонливость, измененное сознание и неврологические признаки, которые указывают на острый энцефалит. У некоторых людей могут также развиваться атипичная пневмония и тяжелые дыхательные проблемы, включая острую дыхательную недостаточность. В тяжелых случаях развиваются энцефалит и конвульсии, приводящие к коме через 24-48 часов.

Считается, что инкубационный период (период после инфицирования до развития симптомов) длится 4-14 дней. Вместе с тем, сообщалось об инкубационном периоде, составившем 45 дней. Большинство людей, выживших после острого энцефалита, полностью восстанавливаются, но среди них также регистрировались долговременные неврологические последствия. Примерно 20% пациентов страдают от остаточных неврологических последствий, таких как припадочные расстройства и изменения личности. У небольшого числа выздоровевших людей впоследствии бывают рецидивы или позднее развивается энцефалит.

Коэффициент летальности оценивается в пределах от 40% до 75%; в условиях разных вспышек болезни этот показатель может варьироваться в зависимости от местных возможностей для проведения эпиднадзора и клинического ведения пациентов. Вакцины и препараты против инфекции отсутствуют. Лечение симптоматическое.

На момент появления симптомов диагноз инфекции вируса Nipah часто не предполагается, поскольку она не имеет специфических первых признаков и симптомов. Это может затруднять точную диагностику и препятствовать выявлению вспышки болезни и принятию эффективных и своевременных мер инфекционного контроля и реагирования. В виду того, что вирус Nipah является высококонтагиозным, он инфицирует большое число животных и приводит к тяжелым заболеваниям и смерти людей, его диагностика является актуальной проблемой.

Диагностируют вирус по наличию в биологических образцах (кровь и ее производные, мазок из носоглотки, мазок из ротоглотки, мокрота) вирусной РНК методом ПНР (https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/nipah-virus). Метод диагностики предусматривает экстракцию РНК из биологических из биологических образцов, с последующим проведением двухстадийной реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции для целевых фрагментов РНК вируса Nipah. Однако, российских диагностических тест-систем нет.

Целью создания настоящего изобретения является расширение арсенала средств, используемых для диагностики, контроля и профилактики возможных будущих эпидемий.

Технической задачей изобретения является разработка высокочувствительного способа идентификации генетического материала вируса Nipah в биологических образцах и других вируссодержащих пробах (культуральная вируссодержащая жидкость, и т. д).

Поставленная задача решалась путем: конструирования диагностических праймеров и флуоресцентно-меченного зонда на консервативный участок гена гликопротеина-С-прикрепления; конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК и MS2 - фага, несущих специфический участок ДНК- и РНК - матрицы; оптимизации концентраций компонентов реакционной смеси и условий проведения ПЦР.

Авторами предложен способ выявления, согласно которому выделенную из биологических образцов (кровь и ее производные, мазок из носоглотки, мазок из ротоглотки, мокрота) РНК анализируют в одной пробирке при помощи реакции обратной транскрипции, для целевых фрагментов РНК вируса Nipah, и дальнейшей полимеразной цепной реакции полученных кДНК, при помощи олигонуклеотидных праймеров и соответствующего флуоресцентно меченного зонда, комплементарных участку гена гликопротеина-G-прикрепления.

Анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла Ct, причем результат считают положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имеет характерную «сигмовидную» форму и пересекает пороговую линию. На начальном этапе были подобраны и синтезированы пара специфических олигонуклеотидных праймеров и зонд для гибридизационно-флуоресцентной детекции продуктов ПЦР. Для этого в базе данных NCBI Mega BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) был выбран наиболее консервативный участок генома вируса Nipah. Были проанализированы все имеющиеся в базе данных последовательности. Также были подобраны праймеры и флуоресцентный зонд для ВКО в качестве внутреннего контроля ПЦР. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда представлены в Таблице 1 и Таблице 2.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на Фиг. 1 представлены кривые флуоресценции, отражающие динамику образования продукта реакции при анализе контрольных образцов. Каждая кривая выше пороговой линии отображает положительный результат на выявление в образце РНК Nipah вируса, каждая кривая ниже пороговой линии отображает отрицательные контроли, не содержащие РНК Nipah вируса.

Подбор и анализ свойств олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда проводился с использованием программного обеспечения Oligonucleotide Properties Calculator и MFold.

Для контроля качества прохождения этапов обратной транскрипции и ПЦР в состав методики были введены рекомбинантные положительные контрольные образцы K+ и ПКО и внутренний контрольный образец (ВКО). Матрицу для создания рекомбинантных положительных контрольных образцов получали синтетическим методом на основе ампликона, включающего в себя диагностическую область-мишень и фланкирующие последовательности нуклеотидов. Ампликон получали методом ПЦР в один шаг. Конечный ПЦР-продукт лигировали в плазмидный вектор pGEM-T («Promega», USA) под контролем промотора Т7 РНК полимеразы и трансформировали им Escherichia coli (штамм XLl-Blue). Рекомбинантные плазмиды из индивидуальных клонов проверяли на правильность ориентации целевой последовательности и отсутствие мутаций в области посадки праймеров и зонда. Проверку осуществляли методом секвенирования по Сэнгеру с помощью прибора для автоматического капиллярного секвенирования ABI PRISM 3500xl («Applied Biosystems», США).

Соответствующие заданным критериям рекомбинантные плазмиды использовали для приготовления положительного контрольного образца этапа ПЦР (К+). Для этого определяли концентрацию ДНК в растворе рекомбинантной плазмиды и разводили стерильной водой до рабочей концентрации 1*10⁷ копий/мл. Также плазмиды использовались для получения рекомбинантного РНК-содержащего положительного контрольного образца с защитной белковой оболочкой MS2-фага (ПКО). Для полученного продукта производили определение концентрации, затем разводили РНК- буфером (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия) до рабочей концентрации 1*10⁶ копий/мл, которую использовали в качестве ПКО.

Оценку аналитической чувствительности метода производили на разведениях РНК-содержащего рекомбинантного положительного контрольного образца (ПКО), из которых экстрагировали РНК с помощью набора для выделения нуклеиновых кислот «Рибо-Преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия), а затем с помощью специфических праймеров и флуоресцентных зондов определяли минимальное разведение, детектируемое как положительное в 100% случаев. Определенная таким образом аналитическая чувствительность метода составила 1*10³ копий/мл.

Свойство изобретения специфически определять РНК вируса Nipah достигнуто путем подбора праймеров и зондов к высококонсервативным фрагментам РНК вируса, что минимизирует возможность перекрестных реакций с НК человека, близкородственных микроорганизмов, других инфекционных возбудителей.

Аналитическую специфичность оценивали при помощи тестирования образцов НК человека и следующих микроорганизмов: вирус Эбола, Крым-Конго, Ласса, ГЛПС. Неспецифические реакции отсутствуют.

Таким образом, в результате проведенных исследований был разработан и апробирован новый способ выявления РНК вируса Nipah в различных видах биологического материала. Технический результат достигается путем определения РНК вируса Nipah, включающим выделение РНК исследуемой пробы, проведение обратной транскрипции и ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени, согласно изобретению.

Диагностика проводится следующим образом: Подготовку проб проводят согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Материалом для исследования могут служить: клинические и биологические образцы.

Экстракция производится из 100 мкл полученной суспензии образца с лизирующим буфером на основе 6 моль гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции к набору для выделения РНК, и последующим инкубированием 5 минут при температуре (65±1)°С. Выделение РНК осуществляют с помощью наборов «Рибо-преп» и «Рибо-Сорб» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии, Россия) в соответствии с инструкциями к наборам. Во все пробирки, включая контроль выделения, до этапа прогревания в лизирующем буфере добавляют 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО). После выделения РНК приступают к постановке ОТ-ПЦР.

Для упрощения подготовки и стандартизации выполнения анализа в тест-систему входят 8 реактивов:

1) Amp 1RT - представляет из себя буферный раствор, содержащий 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0 (при 25°С), 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол, 50% (v/v) глицерин и 0.1% (v/v) NP-40, ингибитор РНКаз, M-MuLV-RH-ревертаза и HS-Taq ДНК-полимераза;

2) Amp 1 В - представляет из себя буферный раствор, содержащий 100 мМ Трис-HCl, рН 8.3 (при 25°С), 150 мМ KCl, 0,6 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 10 мМ MgCl2, 8 мМ ДТТ, стабилизаторы и усилители ферментов;

3) Amp 2 - содержит олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды к РНК вируса Nipah и к ВКО;

4) К+ - представляет собой смесь двух плазмидных ДНК:

a) плазмида содержащая фрагмент вируса Nipah;

b) плазмида содержащая фрагмент ВКО;

с которых, при помощи реактива Amp 2, амплифицируются специфические фрагменты;

5) К- - представляет собой дистиллированную стерильную воду;

6) ПКО - представляет собой псевдовирусные частицы на основе MS2-фага, содержащие РНК с фрагментом РНК вируса Nipah, которые после выделения и обратной траснскрипции в кДНК, амплифицируются при помощи реактива Amp 2;

7) ОКО - дистиллированная стерильная вода;

8) ВКО - представляет собой псевдовирусные частицы на основе MS2-фага, содержащие РНК с фрагментом РНК ВКО, которые после выделения и обратной транскрипции в кДНК, амплифицируются при помощи реактива Amp 2.

Все реактивы, кроме ПКО и ВКО, хранятся при температуре -20°С. ПКО и ВКО хранятся при температуре +4°С.

Для постановки реакции ОТ-ПЦР в реальном времени нужно взять необходимое количество микропробирок объемом 0,2 мл, соответствующее числу исследуемых проб; плюс четыре пробирки для положительных и отрицательных контролей. Подготовить ПЦР-смесь из расчета на одну реакцию: 1 мкл реактив Amp1RT, 12,5 мкл реактив Amp1B, 1,5 мкл реактив Amp2. По 15 мкл полученной смеси вносят в пробирки, затем добавляют в каждую по 10 мкл РНК- пробы, экстрагированной из исследуемого материала. Готовят 4 контрольные реакции. Для этого в пробирку для положительного контроля ПЦР вносят 10 мкл К+, в пробирку для положительного контроля обратной транскрипции вносят 10 мкл образца, экстрагированного из ПКО. В пробирку для отрицательного контроля ПЦР вносят 10 мкл К-, в пробирку для отрицательного контроля экстракции вносят 10 мкл пробы, экстрагированной из ОКО. Конечный объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Микропробирки переносят в программируемый амплификатор с функцией детекции флуоресценции в режиме «реального времени» по каналам (FAM/SybrGreen/Green и JOE/HEX). Режим амплификации представлен в таблице 3.

Примечание: * - детекция флуоресцентного сигнала по каналам Green/Yellow (FAM/HEX).

Детекцию флуоресцентного сигнала производят при 60°С по каналам Green (FAM) и Yellow (JOE/HEX). Учет и анализ результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора на основании отсутствия или наличия сигнала флуоресценции в исследуемых пробах по детектируемым каналам. Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат считают положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имеет характерную «сигмовидную» форму и пересекает пороговую линию. Накопление флуоресцентного сигнала по каналу HEX свидетельствует о наличии в исследуемом материале РНК вируса Нипах. При этом результат считается валидным, если параллельно в пробе по каналу FAM регистрируется накопление флуоресцентного сигнала ВКО, а в образцах К+ и ПКО - по каналу HEX. Сигнал по каналу HEX в образцах К- и ОКО должен отсутствовать.

Сущность изобретения поясняется чертежом, где на фигуре 1 представлены кривые флуоресценции, отражающие динамику образования продукта реакции при анализе контрольных образцов. Каждая кривая выше пороговой линии отображает положительный результат на выявление в образце РНК вируса Нипах, каждая кривая ниже пороговой линии отображает отрицательные контроли, не содержащие РНК данного вируса.

Таким образом, заявляемый способ выявления позволяет достоверно выявлять РНК вируса Нипах в клинических пробах.

--->

Перечень последовательностей

<110> Федеральное бюджетное учреждение науки «Санкт-Петербургский

научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.

Пастера Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав

потребителей и благополучия человека», ул. Мира, 14, Санкт-Петербург,

197101, Российская Федерация

<120> СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА NIPAH МЕТОДОМ ОТ-ПЦР В РЕАЛЬНОМ

ВРЕМЕНИ.

<140> Текущая (данная) заявка регистрационный номер

<141>

<160> 15

<210> 1

<211> 24

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Прямой праймер ПЦР

<400> 1

agtatcactg attgayacat ccag 24

<210> 2

<211> 24

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Обратный праймер ПЦР

<400> 2

tgttacattc gtggattttc aagg 24

<210> 3

<211> 28

<212> ДНК

<213> Синтетическая последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотидный флуоресцентно меченый зонд, несущий на

5’-конце флуорофор R6G, а на 3’-конце не флуоресцентный тушитель BHQ1

<400> 3

attgggctgt taggttcaaa gatcagcc 28

<---

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Описан способ выявления РНК Nipah вируса методом ОТ-ПЦР. Выявление проводят с использованием РНК, выделенной из биологических образцов с целью постановки диагноза и/или эпидемиологического мониторинга. При этом используют олигонуклеотидные праймеры и олигонуклеотид, меченный флуоресцентной меткой (флуоресцентный зонд), имеющие следующую структуру:

Изобретение расширяет арсенал способов диагностики инфекционных заболеваний, а именно выявления генетических маркеров вируса Nipah. 1 ил., 3 табл.

Способ выявления РНК вируса Nipah методом ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени, предусматривающий экстракцию РНК из биологических образцов, с последующим проведением двухстадийной реакции - обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции для целевых фрагментов РНК генома Nipah вируса, с использованием праймеров и зондов, комплементарных специфическому фрагменту гена гликопротеина-G-прикрепления, отличающийся тем, что в качестве праймеров используют последовательности

NIPV-f (SEQ ID NO. 1) agtatcactgattgayacatccag

NIPV-f (SEQ ID NO. 1) agtatcactgattgayacatccag,

а в качестве зонда -

NIPV-prb (SEQ ID NO. 3) R6G- attgggctgttaggttcaaagatcagcc-BHQ1.